JPS61219381A - ヒト−ヒトハイブリド−マ - Google Patents
ヒト−ヒトハイブリド−マInfo
- Publication number
- JPS61219381A JPS61219381A JP60247654A JP24765485A JPS61219381A JP S61219381 A JPS61219381 A JP S61219381A JP 60247654 A JP60247654 A JP 60247654A JP 24765485 A JP24765485 A JP 24765485A JP S61219381 A JPS61219381 A JP S61219381A
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- JP
- Japan
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- human
- cell
- cells
- antibody
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、新規なヒト−ヒトハイプリドーマに関する。
更に詳しくは、本発明は抗破傷風抗体産生能を有するヒ
ト−ヒトハイプリドーマに関する。
ト−ヒトハイプリドーマに関する。
本発明に係るヒト−ヒトハイプリドーマは、破傷風菌に
対するモノクローナル抗体の生産に利用でき、しかも、
その細胞系がヒト由来のものであることから、当該ハイ
ブリドーマによって産生される抗体は、抗原性に関する
問題がない点においプーム価μ十さｆｒ力り昆志！、ナ
ー＾す仝■ＨアあＡ−〔従来技術〕 破傷風抗体は破傷風菌による感染を受けた人に投与する
ことにより、破傷風の発症を防止する効果のあることが
判っている。また、破傷風発症の防止と共に破傷風抗体
の投与により感染を未然に防ぐことも次第に明らかにな
っており、医学的に貢献度の高いものとして期待されて
いる。
対するモノクローナル抗体の生産に利用でき、しかも、
その細胞系がヒト由来のものであることから、当該ハイ
ブリドーマによって産生される抗体は、抗原性に関する
問題がない点においプーム価μ十さｆｒ力り昆志！、ナ
ー＾す仝■ＨアあＡ−〔従来技術〕 破傷風抗体は破傷風菌による感染を受けた人に投与する
ことにより、破傷風の発症を防止する効果のあることが
判っている。また、破傷風発症の防止と共に破傷風抗体
の投与により感染を未然に防ぐことも次第に明らかにな
っており、医学的に貢献度の高いものとして期待されて
いる。
ところで、一般に抗体にはポリクローナル抗体とモノク
ローナル抗体の二種類があるが、最近は増殖性を有する
癌化リンパ様細胞系を用いてモノクローナル抗体を製造
する技術が注目を集めている。このモノクローナル抗体
は、−個の抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体
であるが、その生産方法としては、現在、細胞融合法と
形質転換法がある。どちらも増殖性と抗体産生能を同時
に兼ね備えた細胞を調製するもので、前者は免疫された
供給者のＢ細胞を骨髄腫細胞とｉｎ ｖｉｔｒ。
ローナル抗体の二種類があるが、最近は増殖性を有する
癌化リンパ様細胞系を用いてモノクローナル抗体を製造
する技術が注目を集めている。このモノクローナル抗体
は、−個の抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体
であるが、その生産方法としては、現在、細胞融合法と
形質転換法がある。どちらも増殖性と抗体産生能を同時
に兼ね備えた細胞を調製するもので、前者は免疫された
供給者のＢ細胞を骨髄腫細胞とｉｎ ｖｉｔｒ。
で融合させる方法であり、後者は免疫した供給者のＢ細
胞をＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス等の向リンパ性
ウィルスに感染させて増殖可能な形に変換させる方法で
ある。
胞をＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス等の向リンパ性
ウィルスに感染させて増殖可能な形に変換させる方法で
ある。
これらの製造方法は未だ未熟であり、その抗体産生量の
改善、毒素である抗原を使用することに対する安全対策
、夾雑抗原の精製の困難性の克服などの未解決の問題点
も多く、実用化には多くの困難がある。即ち、細胞融合
法を用いた場合は、融合効率の低さと、全リンパ球の中
に存在する抗破傷風抗体産生細胞の割合の低さにより、
満足のいく抗体産生ハイブリドーマは得られていない。
改善、毒素である抗原を使用することに対する安全対策
、夾雑抗原の精製の困難性の克服などの未解決の問題点
も多く、実用化には多くの困難がある。即ち、細胞融合
法を用いた場合は、融合効率の低さと、全リンパ球の中
に存在する抗破傷風抗体産生細胞の割合の低さにより、
満足のいく抗体産生ハイブリドーマは得られていない。
また、形質転換法を用いる場合、非常に高い確率で株化
細胞は得られるが、クローニング効率が数％と非常に低
いのが弱点である。
細胞は得られるが、クローニング効率が数％と非常に低
いのが弱点である。
また、生産される抗体の抗原性についての問題は、ヒト
と免疫反応を起こさない動物の細胞系を用いることによ
って解決されるが、一般的にはヒト由来の細胞系を用い
ることにより安全性が保たれることが判っている。しか
し、この場合も抗体産生能および増殖性について必ずし
も満足な結果が得られるまでには至っていない。
と免疫反応を起こさない動物の細胞系を用いることによ
って解決されるが、一般的にはヒト由来の細胞系を用い
ることにより安全性が保たれることが判っている。しか
し、この場合も抗体産生能および増殖性について必ずし
も満足な結果が得られるまでには至っていない。
本発明者らは、完全でかつ大量生産可能な抗破傷風抗体
産生細胞系の確立の一環として、抗原性の問題のないヒ
ト−ヒトハイブリドーマについて鋭意研究を重ねた結果
、上述したような抗体生産に係わる諸問題を克服する手
段として、新規な親細胞であるＨＡＴ （ヒボキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジン）感受性ウアバイン耐性
を有するヒト由来株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ）と
Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス等の向リンパ性ウィ
ルスによって形質転換させたヒト由来抗破傷風抗体産生
性Ｂ細胞とを細胞融合させることにより、増殖性が高く
、しかも抗原性の問題もないヒト−ヒトハイブリドーマ
が得られることを見いだし、本発明を完成した。
産生細胞系の確立の一環として、抗原性の問題のないヒ
ト−ヒトハイブリドーマについて鋭意研究を重ねた結果
、上述したような抗体生産に係わる諸問題を克服する手
段として、新規な親細胞であるＨＡＴ （ヒボキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジン）感受性ウアバイン耐性
を有するヒト由来株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ）と
Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス等の向リンパ性ウィ
ルスによって形質転換させたヒト由来抗破傷風抗体産生
性Ｂ細胞とを細胞融合させることにより、増殖性が高く
、しかも抗原性の問題もないヒト−ヒトハイブリドーマ
が得られることを見いだし、本発明を完成した。
（発明の開示〕
本発明は、増殖性に優れ、抗原性の問題もない抗破傷風
抗体産生のためのヒト−ヒトハイブリドーマを提供する
ことを目的とするものであり、ヒト由来ＨＡＴ感受性ウ
アバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ） と
、向リンパ性ウィルスによって形質転換されたヒト由来
抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とを融合させて得られたヒト
−ヒトハイブリドーマに関する。
抗体産生のためのヒト−ヒトハイブリドーマを提供する
ことを目的とするものであり、ヒト由来ＨＡＴ感受性ウ
アバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ） と
、向リンパ性ウィルスによって形質転換されたヒト由来
抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とを融合させて得られたヒト
−ヒトハイブリドーマに関する。
本発明における細胞融合は、増殖性を持った細胞と抗体
産生性を持った細胞とによって行われる。
産生性を持った細胞とによって行われる。
本発明において、抗体産生性細胞として向リンパ性ウィ
ルスによって形質転換されたヒト由来抗破傷風抗体産生
性Ｂ細胞を用いる。
ルスによって形質転換されたヒト由来抗破傷風抗体産生
性Ｂ細胞を用いる。
当該Ｂ細胞は自体既知の手段によって調製され、その調
製法としては、たとえば次の如き方法が例示される。
製法としては、たとえば次の如き方法が例示される。
当該Ｂ細胞を得るための破傷風抗原は、破傷風菌が生成
する分子量１５万、等電点５．１の蛍白毒素であり、菌
体外毒素であり、通常、市販の無毒化トキソイド、破傷
風菌を培養後、培養液を精製したもの等が用いられる。
する分子量１５万、等電点５．１の蛍白毒素であり、菌
体外毒素であり、通常、市販の無毒化トキソイド、破傷
風菌を培養後、培養液を精製したもの等が用いられる。
こうして得られる破傷風抗原の抗原性を高めておくため
に、蛋白変性剤の存在下、加熱処理を施すことも可能で
ある。抗原はさらに免疫用に高度に精製しておくことが
望ましい。
に、蛋白変性剤の存在下、加熱処理を施すことも可能で
ある。抗原はさらに免疫用に高度に精製しておくことが
望ましい。
上記破傷風抗原によるＢ細胞の抗体産生の刺激は、ｉｎ
ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。１ｎ
ｖｉｖｏの場合は、公知の方法を用いればよく、例えば
破傷風抗原をヒトの皮肉に２〜３回接種し、最終免疫の
数日後、採血を行い、得られた血液からＢ細胞を回収、
精製することにより、所望のヒト由来抗破傷風抗体産生
性Ｂ細胞が得られる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの場合は
、Ｂ細胞を先にヒト生体外に取り出し、そのまま、ある
いは培養した後、破傷風抗原で刺激することによって行
われる。破傷風抗原による生体外での刺激は、例えば精
製抗原の適量とＢ細胞とを３０〜４０℃で１０〜５０時
間接触させることによって行われ、一般的には培地中で
行われる。Ｂ細胞の分離は、好適にはファイコール・コ
ンレイの比重遠心法によって行われる。
ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。１ｎ
ｖｉｖｏの場合は、公知の方法を用いればよく、例えば
破傷風抗原をヒトの皮肉に２〜３回接種し、最終免疫の
数日後、採血を行い、得られた血液からＢ細胞を回収、
精製することにより、所望のヒト由来抗破傷風抗体産生
性Ｂ細胞が得られる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの場合は
、Ｂ細胞を先にヒト生体外に取り出し、そのまま、ある
いは培養した後、破傷風抗原で刺激することによって行
われる。破傷風抗原による生体外での刺激は、例えば精
製抗原の適量とＢ細胞とを３０〜４０℃で１０〜５０時
間接触させることによって行われ、一般的には培地中で
行われる。Ｂ細胞の分離は、好適にはファイコール・コ
ンレイの比重遠心法によって行われる。
かくして得られたＢ細胞は、向リンパ性ウィルスによっ
て増殖型に形質転換される。
て増殖型に形質転換される。
形質転換には、向リンパ性ウィルス、たとえばＥｐｓｔ
ｅｉｎ Ｂａｒｒウィルスが用いられる。当８亥ウィル
スは、正常細胞を増殖型の細胞に形質転換させるウィル
スとして知られる（ Ｎａｔｕｒｅ ２６９．４２０−
４２２（１９７７）） 、 Ｂ ９５−８山来Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス〔マイコプラズマフリー ８
９５−８培地からの（培養）上清としてうる〕を用い、
あらかじめ細胞転換可能量のウィルスを調製する。かく
して調製されたウィルスをＢ細胞の培養系培地に適量滴
下し、好ましくは３７℃において５〜２０日間接触させ
る。Ｂ細胞の培養は、例えば３７℃、５％牛脂児血清中
で行う。また、この培養は培地にグルタミンを添加した
培養培地中で行ってもよい。
ｅｉｎ Ｂａｒｒウィルスが用いられる。当８亥ウィル
スは、正常細胞を増殖型の細胞に形質転換させるウィル
スとして知られる（ Ｎａｔｕｒｅ ２６９．４２０−
４２２（１９７７）） 、 Ｂ ９５−８山来Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス〔マイコプラズマフリー ８
９５−８培地からの（培養）上清としてうる〕を用い、
あらかじめ細胞転換可能量のウィルスを調製する。かく
して調製されたウィルスをＢ細胞の培養系培地に適量滴
下し、好ましくは３７℃において５〜２０日間接触させ
る。Ｂ細胞の培養は、例えば３７℃、５％牛脂児血清中
で行う。また、この培養は培地にグルタミンを添加した
培養培地中で行ってもよい。
こうして形質転換により得られた増殖型Ｂ細胞を継代培
養し、この細胞から破傷風抗原に対する抗体を産生ずる
細胞を選別、濃縮する。
養し、この細胞から破傷風抗原に対する抗体を産生ずる
細胞を選別、濃縮する。
抗破傷風抗体を産生ずる細胞は、例えばＰＨＡ法、ＥＲ
Ａ法、ＰＨＡ法等により追跡される。
Ａ法、ＰＨＡ法等により追跡される。
本発明に関して、増殖性をもつ細胞として、ヒト由来Ｈ
ＡＴ惑受性ウアバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉ
ｎｅ ）が用いられる。当該ヒト由来ＨＡＴ感受性ウア
バイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）は、公
知の方法により調製され得る。例えば、ヒト由来ＨＡＴ
感受性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）を培養する
際に、培地中のウアバイン濃度を長時間にわたり上昇さ
せていくことにより、自然発生的なウアバイン耐性細胞
が得られる。この操作により、細胞が本来有していた性
質（ＨＡＴ感受性、融合効率、増殖性など）に影響を及
ぼさずにウアバイン耐性というマーカー機能を持たせる
ことができ、選択が容易になる。
ＡＴ惑受性ウアバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉ
ｎｅ ）が用いられる。当該ヒト由来ＨＡＴ感受性ウア
バイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）は、公
知の方法により調製され得る。例えば、ヒト由来ＨＡＴ
感受性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）を培養する
際に、培地中のウアバイン濃度を長時間にわたり上昇さ
せていくことにより、自然発生的なウアバイン耐性細胞
が得られる。この操作により、細胞が本来有していた性
質（ＨＡＴ感受性、融合効率、増殖性など）に影響を及
ぼさずにウアバイン耐性というマーカー機能を持たせる
ことができ、選択が容易になる。
こうして得られた形質転換により増殖性を有するヒト由
来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とヒト由来ＨＡＴ惑受性ウ
アバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌｌｉｎｅ ）とを用
いて細胞融合を行う。細胞融合は自体既知の手段にて行
われるが、その−例は増殖性を持った細胞と抗体を産生
じている前記Ｂ細胞とをポリエチレングリコールの存在
下で反応せしめる。混合比は増殖性細胞１個に対して、
Ｂ細胞１〜１０個が適当である。
来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とヒト由来ＨＡＴ惑受性ウ
アバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌｌｉｎｅ ）とを用
いて細胞融合を行う。細胞融合は自体既知の手段にて行
われるが、その−例は増殖性を持った細胞と抗体を産生
じている前記Ｂ細胞とをポリエチレングリコールの存在
下で反応せしめる。混合比は増殖性細胞１個に対して、
Ｂ細胞１〜１０個が適当である。
こうして得られた融合細胞は、ＨＡＴ＋ウアバイン添加
培地により選択されるが、それは以下のような根拠に基
づく。ＨＡＴ感受性とは、培地中にＨＡＴが存在すると
綱１？−：が成育あるいは増殖できない性質をさし、ウ
アバイン耐性とは高濃度のウアバイン存在下でも細胞が
増殖可能となることである。又、ウアバイン耐性細胞と
正常細胞とを融合させたものはウアバイン耐性となるこ
とが知られている。従って、ヒト由来ＨＡＴ感受性ウア
バイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）とヒト
由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞（このＢ細胞はＨＡＴ感
受性、ウアバイン耐性ともにない）を融合させた場合、
培地中にＨＡＴ＋ウアバインが存在していれば、融合し
なかった株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ）はＨＡＴ感
受性のために、また融合しなかったＢ細胞もウアバイン
耐性ではないために増殖できない。しかし、融合できた
細胞はウアバイン耐性のために増殖可能となる。こうし
て融合細胞のみを選別することができる。
培地により選択されるが、それは以下のような根拠に基
づく。ＨＡＴ感受性とは、培地中にＨＡＴが存在すると
綱１？−：が成育あるいは増殖できない性質をさし、ウ
アバイン耐性とは高濃度のウアバイン存在下でも細胞が
増殖可能となることである。又、ウアバイン耐性細胞と
正常細胞とを融合させたものはウアバイン耐性となるこ
とが知られている。従って、ヒト由来ＨＡＴ感受性ウア
バイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）とヒト
由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞（このＢ細胞はＨＡＴ感
受性、ウアバイン耐性ともにない）を融合させた場合、
培地中にＨＡＴ＋ウアバインが存在していれば、融合し
なかった株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ）はＨＡＴ感
受性のために、また融合しなかったＢ細胞もウアバイン
耐性ではないために増殖できない。しかし、融合できた
細胞はウアバイン耐性のために増殖可能となる。こうし
て融合細胞のみを選別することができる。
さらに、目的とする抗破傷風抗体を産生じている細胞を
公知の方法によりスクリーニングおよびクローニングし
て、抗破傷風抗体産生ヒト−ヒトハイブリドーマを得る
。
公知の方法によりスクリーニングおよびクローニングし
て、抗破傷風抗体産生ヒト−ヒトハイブリドーマを得る
。
こうして得られたハイブリドーマはヒト由来であるため
、ハイブリドーマが産生じた抗体のヒトに対する抗原性
についても問題はなく、また単にヒト由来株化Ｂ細胞（
ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）とヒト由来抗破傷風抗体産生性
Ｂ細胞を細胞融合させたもの、あるいは、ヒト由来抗破
傷風抗体産生性Ｂ細胞をＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィ
ルスで形質転換させただけのものに比べて、抗体産生能
および特に増殖性に優れた抗体産生細胞を得ることがで
きる。
、ハイブリドーマが産生じた抗体のヒトに対する抗原性
についても問題はなく、また単にヒト由来株化Ｂ細胞（
ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）とヒト由来抗破傷風抗体産生性
Ｂ細胞を細胞融合させたもの、あるいは、ヒト由来抗破
傷風抗体産生性Ｂ細胞をＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィ
ルスで形質転換させただけのものに比べて、抗体産生能
および特に増殖性に優れた抗体産生細胞を得ることがで
きる。
このハイブリドーマを成育培地で増殖させることにより
、モノクローナル抗体を連続的に産生せしめて、次いで
培地から抗体を回収することができる。
、モノクローナル抗体を連続的に産生せしめて、次いで
培地から抗体を回収することができる。
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこ
れらに限定されない。
れらに限定されない。
実施例１
健康な大人の志願者各々にテタヌストキソイド（０，５
ｍ１）のブースター（補助注射）免疫法を行った。この
注射から約４日月を初日として一定の時間間隔で採血し
た。この末梢血液からファイコール・コンレイ比重遠心
法によりリンパ球を単離した後、Ｅ−ロゼツト形成によ
りＴ細胞を除いてＢ細胞のみを得た。このＢ細胞はＲＰ
ＭＩ １６４０＋１５％ウシ胎児血清＋２ｍＭグルタミ
ンの培地で培養しておく （ｆ！胞濃度Ｉ Ｘ １０６
個／ｍｌ） 、 一方、Ｂ９５−８細胞（マーモセント
リンパ球株化細胞）をＲＰＭＩ １６４０＋ ２０％ウ
シ胎児血清培養液で培養し、数日後、培養上清を分取し
たものをＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒウィルス液として用い
た（濃度１０５転換用量／１）。上述したＢ細胞培養培
地１１にＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒウィルス液０．２１を
加え、怒染させて、培養液（ＲＰ旧１６４０＋２０％ウ
シ胎児血清）中、５％ＣＯ２下で３週間静置培養し、細
胞の増殖を行った。増殖した細胞から抗体産生細胞を回
収するために、限界希釈培養法を用い、ＥＬ ｒ ＳＡ
法でチェックしながら抗破傷風抗体産生性の継代培養細
胞を得た。
ｍ１）のブースター（補助注射）免疫法を行った。この
注射から約４日月を初日として一定の時間間隔で採血し
た。この末梢血液からファイコール・コンレイ比重遠心
法によりリンパ球を単離した後、Ｅ−ロゼツト形成によ
りＴ細胞を除いてＢ細胞のみを得た。このＢ細胞はＲＰ
ＭＩ １６４０＋１５％ウシ胎児血清＋２ｍＭグルタミ
ンの培地で培養しておく （ｆ！胞濃度Ｉ Ｘ １０６
個／ｍｌ） 、 一方、Ｂ９５−８細胞（マーモセント
リンパ球株化細胞）をＲＰＭＩ １６４０＋ ２０％ウ
シ胎児血清培養液で培養し、数日後、培養上清を分取し
たものをＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒウィルス液として用い
た（濃度１０５転換用量／１）。上述したＢ細胞培養培
地１１にＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒウィルス液０．２１を
加え、怒染させて、培養液（ＲＰ旧１６４０＋２０％ウ
シ胎児血清）中、５％ＣＯ２下で３週間静置培養し、細
胞の増殖を行った。増殖した細胞から抗体産生細胞を回
収するために、限界希釈培養法を用い、ＥＬ ｒ ＳＡ
法でチェックしながら抗破傷風抗体産生性の継代培養細
胞を得た。
一方、ヒト由来ＨＡＴ惑受性ウアバイン耐性株化Ｂ細胞
（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）は以下の方法により調製した
。
（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）は以下の方法により調製した
。
対数増殖期のヒト由来ＨＡＴ感受性株化Ｂ細胞（ｃｅｌ
ｌ １ｉｎｅ ）を細胞数８個／＋ｍｌとなるように培
地（ＲＰＭｒ １６４０＋ １０％ウシ胎児血清）で希
釈し、９５ｈａｌｌマイクロプレートを用いて１００ｐ
Ｊ／ｗｅｌｌで分注し、ｗｅｌ＋当たりの細胞数を０．
８個とした。
ｌ １ｉｎｅ ）を細胞数８個／＋ｍｌとなるように培
地（ＲＰＭｒ １６４０＋ １０％ウシ胎児血清）で希
釈し、９５ｈａｌｌマイクロプレートを用いて１００ｐ
Ｊ／ｗｅｌｌで分注し、ｗｅｌ＋当たりの細胞数を０．
８個とした。
これを３７℃、５％ＣＯ２で約２週間培養した。
その後、３０〜４０％のクローニング効率で細胞の増殖
がみられ、そのうちもっとも増殖性の良い細胞を約ｔｏ
ｅ個／１の細胞密度に調整した培養液に１０−７Ｍのウ
アバインを加えた培地で培養した。同様の培地交換を２
〜３度繰り返し、最後は１０″６Ｍのウアバインを加え
て培養した。その後、ウアバインを除いて培養を行い、
ごく少数の生存した細胞を増殖させた。約１ｏ日後、増
殖してきた細胞を遠心洗浄し、ｌＯ″ｆ１Ｍのウアバイ
ンを含む培地に１０５個／ｍｌとなるように細胞を浮遊
させ、９６ｈａｌｌマイクロプレートに１００μ／ｈａ
ｌｌとなるように分注した。これを−週間に２回の培地
交換で約１ケ月培養し、１０″ＩＩＩＭのウアバイン存
在下でも増殖する細胞を得た。
がみられ、そのうちもっとも増殖性の良い細胞を約ｔｏ
ｅ個／１の細胞密度に調整した培養液に１０−７Ｍのウ
アバインを加えた培地で培養した。同様の培地交換を２
〜３度繰り返し、最後は１０″６Ｍのウアバインを加え
て培養した。その後、ウアバインを除いて培養を行い、
ごく少数の生存した細胞を増殖させた。約１ｏ日後、増
殖してきた細胞を遠心洗浄し、ｌＯ″ｆ１Ｍのウアバイ
ンを含む培地に１０５個／ｍｌとなるように細胞を浮遊
させ、９６ｈａｌｌマイクロプレートに１００μ／ｈａ
ｌｌとなるように分注した。これを−週間に２回の培地
交換で約１ケ月培養し、１０″ＩＩＩＭのウアバイン存
在下でも増殖する細胞を得た。
このＨＡＴ感受性ウアつイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ
１ｉｎｅ ） １，５ ｘ ｌ ９８個と上述の継
代培養細胞３Ｘ１０”個と混和し、５０％ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ１５００．ＢＤＨ製）０．３＋ｓｌ
を加え、３７℃で２分間、細胞融合を行わせた。細胞を
遠心洗浄した後、ＲＰＭＩ １６４０４１０％ウシ胎児
血清培養液で細胞数をｌＸｌ０”個／ｍｌに調整し、９
６％４ａｌｌマイクロプレートに１００ ｐｊｉ／ｗｅ
ｌｌで分注した。ＨＡＴ＋ウアバイン選択培地〔ヒポキ
サンチア１３．６１Ｂ／１．７−、／７’テ！Ｊ７０．
１８ｍｇ／１１チミジン３．８８ ｍｇ／ ｌ、ウアバ
イ７０．５Ｘ１０″ＢＭ（全て最終濃度）〕は、ＰＥＧ
処理後、２４時間後に加えて２週間培養した。
１ｉｎｅ ） １，５ ｘ ｌ ９８個と上述の継
代培養細胞３Ｘ１０”個と混和し、５０％ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ１５００．ＢＤＨ製）０．３＋ｓｌ
を加え、３７℃で２分間、細胞融合を行わせた。細胞を
遠心洗浄した後、ＲＰＭＩ １６４０４１０％ウシ胎児
血清培養液で細胞数をｌＸｌ０”個／ｍｌに調整し、９
６％４ａｌｌマイクロプレートに１００ ｐｊｉ／ｗｅ
ｌｌで分注した。ＨＡＴ＋ウアバイン選択培地〔ヒポキ
サンチア１３．６１Ｂ／１．７−、／７’テ！Ｊ７０．
１８ｍｇ／１１チミジン３．８８ ｍｇ／ ｌ、ウアバ
イ７０．５Ｘ１０″ＢＭ（全て最終濃度）〕は、ＰＥＧ
処理後、２４時間後に加えて２週間培養した。
その結果、４３ｈｅ１１中２０ｗｅｌｌに細胞の増殖が
見られたので、これらの培養上清中の抗破傷風抗体活性
をＥＬｒＳＡ法で測定し、抗体産生の有無ヲ調べた（ス
クリーニング）。抗体産生の高かった１２−ｅｌｌにつ
いて細胞培養液をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎児
血清培養液で希釈して８個／ｍｌに調整し、９６ｈａｌ
ｌマイクロプレートに１００ｄ／ｗｅｌｌで分注し、ｗ
ｅｌｌ当たりの細胞数を０．８個とした（限界希釈培養
法）、３７℃、５％ｃｏ２下で培養し、クローニングを
行った。抗体産生をＥＬ Ｉ ＳＡ法によりチェックし
て選別し、株化ヒト−ヒトハイブリドーマを得た。〔尚
、ＥＬ Ｉ ＳＡ法ではパーオキシダーゼ標識抗ヒトＩ
ｇＡ＋ Ｉ ｇＧ＋ Ｉ ｇＭヤギ抗体（Ｋ Ｐ Ｌ
社製）を用いた。〕こうして得られた株化ヒト−ヒトハ
イブリドーマは、増殖性および抗体産生能について両親
細胞の性質をよく受は継いでおり、従来の方法による細
胞融合体、形質転換体に比べて優れていることが判明し
た。
見られたので、これらの培養上清中の抗破傷風抗体活性
をＥＬｒＳＡ法で測定し、抗体産生の有無ヲ調べた（ス
クリーニング）。抗体産生の高かった１２−ｅｌｌにつ
いて細胞培養液をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎児
血清培養液で希釈して８個／ｍｌに調整し、９６ｈａｌ
ｌマイクロプレートに１００ｄ／ｗｅｌｌで分注し、ｗ
ｅｌｌ当たりの細胞数を０．８個とした（限界希釈培養
法）、３７℃、５％ｃｏ２下で培養し、クローニングを
行った。抗体産生をＥＬ Ｉ ＳＡ法によりチェックし
て選別し、株化ヒト−ヒトハイブリドーマを得た。〔尚
、ＥＬ Ｉ ＳＡ法ではパーオキシダーゼ標識抗ヒトＩ
ｇＡ＋ Ｉ ｇＧ＋ Ｉ ｇＭヤギ抗体（Ｋ Ｐ Ｌ
社製）を用いた。〕こうして得られた株化ヒト−ヒトハ
イブリドーマは、増殖性および抗体産生能について両親
細胞の性質をよく受は継いでおり、従来の方法による細
胞融合体、形質転換体に比べて優れていることが判明し
た。
実験例１
実施例１により得られた２系列のハイプリドーマ（ＩＯ
Ｃ，ｌ０Ｃ）において、その染色体数を調べた（第１表
）。なお、表中の値はその染色体をもつ細胞数を示す。
Ｃ，ｌ０Ｃ）において、その染色体数を調べた（第１表
）。なお、表中の値はその染色体をもつ細胞数を示す。
第１表に示したようにハイプリドーマはその親細胞であ
るＢ細胞、株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）（染色
体数共に４６）より数本から３０本多い染色体を有して
いることが判った。即ち、染色体に変異が起こっている
ことが確認されたわけで、当該細胞が親細胞とは異なる
ハイブリドーマであることが染色体数からも示唆された
。
るＢ細胞、株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）（染色
体数共に４６）より数本から３０本多い染色体を有して
いることが判った。即ち、染色体に変異が起こっている
ことが確認されたわけで、当該細胞が親細胞とは異なる
ハイブリドーマであることが染色体数からも示唆された
。
実験例２
実施例１により得られた株化ヒト−ヒトハイブリドーマ
の性質を調べ、その結果を第２表に示した。［ハイブリ
ドーマ生成率」は、親細胞ｌＸｌ０”個当たり出現する
ハイブリドーマの数で示した。
の性質を調べ、その結果を第２表に示した。［ハイブリ
ドーマ生成率」は、親細胞ｌＸｌ０”個当たり出現する
ハイブリドーマの数で示した。
「クローニング効率」は、増殖性を示す指標として用い
たが、出現ハイブリドーマ中、増殖可能なハイブリドー
マの確率を示した。また、対照として親細胞であるヒト
株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）およびヒト抗破傷
風抗体産生性Ｂ細胞、株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ
）とＢ細胞の細胞融合体、Ｂ細胞のＥｐｓｔｅｉｎ
Ｂａｒｒウィルスによる形質転換体を用いた。
たが、出現ハイブリドーマ中、増殖可能なハイブリドー
マの確率を示した。また、対照として親細胞であるヒト
株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）およびヒト抗破傷
風抗体産生性Ｂ細胞、株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ
）とＢ細胞の細胞融合体、Ｂ細胞のＥｐｓｔｅｉｎ
Ｂａｒｒウィルスによる形質転換体を用いた。
第２表に示したように本発明の株化ヒト−ヒトハイブリ
ドーマは、発現率も良く、また増殖性も備わった極めて
効率の良い抗破傷風抗体産生細胞となりうろことが判明
した。また、本発明ハイブリドーマは、ヒト由来である
ため抗原性に関する問題もないものである。
ドーマは、発現率も良く、また増殖性も備わった極めて
効率の良い抗破傷風抗体産生細胞となりうろことが判明
した。また、本発明ハイブリドーマは、ヒト由来である
ため抗原性に関する問題もないものである。
Claims (1)
- ヒト由来ＨＡＴ感受性ウアバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅ
ｌｌ ｌｉｎｅ）と、向リンパ性ウィルスによって形質
転換されたヒト由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とを融合
させてなることを特徴とするヒト−ヒトハイブリドーマ
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA477314 | 1985-03-25 | ||
| CA477314 | 1985-03-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61219381A true JPS61219381A (ja) | 1986-09-29 |
Family
ID=4130108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60247654A Pending JPS61219381A (ja) | 1985-03-25 | 1985-11-05 | ヒト−ヒトハイブリド−マ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61219381A (ja) |
-
1985
- 1985-11-05 JP JP60247654A patent/JPS61219381A/ja active Pending
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