JPS61217766A - 蛋白質の定量方法および定量装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は、全く新規な手段に基く蛋白質の定量方法およ
び定量装置に関するものである。

〔従来の技術〕

蛋白質の定量方法（およびそれを実施するための装置）
としては、例えばｒ生物化学実験法７：蛋白質の定量法
（第２版）Ｊ（学会出版センター。

１９８２年１２月２５日刷）等に詳述されているように
、古くから確立されているＫｊｅｄａｈｌ法（蛋白質中
の窒素を変換したアンモニウムイオン量測定法）をはじ
めとして、比色法としてのビユレット法、紫外部吸収ス
ペクトル法（ＵＶ法）。

フェノール試薬法（Ｌ　ｏｕｒｙ法）や、蛋白質に結合
させた色素量を測定する色素結合法や、物理的測定法と
しての示差屈折法、ラジオアイソトープ法（Ｒ１法）、
光散乱法、比濁法などのように非常に多くの方法が知ら
れている。

しかしながら、上記各種方法においては、夫々、手法の
簡易さ・煩雑さとか、測定に要する時間の長短とか、感
度の良否とか、精度の良否とか、測定範囲の広狭とか、
測定装置の規模やコストといった面で一長一短があって
、どの方法が最も適しているかということは一該には決
し難く、測定条件に応じて適宜選択採用されているのが
現状である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところで、最近では、前記した各種方法のなかでは、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）との組み合
わせが可能な紫外部吸収スペクトル法。

示差屈折法、光散乱法などが比較的よく採用されている
ようであるが、これらの方法による場合には、非常に高
級な光学系を必要とするために、測定装置が極めて高価
につく欠点があると共に、紫外部吸収スペクトル法では
、測定範囲が非常に狭くて感度も悪い上に、蛋白質の種
類の違いによってかなり大きな感度差が生じるため未知
の蛋白質には適用できないという欠点があり、また、示
差屈折法では、感度が悪い上に溶媒の影響を受けるため
精度も良くないという欠点があり、また、光散乱法では
、蛋白質の種類による感度差が大きい上に分子量の違い
によって光の散乱状態が異なるために未知（分子量が不
明）の蛋白質には適用できないという欠点があった。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであって、そ
の目的は、比較的簡素かつ安価に構成可能な装置で済み
ながら、しかも、多種類の蛋白質に対して、感度および
精度が良くて測定範囲も広くとれる蛋白質の定量方法お
よび定量装置を提供せんとすることにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明による蛋白質の定量方法および定量装置は、化学
ルミネセンス（化学発光反応）という、当該技術分野に
おいては従来は全く留意されていなかった自然現象を有
効利用するという新規なアイデアに端を発して開発され
たものであるので、先ず、その化学発光反応に係る興味
ある現象について説明しておく。

即ち、第７図に示すように、ルミノール（ｃｍＨ？　Ｎ
３０□）溶液のような被酸化時において化学発光性を示
す物質を含有する溶液ａと、過酸化水素水（Ｈオ０！溶
液）のような酸化性の物質を含有する溶液すと、フェリ
シアン化カリウム（Ｋ２（Ｆ　ｅ　（ＣＮ）６Ｆ　）溶
液のような触媒溶液Ｃとを、反応部ｒを構成するフロー
セルｆへ導入供給して混合させると、前記化学発光性物
質は前記酸化性物質により酸化されてかなり強度の大き
い青色の化学発光１（約４５０ｎｍ）を生じる反応が起
こることがよく知られている。なお、前記化学発光性物
質としては、前記ルミノールの他にルシゲニンやロフィ
ンなどが、また、前記酸化性物質としては前記過酸化水
素の他に酸素、オゾン、次亜塩素酸などが知られている
。

而して、本発明者らは、かかる化学発光反応の系におい
て、同図中点線２で示すように前記触媒溶液Ｃに蛋白質
ｄを混入すると前記化学発光ｌの強度が減少（所謂クエ
ンチング〉し、しかも、その化学発光ｌの強度減少量は
前記混入蛋白質ｄの広い量範囲（ごく少量の場合からか
なり多量の場合まで）に亘って比例的（直線性が良好）
であり、また、その減少率は少数の例外を除けば蛋白質
の種類の違いによってもあまり左右されない、というこ
とを発見ならびに実験的に確認したのである。

更に、本発明者らは、前記触媒溶液Ｃとして、毒性が極
めて強いという難点がある前記フェリシアン化カリウム
溶液の代わりに、銅イオンＣｕ・・などの金属イオンを
含有する溶液またはヘマチンなどの金属錯体を含有する
溶液を用いた場合にも、同様の現象が生じることをも発
見ならびに実験的に確認したのである。なお、かかる現
象は、化学発光反応に対する触媒となる溶液中の金属イ
オンのうちの前記混入された蛋白質の量に見合う量の金
属イオンまたは金属錯体が、その混入された蛋白質とで
ビユレットを形成してその触媒活性を失うために、前記
触媒溶液全体としての触媒活性が低下することによるも
のであると推察される。

そこで、本発明者らは、上記した現象を有効に応用する
ことにより、下記のような蛋白質の定量法および定量装
置を開発するに至った。

即ち、本第−発明に係る蛋白質の定量方法は、ルミノー
ル溶液のように被酸化時において化学発光性を示す物質
を含有する溶液と過酸化水素水のように酸化性を有する
物質を含有する溶液との化学発光反応系に対して銅イオ
ンなどの金属イオンまたはヘマチンなどの金属錯体を含
有する基準触媒溶液のみを供給しているときに計測され
る基準化学発光強度と、前記基準触媒溶液に被測定蛋白
質を含有するサンプル溶液を混入した溶液を前記化学発
光反応系に対して供給しているときに計測される化学発
光強度とを比較することにより、前記サンプル溶液中の
蛋白質の量を測定する、という手法を採用した点に特徴
がある。

また、本第：発明に係る蛋白質の定量装置は、ルミノー
ル溶液のように被酸化時において化学発光性を示す物質
を含有する溶液を化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給
可能に構成された第１流路と、過酸化水素水のように酸
化性を有する物質を含有する溶液を前記化学発光反応部
へ所定量ずつ導入供給可能に構成された第２流路と、銅
゛イオンなどの金属イオンまたはヘマチンなどの金属錯
体を含有する倍懐俺基準触媒溶液を前記化学発光強度部
へ所定量ずつ導入供給可能に構成された第３流路と、前
記第３流路内の基準触媒溶液に対して被測定蛋白質を含
有するサンプル溶液を混入可能なようにその第３流路の
途中に合流接続された第４流路と、前記化学発光反応部
から発せられる化学発光の強度を計測する化学発光強度
計測手段とを設けると共に、前記第３流路における前記
第４流路の合流接続部分の下流側に、加熱手段とそれに
続く冷却手段とを介装してある、という特徴を備えてい
る。

〔作用〕

本発明方法および装置において発渾される作用は次の通
りである。

即ち、上記第一発明方法によれば、化学発光性物質含有
溶液と酸化性物質含有溶液との化学発光反応系へ供給さ
れる基準触媒溶液に混入されたサンプル溶液中の被測定
蛋白質の量に対して、その量がごく少量の場合からかな
り多量の場合までの広い量範囲に亘って良好な直線性を
もって比例的に、しかも、化学発光反応に対してある程
度の触媒作用を有するヘム蛋白質などの少数の種類のも
のを除けば、被測定蛋白質の種類如何に拘わらずほぼ一
定の割合で、その化学発光反応系からの化学発光強度が
減少するので、前記サンプル溶液中の被測定蛋白質の定
量を、感度ならびに精度良く、かつ、広い測定範囲で行
うことができる。ちなみに、本発明方法を採用して行っ
た実験によれば、サンプル溶液を５０μｌとした場合に
０．０１〜５μｇ　（２ｘｌＯ−’　〜ｌＸｌ０−’ｇ
／ｄｍ”に相当）の蛋白質の定量が可能であることが判
明しており、従って、その測定感度は０．０１μｇ（即
ち１０ｎｇ）であり、また、その測定範囲は５００倍（
＝５１０．０１）ということになる、これが非常に卓越
したものであることは、各種従来方法による場合の定量
可能範囲と比較対照した次表から明らかであろう。

また、本発明方法においては、前記化学発光反応系に対
する触媒溶液として、通常用いられる毒性が強いフェリ
シアン化カリウム溶液の代わりに、毒性が無い銅イオン
などの金属イオンまたはヘマチンなどの金属錯体を含む
溶液を用いているため、安全に定量操作を行うことがで
きる。

更に、本発明方法による場合には、１１；１記ヘム蛋白
質などの少数の種類のものを除けば、被測定蛋白質の種
類如何に拘わらずほぼ一定の感度で定量できるため、サ
ンプル溶液中に複数種類の被測定蛋白質が含まれている
場合にも、トータル的に、あるいは、液体クロマトグラ
フィーと組み合わせることにより連続的に、精度良い定
量を行うことができる。

更にまた、本発明方法は、比較的簡素で安価に構成でき
る装置と安価に入手できる試薬で実施でき、しかも、被
測定蛋白質に対する標識操作などの試料の前処理も不要
であるので、イニシャルコストもランニングコストも少
なくて済み、橿めて経済的である。

そして、上記第一発明方法を適用して構成された本第二
発明に係る蛋白質の定量装置は、上記第一発明方法にお
ける優れた基本的作用がそのまま発渾されることは勿論
、特に、銅イオンなどの金属イオンまたはヘマチンなど
の金属錯体を含む基準触媒溶液を化学発光反応部へ所定
量ずつ導入供給可能に構成された第３流路と、その第３
流路内の基準触媒溶液に対して被測定蛋白質を含むサン
プル溶液を混入可能なようにその第３流路の途中に合流
接続された第４流路との合流接続部分の下流側に、加熱
手段とそれに続く冷却手段とを設ける、という工夫を施
してあるため、前記加熱手段による加熱作用によって、
基準触媒溶液とサンプル溶液中の被測定蛋白質との間の
ビユレット形成反応が速やかに且つ不足無く充分に行わ
れると共に、前記冷却手段による冷却作用によって、安
定した発光強度計測の上で大きな障害となる流路内気泡
の発生が確実に防止されるので、より一層精度の良い定
量を短時間で行うことができる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を図面（第１図ないし第６図）に
基いて説明する。

第１図（イ）、（ロ）は本第−発明に係る蛋白質の定量
方法の基本的手順を説明するためのものである。

先ず、第１図（イ）に示すように、被酸化時において化
学発光性を示す物質を含有する溶液Ａとしてのルミノー
ル（Ｃｅ　Ｈ？　Ｎｘ　Ｏ！　）溶液および酸化性を存
する物質を含有する溶液Ｂとしての過酸化水素（Ｈｘ　
ＯＲ）水を、化学発光反応部Ｒを構成するフローセルＦ
へ夫々所定量ずつ混合導入供給するように構成された化
学発光反応系Ｑに対して、基準触媒溶液Ｃとしての銅イ
オンＣｕ”″などの金属イオンを含む溶液のみを所定量
ずつ供給し、その状態において、前記化学発光反応部Ｒ
のフローセルＦから発せられる化学発光りの強度（これ
を基準化学発光強度■。とする）を、フォトセンサー１
．アンプ２．レコーダー３等から成る化学発光強度計測
手段Ｓにより計測する。

次に、第１図（ロ）に示すように、前記フローセルＦへ
の前記基準触媒溶液Ｃの供給流路の途中に、被測定蛋白
質を含むサンプル溶液りを所定量混入供給し、その状態
において、前記と同様にしてフローセルＦから発せられ
る化学発光りの強度■の変化を計測する。

そして、そのサンプル溶液りを混入供給しているとき（
Ｎ売時）に計測された化学発光強度Ｖと前記基準化学発
光強度Ｖ、とを比較することにより、つまり具体的には
、第１図（ハ）においてハッチングで示す部分Ｓの積分
値を計算して、前記サンプル溶液り中の蛋白質による前
記基準触媒溶液Ｃの触媒活性の低下に基く縮減光量を求
め、その縮減光量から前記サンプル溶液り中の蛋白質の
量を定量するのである。

なお、前記第１図（イ）、（ロ）において、Ｐ＋。

Ｐ　！、　Ｐ　ｓは夫々各溶液を移送するための定流量
圧送ポンプを示しており、また、Ｍ　＋　、　Ｍ　ｌ＋
　Ｍ　ｓは夫々混合コネクターを示している。

第２図は、上記第一発明方法を適用して構成された本第
二発明に係る蛋白質の定量装置の概略構成を示し、この
図において、Ｘが本第二発明装置の主要装置部であり、
Ｙはその主要装置部Ｘに対して接続される試料溶出用の
液体クロマトグラフィーの一例を示している。

先ず、前記主要装置部Ｘの構成について説明する。

■は、前記化学発光性物質含有ｆ８ＷＡとしてのルミノ
ール溶液を化学発光反応部１シにおけるフローセルＦへ
所定量ずつ導入供給可能に構成された第１流路、■は、
前記酸化性物質含有溶液Ｂとしての過酸化水素水を前記
フローセルＦへ所定量ずつ導入供給可能に構成された第
２流路、■は、前記基準触媒溶液Ｃとしての銅イオンＣ
ｕ”などの金属イオンを含む溶液を前記フローセルＦへ
所定量ずつ導入供給可能に構成された第３流路であり、
前記各流路＋、ｎ、ｍには密閉型溶液タンクＴ、。

Ｔ、、Ｔ、および流量調節用ニードルバルブ付きフロー
メークｔＪ　ｌ＋　Ｕｚ、　ｔＪ　ｚが夫々設けられて
いる。

そして、前記各流路■、■、ｍに対する溶液移送エネル
ギー源としては、流体フローに脈流が生じることが無い
ように、通常用いられる圧送ポンプの代わりに、それら
各流路＋、ｎ、ｍに共通の調圧器５付きの加圧不活性ガ
ス（例えば窒素ガス）ボンベ６を用いている。

そして、前記第３流路■の途中には、その流路内の基準
触媒溶液Ｃに対して被測定蛋白質を含有するサンプル溶
液りを混入可能なように、第４流路■を合流接続してあ
る。７は前記液体クロマトグラフィーＹなどのサンプル
溶液供給手段を接続するためのコネクターである。

また、前記化学発光反応部ＲのフローセルＦに対しては
、光電子倍増管などのフォトセンサー１゜アンプ２．レ
コーダー３９インチグレーター４等から成る化学発光強
度計測手段Ｓを設けである。

更に、前記第１流路！および第２流路■の途中には、そ
れら流路Ｉ、■内の各溶液を一定の温度に保持して化学
発光反応の安定化を図るための共通の恒温化手段８（例
えば約２５℃程度の恒温水バスなど）を介装してあり、
また、前記第３流路■における前記第４流路■の合流接
続部分の下流側には、高温水バスなどの加熱手段９（例
えば約９５℃）とそれに続く低温水バスなどの冷却手段
１０（例えば約０℃）とを介装することにより、前記加
熱手段９による加熱作用によって、その第３流路ｍにお
いて前記基準触媒溶液Ｃとそれに混入されたサンプル溶
液り中の被測定蛋白質との間のビユレット形成反応が速
やかに且つ不足無く充分に行われると共に、前記冷却手
段１０による冷却作用によって、安定した発光強度計測
の上で大きな障害となる流路的気泡の発生が確実に防止
されるように構成してある。

なお、前記化学発光反応部Ｒ１第１流路■、第２流路■
、第３流路■および第４流路■等、各溶液が接触する部
分は、全てテフロン（ポリ四弗化エチレン：デュポン社
商標）で構成すると共に、配管内での試料の拡散を防止
するために、全ての配管の内径をかなり小径のもの（例
えば０．５＋ｗｍ以下）に構成するのが望ましい。

同第２図中、Ｍ＋、Ｍｔ、Ｍｓは夫々混合コネクターを
示している。

次に、前記液体クロマトグラフィーＹの構成について説
明する。

即ち、第２図に示す液体クロマトグラフィーＹは、緩衝
溶液Ｅ（これは後記するカラム１３における試料蛋白質
の分ｉ９溶出液ともなる）を収容するオープン型タンク
Ｔ４と、その緩衝溶液Ｅを所定量ずつ移送するための定
流量圧送ポンプＰと、そのポンプＰの下流側に位置して
第１定容Ｎ（この例では５０μｍ）サンプリングループ
に１　と第１吸引／吐出用注射器Ｗ１とを備えている７
方コツク１１と、その７方コツク１１がらの流出流路１
２に設けられた試料分離溶出用のカラム１３と、被測定
蛋白質を含有するサンプル溶ＩＤを収容するオーブン型
タンクＴ、と、そのサンプル溶液り用タンクＴ、と前記
７方コツク１１との間に位置して第２定容量（この例で
は５０μりサンプリングループに：と第２吸引／吐出用
注射器ｗ２とを備えた６方コツク１４とから成り、前記
主要装置部Ｘにおけるサンプル溶液供給手段接続用コネ
クター７に対して、前記６方コフク１４がらの流出流路
１５を接続して前記タンクＴ、がらサンプル溶液りを前
記主要装置部Ｘへ直接供給する状態（以下、この状態で
使用する場合を直接注入法と称する）と、前記カラム１
３からの流出流路１６を接続して前記タンクＴ、からサ
ンプル溶液りを前記カラム１３を介して前記主要装置部
Ｘへ供給する状［（この状態が通常の液体クロマトグラ
フィーとしての使用状態であって、以下、この状態で使
用する場合を間接注入法と称する）とに切り替え可能に
構成されている。なお、前記直接注入法は、サンプル溶
液りが単一種類の被測定蛋白質が含有している場合の定
量を行う場合とか、サンプル溶液りが含有している複数
種類の被測定蛋白質をトータル的に定量する場合に採用
され、一方、前記間接注入法は、サンプル溶液りが含有
している複数種類の被測定蛋白質を個別に且つ連続的に
定量する場合に採用されるものである。

ところで、上記した構成の液体クロマトグラフィーＹは
、第３図に示すように、前記第２図に示したものにおけ
る前記第２定容量サンプリングループに２と第２吸引／
吐出用注射器Ｗ！とを備えた６方コフク１４を省略する
代わりに、前記カラム１３を前記７方コツク１１がらの
流出流路１２に対して着脱することと等価であるから、
以下の説明においては、この第３図の筒路等価構成の液
体クロマトグラフィーＹ゛をもって行うこととする。

なお、この液体クロマトグラフィーＹ　（Ｙ’　）の場
合にも、各溶液が接触する部分は全てテフロン（ポリ四
弗化エチレン：デュポン社商標）で構成すると共に、全
ての配管の内径をかなり小径のもの（例えば０．５ｍｓ
以下）に構成するのが望ましい。

第４図は上記のように構成された蛋白質の定量装置によ
る定量操作手順を説明するためのものである。なお、そ
の操作手順は、前記カラム１３を前記７方コンク１１か
らの流出流路１２から取り外した試料直接供給状態にお
いても、前記カラム１３を前記流出流路１２に対して介
装した試料溶出供給状態においても同じである。

先ず、前記液体クロマトグラフィーＹ°の７方コツク１
１を第４図（イ）に示す状態として、前記主要装置部Ｘ
の第４流路■へ緩衝溶液Ｅのみを供給し、その状態にお
いて、つまり、前記化学発光反応系ＱのフローセルＦに
対して実質的に基準触媒溶液Ｃのみを供給している状態
において、前記フローセルＦから発せられる化学発光り
の強度（基準化学発光強度ＶＯ）即ちゼロ点を、前記化
学発光強度計測手段Ｓにより計測する。

次に、前記７方コンク１１を第４図（ロ）に示す状態に
切り喚えて、前記吸引／吐出用注射器Ｗ１に対する吸引
（引き）操作を行い、前記サンブリンクループに、内に
所定量（この場合は５０μりのサンプル溶液りを吸入す
る。

なお、上記第４図（イ）および第４図（ロ）に示した操
作手順は前後してもよい。

続いて、前記７方コツク１１を第４図（ハ）に示す状態
に切り換えて、緩衝溶液Ｅを前記サンプリングループに
、内へ流動させることにより、そのサンプリングループ
に１内のサンプル溶液りを前記主要装置部Ｘの第４流路
■へ供給し、その状態において、つまり、前記化学発光
反応系ＱのフローセルＦに対して前記基準触媒溶液Ｃと
サンプル溶液りとの混合溶液を供給している状態におい
て、前記フローセルＦから発せられる化学発光りの強度
■を前記計測手段Ｓにより計測する。その結果、前記計
測手段Ｓのインテグレータ４により、前記サンプル溶液
りを混入供給しているときに計測された化学発光強度Ｖ
の前記基準化学発光強度■、を基準とした積分値（つま
り、前記サンプル溶液り中の蛋白質による前記基準触媒
溶液Ｃの触媒活性の低下に基く縮減光量）が出力される
ので、その縮減光量から前記サンプル溶液り中の蛋白質
の量を定量する。

最後に、前記７方コツク１１を第４図（ニ）に示す状態
に切り換えて、前記吸引／吐出用注射器Ｗ、に対する吐
出（押し）操作を行い、その注射器Ｗ、内のサンプル溶
液りを排出して次の定量に備えるのである。

、次に、上記のように構成された蛋白質の定量装置を用
いて行った蛋白質定量試験結果の一例について記載して
おく。

試験状態の要目の概略は次の通りである。

〔試薬） 全ての試薬は市販の特級品が用いられた。

■化学発光性物質含有溶液Ａ ０．１ｍｏｌ／ｄｍ”のホウ酸とＯ，１ｍｏｌ／ｄａ’
の水酸化カリウムとを含むｐＨ１Ｏ，２の緩衝溶液（Ｂ
ｕｊｆ−１）で希釈して、１．ＯＸ　１０−’ｓ＋ｏｌ
／ｄａ”のルミノール溶液を調製した。

■酸化性物質含有溶液Ｂ ０．３重量％の過酸化水素水を純水で希釈して５、ＯＸ
　１０−’ｍｏｌ／ｄａ’の過酸化水素水を調製した。

■基準触媒溶液Ｃ ２、ＯＸ　１０−”ｍｏｌ／ｄａｄ３の銅イオンＣｕり
溶液を前記緩衝溶液（Ｂｕｆｆ−１）で希釈して、２．
０　Ｘｌ０−”蒙ｏ１／ｄ＠’のＣｕり溶液を調製した
。

■サンプル溶液りに対する緩衝溶液Ｅ ２．６７Ｘ１０−’ｍｏｌ／ｄａ”のリン酸カリウムと
６．６７Ｘ　１０”’ｓｏｌ／ｄａ”のリン酸ナトリウ
ムとの混合溶液に、カラム１３における試料溶出時にお
いてカラム１３によるイオン的な試料吸着を抑制するた
めに０．１５ｓｏｌ／ｃｔｍ”の塩化カリウムを添加し
て、ｐＨ６，１９で３．３３Ｘ１０−’閘◇ｌ／ｄｓ＋
’のリン酸緩衝溶液（Ｂｕｆｆ−ＩＩ）を調製した。

■サンプル溶液り 試料蛋白質を前記リン酸緩衝溶液（Ｂｕｆｆ−ＩＩ）で
希釈した。

〔装置の調整〕

■全ての配管の内径を０．５ｍｍに統一した。

■全ての溶液Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅをｌ　ｃ＋＊３／ｓ＋
ｉｎで移送するように、加圧不活性ガスボンベ６および
調圧器５．流量調節用ニードルバルブ付きフローメータ
Ｕ＋、Ｕｔ、Ｕｓ　、定流量圧送ポンプＰ等を調整した
。

■恒温化手段８を２５℃に、加熱手段９を９５’Ｃ（０
，６４ｍ）に、冷却手段１０を０℃（０，４０ｍ）に保
持した。

■フローセルＦ内での溶液滞留時間を３．４ｓｅｃに調
整した。

〔試験結果〕

■前記カラム１３を介さない直接注入法による場合には
、２Ｘ１０−’〜Ｉ　Ｘ　１０−’ｇ／ｄ＋＋＋３の蛋
白質（オボアルプミン）を定量でき、また、その検出限
界（感度に相当〕ばＩ　Ｑｎｇであった。また、この場
合の５回の繰り返し試験における変動係数は８．６５％
であった。

■前記カラム１３を介した間接注入法による場合には、
２Ｘ１０−’〜Ｉ　Ｘ　１０−’ｇ／ｄａ３の蛋白質（
オボアルブミン）を定量でき、また、この場合の検出限
界（感度に相当）は、主としてカラム１３による試料捕
捉（試料回収率は７７．３％であった）に起因して、５
０ｎｇと若干低下した。また、この場合の５回の繰り返
し試験における変動係数は１２．７％であった。

■恒温化手段８、加熱手段９．冷却手段ＩＯを用いるこ
とは、安定な基準化学発光強度Ｖ。

を得る上で非常に有効な手段であることが確認された。

■被測定蛋白質として、本発明方法および装置に適した
（ｉ）チログロブリン、（ｉｉ）　　γ−グロプリン、
　　（ｉｉｉ）オボアルブミンの３種に加えて、ヘム蛋
白質の一種である（ｉｖ）ミオグロビンや、中心にコバ
ルト−ポルフィリン諸体構造を有する（Ｖ）ビタミンＢ
−１２といった、化学発光反応に対してある程度の触媒
作用を有するが故に本発明方法および装置には適さない
ことが予め判っている２種をもあえて含有させたサンプ
ル溶液りについて、従来の紫外部吸収スペクトル法（Ｕ
Ｖ法）、および、前記カラム１３を介した本発明におけ
る間接注入法により、定量試験を行ったところ、第５図
のような結果を得た。ただし、第５図（ロ）に示す本発
明の間接注入法に供されたサンプル溶液りは、第５図（
イ）に示す従来の紫外部吸収スペクトル法（ＵＶ法）に
供されたものの６６７分の１の濃度に希釈したものであ
る。

この結果から、本発明方法および装置によれば、非常に
感度良く定量可能であることが一目瞭然である。また、
上記液体クロマトグラフィーＹとの組み合わせによる間
接注入法により連続定量が良好に行われていることが判
る。

第５図（イ）に示した紫外部吸収スペクトル法（ＵＶ法
）による定量結果の精度が保証のかぎりではないので、
この第５図（イ）との定量結果と第５図（ロ）に示した
本発明方法および装置にかかる定量結果との比較だけか
らは、精度の良否は判定できないが、化学発光反応に対
してある程度の触媒作用を有する（ｉｖ）　ミオグロビ
ンについてはやはりかなり低めの結果となっているよう
である。このような種類の蛋白質については、補正係数
を求める方向で対処する必要があろう、なお、第５図（
ロ）におけるＧ、　Ｇはポンプ１１の切り替えに伴って
生じるゴーストピークであるが、これは測定上の問題に
はならない。

第６図は本第二発明に係る蛋白質の定量装置の別実施例
を示している。

これは、前記第２図および第３図に示した装置における
主要装置部Ｘと液体クロマトグラフィーＹ　（Ｙ’　）
とを一体化すると共に、定量に必要なほぼすべての操作
を自動−に行えるように、コントローラー１７と、複数
のサンプル溶液り、・・・・・・・・・Ｄイを順次自動
的に切り替え供給するためのオートサンプラー１８とを
設け、かつ、緩衝溶液Ｅをも加圧不活性ガスボンベ６を
用いて移送するように構成したものである。

即ち、前記オートサンプラー１８は、サンプリングルー
プＫを有する６方コツク１９と、多段切り替え弁２０と
、前記複数のサンプル溶液Ｄ１・・・・・・・・・Ｄ７
を夫々収容する複数のオープン型タンクＴＳＩ・・・・
・・・・・Ｔ３，１と、逆止弁２１および吸引ポンプＰ
、を備えた吸引／排出流路２２から構成されている。

また、前記緩衝溶液Ｅを収容するタンクＴ４はこの場合
は密封型に構成され、その流出流路には流量調節用ニー
ドルバルブ付きフローメータＵ４が介装されている。そ
して、４個の流量調節用ニードルバルブ付きフローメー
タＵ、、Ｕ、、Ｕ、、Ｕ４と前記多段切り替え弁２０お
よび吸引ポンプＰ８は、前記コントローラー１７により
、所定のシーケンスに従って自動制御されるように構成
されている。その他の構成は前述の実施例のものと同様
である。

なお、前記各実施例においては、化学発光性物質含有溶
液Ａとしてルミノール溶液を、酸化性物質含有溶液Ｂと
して過酸化水素水を、そして、基準触媒溶液Ｃとして銅
イオンなどの金属イオンを含有する溶液を夫々採用した
ものを示したが、前記化学発光性物質含を溶液Ａとして
は、前記ルミノールの代わりにルシゲニンやロフィンな
どを、前記酸化性物質含有溶液Ｂとしては、前記過酸化
水素の代わりに次亜塩素酸などを、また、前記基準触媒
溶液Ｃとしては、前記金属イオン含有溶液の代わりにヘ
マチンなどの金属錯体を含有する溶液を用いてもよい。

また、本発明方法および装置により、未知量の蛋白質の
定量を行うに際しては、それに先立つキャリブレーショ
ンとして、既知量の同種の蛋白質の定量を行っておき、
その結果を比較参照するようにすれば、より一層精度の
よい定量を行えることは言うまでもない。

〔発明の効果〕

以上詳述したところから明らかなように、本第−発明方
法に係る蛋白質の定量方法によれば、比較的簡素かつ安
価に構成可能な装置ならびに安価に入手し得て且つ毒性
の無い試薬を用いることができるので、経済性および安
全性において極めて有利であり、しかも、少数の例外を
除く多種類の蛋白質に対して、感度および精度が良くて
測定範囲も広くとれる蛋白質の定量が可能であり、また
、サンプル溶液中に複数種類の被測定蛋白質が含まれて
いる場合にも、トータル的に、あるいは、液体クロマト
グラフィーと組み合わせることにより連続的に精度良い
定量を行える、という優れた効果が発揮される。

また、上記第一発明方法を適用して構成された本第二発
明に係る蛋白質の定量装置によれば、上記第一発明方法
における優れた基本的効果がそのまま発揮されることは
勿論、特に、基準触媒溶液を化学発光反応部へ所定量ず
つ導入供給可能に構成された第３流路と、その第３流路
の途中に合流接続された第４流路との合流接続部分の下
流側に、加熱手段とそれに続く冷却手段とを設ける、と
いう工夫を施してあるため、前記基準触媒溶液とサンプ
ル溶液中の被測定蛋白質との間のビユレット形成反応が
速やかに且つ不足無く充分に行われると共に、流路的気
泡の発生が確実に防止されるので、より一層精度の良い
定量を短時間で行うことができる、という効果も発揮さ
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第６図は本発明の実施例を示し、第１図（
イ）、（ロ）は本第−発明に係る蛋白質の定量方法の手
順の説明図、第１図（ハ）は計測例のグラフ、第２図お
よび第３図は本第二発明に係る蛋白質の定量装置の構成
図、第４図（イ）。 （ロ）、（ハ）、（ニ）はその装置による定量操作手順
の説明図、第５図（イ）、（ロ）は従来法との比較にお
ける定量試験結果の一例を示すグラフ、そして、第６図
は別実施例の蛋白質の定量装置の構成図である。 また、第７図は本発明の背景技術の説明図を示している
。 Ａ・・・・・・・・・・・・化学発光性物質含有溶液、
Ｂ・・・・・・・・・酸化性物質含有溶液、Ｃ・・・・
・・・・・・・・基準触媒溶液、■、・・・・・・・・
・基準化学発光強度、■・・・・・・・・・化学発光強
度（減光時）、Ｄ・・・・・・・・・・・・被測定蛋白
質を含有するサンプル溶液、Ｑ・・・・・・・・・・・
・化学発光反応系、■・・・・・・・・・第１流路、■
・・・・・・・・・第２流路、■・・・・・・・・・第
３流路、■・・・・・・・・・第４流路、Ｓ・・・・・
・・・・化学発光強度計測手段、６・・・・・・・・・
加圧不活性ガスボンベ、８・・・・・・・・・恒温化手
段、９・・・・・・・・・・・・加熱手段、１０・・・
・・・・・・冷却手段。 （時開） 第４ （イ） （ハ） は雪溶潰〕 （ロ） Ｙ′ （ニ） が架１−

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ルミノール溶液のように被酸化時において化学発
   光性を示す物質を含有する溶液と過酸化水素水のように
   酸化性を有する物質を含有する溶液との化学発光反応系
   に対して銅イオンなどの金属イオンまたはヘマチンなど
   の金属錯体を含有する基準触媒溶液のみを供給している
   ときに計測される基準化学発光強度と、前記基準触媒溶
   液に被測定蛋白質を含有するサンプル溶液を混入した溶
   液を前記化学発光反応系に対して供給しているときに計
   測される化学発光強度とを比較することにより、前記サ
   ンプル溶液中の蛋白質の量を測定することを特徴とする
   蛋白質の定量方法。
2. （２）ルミノール溶液のように被酸化時において化学発
   光性を示す物質を含有する溶液を化学発光反応部へ所定
   量ずつ導入供給可能に構成された第１流路と、過酸化水
   素水のように酸化性を有する物質を含有する溶液を前記
   化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成された
   第２流路と、銅イオンなどの金属イオンまたはヘマチン
   などの金属錯体を含有する基準触媒溶液を前記化学 発光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成された第３
   流路と、前記第３流路内の基準触媒溶液に対して被測定
   蛋白質を含有するサンプル溶液を混入可能なようにその
   第３流路の途中に合流接続された第４流路と、前記化学
   発光反応部から発せられる化学発光の強度を計測する化
   学発光強度計測手段とを設けると共に、前記第３流路に
   おける前記第４流路の合流接続部分の下流側に、加熱手
   段とそれに続く冷却手段とを介装してあることを特徴と
   する蛋白質の定量装置。
3. （３）前記第１流路および第２流路の途中に恒温化手段
   を介装してある特許請求の範囲第（２）項に記載の蛋白
   質の定量装置。
4. （４）前記第１流路、第２流路および第３流路における
   溶液移送エネルギー源として加圧不活性ガスボンベを用
   いている特許請求の範囲第（２）項または第（３）項に
   記載の蛋白質の定量装置。
5. （５）前記化学発光反応部、第１流路、第２流路、第３
   流路および第４流路等の溶液流路を全てポリ四弗化エチ
   レン製としてある特許請 求の範囲第（２）項ないし第（４）項の何れかに記載の
   蛋白質の定量装置。