JPS61242575A - Ｇ４１８耐性ヒト−バ−キツトリンパ腫由来細胞 - Google Patents
Ｇ４１８耐性ヒト−バ−キツトリンパ腫由来細胞Info
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- JPS61242575A JPS61242575A JP60084542A JP8454285A JPS61242575A JP S61242575 A JPS61242575 A JP S61242575A JP 60084542 A JP60084542 A JP 60084542A JP 8454285 A JP8454285 A JP 8454285A JP S61242575 A JPS61242575 A JP S61242575A
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- cell
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒト−バーキットリンパ腫に由来し、人為的
に６４１８耐性が付与された細胞に関する。
に６４１８耐性が付与された細胞に関する。
細胞融合技術〔ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）、 ２５
６゜４９５ （１９７５））が紹介されて以来、この技
術を応用して種々のモノクローナル抗体が造成されてい
る。
６゜４９５ （１９７５））が紹介されて以来、この技
術を応用して種々のモノクローナル抗体が造成されてい
る。
そしてこの技術は、一般に、腫瘍細胞と抗体産生細胞と
を細胞融合剤存在下で融合させたのち、所望のモノクロ
ーナル抗体を産生ずる継代培養可能な細胞（ハイブリド
ーマ）を得るという方法である（例えば、特開昭５９−
２９６２２号公報等）。そしてこの方法によってヒト型
のモノクローナル抗体を造成するには、（１）マウス、
ラット等の実験動物のミエローマ細胞株とヒト型の抗体
産生細胞とを融合せしめてハイブリドーマを得、これを
培養して所望の抗体を得る方法、及び（２）ヒトのミエ
ローマ細胞株とヒト型の抗体産生細胞とを融合せしめて
ハイブリドーマを得、これを培養して所望の抗体を得る
方法がある。しかしながら、（１）の方法は、得られた
ハイブリドーマにおいてヒトの染色体が経時的に脱落し
て抗体産生能を喪失し、抗体産生能の維持が極めて困難
であるという問題点を有する。また（２）の方法におい
ては、細胞融合効率が低く、しかも融合に使用し得る細
胞の種類も限定されるところから所望のモノクローナル
抗体の十分な供給ができないという問題点がある。
を細胞融合剤存在下で融合させたのち、所望のモノクロ
ーナル抗体を産生ずる継代培養可能な細胞（ハイブリド
ーマ）を得るという方法である（例えば、特開昭５９−
２９６２２号公報等）。そしてこの方法によってヒト型
のモノクローナル抗体を造成するには、（１）マウス、
ラット等の実験動物のミエローマ細胞株とヒト型の抗体
産生細胞とを融合せしめてハイブリドーマを得、これを
培養して所望の抗体を得る方法、及び（２）ヒトのミエ
ローマ細胞株とヒト型の抗体産生細胞とを融合せしめて
ハイブリドーマを得、これを培養して所望の抗体を得る
方法がある。しかしながら、（１）の方法は、得られた
ハイブリドーマにおいてヒトの染色体が経時的に脱落し
て抗体産生能を喪失し、抗体産生能の維持が極めて困難
であるという問題点を有する。また（２）の方法におい
ては、細胞融合効率が低く、しかも融合に使用し得る細
胞の種類も限定されるところから所望のモノクローナル
抗体の十分な供給ができないという問題点がある。
なお、細胞融合技術を応用せず、常法に従って抗体産生
ヒトＢリンパ球を得、これをエプスタイン−バール−ウ
イルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ（ＥＢ
Ｖ））で形質転換して特定の抗原に対する抗体産生株を
樹立し、所望の抗体を得るという方法も考えられるが、
一般にこのような抗体産生株はクローニングが困難であ
り、抗体産生能が急速に低下する等の問題点を有する。
ヒトＢリンパ球を得、これをエプスタイン−バール−ウ
イルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ（ＥＢ
Ｖ））で形質転換して特定の抗原に対する抗体産生株を
樹立し、所望の抗体を得るという方法も考えられるが、
一般にこのような抗体産生株はクローニングが困難であ
り、抗体産生能が急速に低下する等の問題点を有する。
従ってこのような問題に対処すべく、まず、ＥＢＶでヒ
トＢリンパ球を形質転換させ〔ネイチュア−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、 ２６９．４２０ （１９７７） ｊ、特定の
抗原に対する抗体産生株を一度樹立し、さらにこの株と
ヒト腫瘍細胞とを融合させ、もとの細胞株よりも安定で
しかも抗体を大量に産生ずるバイブリド−マを作製する
方法が考えられる。しかしながらこのようにＥＢＶで形
質転換され造成された抗体産生細胞はＩＩＡＴ培地中で
も増殖可能なため、このような抗体産生細胞とハイブリ
ドーマとを常法に従ってＩＩＡＴ培地中で識別すること
はできない。
トＢリンパ球を形質転換させ〔ネイチュア−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、 ２６９．４２０ （１９７７） ｊ、特定の
抗原に対する抗体産生株を一度樹立し、さらにこの株と
ヒト腫瘍細胞とを融合させ、もとの細胞株よりも安定で
しかも抗体を大量に産生ずるバイブリド−マを作製する
方法が考えられる。しかしながらこのようにＥＢＶで形
質転換され造成された抗体産生細胞はＩＩＡＴ培地中で
も増殖可能なため、このような抗体産生細胞とハイブリ
ドーマとを常法に従ってＩＩＡＴ培地中で識別すること
はできない。
従ってこのような場合に所望のハイブリドーマを得るに
は、上記ＥＢＶで形質転換された抗体産生細胞と融合さ
せる腫瘍細胞として、新たなマーカーが導入された細胞
が必要であり、現在、このような細胞の提供が望まれて
いるところである。
は、上記ＥＢＶで形質転換された抗体産生細胞と融合さ
せる腫瘍細胞として、新たなマーカーが導入された細胞
が必要であり、現在、このような細胞の提供が望まれて
いるところである。
従ってこの発明は、ＥＢＶで形質転換された抗体産生細
胞と、該抗体産生細胞と腫瘍細胞との細胞融合によって
形成されたハイブリドーマとを区別することができるマ
ーカーが導入された腫瘍細胞を提供しようとするもので
ある。
胞と、該抗体産生細胞と腫瘍細胞との細胞融合によって
形成されたハイブリドーマとを区別することができるマ
ーカーが導入された腫瘍細胞を提供しようとするもので
ある。
上記の問題点は、次の性質、すなわち
（１） ヒト−バーキットリンパ腫と大腸菌プロトプ
ラストとの融合に由来する； ＋２１ Ｇ４１８に対して耐性を有する；４３１
ＥＢＶにより形質転換された抗体産生細胞と融合するこ
とができる； を有する細胞を提供することにより解決される。
ラストとの融合に由来する； ＋２１ Ｇ４１８に対して耐性を有する；４３１
ＥＢＶにより形質転換された抗体産生細胞と融合するこ
とができる； を有する細胞を提供することにより解決される。
なお、Ｇ４１８はゲンタマイシン、ネオマイシン及びナ
マイシンに類似する構造を有するアミノグリコシド系抗
生物質である。
マイシンに類似する構造を有するアミノグリコシド系抗
生物質である。
一般に、永続的に増殖することが出来且つ特定のモノク
ローナル抗体を産生ずることができるハイブリドーマを
得るための、抗体産生細胞の融合の相手細胞は、それ自
体として永続的に増殖することができ、単独では特定の
抗体を産生せず、且つ抗体産生細胞と融合することがで
きるものでなければならない。さらに、抗体産生細胞の
融合の相手細胞は、該抗体産生細胞が有していないマー
カーを有し、該抗体産生細胞と該マーカーを伝達された
ハイブリドーマとの間の識別を可能にするものでなけれ
ばならない。この様な条件を満たす細胞を得るため、本
発明においてはヒト−バーキットリンパ腫から誘導され
た融合可能細胞と、ネオマイシン耐性プラスミドを含有
する大腸菌プロトプラストとを融合せしめることにより
人為的に６４１８耐性を付与する。
ローナル抗体を産生ずることができるハイブリドーマを
得るための、抗体産生細胞の融合の相手細胞は、それ自
体として永続的に増殖することができ、単独では特定の
抗体を産生せず、且つ抗体産生細胞と融合することがで
きるものでなければならない。さらに、抗体産生細胞の
融合の相手細胞は、該抗体産生細胞が有していないマー
カーを有し、該抗体産生細胞と該マーカーを伝達された
ハイブリドーマとの間の識別を可能にするものでなけれ
ばならない。この様な条件を満たす細胞を得るため、本
発明においてはヒト−バーキットリンパ腫から誘導され
た融合可能細胞と、ネオマイシン耐性プラスミドを含有
する大腸菌プロトプラストとを融合せしめることにより
人為的に６４１８耐性を付与する。
散査可徹狙胆■遺戚
６４１８耐性を付与するための親細胞は、例えばヒト−
バーキットリンパ腫から分離されたリンパ芽球の中から
、抗体産生細胞と融合することができる細胞を分離する
ことによって得られる。このような細胞として、例えば
ＮＡＴ−３０と命名された細胞を用いることができ、こ
の細胞は次の様な性質を有する。
バーキットリンパ腫から分離されたリンパ芽球の中から
、抗体産生細胞と融合することができる細胞を分離する
ことによって得られる。このような細胞として、例えば
ＮＡＴ−３０と命名された細胞を用いることができ、こ
の細胞は次の様な性質を有する。
（１） ヒト由来の抗体産生細胞と融合することがで
き； （２１４Ｘ１０−７Ｍのアミノプテリンに感受性であり
； （３１ＩＩ Ａ Ｔ培地に感受性である。
き； （２１４Ｘ１０−７Ｍのアミノプテリンに感受性であり
； （３１ＩＩ Ａ Ｔ培地に感受性である。
ＮＡＴ−３０細胞は次のようにして造成することができ
る。まず、ヒト−バーキットリンパ腫細胞を６−チオグ
アニン（６−ＴＧ）含有培地（ＴＩＰＭＴ−１６４０培
地：ダルベソコ変法ＭＥＭ培地：Ｆ１２培地−２：１
： １ （１０％生胎児血清（（Ｉ’Ｃ３） ）含）
〕で生育させ順次６−ＴＧの濃度を上げ最終的に６−Ｔ
Ｇ？ｉ度３０ｔｔｇ、／ｍｌｌ含有培地で生育する細胞
を得る。なお、この具体的な方法は実施例１に詳細に記
載する。
る。まず、ヒト−バーキットリンパ腫細胞を６−チオグ
アニン（６−ＴＧ）含有培地（ＴＩＰＭＴ−１６４０培
地：ダルベソコ変法ＭＥＭ培地：Ｆ１２培地−２：１
： １ （１０％生胎児血清（（Ｉ’Ｃ３） ）含）
〕で生育させ順次６−ＴＧの濃度を上げ最終的に６−Ｔ
Ｇ？ｉ度３０ｔｔｇ、／ｍｌｌ含有培地で生育する細胞
を得る。なお、この具体的な方法は実施例１に詳細に記
載する。
６４１８を主 胞の′告
本発明においては、前記ヒト−バーキットリンパ腫に由
来する融合可能細胞を、ネオマイシン耐性プラスミドを
含有する大腸菌プロトプラストと融合剤の存在下で細胞
融合せしめることにより、前記ヒト−バーキットリンパ
腫由来細胞に６４１８耐性を付与する。ネオマイシン及
びＧ４１８はいずれもアミノグリコシド系抗生物質であ
り、宿主にネオマイシン耐性を付与することができる前
記プラスミドは宿主に６４１８耐性をも付与することが
できるので、前記の細胞融合によって大腸菌からヒト−
バーキットリンパ腫由来細胞に移行したプラスミドが該
ヒト−バーキットリンパ腫由来細胞に６４１８耐性を付
与するものと考えられる。
来する融合可能細胞を、ネオマイシン耐性プラスミドを
含有する大腸菌プロトプラストと融合剤の存在下で細胞
融合せしめることにより、前記ヒト−バーキットリンパ
腫由来細胞に６４１８耐性を付与する。ネオマイシン及
びＧ４１８はいずれもアミノグリコシド系抗生物質であ
り、宿主にネオマイシン耐性を付与することができる前
記プラスミドは宿主に６４１８耐性をも付与することが
できるので、前記の細胞融合によって大腸菌からヒト−
バーキットリンパ腫由来細胞に移行したプラスミドが該
ヒト−バーキットリンパ腫由来細胞に６４１８耐性を付
与するものと考えられる。
前記ネオマイシン耐性プラスミドを含有する大腸菌とし
ては、例えばネオマイシン耐性プラスミドＰＳＶ２１１
１１０ ％ ｆ’５Ｖ３ｎｅｏ又は、ｐｓＶｓｎｅｏを
含有するＥ、コリ （Ｅ、ｃｏｌｉ） ）ＩＢＩＯＩを
挙げることができ、この菌株はＢＲＬ社から市販されて
いる。
ては、例えばネオマイシン耐性プラスミドＰＳＶ２１１
１１０ ％ ｆ’５Ｖ３ｎｅｏ又は、ｐｓＶｓｎｅｏを
含有するＥ、コリ （Ｅ、ｃｏｌｉ） ）ＩＢＩＯＩを
挙げることができ、この菌株はＢＲＬ社から市販されて
いる。
この発明による６４１８耐性細胞の造成は、（Ａ）前記
耐性プラスミドを含有する大腸菌をプロトプラスト化し
、（Ｂ）このプロトプラストと、ヒト−バーキットリン
パ腫由来細胞とを融合剤の存在下で融合せしめ、そして
（Ｃ）この融合処理細胞を６４１８を含有する培地中で
培養し、生育する細胞を選択することにより行うことが
できる。これらの各工程はそれ自体公知の技術であり、
そして例えばメンズ・イン・エンチモロジー（ＭＥＴＨ
ＯＤＳ ＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）、１０１．４０２
（１９８３） 、アカデミツク・プレス刊に記載され
ている一般的方法を応用することにより実施することが
できる。
耐性プラスミドを含有する大腸菌をプロトプラスト化し
、（Ｂ）このプロトプラストと、ヒト−バーキットリン
パ腫由来細胞とを融合剤の存在下で融合せしめ、そして
（Ｃ）この融合処理細胞を６４１８を含有する培地中で
培養し、生育する細胞を選択することにより行うことが
できる。これらの各工程はそれ自体公知の技術であり、
そして例えばメンズ・イン・エンチモロジー（ＭＥＴＨ
ＯＤＳ ＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）、１０１．４０２
（１９８３） 、アカデミツク・プレス刊に記載され
ている一般的方法を応用することにより実施することが
できる。
次に各工程を説明する。 、
（Ａ）大腸菌のプロトプラスト化
細胞内へ導入したいプラスミドを具備する大腸菌をリゾ
チームおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処
理することによりプロトプラスト化した大腸菌を得るこ
とができる。このような方法は例えばメトド・イン・セ
ル・バイオロジー（Ｍｅｔｈ。
チームおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処
理することによりプロトプラスト化した大腸菌を得るこ
とができる。このような方法は例えばメトド・イン・セ
ル・バイオロジー（Ｍｅｔｈ。
Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）、２０，１４１〜１４８ （１
９７８）、ジャーナル・オブ・ハタテリオロジー（Ｊ、
Ｂａｃｔ、）、￥２８．６６８（１９７６）を参照す
ることができる。
９７８）、ジャーナル・オブ・ハタテリオロジー（Ｊ、
Ｂａｃｔ、）、￥２８．６６８（１９７６）を参照す
ることができる。
（Ｂ）細胞融合
この工程は、上記プロトプラスト化された細胞とヒト−
バーキットリンパ腫由来細胞とを細胞融合剤の存在下で
共存せしめることにより行う、ことができる。細胞融合
剤としては、例えば分子量１５００〜６０００のポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）を４０〜５０％の濃度で使
用することができる。この工程は、例えばメトズ・イン
・エンチモロジー（ＭＥＴＩＩＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹ
ＭＯＬＯＧＹ） 、前掲、に記載されている方法により
行うことができる。
バーキットリンパ腫由来細胞とを細胞融合剤の存在下で
共存せしめることにより行う、ことができる。細胞融合
剤としては、例えば分子量１５００〜６０００のポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）を４０〜５０％の濃度で使
用することができる。この工程は、例えばメトズ・イン
・エンチモロジー（ＭＥＴＩＩＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹ
ＭＯＬＯＧＹ） 、前掲、に記載されている方法により
行うことができる。
（Ｃ） Ｇ４１８耐性細胞の取得
本発明に係る細胞は、Ｇ４１８耐性のものである。
従って上記操作で得られた融合細胞を薬剤６４１８含有
培地中で生育させ、この培地中でコロニーを形成する細
胞を取得することにより６４１８耐性細胞を得ることが
できる。
培地中で生育させ、この培地中でコロニーを形成する細
胞を取得することにより６４１８耐性細胞を得ることが
できる。
６４１８耐性細胞の特性
本発明のＧ４１８耐性細胞の１例であるＧ４１８酎性Ｎ
ＡＴ−３０細胞は、親細胞であるＮＡＴ〜３０細胞に６
４１８耐性を付与したものであり、次のような性質を有
する。
ＡＴ−３０細胞は、親細胞であるＮＡＴ〜３０細胞に６
４１８耐性を付与したものであり、次のような性質を有
する。
（１）抗体産生細胞、例えばヒト−由来の、ＦＢＶで形
質転換された抗体産生細胞と融合し、永続的な増殖及び
安定したモノクローナル抗体の産生が可能なハイブリド
ーマを形成することができる。
質転換された抗体産生細胞と融合し、永続的な増殖及び
安定したモノクローナル抗体の産生が可能なハイブリド
ーマを形成することができる。
Ｔ２１ ８００μｇ／ｍＡの６４１８の存在下で増殖す
ることができ、親細胞であるＮＡＴ−３０細胞に比べて
６４１８に対する耐性が約２〜４倍増強されている。
ることができ、親細胞であるＮＡＴ−３０細胞に比べて
６４１８に対する耐性が約２〜４倍増強されている。
（３］ ４Ｘ１０−’Ｍのアミノプテリンに感受性で
ある。
ある。
＋４＋ Ｉｔ Ａ Ｔ培地に感受性である。
さらに次のようにな培養特性を有する。
［５） ＰＲ旧−１６４０培地〔１０％ウシ−胎児血
清（Ｆｅ２）含有培地中での増殖速度は、細胞倍化時間
（ＰＤＴ）が２０〜２５時間である。
清（Ｆｅ２）含有培地中での増殖速度は、細胞倍化時間
（ＰＤＴ）が２０〜２５時間である。
＋６１ ＴＭＤＭ培地（１０％ＦＣ３含有）で良好に
増殖し、団聞培地〔２０％ＦＣＳ 、１０％ＤＭＳＯ（
ジメチルスルホキシド）含有〕が保存用凍結培地として
適当である。
増殖し、団聞培地〔２０％ＦＣＳ 、１０％ＤＭＳＯ（
ジメチルスルホキシド）含有〕が保存用凍結培地として
適当である。
（７） フィーダー細胞を添加しないで十分にクロー
ニングすることができる。
ニングすることができる。
〔発明の効果〕
本発明の細胞は６４１８而１性を有する腫瘍細胞である
。従ってＥＢＶでヒトＢリンパ球を形質転換させ、特定
の抗原に対するモノクローナル抗体産生株を樹立したの
ち、この細胞と本発明の６４１８耐性細胞との融合を行
い、つづく所望抗体産生細胞の選択が可能となる。すな
わち所望抗体産生細胞の選択培地にＧ４１８を添加する
ことにより効率よく所望抗体産生細胞を取得することが
できる。
。従ってＥＢＶでヒトＢリンパ球を形質転換させ、特定
の抗原に対するモノクローナル抗体産生株を樹立したの
ち、この細胞と本発明の６４１８耐性細胞との融合を行
い、つづく所望抗体産生細胞の選択が可能となる。すな
わち所望抗体産生細胞の選択培地にＧ４１８を添加する
ことにより効率よく所望抗体産生細胞を取得することが
できる。
次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
実施炎上 反紅］側グ巌戊
先ずナマルバ細胞（大日本製薬）を４５℃で、０．２５
％寒天を含むダルベコ改質培地＋１０％ＦＣ５添加血清
培地にｌＸＩＯ３個／ ｍ Ｒの細胞濃度で浮遊させ、
５ｃｍシャーレにその５ｍ７！を取り、３７゛Ｃで５％
炭酸ガス及び９５％空気のインキュヘータ内にて３週間
培養した。その後生育したクローン９０個を１つずつ９
６ウエル（１ウエルにつき２００μｐの培地）取り出し
、寒天を含まない上記血清培地中で、同様にして２週間
培養した。抗体産性能のない株を選択する目的から、各
ウェルの培養上清をとりエンザイムイムノアソセイ （
カッベル社）によりその上清中の抗体量の測定を行なっ
た。その結果抗体の全く検出されなかった細胞株７株を
選び、９６ウエル中で充分に増殖させた。
％寒天を含むダルベコ改質培地＋１０％ＦＣ５添加血清
培地にｌＸＩＯ３個／ ｍ Ｒの細胞濃度で浮遊させ、
５ｃｍシャーレにその５ｍ７！を取り、３７゛Ｃで５％
炭酸ガス及び９５％空気のインキュヘータ内にて３週間
培養した。その後生育したクローン９０個を１つずつ９
６ウエル（１ウエルにつき２００μｐの培地）取り出し
、寒天を含まない上記血清培地中で、同様にして２週間
培養した。抗体産性能のない株を選択する目的から、各
ウェルの培養上清をとりエンザイムイムノアソセイ （
カッベル社）によりその上清中の抗体量の測定を行なっ
た。その結果抗体の全く検出されなかった細胞株７株を
選び、９６ウエル中で充分に増殖させた。
増殖した細胞株をそれぞれ２４ウエル（１ウエルにつき
１．５ｍｌ１の培地）、５ｃｍシャーレ（１枚につき５
ｍｆｆの培地）の順に用いて培養液量を増加していき、
約５Ｘ１０’細胞ずつを得た。それぞれの株について３
Ｘ］、Ｏ’細胞を残し、他の細胞を、新しく調製した」
−記血清培地１５ｍｊ！に浮遊させ、＝５℃で凍結後室
温で融解するという凍結・融解操作を２回繰り返し細胞
を死滅させた。この死滅細胞を含む培地５ｍρを３枚の
５ｃｍシャーレに移し、死滅させずに残しておいた細胞
をそれぞれｌＸｌ０’細胞ずつ移植した。上記と同様に
５日間培養すると大部分の細胞は死滅するが、その中の
生き残った細胞を遠心により集めそれぞれの株について
、９６ウエルプレート３０ウエルに移植した。４〜６日
毎に培地を交換しつつ３週間培養した結果、増殖のみら
れた株は上記７株中２株についてであった。２株につい
て、増殖速度の速い５個ずつのウェルの細胞を上記の順
に培養液量を増加し、それぞれ約ｌＸｌ０６細胞を得た
。それぞれの細胞を別々に遠沈により集め、１回ダルベ
コ改質培地にて洗い、無血清培地（ＴＴＥＳ培地）５ｍ
７！にそれぞれ浮遊させた。上記と同様に４週間、４〜
６日毎に培地を換え培養した。この無血清培地での培養
で増殖速度の早いものから３種類の細胞を選び、充分に
増殖させて約１×１０７個ずつの細胞を得た。こ−れら
をそれぞれ３μｇ ／ ｍ ＩＩの６−ＴＧを含む上記
血清培地ＩＱｍｊ！に浮遊させ、４日毎に培地を交換し
つつ４週間培養した。その後生存細胞を取り出し、３０
℃ｇ／ｍｌｌの６−ＴＧを含む同一培地に１×１０５個
／ ｍ （ｌ ｆ７４度となるように浮遊させ、上記と
同様に４週間培養した。このようにして２株の６−ＴＧ
耐性株を得た。キ壬搾揮ｉモ鴫禰ｉｉ謎４ｈこの株をＮ
ＡＴ −３０と命名した。この株は３０℃ｇ／ｍβの６
−ＴＧを含む上記血清培地及び無血清培地にて強い増殖
を示し、それらの培地で継代培養により維持されている
。
１．５ｍｌ１の培地）、５ｃｍシャーレ（１枚につき５
ｍｆｆの培地）の順に用いて培養液量を増加していき、
約５Ｘ１０’細胞ずつを得た。それぞれの株について３
Ｘ］、Ｏ’細胞を残し、他の細胞を、新しく調製した」
−記血清培地１５ｍｊ！に浮遊させ、＝５℃で凍結後室
温で融解するという凍結・融解操作を２回繰り返し細胞
を死滅させた。この死滅細胞を含む培地５ｍρを３枚の
５ｃｍシャーレに移し、死滅させずに残しておいた細胞
をそれぞれｌＸｌ０’細胞ずつ移植した。上記と同様に
５日間培養すると大部分の細胞は死滅するが、その中の
生き残った細胞を遠心により集めそれぞれの株について
、９６ウエルプレート３０ウエルに移植した。４〜６日
毎に培地を交換しつつ３週間培養した結果、増殖のみら
れた株は上記７株中２株についてであった。２株につい
て、増殖速度の速い５個ずつのウェルの細胞を上記の順
に培養液量を増加し、それぞれ約ｌＸｌ０６細胞を得た
。それぞれの細胞を別々に遠沈により集め、１回ダルベ
コ改質培地にて洗い、無血清培地（ＴＴＥＳ培地）５ｍ
７！にそれぞれ浮遊させた。上記と同様に４週間、４〜
６日毎に培地を換え培養した。この無血清培地での培養
で増殖速度の早いものから３種類の細胞を選び、充分に
増殖させて約１×１０７個ずつの細胞を得た。こ−れら
をそれぞれ３μｇ ／ ｍ ＩＩの６−ＴＧを含む上記
血清培地ＩＱｍｊ！に浮遊させ、４日毎に培地を交換し
つつ４週間培養した。その後生存細胞を取り出し、３０
℃ｇ／ｍｌｌの６−ＴＧを含む同一培地に１×１０５個
／ ｍ （ｌ ｆ７４度となるように浮遊させ、上記と
同様に４週間培養した。このようにして２株の６−ＴＧ
耐性株を得た。キ壬搾揮ｉモ鴫禰ｉｉ謎４ｈこの株をＮ
ＡＴ −３０と命名した。この株は３０℃ｇ／ｍβの６
−ＴＧを含む上記血清培地及び無血清培地にて強い増殖
を示し、それらの培地で継代培養により維持されている
。
こメζ□力令ｉごじ１Ｖニ？１ Ｇ４１８ ＮＡＴ
−３０細包の告（Ａ）大腸菌のプロトプラスト化 ルリアブロス培地５００ｍｐ中でｐＳＶ：＋、、ｓｏを
含むＥ、ｃｏｌｉ ＩＩＢＩＯＩ （ＢＲＩ、社）を０
Ｄ４ＳＯｒ＋ｍが０．５になるまで培養したのちクロラ
ムフェニコール（最終濃度２０μｇ／ｍｊりを加えさら
に２時間培養を行った。培養終了後培養液５００ｍ７！
を遠心（５０００×■、１０分間）することとより集菌
した。ついで、得られた細胞を１０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（以下Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！ ）（ｐＨ８，０） ５０
ｍ＃で２回洗浄後、遠心（５０００ｘ ｇ 、 １０
分間）により細胞（ベレット）を得た。ついで、このベ
レットに２０％ショ糖含有０、１ ＭＴｒｉｓ−１１ｃ
Ｊ （ｐＨ８，０）を加え、３７℃に加温したのちフラ
スコ（２００ｒｒｌ ）中で攪拌するとともに、リゾチ
ーム２ｍｇ／ｍｊ！ （シグマ社）２．５ｒｒｌを加
えさらに１２分間培養を行った。
−３０細包の告（Ａ）大腸菌のプロトプラスト化 ルリアブロス培地５００ｍｐ中でｐＳＶ：＋、、ｓｏを
含むＥ、ｃｏｌｉ ＩＩＢＩＯＩ （ＢＲＩ、社）を０
Ｄ４ＳＯｒ＋ｍが０．５になるまで培養したのちクロラ
ムフェニコール（最終濃度２０μｇ／ｍｊりを加えさら
に２時間培養を行った。培養終了後培養液５００ｍ７！
を遠心（５０００×■、１０分間）することとより集菌
した。ついで、得られた細胞を１０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（以下Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！ ）（ｐＨ８，０） ５０
ｍ＃で２回洗浄後、遠心（５０００ｘ ｇ 、 １０
分間）により細胞（ベレット）を得た。ついで、このベ
レットに２０％ショ糖含有０、１ ＭＴｒｉｓ−１１ｃ
Ｊ （ｐＨ８，０）を加え、３７℃に加温したのちフラ
スコ（２００ｒｒｌ ）中で攪拌するとともに、リゾチ
ーム２ｍｇ／ｍｊ！ （シグマ社）２．５ｒｒｌを加
えさらに１２分間培養を行った。
そして、これにＯ，ｌ ＭＥＤＴＡ ５ ｍ Ｒを力■
えさらに１０分間攪拌したのち、１０％ショ糖、１０ｍ
ＭＭｇＣｈおよび０．２μｇ／ｍｌ１ＤＮＡ、、、
Ｉ （シグマ社）および１０ ｍ ＭＨＥＰＥＳ（シ
グマ社）含有ダルベツコｉ法ＭＥＭ培地２００ｍ＃を加
えた。ついでこの懸濁液を遠心（’５０００Ｘｇ、１０
分間）しプロトプラスト化したＥ、コリＩＩＢＩＯＩを
回収したのち、１０％シ、平唐、ｌ Ｏｍ ＭＭｇＣｈ
、０．２μｇ／ｍｊ！ ＤＮＡａｓａ Ｉ含有［Ｉ
ＭＥＭ培地に懸濁した（プロトプラスト懸Ｓ液）。
えさらに１０分間攪拌したのち、１０％ショ糖、１０ｍ
ＭＭｇＣｈおよび０．２μｇ／ｍｌ１ＤＮＡ、、、
Ｉ （シグマ社）および１０ ｍ ＭＨＥＰＥＳ（シ
グマ社）含有ダルベツコｉ法ＭＥＭ培地２００ｍ＃を加
えた。ついでこの懸濁液を遠心（’５０００Ｘｇ、１０
分間）しプロトプラスト化したＥ、コリＩＩＢＩＯＩを
回収したのち、１０％シ、平唐、ｌ Ｏｍ ＭＭｇＣｈ
、０．２μｇ／ｍｊ！ ＤＮＡａｓａ Ｉ含有［Ｉ
ＭＥＭ培地に懸濁した（プロトプラスト懸Ｓ液）。
（Ｂ）細胞融合
プロトプラスト懸濁液２’５ｍｆｆとＩＭ叶培地（１０
χＦＣ５含）中で培養したＮＡＴ−３０細胞２Ｘ１０６
個（予めＤＭＥＭ培地で２回洗浄）とを混合したのち、
遠心（１５０Ｘｇ、１５分間）しベレットを得、ついで
これに５０％ＰＥＧ１ｒｒｌを加えたのち３７℃で５分
間放置した。ついで４０ｒｒ＋７！のＩＭＤｌ’！培地
（１０％ＦＣ５含）（ヘーリンガーマンハイム社）を徐
々に加えたのち遠心 （１５０ｘｇ、１５分間）して細
胞を集めた。
χＦＣ５含）中で培養したＮＡＴ−３０細胞２Ｘ１０６
個（予めＤＭＥＭ培地で２回洗浄）とを混合したのち、
遠心（１５０Ｘｇ、１５分間）しベレットを得、ついで
これに５０％ＰＥＧ１ｒｒｌを加えたのち３７℃で５分
間放置した。ついで４０ｒｒ＋７！のＩＭＤｌ’！培地
（１０％ＦＣ５含）（ヘーリンガーマンハイム社）を徐
々に加えたのち遠心 （１５０ｘｇ、１５分間）して細
胞を集めた。
ついでこの細胞をクロラムフェニコール２０μ［／ｍβ
含有ＩＭＤＭ培地（１０％ＦＣ５含）１００ｒｌ！に懸
濁したのち、９６ウエルのプレート（ファルコン社）に
まいて培養を行った。
含有ＩＭＤＭ培地（１０％ＦＣ５含）１００ｒｌ！に懸
濁したのち、９６ウエルのプレート（ファルコン社）に
まいて培養を行った。
（Ｃ）Ｇ４１８耐性細胞の取得
９６ウエルのプレートで培養開始後６日目に細胞増殖が
認められたので４００μｇ７ｍｌの濃度のＧＥＮＥＴＩ
ＣＩＮ （Ｇ４１Ｂ−５ｕｌｔａｔｅ）（ＧＩＢＣＯ社
）を加えさらに培養を続けた。そして９６ウエル中１１
ウエルでコロニーが形成され、これらのウェル中から６
４１８耐性ＮＡＴ−３０細胞を取得した。
認められたので４００μｇ７ｍｌの濃度のＧＥＮＥＴＩ
ＣＩＮ （Ｇ４１Ｂ−５ｕｌｔａｔｅ）（ＧＩＢＣＯ社
）を加えさらに培養を続けた。そして９６ウエル中１１
ウエルでコロニーが形成され、これらのウェル中から６
４１８耐性ＮＡＴ−３０細胞を取得した。
なお、ここで得られた細胞をＧ４１８（８００，ｌｊｇ
／ｒｒ＋７！ ）含有ＩＭＤＭ培地（１０％ＦＣ５含）
で生育させたときの細胞の生育状態を第１図に示す。
／ｒｒ＋７！ ）含有ＩＭＤＭ培地（１０％ＦＣ５含）
で生育させたときの細胞の生育状態を第１図に示す。
図中破線（＝−−−−−−）はＧ４１８を含まない培地
で培養したときの結果を示し、実線（□）はＧ４１８を
含有する培地で培養したときの結果を示す。また・は対
照としてＮＡＴ−３０細胞の生育状態を示し、○はＧ４
１８耐性ＮＡＴ−３０細胞の生育状態を示す。この結果
より上記の方法により得られた細胞はＧ４１８耐性であ
ることがわかる。
で培養したときの結果を示し、実線（□）はＧ４１８を
含有する培地で培養したときの結果を示す。また・は対
照としてＮＡＴ−３０細胞の生育状態を示し、○はＧ４
１８耐性ＮＡＴ−３０細胞の生育状態を示す。この結果
より上記の方法により得られた細胞はＧ４１８耐性であ
ることがわかる。
正常のヒトの末梢血から８９７３球を採取し、これを試
験管内で緑膿菌Ｆ７（フィッシャータイプ７型）により
感作し、次にこの８９７３球をＥＢｖで形質転換し、緑
膿菌に対する抗体を産生ずる細胞を選択したくこの細胞
の調製方法は特願昭５９−２１２５７９明細書に詳細に
記載されている）。この抗体産生細胞と、実施例２で得
たＧ４１８耐性ＮＡＴ−３０細胞とを常法〔ネイチュア
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、前掲〕に従って融合せしめ、次に
緑膿菌Ｆ７に対する抗体を産生ずるクローンを選択した
ところ、９６ウエル中２ウエルのクローンが所望の抗体
を産生していた。
験管内で緑膿菌Ｆ７（フィッシャータイプ７型）により
感作し、次にこの８９７３球をＥＢｖで形質転換し、緑
膿菌に対する抗体を産生ずる細胞を選択したくこの細胞
の調製方法は特願昭５９−２１２５７９明細書に詳細に
記載されている）。この抗体産生細胞と、実施例２で得
たＧ４１８耐性ＮＡＴ−３０細胞とを常法〔ネイチュア
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、前掲〕に従って融合せしめ、次に
緑膿菌Ｆ７に対する抗体を産生ずるクローンを選択した
ところ、９６ウエル中２ウエルのクローンが所望の抗体
を産生していた。
参考例
本発明の細胞Ｇ４１８耐性ＮＡＴ−３０細胞と融合させ
ることにより融合細胞を得ることが可能な細胞Ｇ３−１
（人末梢血由来のリンパ球をＥＢＶで形質転換すること
により調製したもの：詳細は特願昭５９−２１２５７９
号参照）のＧ４１８感受性を調べた。すなわち、６３〜
１を種々の濃度のＧ４１８含有ＩＭＤＭ培地（１０％Ｆ
Ｃ３含）で培養することにより、Ｇ３−１のＧ４１８に
対する感受性を調べた。そのときの生育状態を第２図に
示す。
ることにより融合細胞を得ることが可能な細胞Ｇ３−１
（人末梢血由来のリンパ球をＥＢＶで形質転換すること
により調製したもの：詳細は特願昭５９−２１２５７９
号参照）のＧ４１８感受性を調べた。すなわち、６３〜
１を種々の濃度のＧ４１８含有ＩＭＤＭ培地（１０％Ｆ
Ｃ３含）で培養することにより、Ｇ３−１のＧ４１８に
対する感受性を調べた。そのときの生育状態を第２図に
示す。
図中カッコ内の数値は培地に添加した６４１８の濃度（
ｐ ｇ／ｍｌｌ ）を示す。この結果より６３−１はＧ
４１８濃度２００μｇ ／ ｍ １２で増殖が抑制され
、Ｇ ４１８ ？ａ度４００μｇ ／ ｍ Ｉ！で死滅
した。従って本発明のＧ４１８耐性ＮＡＴ−３０細胞は
Ｇ ４］ Ｂ ？ａｆｆ度８００μｇ／ｍｎに耐性なの
で、このＧ３−１と細胞融合を行ったのち、６４１８含
有ＨＡＴ培地で、所望融合細胞の選択が可能である。
ｐ ｇ／ｍｌｌ ）を示す。この結果より６３−１はＧ
４１８濃度２００μｇ ／ ｍ １２で増殖が抑制され
、Ｇ ４１８ ？ａ度４００μｇ ／ ｍ Ｉ！で死滅
した。従って本発明のＧ４１８耐性ＮＡＴ−３０細胞は
Ｇ ４］ Ｂ ？ａｆｆ度８００μｇ／ｍｎに耐性なの
で、このＧ３−１と細胞融合を行ったのち、６４１８含
有ＨＡＴ培地で、所望融合細胞の選択が可能である。
第１図は、本発明の細胞Ｇ４１８耐性ＮＡＴ−３０細胞
を６４１８含有培地で生育させたときの生育状態を示す
グラフである。 第２図は、Ｇ３−１細胞の各種濃度の６４１８含有培地
中での生育状態を示すグラフである。
を６４１８含有培地で生育させたときの生育状態を示す
グラフである。 第２図は、Ｇ３−１細胞の各種濃度の６４１８含有培地
中での生育状態を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の性質： （１）ヒト−バーキットリンパ腫と大腸菌プロトプラス
トとの融合に由来する； （２）Ｇ４１８に対して耐性を有する； （３）エプスタイン−バール−ウイルスにより形質転換
された抗体産生細胞と融合することができる； を有する細胞。 ２、さらに次の性質： （４）アミノプテリンに対して感受性である；（５）Ｈ
ＡＴ培地に対して感受性である； を有するＧ４１８耐性ＮＡＴ−３０細胞である特許請求
の範囲第１項記載の細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60084542A JPS61242575A (ja) | 1985-04-22 | 1985-04-22 | Ｇ４１８耐性ヒト−バ−キツトリンパ腫由来細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60084542A JPS61242575A (ja) | 1985-04-22 | 1985-04-22 | Ｇ４１８耐性ヒト−バ−キツトリンパ腫由来細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61242575A true JPS61242575A (ja) | 1986-10-28 |
Family
ID=13833533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60084542A Pending JPS61242575A (ja) | 1985-04-22 | 1985-04-22 | Ｇ４１８耐性ヒト−バ−キツトリンパ腫由来細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61242575A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0368662A2 (en) | 1988-11-09 | 1990-05-16 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Parent cell lines for producing human hybridomas |
| EP0911395A3 (en) * | 1997-10-22 | 2003-09-10 | National Agricultural Research Organization | Fused cell line and method of obtaining the same |
-
1985
- 1985-04-22 JP JP60084542A patent/JPS61242575A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0368662A2 (en) | 1988-11-09 | 1990-05-16 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Parent cell lines for producing human hybridomas |
| EP0911395A3 (en) * | 1997-10-22 | 2003-09-10 | National Agricultural Research Organization | Fused cell line and method of obtaining the same |
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