JPS61249385A - 形質転換血球由来株化細胞およびそれを用いるヒトインタ−フエロン−γの製造方法 - Google Patents
形質転換血球由来株化細胞およびそれを用いるヒトインタ−フエロン−γの製造方法Info
- Publication number
- JPS61249385A JPS61249385A JP60091619A JP9161985A JPS61249385A JP S61249385 A JPS61249385 A JP S61249385A JP 60091619 A JP60091619 A JP 60091619A JP 9161985 A JP9161985 A JP 9161985A JP S61249385 A JPS61249385 A JP S61249385A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- established cell
- human interferon
- cell line
- dna sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ヒトインターフェロン−γ（ＨｕＩＦＮ−γ
）をコードするＤＮＡ配列と動物細胞内で機能するプロ
モーター領域のＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列を導入
しＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを産生するようになった血球由
来の株化細胞、更にその細胞を利用したＨｕ Ｉ Ｐ
Ｎ−γの製造法に係る。
）をコードするＤＮＡ配列と動物細胞内で機能するプロ
モーター領域のＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列を導入
しＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを産生するようになった血球由
来の株化細胞、更にその細胞を利用したＨｕ Ｉ Ｐ
Ｎ−γの製造法に係る。
（従来の技術）
インターフェロン（ＩＦＮ）は、抗ウィルス作用を持つ
物質として発見され、少くとも同種の細胞内におけるウ
ィルスには非特異的な抗ウイルス状態を誘導する蛋白で
ある。ヒトインターフェロン（ＨｕＩＦＮ）は、蛋白の
生理学的、生化学的。
物質として発見され、少くとも同種の細胞内におけるウ
ィルスには非特異的な抗ウイルス状態を誘導する蛋白で
ある。ヒトインターフェロン（ＨｕＩＦＮ）は、蛋白の
生理学的、生化学的。
免疫学的或いは、生産細胞と誘発方法の差異により３つ
の種類に分類されており、それぞれインターフェロン−
α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β
）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−７”）と命名さ
れている（ ５ｔｅＷａｒｔ Ｈ＋Ｗ、Ｅ、ら（１９８
０年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８６巻、１１０
頁）。最近これら３種のヒトＩＦＮの相補ＤＮＡ（ＯＤ
ＮＡ）がクローニングされ、ｃＤＮＡの塩基配列並びに
塩基配列から推定されるアミノ酸配列が決定された。Ｉ
ＦＮの抗ウィルス作用は種特異的であり、ヒト細胞を用
いたウィルス感染試験ではＨｕ Ｉ Ｆ Ｎは抗ウィル
ス作用を示すが、マウスＩＦＮは示さない。しかし、Ｉ
ＦＮのウィルスに対する特異性はかなり広く、種々のウ
ィルスに対して活性を示す。
の種類に分類されており、それぞれインターフェロン−
α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β
）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−７”）と命名さ
れている（ ５ｔｅＷａｒｔ Ｈ＋Ｗ、Ｅ、ら（１９８
０年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８６巻、１１０
頁）。最近これら３種のヒトＩＦＮの相補ＤＮＡ（ＯＤ
ＮＡ）がクローニングされ、ｃＤＮＡの塩基配列並びに
塩基配列から推定されるアミノ酸配列が決定された。Ｉ
ＦＮの抗ウィルス作用は種特異的であり、ヒト細胞を用
いたウィルス感染試験ではＨｕ Ｉ Ｆ Ｎは抗ウィル
ス作用を示すが、マウスＩＦＮは示さない。しかし、Ｉ
ＦＮのウィルスに対する特異性はかなり広く、種々のウ
ィルスに対して活性を示す。
ＩＦＮは抗ウイルス物質として発見されたが、その後、
ＩＦＮが種々の生物学的及び免疫学的活性を持つ物質で
ある事が示された。ＩＦＮはかなり古くから細胞の増殖
を抑制する作用があることが知られ（Ｒｕｂｉｎ 、
Ｂ、 Ｙ、ら（１９８０年）プロシーデイングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニ
ーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ＩＦＮが種々の生物学的及び免疫学的活性を持つ物質で
ある事が示された。ＩＦＮはかなり古くから細胞の増殖
を抑制する作用があることが知られ（Ｒｕｂｉｎ 、
Ｂ、 Ｙ、ら（１９８０年）プロシーデイングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニ
ーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）、 ７７巻、５９２８
頁）、また最近になり免疫学の進歩とともにＩＦＮがい
わゆる癌の免疫監視機構に関与していると考えられてい
る。
頁）、また最近になり免疫学の進歩とともにＩＦＮがい
わゆる癌の免疫監視機構に関与していると考えられてい
る。
ＩＦＮＯ中でもＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−α。
ＩＦＮ−βに比べ、はるかに低濃度で細胞の増殖を抑制
する事ができ（Ｒｕｂｉｎ 、 Ｂ−Ｙ、ら（１９８０
年）ブロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
テミー・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻、５
９２８頁）、またナチュラルキラー細胞、キラーＴ細胞
、に細胞及びマクロファージ等のいわゆる癌の免疫監視
機構に働いている細胞群の活性化を行うことができ、臨
床応用面での期待は大きい。
する事ができ（Ｒｕｂｉｎ 、 Ｂ−Ｙ、ら（１９８０
年）ブロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
テミー・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻、５
９２８頁）、またナチュラルキラー細胞、キラーＴ細胞
、に細胞及びマクロファージ等のいわゆる癌の免疫監視
機構に働いている細胞群の活性化を行うことができ、臨
床応用面での期待は大きい。
ＨｕＩＪｉ’Ｎ−１は、ヒトのリンパ球をフィトヘマグ
ルチニン、メタフィロコツカルエンテロトキシンＡ１コ
ンカナバリンＡ或いは、ガラクトース酸化酵素での刺激
に対して誘導される事が知られている（ Ｗｈｅｅｌｏ
ｃｋ 、 Ｅ、 Ｆ、 （１９６５年）サイエンス（５
ｃｉｅｎｃｅ ） 、 １４９巻、３１０頁； Ｌａｎ
ｇｆｏｒｄ 。
ルチニン、メタフィロコツカルエンテロトキシンＡ１コ
ンカナバリンＡ或いは、ガラクトース酸化酵素での刺激
に対して誘導される事が知られている（ Ｗｈｅｅｌｏ
ｃｋ 、 Ｅ、 Ｆ、 （１９６５年）サイエンス（５
ｃｉｅｎｃｅ ） 、 １４９巻、３１０頁； Ｌａｎ
ｇｆｏｒｄ 。
Ｍ、Ｐ、 ら（１９７９年）インフエクション・アンド
・イミューニテイ−（Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、
）、 ２６巻。
・イミューニテイ−（Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、
）、 ２６巻。
３６頁； ｄｅ Ｌａｙ、 Ｍ、ら（１９８０年）ユー
ロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ
。
ロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ
。
Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ） 、 １０巻、８７７頁＋
ｉ ＤｌａｎＺａｎｌ ＋Ｆ、ら（１９７９年）インフ
エクション・アンド・イミューニテイー、２５巻、８９
７頁）。しかし以上のような生産法は新鮮なリンパ球が
大量に必要となり、治療薬としてのＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−
γの大量生産を困難にしている。近年Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ
−１のｃＤＮＡがクローニングされ、大腸菌でＨｕ Ｉ
Ｆ Ｎ−γ様蛋白の生産が可能になった（ Ｇｒａｙ
、 Ｐ、Ｗ、ら（１９８２年）ネイチャー、２９５巻、
５０３頁）。しかし微生物でつくられるＩＦＮ−γは動
物細胞と微生物との蛋白合成機構が多少異なる為に、つ
くられる蛋白のア・ミ・λ末端が天然のそれと異なる場
合が多い。現に大腸菌で作られた組換え型のＨｕＩＦＮ
−γのアミノ末端は、天然のＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γのそ
れがピログルタミン酸であるのに対し、メチオニンにな
っている。更に微生物によってつくられるＩＦＮ−γは
、天然のＨｕＩＦＮ−７が糖鎖を有しているのに対し、
糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋白合成系
によってつくられたＩＦＮ−γと天然のＨｕ Ｉ Ｆ
Ｎ−γとは物質として異なり、治療薬として長期間使用
したり頻回使用する場合には、抗原抗体反応による力価
の減少、ショック等のアレルギー反応の問題が懸念され
る。Ｌｅらは天然のＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γと大腸菌でつ
くられたＩＦＮ−ｒとではモノクローナル抗体を用いた
抗原抗体反応の反応性が異なる事を報告しており、この
反応性の違いは糖鎖の有無に起因するものではないこと
を示した（Ｌｅら（１９８４年）ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ）、 １８２
巻。
ｉ ＤｌａｎＺａｎｌ ＋Ｆ、ら（１９７９年）インフ
エクション・アンド・イミューニテイー、２５巻、８９
７頁）。しかし以上のような生産法は新鮮なリンパ球が
大量に必要となり、治療薬としてのＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−
γの大量生産を困難にしている。近年Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ
−１のｃＤＮＡがクローニングされ、大腸菌でＨｕ Ｉ
Ｆ Ｎ−γ様蛋白の生産が可能になった（ Ｇｒａｙ
、 Ｐ、Ｗ、ら（１９８２年）ネイチャー、２９５巻、
５０３頁）。しかし微生物でつくられるＩＦＮ−γは動
物細胞と微生物との蛋白合成機構が多少異なる為に、つ
くられる蛋白のア・ミ・λ末端が天然のそれと異なる場
合が多い。現に大腸菌で作られた組換え型のＨｕＩＦＮ
−γのアミノ末端は、天然のＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γのそ
れがピログルタミン酸であるのに対し、メチオニンにな
っている。更に微生物によってつくられるＩＦＮ−γは
、天然のＨｕＩＦＮ−７が糖鎖を有しているのに対し、
糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋白合成系
によってつくられたＩＦＮ−γと天然のＨｕ Ｉ Ｆ
Ｎ−γとは物質として異なり、治療薬として長期間使用
したり頻回使用する場合には、抗原抗体反応による力価
の減少、ショック等のアレルギー反応の問題が懸念され
る。Ｌｅらは天然のＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γと大腸菌でつ
くられたＩＦＮ−ｒとではモノクローナル抗体を用いた
抗原抗体反応の反応性が異なる事を報告しており、この
反応性の違いは糖鎖の有無に起因するものではないこと
を示した（Ｌｅら（１９８４年）ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ）、 １８２
巻。
１３００頁）。一方、株化されたＴ細胞クローン（Ｎａ
ｔｈａｎ 、 Ｈ，ら（１９８１年）ネイチャー、２９
２巻、８４２頁）、Ｔ細胞ハイプリドーマ（Ｌｅら（１
９８２年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７９
巻、７８５７頁）、成人型白血病ウィルスで形質転換し
たＴ細胞（Ｓｕｇａｍｕｒａ 、 Ｋら（１９８１年）
ジャーナル・オブ・イミュノロジー。
ｔｈａｎ 、 Ｈ，ら（１９８１年）ネイチャー、２９
２巻、８４２頁）、Ｔ細胞ハイプリドーマ（Ｌｅら（１
９８２年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７９
巻、７８５７頁）、成人型白血病ウィルスで形質転換し
たＴ細胞（Ｓｕｇａｍｕｒａ 、 Ｋら（１９８１年）
ジャーナル・オブ・イミュノロジー。
１３１巻、１６１１頁）によるＨｕＩＦＮ−１の生産が
報告されているが、これらの細胞はヒト白血病ウィルス
をプロウィルスとして含み、或いはウィルス粒子を細胞
外に放出しているものと思われ、生物的危険の問題が残
されている（ Ｓｕｇａｍｕｒａら（１９８８年）ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー。
報告されているが、これらの細胞はヒト白血病ウィルス
をプロウィルスとして含み、或いはウィルス粒子を細胞
外に放出しているものと思われ、生物的危険の問題が残
されている（ Ｓｕｇａｍｕｒａら（１９８８年）ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー。
１３１巻、１６１１頁）。
また、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ −ｒのｃＤＮＡ配列にＳＶ４
０のプロモーターを接続し、動物細胞でのＨｕＩＦＮ−
γの生産が試みられた（ Ｇｒａｙ 、 Ｐ 、Ｗ、ら
（１９８２年）ネイチャー、２９５巻、５０３頁； Ｈ
ａｙｎｅｓ、 Ｊ。
０のプロモーターを接続し、動物細胞でのＨｕＩＦＮ−
γの生産が試みられた（ Ｇｒａｙ 、 Ｐ 、Ｗ、ら
（１９８２年）ネイチャー、２９５巻、５０３頁； Ｈ
ａｙｎｅｓ、 Ｊ。
ら（１９８３年）ニスクレイツク・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ）ｅ １１
巻、６８７頁；５ｃａｈｉｌｌ 、 Ｓ、 Ｊ、ら（１
９８８年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、８０
巻、４６５４頁；Ｄｅｖｏｓ 、 Ｒ，ら（１９８２年
）ニスクレイック・アシツズ・リサーチ、１０巻、２４
８７頁）。しかしこれらの生産に使用された細胞は全て
培地を強力に攪拌しないかぎり浮遊培養できない細胞で
あった。
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ）ｅ １１
巻、６８７頁；５ｃａｈｉｌｌ 、 Ｓ、 Ｊ、ら（１
９８８年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、８０
巻、４６５４頁；Ｄｅｖｏｓ 、 Ｒ，ら（１９８２年
）ニスクレイック・アシツズ・リサーチ、１０巻、２４
８７頁）。しかしこれらの生産に使用された細胞は全て
培地を強力に攪拌しないかぎり浮遊培養できない細胞で
あった。
（発明が解決しようとする問題点）
Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γ遺伝子の５′側隣接配列には、Ｈ
ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの発現を制御している調節部位が存
在し、特にＲＮＡポリメラーゼが結合し、ｍＲＮＡの合
成を開始するＤＮＡ配列を含む領域をプロモーター領域
と呼ぶが、本発明者らは、この領域を含むＨｕＩＦＮ−
γ遺伝子配列をそのまま動物細胞に導入してもＨｕ Ｉ
Ｆ Ｎ−γの生産はごく微弱である事を知った。本発
明者らはＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γをコードしている核ＤＮ
Ａ配列に動物培養細胞で機能する、すなわちｍＲＮＡ合
成を開始する事が可能なプロモーター領域のＤＮＡ配列
を結合させ、種々の動物培養細胞に導入した場合、正常
にスプライシングが起り、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γが培地
中に著量分泌される事を見い出した。しかし使用した動
物培養細胞は、培地を強力に攪拌しないかぎり浮遊培養
できない細胞であった（ＯＨＯ−Ｋ１等）。
ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの発現を制御している調節部位が存
在し、特にＲＮＡポリメラーゼが結合し、ｍＲＮＡの合
成を開始するＤＮＡ配列を含む領域をプロモーター領域
と呼ぶが、本発明者らは、この領域を含むＨｕＩＦＮ−
γ遺伝子配列をそのまま動物細胞に導入してもＨｕ Ｉ
Ｆ Ｎ−γの生産はごく微弱である事を知った。本発
明者らはＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γをコードしている核ＤＮ
Ａ配列に動物培養細胞で機能する、すなわちｍＲＮＡ合
成を開始する事が可能なプロモーター領域のＤＮＡ配列
を結合させ、種々の動物培養細胞に導入した場合、正常
にスプライシングが起り、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γが培地
中に著量分泌される事を見い出した。しかし使用した動
物培養細胞は、培地を強力に攪拌しないかぎり浮遊培養
できない細胞であった（ＯＨＯ−Ｋ１等）。
これらの細胞は、培地中で強制攪拌を行い浮遊培養法で
増殖させた場合でさえ、細胞は単独にならず、また細胞
の凝集塊の大きさが不均一である為に、培地中での細胞
密度は均一にならない。また攪拌条件の制御が困難で、
攪拌が緩い場合には細胞が器壁に付着してしまう傾向に
あり、逆に攪拌が強い場合には細胞を傷つけるおそれが
ある。
増殖させた場合でさえ、細胞は単独にならず、また細胞
の凝集塊の大きさが不均一である為に、培地中での細胞
密度は均一にならない。また攪拌条件の制御が困難で、
攪拌が緩い場合には細胞が器壁に付着してしまう傾向に
あり、逆に攪拌が強い場合には細胞を傷つけるおそれが
ある。
更にこれらの細胞は、器壁で生育させた場合、ある一定
の細胞密度になると生育を停止する傾向があり、そのよ
うな場合には細胞をトリプシン処理などにより器壁から
剥し単独の細胞にしたう丸で植継がねばならない。従っ
て付着する傾向にある細胞は大量培養が比較的困難であ
った。
の細胞密度になると生育を停止する傾向があり、そのよ
うな場合には細胞をトリプシン処理などにより器壁から
剥し単独の細胞にしたう丸で植継がねばならない。従っ
て付着する傾向にある細胞は大量培養が比較的困難であ
った。
本発明者らは、本来培養時に器壁に付着せず細胞の凝集
塊を生じにくく単独な細胞として増殖可能な血球由来の
株化細胞に、動物培養細胞で機能するプロモーター領域
の配列を結合させたＨｕＩＦＮ−γの核ＤＮＡ配列を導
入した場合、高度にＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを分泌する形
質転換株を分離できる事を見い出した。またこの形質転
換株は、器壁に付着せず、単独な細胞として非常に容易
に浮遊培養を行なえ、大量培養も容易にできる事を見い
出し本発明に至った。本発明によりＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−
γを大量に供給する事が可能になるものと考えられる。
塊を生じにくく単独な細胞として増殖可能な血球由来の
株化細胞に、動物培養細胞で機能するプロモーター領域
の配列を結合させたＨｕＩＦＮ−γの核ＤＮＡ配列を導
入した場合、高度にＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを分泌する形
質転換株を分離できる事を見い出した。またこの形質転
換株は、器壁に付着せず、単独な細胞として非常に容易
に浮遊培養を行なえ、大量培養も容易にできる事を見い
出し本発明に至った。本発明によりＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−
γを大量に供給する事が可能になるものと考えられる。
以下に本発明の詳細な説明する。
（問題点を解決するための手段）
Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γをコードしている遺伝子領域は、
ヒト染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ１で切断した場合
、約８．６キロベース（Ｋｂ ）のＤＮＡ断片中に含ま
れる。Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの成熟型ｍＲＮＡの配列を
コードしている配列（エクソン）は４ケ所に分断して存
在している。ＤＮＡ配列の５′側から第１エクソン、第
２エクソン、第３エクソン及び第４エクソンとする。第
１エクソンの５′側に隣接する配列には、ＨｕＩＦＮ−
γの発現を制御している調節部位がある。また第４エク
ソンには、終止コドンにつづいてｍＲＮＡのポリアデニ
ル酸化のシグナルＡＡ’Ｉ’ＡＡＡが存在している。第
１エクソンは３８残基のアミノ酸からなるポリペプチド
をコードしているが、蛋白合成開始のアミノ酸であるメ
チオニンからはじまるＮ端の２３アミノ酸は、多くの分
泌性蛋白のＮ端にみられるシグナルペプタイドで、Ｈｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γが合成され、細胞外へ分泌される過程
で切断される。Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γをコードする核Ｄ
ＮＡ配列とは、この４つのエクソンと３つのイントロン
を含むＤＮＡ配列を示す。ＨｕＩＦＮ−γをコードする
核ＤＮＡ配列は、ヒトＤＮＡからクローン化される。ヒ
トＤＮＡは、例えばヒト白血球細胞培養細胞或いは組織
などを用い、Ｂ１１ｎらの方法（Ｂ ｌｉｎ ＋ Ｎら
（１９７６年）ニスクレイツク・アシツズ・リサーチ、
８巻、２８０Ｂ頁）により調製される。Ｈｕ Ｉ Ｆ
Ｎ−γ遺伝子のクローニングに用いるベクターは０ｈａ
ｒｏｎ ２８に代表されるλフアージベクター、ｐＢＲ
８２２に代表されるプラスミドベクター或いはｐＨ０７
９に代表されるコスミッドなどが利用できるが、一般的
には、高率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニングできるλ
ファージをベクターとして用いる遺伝子操作法が用いら
れる。すなわちヒト高分子ＤＮＡを適切な制限酵素で切
断後、λフアージベクターの置換可能領域の代りに挿入
し、リコンビナントファージＤＮＡをつくる。次にイン
ビトロパッケージングの手法を用い、感染性のあるファ
ージ粒子を作製する。次に宿主大腸菌とともにプレート
にまき、組換え型ファージのプラークを形成させる（Ｅ
ｎｑｕｉｅｔ、 Ｌら（１９７９年）メソッズ・イン・
エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）６８巻、２８１頁；Ｈｏｒｎ、Ｂ（１９７
９年）メソッズ・イン・エンザイモロジー、６８巻、２
９９頁）。
ヒト染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ１で切断した場合
、約８．６キロベース（Ｋｂ ）のＤＮＡ断片中に含ま
れる。Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの成熟型ｍＲＮＡの配列を
コードしている配列（エクソン）は４ケ所に分断して存
在している。ＤＮＡ配列の５′側から第１エクソン、第
２エクソン、第３エクソン及び第４エクソンとする。第
１エクソンの５′側に隣接する配列には、ＨｕＩＦＮ−
γの発現を制御している調節部位がある。また第４エク
ソンには、終止コドンにつづいてｍＲＮＡのポリアデニ
ル酸化のシグナルＡＡ’Ｉ’ＡＡＡが存在している。第
１エクソンは３８残基のアミノ酸からなるポリペプチド
をコードしているが、蛋白合成開始のアミノ酸であるメ
チオニンからはじまるＮ端の２３アミノ酸は、多くの分
泌性蛋白のＮ端にみられるシグナルペプタイドで、Ｈｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γが合成され、細胞外へ分泌される過程
で切断される。Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γをコードする核Ｄ
ＮＡ配列とは、この４つのエクソンと３つのイントロン
を含むＤＮＡ配列を示す。ＨｕＩＦＮ−γをコードする
核ＤＮＡ配列は、ヒトＤＮＡからクローン化される。ヒ
トＤＮＡは、例えばヒト白血球細胞培養細胞或いは組織
などを用い、Ｂ１１ｎらの方法（Ｂ ｌｉｎ ＋ Ｎら
（１９７６年）ニスクレイツク・アシツズ・リサーチ、
８巻、２８０Ｂ頁）により調製される。Ｈｕ Ｉ Ｆ
Ｎ−γ遺伝子のクローニングに用いるベクターは０ｈａ
ｒｏｎ ２８に代表されるλフアージベクター、ｐＢＲ
８２２に代表されるプラスミドベクター或いはｐＨ０７
９に代表されるコスミッドなどが利用できるが、一般的
には、高率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニングできるλ
ファージをベクターとして用いる遺伝子操作法が用いら
れる。すなわちヒト高分子ＤＮＡを適切な制限酵素で切
断後、λフアージベクターの置換可能領域の代りに挿入
し、リコンビナントファージＤＮＡをつくる。次にイン
ビトロパッケージングの手法を用い、感染性のあるファ
ージ粒子を作製する。次に宿主大腸菌とともにプレート
にまき、組換え型ファージのプラークを形成させる（Ｅ
ｎｑｕｉｅｔ、 Ｌら（１９７９年）メソッズ・イン・
エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）６８巻、２８１頁；Ｈｏｒｎ、Ｂ（１９７
９年）メソッズ・イン・エンザイモロジー、６８巻、２
９９頁）。
Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γをコードするＤＮＡ断片を持つ組
換え型ファージのプラークの検出には、ＣＤＮＡや合成
りＮＡをプローブとしたプラークハイブリダイゼーショ
ンの手法（Ｗｏｏ、 Ｓ、Ｌ、０． （１９７９年）メ
ソツズ・イン・エンザイモロジー、６８巻。
換え型ファージのプラークの検出には、ＣＤＮＡや合成
りＮＡをプローブとしたプラークハイブリダイゼーショ
ンの手法（Ｗｏｏ、 Ｓ、Ｌ、０． （１９７９年）メ
ソツズ・イン・エンザイモロジー、６８巻。
３８９頁； ５ｚｏｓｔａｋ 、 Ｊ、 Ｗ、ら（１９
７９年）メソッズ・イン・エンザイモロジー、６８巻、
４１９頁）が利用できる。実際にそのような手法を用い
、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γをコードするＤＮＡ断片を持つ
組換え型ファージがつくられた（特願昭５９−１１９６
４８）；Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、とＧｏｅｄｄｅｌ 、 Ｄ
、 Ｖ。
７９年）メソッズ・イン・エンザイモロジー、６８巻、
４１９頁）が利用できる。実際にそのような手法を用い
、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γをコードするＤＮＡ断片を持つ
組換え型ファージがつくられた（特願昭５９−１１９６
４８）；Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、とＧｏｅｄｄｅｌ 、 Ｄ
、 Ｖ。
（１９８２年）ネイチャー、２９８巻、８５９頁）。
またＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの遺伝子を持つ組換え型ファ
ージは、プラークハイブリダイゼーションによって選択
されたプラークから回収し宿主大腸菌と共に培養するこ
とにより大量調製できる。また組換え型ファージのＤＮ
Ａはフェノール法等によす調製できる（ Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ 、 Ｔら（１９８２年）モレキュラー・フローニ
ング・ア・ラボラトリ−・マニュアル・コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｏｌｏｎｉｎｇ ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
ージは、プラークハイブリダイゼーションによって選択
されたプラークから回収し宿主大腸菌と共に培養するこ
とにより大量調製できる。また組換え型ファージのＤＮ
Ａはフェノール法等によす調製できる（ Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ 、 Ｔら（１９８２年）モレキュラー・フローニ
ング・ア・ラボラトリ−・マニュアル・コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｏｌｏｎｉｎｇ ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
このようにして得られたヒトインターフェロン−γ核Ｄ
ＮＡは、公知の方法により種々の動物細胞で発現可能な
ベクターに組換えることができる。
ＮＡは、公知の方法により種々の動物細胞で発現可能な
ベクターに組換えることができる。
たとえば組換えベクターとしてヒトインターフェロン核
ＤＮＡをＳＶ４０ 初期プロモーターに結合り、 ｔ：
ｐｓＶｅｓｍａ Ｉγ、ヘルペスシンプレックスウィ
ルス（Ｈ８Ｖ）のチミジンキナーゼプロモーターに接続
したｐｓＶ２ｐＴＫγ（いずれも特願昭５９−１１９６
４８に記載）、ＳＶ４０後期プロモーターに接続したプ
ラスミド、ヘルペスシンプレックスウィルスのプロモー
ターに接続したプラスミド等。
ＤＮＡをＳＶ４０ 初期プロモーターに結合り、 ｔ：
ｐｓＶｅｓｍａ Ｉγ、ヘルペスシンプレックスウィ
ルス（Ｈ８Ｖ）のチミジンキナーゼプロモーターに接続
したｐｓＶ２ｐＴＫγ（いずれも特願昭５９−１１９６
４８に記載）、ＳＶ４０後期プロモーターに接続したプ
ラスミド、ヘルペスシンプレックスウィルスのプロモー
ターに接続したプラスミド等。
動物細胞で複製・発現できるプラスミドベクターであれ
ば、いずれも使用可能である。
ば、いずれも使用可能である。
動物培養細胞へのＤＮＡの導入法として、トランスフェ
クション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗｉ
ｇｌｅｒ 、 Ｍ、ら（１９７７年）セル（Ｃｅｌｌ）
、１１巻、２２３頁）、マイクロインジェクション法（
Ａｎｃｌｅｒｓｏｎ 、 Ｗ、 Ｆ、ら（１９８０年）
プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻。
クション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗｉ
ｇｌｅｒ 、 Ｍ、ら（１９７７年）セル（Ｃｅｌｌ）
、１１巻、２２３頁）、マイクロインジェクション法（
Ａｎｃｌｅｒｓｏｎ 、 Ｗ、 Ｆ、ら（１９８０年）
プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻。
５８９９頁）、リポゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン
法或いは細胞融合法（５ｃｈｏｆｆｎｅｒ 、 Ｗ、ら
（１９８０年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、
７７巻、２１６８頁）等が用いられている。リン酸カル
シウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮＡ溶液
の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用できる
。細胞融合法では目的ＤＮＡ配列をプラスミドとして保
有している微生物のプロトプラストが用いられている。
法或いは細胞融合法（５ｃｈｏｆｆｎｅｒ 、 Ｗ、ら
（１９８０年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、
７７巻、２１６８頁）等が用いられている。リン酸カル
シウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮＡ溶液
の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用できる
。細胞融合法では目的ＤＮＡ配列をプラスミドとして保
有している微生物のプロトプラストが用いられている。
Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γは誘導蛋白であり、ヒト白血球細
胞を種々のマイト−ジエンで刺激することにより誘導さ
れる。現在マイト−ジエンの刺激が、どのような形でＨ
ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの遺伝子に働き、ＨｕＩＦＮ−γを
誘導するかは不明であるが、そのような誘導機構のない
細胞にＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの調節部位を含む遺伝子を
導入してもＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの生産は微弱なもので
あった。本発明者らは、動物培養細胞内で機能する他の
遺伝子のプロモーター領域の配列をＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−
γの核ＤＮＡ配列の５′側に接続し、血球由来の株化細
胞に導入することによりＨｕＩＦＮ−γの非生産細胞を
高生産細胞に形質転換できることを見い出した。ここで
言う血球由来の株化細胞とは、哺乳類に於いては、幹細
胞から派生したリンパ芽球、骨髄芽球、単芽球、赤芽球
及びそれらの細胞から更に分化或いは派生した細胞から
樹立された株化細胞を示す。
胞を種々のマイト−ジエンで刺激することにより誘導さ
れる。現在マイト−ジエンの刺激が、どのような形でＨ
ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの遺伝子に働き、ＨｕＩＦＮ−γを
誘導するかは不明であるが、そのような誘導機構のない
細胞にＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの調節部位を含む遺伝子を
導入してもＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの生産は微弱なもので
あった。本発明者らは、動物培養細胞内で機能する他の
遺伝子のプロモーター領域の配列をＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−
γの核ＤＮＡ配列の５′側に接続し、血球由来の株化細
胞に導入することによりＨｕＩＦＮ−γの非生産細胞を
高生産細胞に形質転換できることを見い出した。ここで
言う血球由来の株化細胞とは、哺乳類に於いては、幹細
胞から派生したリンパ芽球、骨髄芽球、単芽球、赤芽球
及びそれらの細胞から更に分化或いは派生した細胞から
樹立された株化細胞を示す。
血球由来の株化細胞は、通常用いられる培地で増殖した
場合、形態的には主として球形を示し、培養液に浮遊す
ることが多い。また血球由来の株化細胞のうち、ある株
化細胞はグロブリンを産生じ、蛋白の合成及び分泌の機
能が高いと考えられ、そのような株を宿主とすることは
蛋白質生産上有利である。
場合、形態的には主として球形を示し、培養液に浮遊す
ることが多い。また血球由来の株化細胞のうち、ある株
化細胞はグロブリンを産生じ、蛋白の合成及び分泌の機
能が高いと考えられ、そのような株を宿主とすることは
蛋白質生産上有利である。
機能する他の遺伝子のプロモーター領域を接続したＭｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γの核ＤＮＡ配列を導入された細胞がＨ
ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを産生する為には、該ＤＮＡ配列が
、用いた細胞固有のＲＮＡ合成系、ＲＮＡの成熟、蛋白
合成系、蛋白の成熟１分泌等の機能に適合している必要
がある。導入されたＤＮＡからはｍＲＮＡが合成される
が、ｍＲＮＡの５′末端はキャップ構造の付加、正常な
位置でのスプライシング及び８′末端へのポリアゾニレ
−ジョンが必要である。また活性のあるＩＦＮの発現に
は、合成されるＩＦＮペプタイドの正常な高次構造の形
成と維持、更にはシグナルペプタイドの切断、細胞から
の分泌が正確に行なわれる必要がある。本発明者らが試
用した動物培養細胞はアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ＡＴＯＯ）から入手したＭＯＰＣ−８１０（
プラストサイトーマ）。
Ｉ Ｆ Ｎ−γの核ＤＮＡ配列を導入された細胞がＨ
ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを産生する為には、該ＤＮＡ配列が
、用いた細胞固有のＲＮＡ合成系、ＲＮＡの成熟、蛋白
合成系、蛋白の成熟１分泌等の機能に適合している必要
がある。導入されたＤＮＡからはｍＲＮＡが合成される
が、ｍＲＮＡの５′末端はキャップ構造の付加、正常な
位置でのスプライシング及び８′末端へのポリアゾニレ
−ジョンが必要である。また活性のあるＩＦＮの発現に
は、合成されるＩＦＮペプタイドの正常な高次構造の形
成と維持、更にはシグナルペプタイドの切断、細胞から
の分泌が正確に行なわれる必要がある。本発明者らが試
用した動物培養細胞はアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ＡＴＯＯ）から入手したＭＯＰＣ−８１０（
プラストサイトーマ）。
ＭＰＯ１１（ミエローマ）、 ＭＢ ＩＩＩ （リンホ
ザルコーマ）、ＲＢＬ−１（ロイケミツク バソフイリ
ツク グラニスロサイト）、ＲＰＭＩ ７６６６（リン
ホブラストイド）ｓＭＯＬＴ−８（アキュート リンホ
ブラスチック ロイケミア）、Ｌ１２１０、ＯＯＲＦ−
ＯＥＭ、Ｕ９３７．Ｐａ−Ｘ６Ｂ−Ａｙ８．６５ Ｂあ
るいはＥＬ４ Ｆａｒｒａｒ Ｊ、 Ｊ、ジャーナル・
オブ・イミュノロジー、１２５巻、２５５５頁（１９８
０年）などであるが、本明細書に示されているＨｕ Ｉ
Ｆ Ｎ−γの製造法を用いれば、少くとも哺乳類の血
球由来の株化細胞、融合細胞、正常及び変異細胞、ウィ
ルスによる形質転換細胞等において活性あるＨｕＩＦＮ
−１を産生ずることが可能である。
ザルコーマ）、ＲＢＬ−１（ロイケミツク バソフイリ
ツク グラニスロサイト）、ＲＰＭＩ ７６６６（リン
ホブラストイド）ｓＭＯＬＴ−８（アキュート リンホ
ブラスチック ロイケミア）、Ｌ１２１０、ＯＯＲＦ−
ＯＥＭ、Ｕ９３７．Ｐａ−Ｘ６Ｂ−Ａｙ８．６５ Ｂあ
るいはＥＬ４ Ｆａｒｒａｒ Ｊ、 Ｊ、ジャーナル・
オブ・イミュノロジー、１２５巻、２５５５頁（１９８
０年）などであるが、本明細書に示されているＨｕ Ｉ
Ｆ Ｎ−γの製造法を用いれば、少くとも哺乳類の血
球由来の株化細胞、融合細胞、正常及び変異細胞、ウィ
ルスによる形質転換細胞等において活性あるＨｕＩＦＮ
−１を産生ずることが可能である。
機能するプロモーターを接続したｎｕ Ｉ Ｉｔ’ Ｎ
−γ核ＤＮＡ配列を、例えば細胞融合法で血球由来の株
化細胞に導入し、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを産生するよう
になった細胞は、通常細胞の培養に用いられる血清を含
んだ培地ばかりでなく、全く血清を含まない無血清培地
でもＨｕＩＦＮ−１を産生する事を見い出した。Ｈｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γの生産に無血清培地を用いる事はＨｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γの培地からの回収精製をより容易にする
ものである。
−γ核ＤＮＡ配列を、例えば細胞融合法で血球由来の株
化細胞に導入し、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを産生するよう
になった細胞は、通常細胞の培養に用いられる血清を含
んだ培地ばかりでなく、全く血清を含まない無血清培地
でもＨｕＩＦＮ−１を産生する事を見い出した。Ｈｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γの生産に無血清培地を用いる事はＨｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γの培地からの回収精製をより容易にする
ものである。
（発明の効果）
以上のように遺伝子導入によりＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの
生産株になった細胞は、現在の知見からは、ヌードマウ
ス或いはハムスター等の動物体内で増殖させることが可
能である。又それらの動物の腹腔液や血清中からＨｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γを回収する事も可能なことと思われる。
生産株になった細胞は、現在の知見からは、ヌードマウ
ス或いはハムスター等の動物体内で増殖させることが可
能である。又それらの動物の腹腔液や血清中からＨｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γを回収する事も可能なことと思われる。
また細胞を動物体内で増殖させ、細胞を回収し、培養液
中で培養することによりＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを産生す
る事も可能と思われる。
中で培養することによりＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γを産生す
る事も可能と思われる。
（実施例）
以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑
誌、載置を参考とした。
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑
誌、載置を参考とした。
（１）蛋白質 核酸 酵素、２６巻、４号、 （１９８
１年）臨時増刊 遺伝子操作（共立出版）（２）遺伝子
操作実験法、高木康敬 編著（１９８０年） 講談社 （３）遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（１９８２
年） 講談社 （４） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ 、 Ｔ、 Ｍａｎ
ｉａｔｉＳら編（１９８２年）Ｃ！ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｓ） Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６５巻＋
Ｒ，Ｗｕ編（１９７９年） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ実施例Ｉ Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γ発現ベクターの細胞への導入と１
、ＦＮの発現 ＨｕＩＦＮ−ｒ発現ベクターｐｓＶｅｓｍａ Ｉ １は
第１図に示したように、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γ遺伝子Ｓ
Ｖ４０の初期プロモーターが接続した配列を有している
。
１年）臨時増刊 遺伝子操作（共立出版）（２）遺伝子
操作実験法、高木康敬 編著（１９８０年） 講談社 （３）遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（１９８２
年） 講談社 （４） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ 、 Ｔ、 Ｍａｎ
ｉａｔｉＳら編（１９８２年）Ｃ！ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｓ） Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６５巻＋
Ｒ，Ｗｕ編（１９７９年） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ実施例Ｉ Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γ発現ベクターの細胞への導入と１
、ＦＮの発現 ＨｕＩＦＮ−ｒ発現ベクターｐｓＶｅｓｍａ Ｉ １は
第１図に示したように、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γ遺伝子Ｓ
Ｖ４０の初期プロモーターが接続した配列を有している
。
また形質転換株がミコフェノール酸耐性株として選択で
きるように大腸菌のグアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を有している。更に大量調製の為に大腸
菌のプラスミドｐＢＲ８２２に由来するアンピシリン耐
性遺伝子とＤＮＡの複製起点を有している。このＨｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γ発現ベクター ｐｓＶｅ Ｓｍａ ｌγ
の作製は以下のように行った。
きるように大腸菌のグアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を有している。更に大量調製の為に大腸
菌のプラスミドｐＢＲ８２２に由来するアンピシリン耐
性遺伝子とＤＮＡの複製起点を有している。このＨｕ
Ｉ Ｆ Ｎ−γ発現ベクター ｐｓＶｅ Ｓｍａ ｌγ
の作製は以下のように行った。
Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−Ｉ Ｄ Ｎ Ａは、ヒト染色体ＤＮ
Ａを制限酵素ＢａｍＨＩで切断した場合、８．６キロベ
ース（Ｋｌ：＋）のＤＮＡ断片中に含まれる（タヤらザ
・エンボ・シャーナ／ｌ／ （Ｔｈｅ ＥＭＢＯＪ、
） １巻、９５３頁、１９８２年）。健康人のヒト白血
球細胞からＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨＩで切断後、０ｈ
ａｒｏｎ４Ａフアージを用いるプラークハイブリダイゼ
ーションにより、ＨｕＩＦＮ−γ核ＤＮＡを得た。この
断片を一担ｐＢＲ８２２（Ｂｏｌｉｖａｒ 、 Ｆ、ら
（１９７７年） シーン（Ｇｅｎｅ） ２巻、９５頁）
のＢａｍＨ１部位に挿入し、プラスミドｐＢＲγ８．６
−１を作製後、培養、増殖した後プラスミドを回収、Ｂ
ａｍＨｉで再び切断して、プラスミドｐｓ Ｖ ２ ｇ
ｐｔ （Ｍｕｌｌｉｇａｍ 。
Ａを制限酵素ＢａｍＨＩで切断した場合、８．６キロベ
ース（Ｋｌ：＋）のＤＮＡ断片中に含まれる（タヤらザ
・エンボ・シャーナ／ｌ／ （Ｔｈｅ ＥＭＢＯＪ、
） １巻、９５３頁、１９８２年）。健康人のヒト白血
球細胞からＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨＩで切断後、０ｈ
ａｒｏｎ４Ａフアージを用いるプラークハイブリダイゼ
ーションにより、ＨｕＩＦＮ−γ核ＤＮＡを得た。この
断片を一担ｐＢＲ８２２（Ｂｏｌｉｖａｒ 、 Ｆ、ら
（１９７７年） シーン（Ｇｅｎｅ） ２巻、９５頁）
のＢａｍＨ１部位に挿入し、プラスミドｐＢＲγ８．６
−１を作製後、培養、増殖した後プラスミドを回収、Ｂ
ａｍＨｉで再び切断して、プラスミドｐｓ Ｖ ２ ｇ
ｐｔ （Ｍｕｌｌｉｇａｍ 。
Ｒ，Ｇ！、とＢｅｒｇ、Ｐ、（１９８０年）サイエンス
（５ｃｉｅｎｃｅ ） 、 ２０９巻、１４２２頁）の
ＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐ８Ｖ２γ８．６−１を得た
。
（５ｃｉｅｎｃｅ ） 、 ２０９巻、１４２２頁）の
ＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐ８Ｖ２γ８．６−１を得た
。
ＨｕＩＦＮ−ｒ発現ベクターｐｓＶｅｓｍａｌγ はｐ
ＢＲ８，６−１、ｐｓＶ２ｇｐｔ及びｐｓｖａｇｐｔ
カら作成した。即ち、ｐｓｖａｇｐｔをＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで切断し、最も大きいＤＮＡ断片を環状化しｐＨ１を
作製した。次にｐＨ１のＰｖｕ１部位を５ａ１１部位に
改め、ｐＨ２を作製した。更にｐＨ２のＨｉｎｄ Ｎ部
位にＳｍａ １部位を導入しｐＨ８ｍａＩを作製した。
ＢＲ８，６−１、ｐｓＶ２ｇｐｔ及びｐｓｖａｇｐｔ
カら作成した。即ち、ｐｓｖａｇｐｔをＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで切断し、最も大きいＤＮＡ断片を環状化しｐＨ１を
作製した。次にｐＨ１のＰｖｕ１部位を５ａ１１部位に
改め、ｐＨ２を作製した。更にｐＨ２のＨｉｎｄ Ｎ部
位にＳｍａ １部位を導入しｐＨ８ｍａＩを作製した。
一方、ｐｓＶ２ｇｐｔのＢａｍＨ１部位を切断後、平滑
末端にしＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼで環状化して作製したｐ
Ｓ１をＳａｌ ｌ 、 ＥｃｏＲｌ切断し、同じ＜５ａ
ｌＪ。
末端にしＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼで環状化して作製したｐ
Ｓ１をＳａｌ ｌ 、 ＥｃｏＲｌ切断し、同じ＜５ａ
ｌＪ。
ＥｃｏＲｌ切断した前記ｐＨ８ｍａ Ｉ断片とを結合さ
せｐｓｖ８ｓｍａ Ｉをツ＜ッた。次にｐＢＲγ８．６
−１をＭｓｔｌ［で切断し、末端を平滑末端にし、次に
ＢａｍＨＩで切断し、ＨｕＩＦＮ−１配列を持ツＤＮＡ
断片を得、これをＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ切断したｐｓＶ
ｅｓｍａ Ｉに導入しｐＳｖｅＳｍａＩγを作製した。
せｐｓｖ８ｓｍａ Ｉをツ＜ッた。次にｐＢＲγ８．６
−１をＭｓｔｌ［で切断し、末端を平滑末端にし、次に
ＢａｍＨＩで切断し、ＨｕＩＦＮ−１配列を持ツＤＮＡ
断片を得、これをＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ切断したｐｓＶ
ｅｓｍａ Ｉに導入しｐＳｖｅＳｍａＩγを作製した。
これらの方法は、既に特願昭５９−１１９６４８に詳し
く記述した。
く記述した。
アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した
種々の表−１記載の血球由来の株化細胞に、ＨｕＩＦＮ
−ｒ発現ベクターｐｓＶｅｓｍａＩγの導入をＯｉらの
方法（Ｏｉ、 Ｖ、 Ｔ、ら（１９８３年）プロシーデ
イングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカテミー・オブ・
サイエンス・ニーニスニー。
種々の表−１記載の血球由来の株化細胞に、ＨｕＩＦＮ
−ｒ発現ベクターｐｓＶｅｓｍａＩγの導入をＯｉらの
方法（Ｏｉ、 Ｖ、 Ｔ、ら（１９８３年）プロシーデ
イングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカテミー・オブ・
サイエンス・ニーニスニー。
８０巻、８２５頁）に準じて行った。
プラスミドｐｓＶｅｓｍａＩγを保持する大腸菌に一１
２株Ｃ６Ｃ６００ｒ−を、Ｌ培地で６００ｎｍの吸光度
が０．６から０．８になるまで３７°Ｃで培養した。
２株Ｃ６Ｃ６００ｒ−を、Ｌ培地で６００ｎｍの吸光度
が０．６から０．８になるまで３７°Ｃで培養した。
クロラムフェニコールを１２５μｆ／ｍｌになるヨウに
加え、更に１２から１６時間培養し、遠沈、集菌した。
加え、更に１２から１６時間培養し、遠沈、集菌した。
２５ｚｌの培地あたり、冷却した２０％蔗糖を含む０．
０５Ｍトリス−塩酸（１）Ｈ８，Ｏ）を加え、バクテリ
アを分散させた。５ダ／耐濃度のリゾチーム液０．２５
ｍｌを加え、５分間水中に放置後、０．５ｘｌの０．
２５Ｍ ＥＤ’ｌ”Ａ（ｐＨ８，０）を加え、更に５
分間水中に放置した。０．０５Ｍ Ｆ−リス−塩酸（ｐ
Ｈ８，０）を加え８７°Ｃで１０分から１５分インキュ
ベートして大腸菌をプロトプラストにした。
０５Ｍトリス−塩酸（１）Ｈ８，Ｏ）を加え、バクテリ
アを分散させた。５ダ／耐濃度のリゾチーム液０．２５
ｍｌを加え、５分間水中に放置後、０．５ｘｌの０．
２５Ｍ ＥＤ’ｌ”Ａ（ｐＨ８，０）を加え、更に５
分間水中に放置した。０．０５Ｍ Ｆ−リス−塩酸（ｐ
Ｈ８，０）を加え８７°Ｃで１０分から１５分インキュ
ベートして大腸菌をプロトプラストにした。
プロトプラストを１０％の蔗糖を含むダルベツコ変法Ｍ
ＥＭ培地１０ｇ／で希釈し、更に室温に１０分装いた。
ＥＭ培地１０ｇ／で希釈し、更に室温に１０分装いた。
一方、１０％仔牛脂児血清を含むダルベツコ変法ＭＥＭ
培地で血球由来の株化細胞を１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに
増殖させ、２Ｘ１０’の細胞に対してプロトプラスト懸
濁液を５ｘｌ加え、室温で約５００ｘｆで遠゛心した。
培地で血球由来の株化細胞を１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに
増殖させ、２Ｘ１０’の細胞に対してプロトプラスト懸
濁液を５ｘｌ加え、室温で約５００ｘｆで遠゛心した。
上澄をのぞき、沈殿にダルベツコ変法ＭＥＭ培地に溶か
した５０％ポリエチレングリコール液（ｐＨ８，０）
２ｘｌを加え、ゆっくりと攪拌し、３分間５００ｘｇで
遠心した。７ｘｌのダルベツコ変法ＭＥＭ培地で細胞を
洗浄後、１０％の仔牛脂児血清を含むダルベツコ変法Ｍ
ＥＮ培地に分散させ、２４穴マルチデイツシユプレート
で細胞濃度２ Ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ ・ｍ
ｌで培養した。４８時間後に培養上澄をとり、培地に含
まれるＩＦＮ活性を、ＦＬ細胞とベスキュラー・ストマ
チチス・ウィルス（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉ
ｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ ）或いはシンドビス・ウィルス（
５ｉｎｄｏｂｉｓ Ｖｉｒｕｓ ）を用いたＯＰＥ阻止
法（Ｐｈ１ｌｉｐ 、 ０．ら（１９８１年）メソツズ
・イン・エンザイモロジー、７８巻。
した５０％ポリエチレングリコール液（ｐＨ８，０）
２ｘｌを加え、ゆっくりと攪拌し、３分間５００ｘｇで
遠心した。７ｘｌのダルベツコ変法ＭＥＭ培地で細胞を
洗浄後、１０％の仔牛脂児血清を含むダルベツコ変法Ｍ
ＥＮ培地に分散させ、２４穴マルチデイツシユプレート
で細胞濃度２ Ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ ・ｍ
ｌで培養した。４８時間後に培養上澄をとり、培地に含
まれるＩＦＮ活性を、ＦＬ細胞とベスキュラー・ストマ
チチス・ウィルス（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉ
ｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ ）或いはシンドビス・ウィルス（
５ｉｎｄｏｂｉｓ Ｖｉｒｕｓ ）を用いたＯＰＥ阻止
法（Ｐｈ１ｌｉｐ 、 ０．ら（１９８１年）メソツズ
・イン・エンザイモロジー、７８巻。
３８７頁）で測定した。表−１に示すように、ｐｓＶｅ
ｓｍａＩγをプロトプラスト融合法で導入した細胞はＩ
ＦＮの発現がみられた。
ｓｍａＩγをプロトプラスト融合法で導入した細胞はＩ
ＦＮの発現がみられた。
以下余白
表−１
プロトプラスト融合によるＩＦＮの生産”Ｅ Ｌ ４
： Ｆａｒｒａｒ Ｊ’、 Ｊ、ら（１９８０）ジャー
ナル・オブ・イミュノロジー、１２５巻、２５５５頁実
施例２ Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの通常培地及び無血清培地での生
実施例１゛でｐｓＶｅ８ｍａｌγをプロトプラスト融合
法で導入したＭＯＰＣ−３１Ｃ細胞を、１０％牛脂児血
清、２５μｇ／ｚｌミコフェノール酸、２５０μｙ／ｍ
ｌキサンチン、５μｍ４１チミジン、０．１μｆ／ｍｌ
アミノプテリン及び２５μｇ／Ｍｔアデニンを含むダル
ベツコ変法ＭＥＭ培地に更新し、８乃至４週間培養をつ
づけ、ミコフェノール酸耐性株を分離した。ミコフェノ
ール酸耐性株を２４穴マルチデイツシユの底面全面に培
養し、５％牛脂児血清を含む或いは含まないダルベツコ
変法ＭＥＭ培地で４８時間培養し、培地中に含まれるＩ
ＦＮ活性を測定した。表−２に示すように、分離された
細胞株は血清の有無にかかわらずＩＦＮを生産した。
： Ｆａｒｒａｒ Ｊ’、 Ｊ、ら（１９８０）ジャー
ナル・オブ・イミュノロジー、１２５巻、２５５５頁実
施例２ Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γの通常培地及び無血清培地での生
実施例１゛でｐｓＶｅ８ｍａｌγをプロトプラスト融合
法で導入したＭＯＰＣ−３１Ｃ細胞を、１０％牛脂児血
清、２５μｇ／ｚｌミコフェノール酸、２５０μｙ／ｍ
ｌキサンチン、５μｍ４１チミジン、０．１μｆ／ｍｌ
アミノプテリン及び２５μｇ／Ｍｔアデニンを含むダル
ベツコ変法ＭＥＭ培地に更新し、８乃至４週間培養をつ
づけ、ミコフェノール酸耐性株を分離した。ミコフェノ
ール酸耐性株を２４穴マルチデイツシユの底面全面に培
養し、５％牛脂児血清を含む或いは含まないダルベツコ
変法ＭＥＭ培地で４８時間培養し、培地中に含まれるＩ
ＦＮ活性を測定した。表−２に示すように、分離された
細胞株は血清の有無にかかわらずＩＦＮを生産した。
また同様にＭＰＯ１１，ＥＬ４もＩＦＮの発現がみられ
た。
た。
表−２
分離されたミコフェノール酸耐性株によるＩＦＨの生産
第１図は、プラスミドｐｓＶｅｓｍａ５ の構造を示す
図である。 ＨｕＩＦＮ−１，５Ｖｅｓ Ａｍｐ 及びＥｃｏｇｐｔ
は、それぞれＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γ遺伝子、ＳＶ４０の
初期プロモーター、アンピシリン耐性遺伝子及び大腸菌
のグアニンホスホリボシルトランスフエラーセ遺伝子を
示す。Ｏｒｉは大腸菌での複製起点を示す。 ＢａｍＨｌ ＊ ＥＯＯＲ１，８ａｌ Ｉ、 Ｈｉｎｄ
ｌ及びＰｒｕｌ［は、それぞれ制限酵素ＢａｍＨｌ
、 ＥｃｏＲｌ 、 Ｓａｌ ｌ。 Ｈｉｎｄ ＩＩ及びＰｒｕｌの認識部位を示す。
図である。 ＨｕＩＦＮ−１，５Ｖｅｓ Ａｍｐ 及びＥｃｏｇｐｔ
は、それぞれＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−γ遺伝子、ＳＶ４０の
初期プロモーター、アンピシリン耐性遺伝子及び大腸菌
のグアニンホスホリボシルトランスフエラーセ遺伝子を
示す。Ｏｒｉは大腸菌での複製起点を示す。 ＢａｍＨｌ ＊ ＥＯＯＲ１，８ａｌ Ｉ、 Ｈｉｎｄ
ｌ及びＰｒｕｌ［は、それぞれ制限酵素ＢａｍＨｌ
、 ＥｃｏＲｌ 、 Ｓａｌ ｌ。 Ｈｉｎｄ ＩＩ及びＰｒｕｌの認識部位を示す。
Claims (14)
- （１）ヒトインターフェロン−γをコードするＤＮＡ配
列とこれに接続した動物培養細胞で機能する他の遺伝子
のプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を持つＤＮＡによ
つて形質転換された、血球由来の株化細胞。 - （２）ヒトインターフェロン−γをコードするＤＮＡ配
列が核ＤＮＡ配列である特許請求の範囲第１項記載の血
球由来の株化細胞。 - （３）細胞がリンパ系の株化細胞である特許請求の範囲
第１項または第２項記載の株化細胞。 - （４）細胞がグロブリンを産生している株化細胞である
特許請求の範囲第１項乃至第３項の何れかの項記載の株
化細胞。 - （５）細胞がＭＯＰＣ−３１Ｃ、ＭＰＣ１１、ＥＬ４、
ＭＢＩＩＩ、ＲＰＭＩ ７６６６、ＭＯＬＴ−３、ＢＲ
Ｌ−１或いはＬ１２１０である特許請求の範囲第１項乃
至第４項の何れかの項記載の株化細胞。 - （６）ヒトインターフェロン−γをコードするＤＮＡ配
列とこれに接続した動物培養細胞で機能する他の遺伝子
のプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を持つＤＮＡによ
つて形質転換された、血球由来の株化細胞を培養して、
ヒトインターフェロン−γを生成せしめ、これを採取す
るヒトインターフェロン−γの製造方法。 - （７）ヒトインターフェロン−γをコードするＤＮＡ配
列が核ＤＮＡである特許請求の範囲第６項記載の製造方
法。 - （８）細胞がリンパ系の株化細胞である特許請求の範囲
第６項または第７項記載の製造方法。 - （９）細胞がグロブリンを産生している株化細胞である
特許請求の範囲第６項乃至第８項の何れかの項記載の製
造方法。 - （１０）細胞がＭＯＰＣ−３１Ｃ、ＭＰＣ１１、ＥＬ４
、ＭＢＩＩＩ、ＲＰＭＩ ７６６６、ＭＯＬＴ−３、Ｂ
ＲＬ−１或いはＬ１２１０である特許請求の範囲第６項
乃至第９項の何れかの項記載の製造方法。 - （１１）株化細胞を培養液中で培養し、培養液からヒト
インターフェロンを回収する特許請求の範囲第６項乃至
第１０項の何れかの項記載の製造方法。 - （１２）培養培地が無血清培地である特許請求の範囲第
６項乃至第１１項の何れかの項記載の製造方法。 - （１３）株化細胞を動物体内で増殖させ、ヒトインター
フェロン−γを該動物から回収する特許請求の範囲第６
項記載の製造方法。 - （１４）株化細胞を動物体内で増殖させた後、細胞を回
収し培養液中で培養する特許請求の範囲第６項または第
１３項記載の製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60091619A JPS61249385A (ja) | 1985-04-27 | 1985-04-27 | 形質転換血球由来株化細胞およびそれを用いるヒトインタ−フエロン−γの製造方法 |
| CA000482839A CA1302320C (en) | 1984-06-11 | 1985-05-30 | Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells |
| EP85107142A EP0167852B1 (en) | 1984-06-11 | 1985-06-11 | Human interferon-gamma |
| DE8585107142T DE3586574T2 (de) | 1984-06-11 | 1985-06-11 | Menschliches gamma-interferon. |
| US07/144,988 US4970161A (en) | 1984-06-11 | 1988-01-19 | Human interferon-gamma |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60091619A JPS61249385A (ja) | 1985-04-27 | 1985-04-27 | 形質転換血球由来株化細胞およびそれを用いるヒトインタ−フエロン−γの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61249385A true JPS61249385A (ja) | 1986-11-06 |
Family
ID=14031587
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60091619A Pending JPS61249385A (ja) | 1984-06-11 | 1985-04-27 | 形質転換血球由来株化細胞およびそれを用いるヒトインタ−フエロン−γの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61249385A (ja) |
-
1985
- 1985-04-27 JP JP60091619A patent/JPS61249385A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2687995B2 (ja) | Ｄｎａ配列、組替えｄｎａ分子およびヒト繊維芽細胞インターフェロン様ポリペプチドの製造方法 | |
| KR0149012B1 (ko) | 사람 f크롬 수용체 iii | |
| EP0658627B1 (en) | Recombinant DNA with interferon-alpha promoter | |
| US5545723A (en) | Muteins of IFN-β | |
| US5672692A (en) | Purification of human myelomonocyte interferon gamma with an immobilized antibody | |
| JP3260368B2 (ja) | インターロイキン−１０による腫瘍性疾患の処置 | |
| JPH06315383A (ja) | Ｃｄ４０のための可溶性リガンド | |
| IE61773B1 (en) | Novel lymphokine related peptides | |
| CN101014626A (zh) | 糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素 | |
| Zimmermann et al. | Native versus recombinant high-mobility group B1 proteins: functional activity in vitro | |
| CN120225550A (zh) | Il-18变体多肽 | |
| JP6047524B2 (ja) | 内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の生産のためのヒト細胞株の同定 | |
| CA2265923A1 (en) | Human proteins having secretory signal sequences and dnas encoding these proteins | |
| JP2001511342A (ja) | 内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の生産のためのヒト細胞株の同定 | |
| US4970161A (en) | Human interferon-gamma | |
| JPS61249385A (ja) | 形質転換血球由来株化細胞およびそれを用いるヒトインタ−フエロン−γの製造方法 | |
| US6548296B1 (en) | Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof | |
| GB2194240A (en) | Preparation of interferon-gamma | |
| EP0444638A2 (en) | Process for the expression of human nerve growth factor in arthropoda frugiperda cells by infection with recombinant baculovirus | |
| JPH05103675A (ja) | ヒト神経成長因子２の製造法 | |
| JPS6188875A (ja) | ヒトインタ−フエロン−γ | |
| JPS61249394A (ja) | インタ−フエロン−γ | |
| WO1992017500A1 (fr) | Nouveau facteur d'amplification de megacaryocytes et son procede de production | |
| EP0198386A2 (en) | Sustained high-level production of recombinant human gamma interferon using a bovine papillomavirus vector | |
| Waldman et al. | Transfer of herpes simplex virus thymidine kinase synthesized in bacteria by a high-expression plasmid to tissue culture cells by protoplast fusion |