JPS6125358B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は含燐アミノ酸の製造法に関するもので
ある。

更に詳しくは、下記の一般式： （式中、Ｒはハロゲン置換又は非置換アシル基を
意味する）で表わされるＮ―アシル―Ｄ，Ｌ―２
―アミノ―４―メチル―フオスフイノ酪酸にシユ
ードモナス属に属する細菌、例えばシユードモナ
ス・マルトフイリアBN―233の培養菌体又はその
処理物を水性媒体下に作用させ、Ｌ―２―アミノ
―４―メチル―フオスフイノ酪酸とＮ―アシル―
Ｄ―２―アミノ―４―メチル―フオスフイノ酪酸
との混合物に変換して光学分割を行ない、Ｎ―ア
シル―Ｄ体は更に酸等で加水分解されて、Ｌ―２
―アミノ―４―メチル―フオスフイノ酪酸とＤ―
２―アミノ―４―メチル―フオスフイノ酪酸を採
取することを特徴とする含燐アミノ酸の製造法に
関する。Ｄ，Ｌ―２―アミノ―４―メチル―フオ
スフイノ酪酸（以下Ｄ，Ｌ―MPGAと略称する）
又はその金属及び有機塩基との塩は農園芸用殺菌
剤とし有用である（特開昭40―14644号、特開昭
49―14641号及び特開昭49―26430号公報）のみな
らず、除草剤、特に多年性雑草及び雑かん木防除
用除草剤として優れた効力を発揮する有用な化合
物である（特開昭52―139727号公報）。

しかしながら、本物質のその後の除草作用の研
究において、Ｌ―MPGAの除草効力はラセミ体、
即ちＤ，Ｌ―MPGAのそれよりも約２倍強いこと
から明らかになり、主たる除草作用の本質はＬ―
MPGAに起因するものでＤ―MPGAに起因するも
のでないことが認められた。従つて環境汚染の見
地からはＤ，Ｌ―体よりはＬ―体散布の方が好ま
しい。

Ｌ―MPGAの製造に当つては抗菌剤として見出
されたSF―1293物質、即ちＬ―MPGA―アラニ
ル―アラニン（特開昭48―22688号公報、
Helvetica Chimica Acta，Vol，55，Fase1，第
224〜239頁、1972年）を酸分解する（特開昭48―
85538号公報）か、あるいは微生物酸素で分解し
て得る方法（特開昭49―31890号公報）が知られ
ている。一方化学的合成法（特開昭48―91019号
及び特開昭52−13972号公報）でもMPGAが得ら
れるが、この場合はラセミ体、即ち光学異性体で
あるＤ―体とＬ―体の混合物として得られる。

本発明者等は化学合成法で得られたＤ，Ｌ―
MPGAの光学分割法についで鋭意研究を重ねた結
果、化学的に合成されるＮ―アシル―Ｄ，Ｌ―
MPGAの微生物酵素、アシラーゼによる光学分割
法を発見して本発明を完成させ、こゝにその方法
を提供せんとするものである。

以下にその概要を述べる。

化学的合成法で得られるＮ―アシル―MPGAの
ラセミ体、即ちＮ―アシル―Ｄ―MPGAとＮ―ア
シル―Ｌ―MPGAの混合物に対し、そのＤ―体に
は作用せず、そのＬ―体アシル基のみを特異的に
酵素水解し得る微生物アシラーゼを広く自然界に
求め探索した結果、シユードモナス属に属する細
菌がこの目的に合致するアシラーゼを生産するこ
とを見出した。この細菌アシラーゼをＮ―アシル
―MPGAのラセミ体に作用させ、Ｌ―MPGAとＮ
―アシル―Ｄ―MPGAとの混合物に導き、それぞ
れ分別採取することができる。

本酵素の基質となるＮ―アシル―Ｄ，Ｌ―
MPGAのアシル基は本微生物酵素で分解されてＬ
―MPGAを生成し得るアシル基であればどんな基
であつてもよが、通常工業的に用いられる基とし
てはアルカノイル及びアロイル基で、その中で
も、アセチル、プロピオニル、ブチリルのような
炭素数２〜４個のアルカノイル基及びベンゾイル
基等が有利であり、またこれらの基の水素原子が
ハロゲン原子と置換されていることは本酵素反応
を妨げないかぎり何等制限されない。

本発明において、この目的に叶うアシラーゼ生
産性を有する細菌の例としては、本発明者らが愛
知県知多半島の土壌より分離したシユードモナス
マルトフイリアBN―233があり、その菌学的性状
を示せば以下の通りである。

シユードモナス・マルトフイリアBN―233の菌
学的性状 (a) 形態的性質 肉汁寒天上で培養した細胞は、0.5〜0.7×1.0
〜2.0ミクロンの桿菌であり、極毛性のベン毛
で運動する。胞子は作らず多形性も示さない。
グラム染色性は陰性である。

(b) 培養的性質 (1) 肉汁寒天培養：菌体は黄茶色を呈して増殖
する。拡散性色素の生産、シワ様増殖、粘稠
性、遊走性は認められない。

(2) 肉汁培養：培地全体が濁り、菌膜形成は認
められない。

(3) 肉汁ゼラチン穿刺培養：液化される。

(4) ミルク培養：アルカリ性と呈しながら液化
される。

(c) 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰 性 (2) 脱窒反応：陰 性 (3) MRテスト：陰 性 (4) VPテスト：陰 性 (5) インドール生成：陰 性 (6) 硫化水素の生成：鉛糖紙を黒変するが、
TSI培地は黒変しない。

(7) デンプンの加水分解：陰 性 (8) クエン酸の利用：陽 性 (9) アンモニウム塩を唯一のＮ源として利用する
が、硝酸塩は唯一のＮ源にはならない。

(10) キングＡ，Ｂ培地で顕著な水溶性色素の生成
は認められない。

（11） 栄養要求性：メチオニンだけを要求す
る。

（12） ポリベーターハイドロキシプチレートの
菌体内蓄積：陰 性 （13） オキシターゼ：陰 性 （14） 15〜37℃で生育するが、５℃，42℃では
生育しない。

（15） 嫌気条件下で生育できない。

（16） O.Fテスト：Ｏ 型 （17） 炭素源の利用性 ） 次の炭素化合物を唯一の炭素源として生
育できる。グルコース、マルトース、セロビ
オース、ラクトース ） 次の炭素化合物を唯一の炭素源として生
育できない。グリセリン、グルタール酸 以上の菌学的性質を有するBN―233株をバーシ
ーズ・マニユアル・オブ・デターミネイテイブ・
バクテリオロジー８版（Hergey′s Manual of Determinative Bacteriology，Ｓ th
Edition 1974）に従つて同定し、次の結論に至つ
た。

） グラム陰性桿菌で胞子を作らず、極毛によ
つて運動するという形態的性質を有し、絶対好
気性であるとから、この菌株はシユードモナス
（Pseudomonas）属に所属すると判定した。

） メチオニンを要求し、オキシダーゼ陰性、
ゼラチン液化陽性及び糖の利用スペクトルか
ら、この菌株はシユードモナス属の中でもシユ
ードモナスマルトフイリア（Pseudomonas
meltophilla）の種に所属するものと判定し
た。

以上の理由から、この菌株をシユードモナスマ
ルトフイリアBN―233（Pseudomonas
maltophilia BN―233）と命名した。なお本菌株
は、工業技術院微生物工業技術研究所に昭和53年
４月28日以降寄託されており、その微生物受託番
号は微工研菌寄第4487号（FERM―ＰNo.4487）
である。

上記に示した菌株は、他の一般微生物の菌株に
見られるようにその性状が変化しやすく、例えば
紫外線、高周波、放射線や化学変異剤等を用いる
人工変異の手段で変異し得るものであり、このよ
うな変異株であつても目的のアシラーゼ生産能を
有する菌株は全て本発明の方法に使用することが
できる。

Ｎ―アシル―MPGAのラセミ分割を行ないＬ―
MPGA及びＤ―MPGAを製造するため本発明の方
法を実施するに当つては、まず前述のアシラーゼ
生産菌を培養し、得られる培養物またはそれらの
処理物を原料化合物（Ｎ―アシル―Ｄ，Ｌ―
MPGA）に適当な条件下で水性媒体中で作用させ
るのがよい。微生物の培養物を得るための培養方
法としては、通常微生物が利用し得る栄養物を含
有する培地で培養することができる。栄養源とし
ては一般微生物に利用される公知のものが使用で
きる。例えば炭素源としてグルコース、蔗糖、澱
粉、グリセリン、水飴、糖蜜、植物油等を使用し
得る。また窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、肉
エキス、ペプトン、コーンステイーブリカー、乾
燥酵母、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を
使用し得る。その他必要に応じて食塩、塩化カ
リ、炭酸カルシウム、燐酸塩その他の無機塩のほ
か、菌の発育を助け、前記アシラーゼの生産促進
に必要な添加物を適宜組合せ使用することができ
る。培養方法としては微生物一般に用いられる培
養法、即ち固型培養法ならびに液体培養法が可能
であり、工業的には深部培養法が適している。培
養は好気的条件で行なわれ、培養温度は25〜37℃
の範囲で選ばれるが、多くの場合28℃付近で行な
うのが適当である。培養時間は培養条件、特に培
養装置、培地組成、培地温度などによつて異なる
が、アシラーゼ活性が最大になる時点に培養を終
了するのが良い。例えば培地の種類や濃度によつ
て多少異なるが培養１日目からアシラーゼ活性が
見られ、２〜３日でその活性は最大となり、それ
以後活性は低下し消失する。従つて通常２〜４日
培養が適当である。

上記の方法で得られた培養物またはその処理物
がＮ―アシル―MPGAの光学分割に用いられる
が、ここでいう培養処理物とは培養物に適当な処
理を加えて目的とするアシル分解の能率を高め、
目的地Ｌ―MPGA及びＤ―MPGAの製造に有利な
形にしたものを指す。例えば培養物から集菌洗浄
された菌体、菌体の超音波処理、細胞破砕やその
他の処理でアシラーゼを抽出精製したものや、菌
体や抽出精製酵素に更に固形化処理を施したもの
等を指す。

本法において脱アシル化酵素反応によつてＬ―
MPGAを製造する場合、通常反応は水性媒体中で
行なわれる。その場合の反応条件としては酵素の
性質を最大限に生かす条件が選ばれる。本法で用
いられる菌体含有の状態でアシラーゼ酵素のおよ
そ性質を示せば、反応はpH6〜８でアシラーゼ活
性が高く、pH5以下又は９以上では活性が低下す
るか又は認められない。作用温度は20〜45℃であ
るが、50℃以上では失活する。

従つて、反応pHは6.5〜7.5，反応温度は25〜
40℃が好適である。本酵素はＮ―アシル―Ｌ―
MPGA以外の基質、例えば他の一般のＬ―アミノ
酸のＮ―アシル体に対しては作用が弱いかほとん
ど作用しない。

洗浄菌体を用いる場合、基質溶液中に菌体を分
散し、濁液中の中で反応が実施されるのが好まし
いが、この際適当な振盪又は撹拌を伴なわせる方
が効果的である。あるいは培養物またはその処理
物を一旦カラムに充填し、基質溶液がこのカラム
内を通過する際に脱アシル化反応を連続して行な
われるような形で実施することも可能である。反
応時間は基質濃度、脱アシル活性の強さや反応温
度などに左右されるが、通常２〜40時間であつ
て、目的のＬ―MPGAが最高に生成される時間を
検討し、適当な時間で反応を終了すればよい。基
質濃度は主として脱アシル化活性の強さとの関係
で決められるが0.1〜10％の範囲で適当に選ばれ
る。一方、反応中反応液が他の微生物で汚染され
ることを防ぐ目的で適当な汚染防止剤を用いるこ
とも可能である。

以上のごとく生成されたＬ―MPGAとＮ―アシ
ル―Ｄ―MPGAを分別、採集するには、反応終了
混液を別又は遠心分離等の操作により菌体又は
その処理物を除き、反応液を強酸性樹脂、例え
ばダウエツクス50（ダウケミカル社）のカラムを
通すと未反応のＮ―アシル―Ｄ―MPGAは素通り
画分に含まれ、カラムを更に水で展開するとニン
ヒドリン反応陽性物質であるＬ―MPGAが溶出さ
れる。これを必要に応じ活性炭又は弱塩基性樹
脂、例えばダウエツクス（ダウケミカル社）で処
理するとほぼ純粋状態の溶液が得られ、更に濃縮
して結晶化するか又は凍結乾燥すればＬ―MPGA
の結晶又は白色粉末が得られる。

一方、先に分画されたＮ―アシル―Ｄ―MPGA
は酸で加水分解することにつてアシル基を離脱し
てＤ―MPGAとすることができ、中和後更に前述
の樹脂処理を行なうことによつて純粋なＤ―
MPGAを得ることができる。

なお、酵素反応の進行状態は以下に示す測定法
によりＬ―MPGAの生成量を測定し、反応の終了
点を知ることができる。

Ｄ，Ｌ―MPGAの測定法： Ｄ，Ｌ―MPGAはE.W.YemmとB.C.Cocking
（Analyst，Vol，80，209頁、1955年）のニンヒ
ドリン比色法により測定でき、あらかじめ、DL
―MPGAの標準検量線を求め、その検量線より定
量することができる。

試 薬 類； Ａ液： 4M酢酸緩衝液（pH，50） Ｂ液： 0.01Mシアン化カリ溶液５mlとメチル
セロソルブ245mlを混合した溶液 Ｃ液： ニソヒドリン2.5ｇをメチルセロソル
ブ50mlに溶解した溶液 Ｄ液： Ｂ液を250mlとＣ液50mlの混合液 Ｅ液： 60％のエタノール溶液 測 定 操 作： 検液1.0mlを試験管に取り、Ａ液0.5mlとＤ液1.2
mlを加え混合して沸騰浴中で15分間保つた液、冷
水中で５分間冷却する。次にＥ液3.0mlを加えて
よく混合した後、分光光度計にて570nmの吸光度
を測定する。

Ｄ，Ｌ―MPGAは１μｇ／mlから50μｇ／mlの
濃度範囲で直線関係が得られ、これより検液の含
有量を知ることができる。

つぎに本発明を実施例によつて、さらに説明す
る。

実施例 １ グルコース0.5％，肉エキス0.3％，ペプトン0.5
％，グルタミン酸ナトリウム0.2％，塩化コバル
ト0.001％及び硫酸第一鉄0.001％の組成からなる
滅菌培地200mlにシユードモナス・マルトフイリ
アBN―233のスラントから１エーゼを殖菌し、28
℃で42時間振盪培養した。培養混液を8000rpm，
20分の遠心分離操作にて集菌し、菌体を50mlの生
理食塩水で洗浄して、洗浄菌体５ｇ（湿潤重量）
を得た。

この菌体1.6ｇをpH7.0，0.05Mリン酸緩衝液50
mlに懸濁し、Ｎ―アセチル―Ｄ，Ｌ―MPGA240
mgを加え、200ml容量の三角フラスコで28℃，18
時間振盪反応させた。反応終了後、反応混液を遠
心分離して、菌体と上澄液に分け、菌体は５mlの
水で２回洗浄し上澄液と合わせた。この液をタウ
エツクス１×２（CH₃COO^-）のカラム（径1.6
cm，高さ12cm）に掛け、水を十分通した後、0.3
規定の酢酸で展開した。溶出液フラクシヨンのニ
ンヒドリン反応陽性画分90mlを集めて減圧濃縮乾
固し、更に真空乾燥してＬ―MPGAの白色粉末84
mgを得た。このものは純度85％，〔α〕^２２ _Ｄ，21.7゜
（ｃ＝1.1NHCl）、収率68％であつた。

実施例 ２ 実施例１と同じ方法で得たシユードモナス・マ
ルトフイリアBN―233の洗浄菌体8.5ｇ（湿潤重
量）をpH7.0，0.05Mリン酸緩衝液350mlに懸濁
し、これにＮ―アセチル―D.L―MPGA1.8ｇを加
え、35℃の恒温水槽中に保ち、反応混液を撹拌機
で撹拌しながら20時間反応を行なつた。反応終了
液を遠心分離して菌体を除き、菌体は少量の水で
洗浄後、遠心分離して除き、洗液を反応上澄液と
合せ、更に水で希釈して全量を550mlとして、ダ
ウエツクス50W×２（H⁺）のカラム（径3.8cm，
高さ56cm）を通し、水で展開した。溶出フラクシ
ミンのニンヒドリン陽性画分1200mlを集め、110
mlに減圧濃縮した。この濃縮液に活性炭500mgを
加え室温で30分撹拌し、別し、活性炭は30mlの
水で２回洗浄して液と併せ、減圧濃縮乾固し更
に真空乾燥してＬ―MPGAの白色粉末576mgを得
た。このものは純度90％，〔α〕^２２ _Ｄ，23゜（ｃ＝
1N・HCl）、収率74.4％であつた。

実施例 ３ 実施例２でダウエツクスカラムの素通り画分
650mlに含まれるＮ―アセチル―Ｄ―MPGAの溶
液に１規定になるよう濃塩酸を加え、100℃で60
分間煮沸し、濃アンモニア水で中和後ダウエツク
ス50W×２（H⁺）のカラム（径3.8cm，高さ40
cm）に掛け、水で展開した。ニンヒドリン反応陽
性のフラクシヨン900mlを減圧濃縮して95mlに
し、活性炭500mgを加え、室温で約30分撹拌後
過し、活性炭を少量の水で洗い、その洗液を液
と併せ、減圧濃縮乾固、更に真空乾燥してＤ―
MPGAの白色粉末621mgを得た。このものは純度
80％，〔α〕^２２ _Ｄ〕，−19.7（ｃ＝１，1NHCl）、収
率
72.5％であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中、Ｒはハロゲン置換又は非置換アシル基を
   意味する）で表わされるＮ―アシル―Ｄ，Ｌ―２
   ―アミノ―４―メチル―フオスフイノ酪酸にシユ
   ードモナス属に属する細菌の培養菌体又はその処
   理物を水性媒体下に作用させ、Ｌ―２―アミノ―
   ４―メチル―フオスフイノ酪酸とＮ―アシル―Ｄ
   ―２―アミノ―４―メチル―フオスフイノ酪酸と
   の混合物に変換して光学分割を行ない、Ｌ―２―
   アミノ―４―メチル―フオスフイノ酪酸とＤ―２
   ―アミノ―４―メチル―フオスフイノ酪酸を採取
   することを特徴とする含燐アミノ酸の製造法。 ２ シユードモナス属に属する細菌がシユードモ
   ナス・マルトフイリアBN―233である特許請求の
   範囲第１項記載の含燐アミノ酸の製造法。