JPS61242592A - キシラン分解物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、キシラン分解生成物を所望の比率で含有する
キシラン分解生成物混合物の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

従来・キシランから、加水分解法により、キシロースの
製造が行なわれてきた。

最近では、種々のオリゴ糖が甘味料、増量剤、賦形剤、
包接剤、保湿剤、或いは増粘剤など、食品及び薬品工業
に広く使用できるものと考えられ、これらの用途に応じ
た種々のオリゴ糖の製造技術の開発が要望されている。

部分加水分解法によるキシロオリゴ糖の製造法は精製工
程が繁雑で、収率も低く工業生産には適さない。そこで
、キシロビオース（Ｘ２）、キシロトリオース（Ｘ３）
、キシロテトラオース（Ｘ４）等のキシロオリゴ糊、又
は所望の比率でこれらを含有するキシロオリゴ糖混合物
を特異的に生成せしめるキシラナーゼの開発が必要とさ
れる。

キシラナーゼとしては従来から、ハシルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）が生産する
酵素（醗酵工学雑誌↓上、　１８１−１８６．１９６３
）　、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
　ｓｐ、）菌株が生産する酵素（農芸化学会誌↓３．　
ｔ４５−１ｓ３．ｔ９ｅ９）−アスペルギルス・ニガー
（＾ｓｐｃｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）が生産する酵
素〔バイオテクノロジー・レター（Ｂｉｏｔｅｃｈ。

Ｌｅｔｔｅｒ）　　３　、３４５−３５０．１９８１）
等が知られているが、キシラナーゼにより特異的にキシ
ロオリゴ糖を製造する方法についての研究は少ない。キ
シロオリゴ糖の製造の例としては、フミコーラ・ラヌギ
ノーザ（Ｉｌｕｍｉｃｏｌａ　Ｉａｎｕｇｉｎｏｓａ）
由来のキシラナーゼによるキシロビオース及びキシロト
リオースの製造〔ジャーナル・オブ・ファーメンテ−ジ
ョン・テクノロジー（Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｔｅｃｈ
ｎｏ＋、）　６２４１５−４２０、１９８４）や、スト
レプトマイセス属由来のキシラナーゼによるキシロース
及びキシロビオースの製造（農芸化学会誌↓立、　１４
５−１５３．１９６９）等の例がある。しかしながら、
キシロトリオース及びキシロテトラオースを主として製
造する方法は知られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従ってこの発明は、キシロビオース、キシロトリオース
、キシロテトラオース等を所望の比率で含有するキシラ
ン分解物の製造方法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するだめの手段〕

前記の目的は、特定の条件下でキシランに作用してキシ
ロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース等
を所望の比率で生成せしめるキシラナーゼによりキシラ
ンを加水分解する方法により達成される。

本発明者らは、キシランから、オリゴ糖生産能の強い微
生物を求めて、土壌中より微生物の検索を行なった結果
、バチルス・プミラスと同定された微生物Ｓ　Ａ　Ｍ２
Ｏ２Ｓ株が、キシロビオース、キシロトリオース、キシ
ロテトラオース等のキシロオリゴ糖を効率良く生成する
キシラナーゼを菌体外に、著量に生産することを認めた
。

さらに、Ｓ　Ａ　Ｍ２Ｏ２Ｓ株の生産するキシラナーゼ
によるキシランの分解条件を検討した結果、適当に条件
を設定することにより、糖組成の異なったキシロオリゴ
糖を作り分けることが可能であることを認め、本発明を
完成した。

以下にパシルス・プミラスが生産する本発明において使
用するキシラナーゼの性質を記載する。

（１）作用：本酵素はキシランに作用し、キシロビオー
ス、キシロトリオース、キジロチ１−ラオース等のキシ
ロオリゴ糖を主として生成する。また、作用条件を変え
ることにより、生成糖の組成比を変えることができる。

例えば、キシロビオースは１０〜８０％、キシロトリオ
ースは１０〜６０％、キシロテトラオースは０〜４０％
の範囲で組成比を変えることが可能である。

（２）作用ｐＨ範囲と最適作用ｐ　Ｈ：ｐＨ５〜９の範
囲で作用し、最適ｐＨは、約６である（１％キシラン、
５０℃、１０分間反応）（第１図）。

（３）ｐＨ安定性：ｐＨ５，５〜８．０の範囲で安定（
０，１Ｍ緩衝液中で、３時間（室温）放置後、残存活性
を測定）である（第３図）。

（４）作用温度範囲及び最適作用温度：約７０℃まで作
用し、最適作用温度は４５〜５５℃（１％キシラン、ｐ
　Ｈ６，０，１０分間反応）である（第２図）。

（５）熱安定性：　ｐ　Ｈ６，０，１０分間加熱処理後
、残存活性を測定した。その結果、５０℃で３０％、６
０℃で９０％、７０℃でほぼ完全に失活した（第４図）
。

（６）活性測定法＝１％（Ｗ／Ｖ）キシラン（ｌａｒｃ
ｈ　ｗｏｏｄ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６
，０）　０．４８ｍ［に、０．０２ｍｊ！の適当に希釈
した酵素液を加え、５０℃、１＼０分間反応を行ない、
生成した還元糖をＤＮＳ法で比色定量する。１分間にキ
シロース１μモルに相当する還元力を生ずる酵素量を一
単位とする。

次に、この発明の方法に使用するキシラナーゼの生産菌
の代表であるＳ　Ａ　Ｍ２Ｏ２Ｓ株の菌学的性質を記載
する。

（Ａ）形態 （１）細胞の大きさは約０．５μｍ　Ｘ　２．０μｍの
桿菌である。

（２）細胞の多形性はない。

（３）運動性があり、鞭毛は周毛である。

（４）胞子の形紙、１−Ａ　＄６　ＶＩ：ｌて′ある。

（５）ダラム染色性は陽性である。

（Ｂ）培地におＬ−する生育状態 （１）肉汁液体培地 菌体は黄白色を呈し、表面に膜状に生 育する。

（２）肉汁寒天平板培地 発育は旺盛で、菌体は黄白色を呈する。

コロニーの直径は約２ｍｍで、表面は 凹凸があり、光沢はなく、周縁は波状 を呈する。

（３）肉汁寒天斜面培地 （２）と同様の生育状態を示し、拡布 状に生育する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培地 ゼラチンを？夜化しない。

（５）リドマスミルク リ１−マス色素を赤変し、凝固させる。

（Ｃ）生理的性質 （１）硝酸塩の還元　　　　　　− （２）ｖＰテスト　　　　　　　士 （３）ＭＲテスト　　　　　　　＋ （４）ＯＦテスト０ （５）インドールの生成　　　　− （６）硫化水素の生成　　　　　− （７）デンプンの加水分解　　　− （８）カゼインの分解　　　　　→− （９）馬尿酸の分解　　　　　　十 （１０）プロピオン酸の利用　　　− （１１）＾ｎａｅｒｏｂｉｃ　Ａｇａｒでの生育　−（
１２）　　７％ＮａＣ］に対する耐性　　→−（１３）
カタラーゼの生成　　　　十 （１４）オキシダーゼの生成　　　士 （１５）　５０℃での生育　　　　　→＝（１６）酸素
に対する態度　　　好気性（Ｄ）糖から酸およびガスの
生成 酸の生成　ガスの生成 （１）Ｌ−アラビノース　　十　　　　　−（２）　ｒ
ｌ−キシロース　　　十　　　　　−（３）Ｄ−グリコ
ース　　　十　　　　　−（４）Ｄ−マンノース　　　
＋　　　　　　−（５）Ｄ−フラクトース　　→−− （６）Ｄ−ガラクトース　　±　　　　　−（７）マル
トース　　　　±　　　　　−（８）ザソカロース　　
　十　　　　　−（９）ラケトース　　　　− （１０）　　）レバロース　　　十　　　　　　−（１
１）　ｎ−ソルビット　　　− （１２）　Ｄ−マンニット　　　＋　　　　　−（１３
）イノジット　　　　− （１４）グリセリン　　　　＋　　　　　−（１５）デ
ンプン　　　　　− （Ｅ）ＤＮＡのＧＣ含量 本菌のＤＮＡのＧＣ含量は、４１．７％であった〔測定
は、Ｊ、Ｔａｍａｏｋａ及びに、Ｋｏｍａｇａｔａ、　
１９８４．逆相高速液体クロマトグラフィーによるＤＮ
Ａ塩基組成の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ
　ＤＮＡ　ｂａｓｅ　ｃｏｍｐｏｓｉ−ｔｉｏｎ　　ｂ
ｙ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ　ｈｉｇｈ−ｐｅｒ
ｆｏｒｍａｎｃｅ　１ｉ−ｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ）、ＦＢＭＳ　ミクロビオロジー・レター
ズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉ、ｅｔｔｅｒｓ）　
２５　：　１２５−１２８に従って行った〕。

（Ｆ）細胞内キノンの分子量の同定 木菌はメナキノン７　　（ＭＫ−７）を有する〔測定は
、山田ｈ１を三・倉石行・１９８２年、ユビキノンとメ
ナキノンモキ駒形和男編「微生物の化学分類実験法Ｊ　
Ｐ　１４３−１５５．学会出版センター、東京）±に従
った〕。

以上の菌学的性質に従い、本発明の菌株ＳＡＭ００４５
の分類学的地位をハーシェーズ・マニュアル・オブ・テ
ターミネティブ・ハタテリオロジ＝（Ｂｅｒｇｅｙ　’
　ｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｉ）ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ
ｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ）第８版により求める
と、ダラム陽性かん菌で、胞子を形成し、運動性があり
、ＤＮＡのＧＣ含量が４１．７％であることから、本菌
株はハシルス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）属に属する細菌
であると同定された。

さらにカタラーゼを生産し、■Ｐ反応陽性、５０℃で生
育し、７％ＮａＣ＋に耐性ある、という性質からＧｏｒ
ｄｏｎ　Ｒ，Ｅ、Ｗ、Ｃ，Ｈａｙｎｅｓ及びＣ，Ｉ（、
−Ｎ、Ｐａｎｇ。

１９７３、ザ・ジーナス・ハシルス、ユナイテソド・ス
テイク・デパートメント・オブ・アグリカルチュアー・
ハンドフック（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ
、Ｕｎ−４ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐｅｒｔｍｅｎ
ｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂ−ｏｏ
ｋ）Ｎｏ、４２７により、本菌株ばＢ、ズブチリス（［
１゜５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、Ｂ、プミルス（Ｂ、ｐｕｍ
ｉ　１ｕｓ）、Ｂ、リケニホルミス（Ｂ、　］ｉ、ｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）らに近縁の種であることが判明し
た。

さらに詳しい検討を行った結果、硝酸塩還元能なし、デ
ン“プン分解能なし、プロピオン酸を利用せずＡｎａｅ
ｒｏｂｉｃ　Ａｇａｒで生育せず、馬尿酸を分解すると
いう性質から、本菌株はバシルス・プミルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）であると同定された。

次に、本菌を用いてキシラナーゼを生産せしめるための
培養条件について述べる。培養法としては、通常の細菌
の培養法が使用できる。

まず、炭素源としては、キシラン、ビール又はウィスキ
ーの麦芽糖化粕、小麦ふすま、或いはその他のＷ！類を
、単独または組合わせて用いる。窒素源としては、無機
化合物として硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿
素等、また、有機窒素含有物として、イーストエキス、
ペプトン、マルトエキス、コーン・ステイープ・リカー
、スキムミルク、各種アミノ酸類等が単独または組合わ
せて用いられる。

培養温度は、２０〜３５℃が適している。また、初発ｐ
Ｈは、５〜１１の広い範囲が利用可能であるが、特に、
アルカリ条件が適している。培養日数は、通常１〜２日
である。固体培養、液体培養のいずれも可能であるが好
気的条件下で液体培養するのが好ましい。

培養終了後、既知の手法を利用して、キシラナーゼを採
取することが可能である。次にその一例を示す。

まず、培養液中の菌体及び固形分を遠心除去し、上澄液
を得る。この上澄液を粗酵素として利用することも可能
である。この上澄液を約４０％硫酸アンモニウムで沈で
んさせる。沈でんを一晩透析し、２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で平衡化ＬＪ、：Ｔ）ＥＡＥ　　・セル
ロースカラムを通過させ、素通り区分を集める。次に、
この素通り区分を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）
で平衡化したＣＭセルロースに吸着させた後に、食塩濃
度を０．１〜０．７Ｍまで変化させて酸素を溶出させ、
キシラナーゼ活性区分を集める。更に、酵素純度を」二
げるためには、セファデックスＧ−１００カラムでゲル
濾過を行ない、最終標品を得る。

この発明の方法によりキシラン加水分解物混合物を製造
するための酵素反応は、ｐ　Ｈ５，５〜８．０．３０℃
〜６０℃の温度において３〜４８時間、特に好ましくは
３〜１５時間行う。また反応液中のキシラン濃度は通常
１〜４０％、特に好ましくは１〜２０％とする。反応媒
体としては緩衝液、例えばリン酸緩衝液を用いるのが好
ましい。

上記の範囲内で反応ｐＨ１反応温度、及び反応時間を変
えても、生成物中のキシロオリゴ糖の比率はほとんど変
わらなかった。また基質であるキシランの初濃度を高く
するに従ってキシロオリゴ糖の収率が低下する傾向があ
ったが、この場合もキシロオリゴ糖の生成比率は変わら
なかった。

これに対して酵素の濃度を変えることによって生成糖の
組成は大きく変化した。すなわち、キシロビオース（Ｘ
２）は１０〜８０％、キシロトリオース（Ｘ３）は１０
〜６０％、そしてキシロテトラオース（Ｘ４）は０〜４
０％の変化を示した。キシランの初濃度を５％として種
々のキシラナーゼが濃度において加水分解を行った場合
のキシロース（Ｘ、）、キシロビオース（Ｘ２）、キシ
ロトリオース（Ｘ３）、及びキシロテトラオース（Ｘ４
）の生成濃度を第６図、及び下の表に示す。

反応は、反応液を加熱してキシラナーゼを不活性化する
ことにより停止することができる。次に、常法に従って
加水分解生成物を反応液から分離採取する。例えば、加
熱処理した反応液を濾過して透明な反応液を得、これを
濃縮することによって製品濃厚液、又はシロップを得る
ことができる。

又、反応液又はその濃縮液を凍結乾燥することにより粉
末製品を得ることができる。

次に実施例により、この発明をさらに具体的に説明する
。

Ｕ遣１−０　　群芳版ｐ馴製 キシラン１％：酵母エキス０．３％、ポリペプトン０．
５％、Ｋ２１１ＰＯ４，０，１％、及びＭｇ５Ｏ，ｌ　
　・７■２００．１％からなる培地２７！を５ｐのジャ
ーファーメンタ−に仕込み、バシルス・プミラス（微工
研菌寄第８１７５号）を、ｌ　Ｖｖｌｌ　、３００ｒｐ
ｍにて４８時間培養した。培養後、培養液を遠心分離し
て上滑液を得た。この−上滑液は５８５ユニット／ｍｌ
のキシラナーゼを含有していた。

」Ｕ江１．　反疫 実施例１で得られた培養上清０，０１ｍ１ｌを４％キシ
ランを含むｐ　Ｈ６，０の５０ｍＭリン酸緩衝液１０ｍ
７！に添加し、４５℃、１０時間反応させた。

生成糖を液体クロマトグラフィー（カラムＣｏ５ｍ０−
ｓｉｌ　　・５ＮＨ２、溶出液アセトニトリル７０％：
水３０％、検出器５ｈｏｄｅｘＲＩ−３Ｅ５１）にて分
析した結果、キシロビオース１７％、キシロトリオース
４３％、キシロテトラオース３７％であり、キシロトリ
オースとキシロテトラオースを主成分（合計８０％）と
する生成物が得られた（第５図ａ）。

実施例３．　反庭 実施例１で得られた培養上清０．１ｒｒｌを、０．５ｇ
キシランを含む５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６，０
）１０ｍｎに添加し、４５℃１２時間反応させた。生成
糖の分析を行なった結果、キシロビオース４１％、キシ
ロトリオース５３％であり　、キシロビオースとキシロ
トリオースを主成分（合計９４％）とする生成物が得ら
れた（第５図ｂ）。

実施例４．　反痘 実施例１で得られた培養上澄を、４０％硫酸アンモニウ
ムで沈澱させた。この沈澱を透析して得た粗酵素液を、
５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６，５）で希釈して４
００単位／ｍ７！とじた。この酵素液１０ｍ１に、０．
５ｇキシランを添加して、４５°Ｃ１５時間反応を行な
った。生成糖の分析を行なった結果、キシロース１３％
、キシロビオース７６％、′キシロトリオース１１％で
あり、キシロビオースを主成分とする生成物が得られた
く第５図Ｃ）。またこの際のキシロビオースの収率は３
４％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に用いるキシラナーゼのｐＨと　′活性
の関係を示すグラフであり、第２図は該キシラナーゼの
温度と活性の関係を示すグラフであり、第３図は該酵素
のｐＨ安定性を示すグラフであり、第４図は該酵素の温
度安定性を示すグラフであり、そして第５図及び第６図
は種々の酵素濃度におけ　　。 る生成糖の比率を示す。 （’１０） （’／、） 第２図 （’／、） 第４図 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来のキシラ
   ナーゼでキシランを加水分解してキシラン分解物混合物
   を得る方法において、加水分解媒体中のキシラナーゼ濃
   度を調節することによりキシロビオース、キシロトリオ
   ース、及びキシロテトラオースの内の複数種類のキシロ
   オリゴ糖を所望の比率で含有する混合物を得ることを特
   徴とする方法。 ２、前記バシルス属細菌がバシルス・プミラス（Ｂａｃ
   ｉｌｌｕｓ　Ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＡＭ００４５（微工研
   菌寄第８１７５号である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。