JPS6122851A - 精液分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｘ精液及びＹ精液の表現型の差による重量分
析方法における分離方法、並びに精液の重量分析用培地
及びこの培地の製造方法に関する。

従来技術の状態は、本発明者の米国特許Ｎα３゜８９４
．５２９号及び４，３２７，１７７号の各明細書によシ
最も良く表わされている。

本発明者の従来の特許において、精液の如何なる可能性
のある有害な圧縮或いは膨張を避けるために分離方法の
際に適当な浸透圧を維持することが重要であることが認
識されていた。しかしながら、浸透圧は分離カラム内で
変化しないものと想定されていた。例えば、米国特許３
．’８９４，５２９号明細書においては、オスモル濃度
は密度勾配内で実質的に一定であろうと述べられている
。実質的に同一の陳述が米国特許４，３２７，１７７号
においてもなされている。この様に、カラム内の静水圧
力が考慮に入れられるべきである。或いは静水圧の変化
をオスモル濃度の変化によシ保障することが可能である
との認識はなされていなかった。

本発明の密度勾配法の修正方法の成功の理由の１つは、
培地の浸透圧を制御することにより細胞の容積を正確に
制御することが出来たことである。

細胞を取少囲む溶液の浸透圧を増減することによシ細胞
内の遊離水の量を調整することによ）細胞容積を変える
ことが可能である。

赤血球と同様に、精細胞がよシ低い浸透圧の溶液即ち細
胞内よりも単位容積当シの水分子がよシ多い状態におく
ことによシ膨張させることが出来、又よシ高い浸透圧の
溶液に入れることによシ収縮させることが出来ることは
良く知られている。

浸透圧は又ｐ＝９（Ｐ＝密度、Ｍ＝細胞の質量、■＝細
胞の容積）として細胞の密度に変化を起こさせる。

異った大きさの核を有する細胞は、浸透圧により異った
影響を及ぼされるようであシ、即ちよシ小さな核を有す
る細胞の膨潤比は細胞内の遊離水の量の相違及びおそら
くは膜張力における相違により大きな核を有するものと
は異る。

従って、オスモル濃度の制御は密度勾配分離方法の改良
された開発において重要な因子である。

密度勾配分離を行う手段として開発された装置の１つは
吟浸透圧勾配でおる。これまで使用されて来た密度勾配
は溶液中のある分子の数を増大することによシ通常作ら
れている。溶液のオスモル濃度は溶液に添加される分子
の増加と共に増大する。この様に、従来は密度及びオス
モル濃度は独立には変えることは出来なかった。

本発明に従えば、溶液のオスモル濃度を調整し、次いで
脂質類例えばクリーム、油或いは任意の溶液中で安定に
乳化することのできる物質の小球（１〜２μ）を添加す
ることにより溶液の密度を調整することかで−きる。こ
れらの小球は分子径の範囲を越えるものであシ、溶液の
浸透圧には影響を及ぼさない。

密度勾配の操ｆ′ｌ＝を行うに際し、 ＆）精液が分離される浸透圧の範囲を調整すること、及
び ｂ）カラム内の浸透圧の調整を溶液中の精細胞の浸漬の
深さと共に変わる精液上の静水圧の相違を保障するよう
に行うこと が必要であることが見出された。

本発明を実施するに際し、力２ム内の浸透圧及び密度を
独立に変化させる手段が提供されなければならない。通
常比較的大きい密度差を取シ扱う鳩舎には、オスモル濃
度の影響は影が薄くなる。

本発明においては極めて僅かな密度勾配を取シ扱い、こ
の様な条件下においては、浸透圧の分離に及ぼす影響は
重要である。

一般的には、本発明の方法は先ず低密度金有する物質全
準備し、その浸透圧を通常は水金添加することによシ所
定の値に調整すること罠よシ実施される。次によシ高密
度の物質を取シ、そのオスモル濃度を再び例えは水を添
加することによりｍ整して低オスモル濃度及び上記で調
製した物質よυも高密度の物質を得る。通常本発明の実
際的な実施態様に於いては、中密度物質を用い、及びこ
のオスモル濃度を上記で調製した物質を混合することに
よシ上記の高い値及び低い値の中間のいずれかの値に調
整することもできる。この様にしてこれらの物質を用い
て、底部において高密度及び頂部において低密度を有す
が、しかし好壕しくけ反対の間係のオスモル濃度を有す
る分離カラムを提供することが可能となる。これは効果
としてカラムの底部における静水圧の増大を保障し、そ
の結果、分離が勾配に基づきよシ効果的に行われる。

従って、本発明は、Ｘ精液及びｙｇ液を表現型により精
液の容器の底部において高密度を有し、その頂部におい
て低密度を有する栄養培地内に懸濁される密度分離方法
において分離する方法において、該容器内にオスモル濃
度勾配を維持することを特徴とする方法を提供する。

本発明は、底部において高密度及び頂部において低密度
を有し、且つ底部において低オスモル濃度及び頂部にお
いて高オスモル濃度を有することを特徴とする精液の重
量分離用培地も又提供する。

最後に、本発明は下記工程を含んでなることを特徴とす
る生体物質の重量分離用培地の製造方法：ａ、低密度の
第一の栄養培地を準備し、そのオスモル濃度を所望値に
調整する工程、 ｂ、高密度の第二の栄養培地を準備し、そのオスモル濃
度を該第一の栄養培地のオスモル濃度よりも低い値に調
整する工程、及びＣ１該第一及び第二の栄養培地を容器
内に入れ、底部において高密度及び低オスモル濃度を有
し、その頂部において低密度及び高オスモル濃度を有す
る重量分離手段を提供する工程、 を提供するものである。

以下の説明は分離方法に使用するための各種ミルク培地
の特別の調製方法に関するものである。

Ａ、殺菌 １、ニルボイラー内において２クオートのハーフ・アン
ド・ハーフ（ｈａｌｆ　＆　ｈａｌｆ、牛乳とクリーム
の混合物）を９２℃に加熱し、５〜１゜分毎に撹拌する
。

２　熱から取少出し、１０℃に冷却させる。

３、／−−７・アンド・ハーフの表面に生ずるバター脂
肪を除去する。

４、ハーフ・アンド・二・−７をガラスウールを通して
Ｆ遇する。

５、無菌の１０００−メスシリンダー中においてハーフ
・アンド・ハーフの容積を測定する。

ハーフ・アンド・ハーフを無菌プラスチック瓶に戻す。

６　工８１〜５を１クオートのホモジナイズされた（以
下ホモ）ミルクについて繰シ返す。

７１〜５の工程を半バインドのホイツピングクリームに
ついて繰シ返す。

８．２クオートのスキムミルクを次のようにして殺菌す
る： ａ、温度を９２℃にする、 ｂ、　９０℃に冷却する、 ｃ、９２℃に昇温する、 ｄ、工程ａ、ｂ及びｃを総時間１０分間において繰シ返
す。

９、工程２〜６を非−脂肪ミルクについて繰シ返す。

Ｂ、抗生物質の添加 １、殺菌及び濾過後１１次の抗生物質全各々のタイプの
培地に添加する： ３ｃｃ／ｌのペニシリン、 ３ｃｃ／ｌのストレプトマイシン、 １５ｃｃ／ｌのポリミキシムＢサルフェート。

２、　１００ｒＲ１のホモをグリセリン処理のために取
っておく。

３　抗生物質添加後０．２Ｆ／１００−の７ラクトース
を各タイプの培地に添加する。

４、容器を確実に栓をし、冷蔵する。

Ｃ，オスモル濃度 】　使用される各タイプのミルクのオスモル濃度を測定
する。

２、無菌蒸留水を次の値１て添加することＫよシ各タイ
プのミルクのオスモル濃度を調整スる： 非−脂肪２７８．５、ホモ２７９．５、ハーフ・アンド
・ハーフ２８０．５゜ オスモル濃度補正用の計算は下記の通シである： 調整に必要な蒸留水の容量を得るために最初のオスモル
濃度全目的オスモル濃度にょシ割シ、１．００を引き、
得られた結果にそのミルクの容量をかける。計算例： 初期オスモル濃度　　　　　　３０５ｍ／ａｌｌ容１ｍ
’　　　　　　１５００πを 目的オスモル濃度　　　　　　２７８ｍ／ｓ。

３、オスモル濃度が過剰になると補正するのが困難であ
るので常に計算量の蒸留水よりも少なく添加すること。

Ｄ、密度 １、各タイプのミルクの密度全測定する。密度はオスモ
ル濃度を調整後測定されるべきである。

２、ある特別の密度の培地が必要とされる場合には成分
培地の必要な襲を計算する。

計算例：リンス液培地 必要密度　　　　　１．０２８０ 成分　　　　　ハーフ・アンド・ハーフ及びホモハーフ
・アンド・ハーフ密度　　１．０２４０ホモ密度　　　
　　　　１．０３３０ ａ、各密度の５０％を取シそれらの積を加算する。

ｄ　ハフ　−／Ｓ７ドー　バー　７　＝　１．０２４０
　Ｘｏ、　５＝０．５１２０ａホ％　　　　　　　　＝
　１．０３３０Ｘ０．５＝０．５１６５１．０２Ｂ５ １．０２８５　カ５０％のハーフ・ハンド・ハーフ及び
５０チのホモを混合することにょシ得られた密度である
。

ｂ、この結果が所望よりもよシ重いものである場合には
よシ軽い密度のミルクの割合を増大せよ。

Ｃ０もしこの結果が所望よりも軽い場合には、よシ重い
密度のミルクの割合を増大せよ。

３　割算後に所望割合をメスシリンダーで測定し、−緒
に混合する。

４　よく混合し、２１℃における密度をチェックする。

５、密度が正しくない場合には、適当な培地の添加を試
行錯誤によシ調整する。

６　培地を無菌プラスチック瓶中に注ぐ。各実醗に対し
て新たな無菌瓶キャップを使用する。

各瓶を下記の如くラベルする： ａ、合宿される培地のタイプ（リンス液、低密度など）
、 ｂ、密度、 Ｃ，オスモル濃度、 ｄ、　日付。

７、作成される全てのタイプの培地に付、工程１〜６’
ｉ−繰シ返す。

８、次の表は各種培地の成分の饅割合の範囲を与えるも
のである。これらはフジクトース、抗生物質の添加及び
オスモル濃度の調整後の組み合わせに基づくものである
。

リンス液：　　１．０２８０　　　　増量液　　１．０
２７５５０〜７０チハー７・アンド・ハーフ　９２％ハ
ーフ・アンド・ハーフ３０〜５０％ホモ　　　　　　　
８％卵黄１０〜３０チホモ　　　　　　　　　２５〜１
０％５〜１０％ホイツピングクリーム密モル濃度が 設定後ホモジナイズされ なければならない。

Ｘ−低密度：　１．０２２０　　　　　特別高密度８０
〜９０％ハーフ・アンド・ハーフ　　１００％スキムミ
ルク１０〜２０チホイツピンククリーム 緩衝液 １００チ非−脂肪ミルク リンス液は分離を行う前にチューブを濯ぎ洗いするため
にのみ使用される。増量液は希釈剤として使用される。

その他の溶液は、上記本発明者の従来の特許に教示され
るように、密度勾配カラムをＦＡ製するために使用され
る。

上記操作に従い作成された所望の密度及びオスモル濃度
を有する溶液を使用して次の試鋏を行った。

オスモル濃度 Ａ、成る雄牛についての最適値からオスモル濃度を変化
させることの影響 精液はカーネーションジエネティックス（Ｃａｒｎａｔ
ｉｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）　　におけるホルスタイ
ン雄牛÷１２０４から３回異った日−１／２４／８３、
　］／３１／８３　　及び２／８／８３に採取した。こ
の精液を上記高密度及び低密度培地の混合物から作成し
た増量液中で稀釈した。表Ｉはその他の点においては同
一である用いられた培地の相違点を示すものである。

低密［２８０Ｍ／’オスモル　　２７８　Ｍ／オスモル
高ａＷ度　　２７８Ｍ／オスモル　　２７６Ｍ／オスモ
ル実験２　　対照例　　　実験例 低密度　　２８０Ｍ／オスモル　　　２８２Ｍ／オスモ
ル高密度２７８　’Ｐ／ｉ／オスモル　　　２８０　Ｍ
／オスモル実験３　　対照例　　　実験例 低密度　　２８０．０Ｍ／オスモル　　２７８Ｍ／オス
モル高密度　　２７８．１Ｍ／オスモル　　２８０Ｍ／
オスモル試料は洛ロットの精液から抜き出されて対照例
として作用させた。

精液の分離は上記本発明者の従来特許に示される密度勾
配法を用いて試みられた。

完全な分離操作に従い各実験から得られた対照例及び分
離例の精液はグリセリン処理され、液体窒素中に凍結さ
れた。

各実験からの精液を次いで解凍し、細胞容量を測定し、
対比した。過去における経験は特定の組合わせの条件下
に測定した場合には次の様に挙動した。即ち、雌の仔ウ
シを産んだものは産まなかったものに対比して有意的に
より大きな容量を繰シ返し示した。例えば、未分離の対
照例からの２つの試料は大きさの相違を示さない。雌分
離精液からの試料はフィールド試験によシ常に分離され
なかったものよりも容量が多いものであることが示され
た。

上記＊、ｌ、（１）ｆｉウシ１２０４についてはオヌモ
ル濃度が範ｕＩＪを越える場合或いは通常の逆浸透圧勾
配が反対にされると分離の起こる度合いが低くなること
を示している。

（２）範囲の減少は分離を僅かに厖大させる。

従って、この雄ウシに対する最適範囲は２７８〜２８０
ｍ／オス上２８０ｍ度の培地及び２７６〜２７８ｍ／オ
ス上２７８ｍ度の培地であるように思われる。

Ｂ、各雄ウシについて同一の浸透圧範囲を用いた場合の
影響 精液をＪ（ｌｉウシ２１９から６回異った日に集め、他
の全一〇の条件は等しく保って各種浸透圧範囲において
実験を行った。下記の表■は結果の要約を示すものであ
る。

これ迄の上記証拠は雄ウシ２１９は雄１２０４よすもカ
ラム中のよシ低いオスモル濃度設定を必要とすることを
示す傾向がある。即ち、カラム内のオスモル濃度は各雄
ウシに対して別々の因子であるように思われる。現時点
において、これが秀節の変化と共に変化するか否かは知
られていない。

上記観察は全ての雄ウシの精細胞が同一の浸透圧要請金
有するということは極めて６Ｄそうにもないことである
という事実に照らしても正当であるように思われる。

本発明は主としてウシの精液の分離について開発された
ものであるが、それは重量分離によシ分離或いは分別す
ることのできる任意の細胞状生体物質に適用することが
出来るものである。

１、事件の表示 特願昭６０−８０４３４号 ２、発明の名称 精液分離方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏　名　ウォーレス　シュリンブトン ４、代理人 〒１０７　　東京都港区赤坂２丁目２番２１号６、補正
の対象 （１）明細書全文の浄書（但し、内容についての変更は
なし１）（２）委任状及び訳文 ７、補正の内容 別紙の通り ８、添付書類

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｘ精液及びＹ精液を表現型により、精液が容器の底
   部において高密度を有する栄養培地内に懸濁される密度
   分離方法において分離する方法において、該容器内にオ
   スモル濃度勾配を維持することを特徴とする方法。 ２、培地の底部に比較的低いオスモル濃度を与え、その
   頂部に比較的高い濃度を与えることにより逆オスモル濃
   度が維持される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、下記工程を含んでなることを特徴とする生体物質の
   重量分離用培地の製造方法： ａ、低密度の第一の栄養培地を準備し、そのオスモル濃
   度を所望値に調整する工程、 ｂ、高密度の第二の栄養培地を準備し、そのオスモル濃
   度を該第一の栄養培地のオスモル 濃度よりも低い値に調整する工程、及び ｃ、該第一及び第二の栄養培地を容器内に入れ、底部に
   おいて高密度及び低オスモル濃度を 有し、その頂部において低密度及び高オスモル濃度を有
   する重量分離手段を提供する工程。 ４、生体物質が精液である特許請求の範囲第３項記載の
   方法。 ５、底部において高密度及び頂部において低密度を有し
   、且つ底部において低オスモル濃度及び頂部において高
   オスモル濃度を有することを特徴とする精液の重量分離
   用培地。