JPS61260892A - Ｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents
Ｌ−フエニルアラニンの製造法Info
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- JPS61260892A JPS61260892A JP60102101A JP10210185A JPS61260892A JP S61260892 A JPS61260892 A JP S61260892A JP 60102101 A JP60102101 A JP 60102101A JP 10210185 A JP10210185 A JP 10210185A JP S61260892 A JPS61260892 A JP S61260892A
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- phenylalanine
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、コリスメートムターゼ（以下ＣＭと略す）と
プリフェネートデヒドラターゼ（以下ＰＤと略す）の合
成に関与するエシェリシア属菌種の遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネバク
テリウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテ
リウム属に属する微生物に保有させ、該微生物を培地中
で培養し、培養物中に生成蓄積したＬ−フェニルアラニ
ンを採取することを特徴とするＬ−フェニルアラニンの
製造法に関する。従って、本発明はバイオインダストｖ
−、ｍ産業分野に関し、特に医薬、食品工業において有
用なＬ−フェニルアラニンの製造分野に関する。
プリフェネートデヒドラターゼ（以下ＰＤと略す）の合
成に関与するエシェリシア属菌種の遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネバク
テリウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテ
リウム属に属する微生物に保有させ、該微生物を培地中
で培養し、培養物中に生成蓄積したＬ−フェニルアラニ
ンを採取することを特徴とするＬ−フェニルアラニンの
製造法に関する。従って、本発明はバイオインダストｖ
−、ｍ産業分野に関し、特に医薬、食品工業において有
用なＬ−フェニルアラニンの製造分野に関する。
従来の技術
］リネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはミ
クロバクテリウム属に属する微生物を用いた発酵法によ
るＬ−フェニルアラニンの製造法としてはチロシン要求
性変異、フェニルアラニンのアナログ物質に対する耐性
変異あるいはこれらの変異を併有する菌株を用いる方法
が知られている〔農芸化学会誌、 ５０． （１） ｐ
、Ｒ７９（１９７６） ）。さらに、組換えＤＮＡ技術
によりこれらの微生物のフェニルアラニン生合成に係る
酵素の遺伝子をクローニングし、これを利用して造成さ
れた菌株を用いる方法も記載されている（特開昭６０−
２４１９２号）。
クロバクテリウム属に属する微生物を用いた発酵法によ
るＬ−フェニルアラニンの製造法としてはチロシン要求
性変異、フェニルアラニンのアナログ物質に対する耐性
変異あるいはこれらの変異を併有する菌株を用いる方法
が知られている〔農芸化学会誌、 ５０． （１） ｐ
、Ｒ７９（１９７６） ）。さらに、組換えＤＮＡ技術
によりこれらの微生物のフェニルアラニン生合成に係る
酵素の遺伝子をクローニングし、これを利用して造成さ
れた菌株を用いる方法も記載されている（特開昭６０−
２４１９２号）。
発明が解決しようとする問題点
近年、フェニルアラニンの需要が増大するにつれてその
製造法の改善が強く望まれている。本発明者らは、この
ような状況に鑑み、組換えＤＮＡ技術を有効に活用し、
すぐれたし−フェニルアラニン生産菌を造成すべく鋭意
研究を重ねた。
製造法の改善が強く望まれている。本発明者らは、この
ような状況に鑑み、組換えＤＮＡ技術を有効に活用し、
すぐれたし−フェニルアラニン生産菌を造成すべく鋭意
研究を重ねた。
問題点を解決するための手段
エシェリシア属菌種のＬ−フェニルアラニン生合成に係
るＣＭとＰＤの合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片
とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有する菌株を
用いれば、Ｌ−フェニルアラニンの生産性が改良される
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
るＣＭとＰＤの合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片
とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有する菌株を
用いれば、Ｌ−フェニルアラニンの生産性が改良される
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明によれば、エシェリシア属菌種のフェニルアラニ
ン生合成に係る酵素ＣＭとＰＤの遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有せしめた
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはミ
クロバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培
養物中にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、該培
養物からし一７エニルアラニンを採取することにより、
Ｌ−フェニルアラニンを製造することができる。
ン生合成に係る酵素ＣＭとＰＤの遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有せしめた
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはミ
クロバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培
養物中にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、該培
養物からし一７エニルアラニンを採取することにより、
Ｌ−フェニルアラニンを製造することができる。
宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属、ブレビ
バクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属する微
生物としては、コリネ型グルタミン酸生産菌として知ら
れている微生物は全て用いることができるが、好適には
下記の菌株が用いられる。
バクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属する微
生物としては、コリネ型グルタミン酸生産菌として知ら
れている微生物は全て用いることができるが、好適には
下記の菌株が用いられる。
コリネバクテリウム・グルタミクム ＾ＴＣＣ１３０３
２コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＾ＴＣＣ１３８６
８コリネバクテリウム・リリウム ＾ＴＣＣ１５９
９０ブレビバクテリウム・ディバリカラム＾ＴＣＣ１４
０２０ブレビバクテリウム・フラブム ＾ＴＣＣ１
４０６７ブレビバクテリウム・イマリオフィラム＾ＴＣ
Ｃ１４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲータリスＡＴＣＣ１９２４
０ミクロバクテリウム・アンモニアフィルムＡＴＣＣ１
５３５４ 宿主微生物としてはＬ−フェニルアラニン生産能を有し
ない菌株を用いることもできるが、好ましくはＬ−フェ
ニルアラニン生産性を有する菌株を用いる。Ｌ−フェニ
ルアラニン生産性を有する菌株は、前記のごとくチロシ
ン要求性変異、フェニルアラニンアナログ耐性変異ある
いはこれらの変異を共有せしめる公知の方法によって造
成できる。
２コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＾ＴＣＣ１３８６
８コリネバクテリウム・リリウム ＾ＴＣＣ１５９
９０ブレビバクテリウム・ディバリカラム＾ＴＣＣ１４
０２０ブレビバクテリウム・フラブム ＾ＴＣＣ１
４０６７ブレビバクテリウム・イマリオフィラム＾ＴＣ
Ｃ１４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲータリスＡＴＣＣ１９２４
０ミクロバクテリウム・アンモニアフィルムＡＴＣＣ１
５３５４ 宿主微生物としてはＬ−フェニルアラニン生産能を有し
ない菌株を用いることもできるが、好ましくはＬ−フェ
ニルアラニン生産性を有する菌株を用いる。Ｌ−フェニ
ルアラニン生産性を有する菌株は、前記のごとくチロシ
ン要求性変異、フェニルアラニンアナログ耐性変異ある
いはこれらの変異を共有せしめる公知の方法によって造
成できる。
本発明において、ＣＭとＰＤの遺伝子の供給源となる微
生物としては、エシェリシア属に属し、ＣＭとＦＤの再
活性を有するものであればいかなる微生物でもよく、例
えばエシェリシア・コリに一１２株の亜株ＪＡ１９４（
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ
・オプ・サイｚンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＾ｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、）、 ９４． ４８７（１９７７
） ）を用いることができる。エシェリシア・コリに
一１２株は、ＣＭ −ＰＤ両酵素活性を有する遺伝子産
物がｐｈｅ＾と称する一つの遺伝子にコードされている
ため〔ジャーナル・オブ・バクテリオ０２イ（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、） １５０．１１３０（１９８２）
） 、一つのＤＮＡ断片としてクローニングし得る点
で好都合である。
生物としては、エシェリシア属に属し、ＣＭとＦＤの再
活性を有するものであればいかなる微生物でもよく、例
えばエシェリシア・コリに一１２株の亜株ＪＡ１９４（
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ
・オプ・サイｚンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＾ｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、）、 ９４． ４８７（１９７７
） ）を用いることができる。エシェリシア・コリに
一１２株は、ＣＭ −ＰＤ両酵素活性を有する遺伝子産
物がｐｈｅ＾と称する一つの遺伝子にコードされている
ため〔ジャーナル・オブ・バクテリオ０２イ（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、） １５０．１１３０（１９８２）
） 、一つのＤＮＡ断片としてクローニングし得る点
で好都合である。
ｐｈｅ＾遺伝子の供給源となる染色体ＤＮＡは、ＣＭ−
ＰＤ活性を有する微生物の培養菌体をリゾチームおよび
界面活性剤で処理して溶菌した後、除蛋白し、ついでエ
タノールで沈澱せしめる常法〔バイ１キミ力・工・バイ
オフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、＾ｃｔａ） ７２．６１９ （１９６３））により
単離できる。ベクターとしては、エシェリシア属に属す
る微生物で複製できるプラスミドであればいかなるもの
でも構わないが、例えば頻用されるｐＢＲ３２２（ジー
ン（Ｇｅｎｅ）、 ２．９５ （１９７５） ）ｐＡ
ｃＹｃ１？？、 ｐＡｃＹｃ１８４ （いずれもジャー
ナル・オブ・バクテリオ０２イＣＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、） １３１．１１４１（１９７８）） 、ｐＧ＾
２２〔ジャーナル・オブ・バクテリオ０２イ（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、） １４０．４００（１９７９））
等を用いることができる。染色体ＤＮＡとプラスミドと
の試験管内組換えは、両者を制限酵素で切断したのちＤ
ＮＡ’Ｊガーゼで処理するか、あるいはその切断片をタ
ーミナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラーゼ等で
処理したのちＤＮＡリガーゼを作用させて結合する等の
常法〔メソッヅ・イン・エンチモロジ４ （Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） ６８（１９７９
） ）により実施できる。
ＰＤ活性を有する微生物の培養菌体をリゾチームおよび
界面活性剤で処理して溶菌した後、除蛋白し、ついでエ
タノールで沈澱せしめる常法〔バイ１キミ力・工・バイ
オフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、＾ｃｔａ） ７２．６１９ （１９６３））により
単離できる。ベクターとしては、エシェリシア属に属す
る微生物で複製できるプラスミドであればいかなるもの
でも構わないが、例えば頻用されるｐＢＲ３２２（ジー
ン（Ｇｅｎｅ）、 ２．９５ （１９７５） ）ｐＡ
ｃＹｃ１？？、 ｐＡｃＹｃ１８４ （いずれもジャー
ナル・オブ・バクテリオ０２イＣＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、） １３１．１１４１（１９７８）） 、ｐＧ＾
２２〔ジャーナル・オブ・バクテリオ０２イ（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、） １４０．４００（１９７９））
等を用いることができる。染色体ＤＮＡとプラスミドと
の試験管内組換えは、両者を制限酵素で切断したのちＤ
ＮＡ’Ｊガーゼで処理するか、あるいはその切断片をタ
ーミナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラーゼ等で
処理したのちＤＮＡリガーゼを作用させて結合する等の
常法〔メソッヅ・イン・エンチモロジ４ （Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） ６８（１９７９
） ）により実施できる。
この結合反応物を用いてｐｈｅＡ遺伝子が欠損したエン
エリシア・コリに一１２株のフェニルアラニン要求性変
異株を形質転換しフェニルアラニン非要求性となった形
質転換株を選択することによってｐｈｅＡ遺伝子をベク
タープラスミド上にクローニングすることができる。こ
こで用いる形質転換法は、例えば低温下で塩化カルシウ
ムで受容菌細胞を処理してＤＮＡを細胞中にとり込ませ
る方法〔ジャーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジ
イ（Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、） ５３． １５９（１
９７０） ； ジーン（Ｇｅｎｅ）、 ６．２３（１
９７９） ）に従って行うことができる。このようにし
て、ｐｈｅ＾遺伝子は、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
ｌｌｉで切り出される約４．２キロベース（Ｋｂ）のＤ
ＮＡ断片としてベクターｐＢＲ３２２上にクローニング
できる。この４．２にｂのＤＮＡ断片上にはエシェリシ
ア・コリに一１２株の染色体上で隣接して存在するａｒ
ｏＦ遺伝子とｔｙｒ＾遺伝子〔ミクロバイオロジカル・
レビニ−（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｒｅｖ、）旦、（２
） １８０（１９８３））が含まれているが、さらにρ
ｈｅＡ遺伝子を別の制限酵素で切り出し、再度ベクター
と組み換え、前記と同様にｐｈｅＡ欠損株を形質転換し
、フェニルアラニン非要求性の形質転換株を選択するこ
とにより、ｐｈｅ＾遺伝子のみを含むＩ）ＮＡ断片を取
得できる 。
エリシア・コリに一１２株のフェニルアラニン要求性変
異株を形質転換しフェニルアラニン非要求性となった形
質転換株を選択することによってｐｈｅＡ遺伝子をベク
タープラスミド上にクローニングすることができる。こ
こで用いる形質転換法は、例えば低温下で塩化カルシウ
ムで受容菌細胞を処理してＤＮＡを細胞中にとり込ませ
る方法〔ジャーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジ
イ（Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、） ５３． １５９（１
９７０） ； ジーン（Ｇｅｎｅ）、 ６．２３（１
９７９） ）に従って行うことができる。このようにし
て、ｐｈｅ＾遺伝子は、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
ｌｌｉで切り出される約４．２キロベース（Ｋｂ）のＤ
ＮＡ断片としてベクターｐＢＲ３２２上にクローニング
できる。この４．２にｂのＤＮＡ断片上にはエシェリシ
ア・コリに一１２株の染色体上で隣接して存在するａｒ
ｏＦ遺伝子とｔｙｒ＾遺伝子〔ミクロバイオロジカル・
レビニ−（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｒｅｖ、）旦、（２
） １８０（１９８３））が含まれているが、さらにρ
ｈｅＡ遺伝子を別の制限酵素で切り出し、再度ベクター
と組み換え、前記と同様にｐｈｅＡ欠損株を形質転換し
、フェニルアラニン非要求性の形質転換株を選択するこ
とにより、ｐｈｅ＾遺伝子のみを含むＩ）ＮＡ断片を取
得できる 。
このようにクローニングされたｐｈｅＡ遺伝子含有ＤＮ
Ａ断片とコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属
またはミクロバクテリウム属に属する微生物のベクター
プラスミドとを制限酵素による切断およびＤＮＡリガー
ゼによる結合により試験管内で組み換えてコリネバクテ
リウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテリ
ウム属で複製可能な組換え体プラスミドを作製できる。
Ａ断片とコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属
またはミクロバクテリウム属に属する微生物のベクター
プラスミドとを制限酵素による切断およびＤＮＡリガー
ゼによる結合により試験管内で組み換えてコリネバクテ
リウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテリ
ウム属で複製可能な組換え体プラスミドを作製できる。
該ベクタープラスミドとしては、上記微生物中で複製で
きるものであれば特に限定されないが、例えば本発明者
らが先に特許出願したｐｃｃｌ（特開昭５７−１３４５
００）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７ ＞、ｐＣ
Ｇ４、ｐＣＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３７９９
）ｐＣＥ５４、ｐｃＢｌｏｌ（いずれも特開昭５８−１
０５９９９） 、ｐＣＥ ５１ （特願昭６０−３４１
９７ ＞および。
きるものであれば特に限定されないが、例えば本発明者
らが先に特許出願したｐｃｃｌ（特開昭５７−１３４５
００）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７ ＞、ｐＣ
Ｇ４、ｐＣＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３７９９
）ｐＣＥ５４、ｐｃＢｌｏｌ（いずれも特開昭５８−１
０５９９９） 、ｐＣＥ ５１ （特願昭６０−３４１
９７ ＞および。
ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３（いずれもモレキユラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ。
ド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、） １９６． １７５（１９８４） ）な
どが用いられる。
どが用いられる。
ρｈｅＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクタープラスミド
との組換え体ＤＮＡは、試験管内組換え混合物を用いて
、通常の変異操作によって透導されるＣＭあるいはＰＤ
酵素活性の欠失したコリネバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属またはミクロバクテリウム属のフェニルアラ
ニン要求性変異株を直接形質転換し、フェニルアラニン
非要求性となった形質転換株を選択することによって取
得できる。特にｐｃＥ５１のようなエシェリシア・コリ
とコリネバクテリウ属、ブレビバクテリウム属またはミ
クロバクテリウム属微生物との両方で複製可能なシャト
ルベクターを使用する場合は、前記のようにエシェリシ
ア・コリのｐｈｅＡ欠損変異株の相補性によりｐｈｅ＾
遺伝子をシャトルベクター上にサブクローニングし、し
かる後にコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属
またはミクロバクテリウム属に属する微生物に導入する
こともできる。これら微生物に組換え体ＤＮＡを導入す
る形質転換法としては本発明者らが開発したプロトプラ
ストを使用する方法（特開昭５７−１８６４９２および
特開昭５７〜１８６４８９および下記実施例を参照）に
より実施することができる。
との組換え体ＤＮＡは、試験管内組換え混合物を用いて
、通常の変異操作によって透導されるＣＭあるいはＰＤ
酵素活性の欠失したコリネバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属またはミクロバクテリウム属のフェニルアラ
ニン要求性変異株を直接形質転換し、フェニルアラニン
非要求性となった形質転換株を選択することによって取
得できる。特にｐｃＥ５１のようなエシェリシア・コリ
とコリネバクテリウ属、ブレビバクテリウム属またはミ
クロバクテリウム属微生物との両方で複製可能なシャト
ルベクターを使用する場合は、前記のようにエシェリシ
ア・コリのｐｈｅＡ欠損変異株の相補性によりｐｈｅ＾
遺伝子をシャトルベクター上にサブクローニングし、し
かる後にコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属
またはミクロバクテリウム属に属する微生物に導入する
こともできる。これら微生物に組換え体ＤＮＡを導入す
る形質転換法としては本発明者らが開発したプロトプラ
ストを使用する方法（特開昭５７−１８６４９２および
特開昭５７〜１８６４８９および下記実施例を参照）に
より実施することができる。
以上のようにして野性型ｐｈｅＡ遺伝子をもつエシェリ
シア・コリの染色体ＤＮＡを供与源とじた場合には、野
性型ｐｈｅＡ遺伝子を組換え体ＤＮＡとしてコリネバク
テリウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテ
リウム属微生物に導入できる。しかしながら、野性型ｐ
ｈｅＡ遺伝子がコードする遺伝子産物ＣＭ−ＰＤ合成は
エシェリシア・コリ中で生産されるフェニルアラニンに
より抑制され、またＣＭＰＤ活性は生産されるフェニル
アラニンで阻害されることが知られている〔ジャーナル
・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
）１５０、１１３０（１９８２） ； ヨーロピアン
・ジャーナル・オプ・バイオケミストリイ（εｕｒ、
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）８６、１６５（１９７８） ）
。従って、この抑制および阻害から解除された変異型ｐ
ｈｅ＾遺伝子を導入する方が、コリネバクテリウム属、
ブレビバクテリウム属またはミクロバクテリウム属微生
物に高いフェニルアラニン生産能を付与できるので好ま
しい。
シア・コリの染色体ＤＮＡを供与源とじた場合には、野
性型ｐｈｅＡ遺伝子を組換え体ＤＮＡとしてコリネバク
テリウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテ
リウム属微生物に導入できる。しかしながら、野性型ｐ
ｈｅＡ遺伝子がコードする遺伝子産物ＣＭ−ＰＤ合成は
エシェリシア・コリ中で生産されるフェニルアラニンに
より抑制され、またＣＭＰＤ活性は生産されるフェニル
アラニンで阻害されることが知られている〔ジャーナル
・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
）１５０、１１３０（１９８２） ； ヨーロピアン
・ジャーナル・オプ・バイオケミストリイ（εｕｒ、
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）８６、１６５（１９７８） ）
。従って、この抑制および阻害から解除された変異型ｐ
ｈｅ＾遺伝子を導入する方が、コリネバクテリウム属、
ブレビバクテリウム属またはミクロバクテリウム属微生
物に高いフェニルアラニン生産能を付与できるので好ま
しい。
変異型ｐｈｅ＾遺伝子を導入するには、所望の変異を受
けたｐｈｅＡ遺伝子を有するエシェリシア・コリ変異株
の染色体ＤＮＡを供与源として、野性型ｐｈｅ人遺伝子
を得たのと同様な方法で組換え体プラスミドを作製する
ことにより果たされる。あるいは野性型ｐｈｅＡ遺伝子
を含む組換え体プラスミドを保有する微生物をｉｎ ｖ
ｉｖｏで変異処理するか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで変異を誘
起し形質転換して変異型ｐｈｅ＾遺伝子を含む組換え体
プラスミドを作成し、これを使用することもできる。
けたｐｈｅＡ遺伝子を有するエシェリシア・コリ変異株
の染色体ＤＮＡを供与源として、野性型ｐｈｅ人遺伝子
を得たのと同様な方法で組換え体プラスミドを作製する
ことにより果たされる。あるいは野性型ｐｈｅＡ遺伝子
を含む組換え体プラスミドを保有する微生物をｉｎ ｖ
ｉｖｏで変異処理するか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで変異を誘
起し形質転換して変異型ｐｈｅ＾遺伝子を含む組換え体
プラスミドを作成し、これを使用することもできる。
野性型あるいは変異型ｐｈｅＡ遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドは前記のごときプロトプラストを用いる形質転
換法によりコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属またはミクロバクテリウム属微生物に導入できる。こ
れらの組換え体プラスミド保有株によるＬ−フェニルア
ラニン生産は、従来の発酵法によるＬ−フェニルアラニ
ン製造に用いられる培養方法により行うことができる。
ラスミドは前記のごときプロトプラストを用いる形質転
換法によりコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属またはミクロバクテリウム属微生物に導入できる。こ
れらの組換え体プラスミド保有株によるＬ−フェニルア
ラニン生産は、従来の発酵法によるＬ−フェニルアラニ
ン製造に用いられる培養方法により行うことができる。
すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物、ア
ミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好気的
条件下、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培
養物中にＬ−フェニルアラニンが生成蓄積するのでこれ
を採取する。
ミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好気的
条件下、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培
養物中にＬ−フェニルアラニンが生成蓄積するのでこれ
を採取する。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シェークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜は好
適に用いられる。
ス、シェークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜は好
適に用いられる。
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモ二〇、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシ！−％−ルあるいは
その消化物、蝋加水分解物などの窒素含有有機物など種
々のものが使用可能である。
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシ！−％−ルあるいは
その消化物、蝋加水分解物などの窒素含有有機物など種
々のものが使用可能である。
さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム、燐酸第
二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。微生
物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源などは、前
記したような他の培地成分によって培地に供給されれば
特に加えなくてもよい。
二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。微生
物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源などは、前
記したような他の培地成分によって培地に供給されれば
特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培
養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−７エニルアラニ
ンが蓄積する。培養終了後、菌体を除去して活性炭処理
、イオン交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からＬ
−フェニルアラニンが回収される。
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培
養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−７エニルアラニ
ンが蓄積する。培養終了後、菌体を除去して活性炭処理
、イオン交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からＬ
−フェニルアラニンが回収される。
かくしてｐｈｅ＾遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有せ
しめたコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属ま
たはミクロバクテリウム属菌株を用いることにより、高
い収率でＬ−７エニルアラニンを生産することができる
。かかる微生物として具体的には例えばコリネバクテリ
ウム・グルタミタムＫ−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６
８）、コリネバクテリウム・グルタミタムＫ−５２（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−７６９）等があげられ、その宿主菌コリネ
バクテリウム・グルタミタムＫ−５０（ＦＥＲＭＢＰ−
７６７）とともに工業技術院微生物工業技術研究所（微
工研）に寄託されている。
しめたコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属ま
たはミクロバクテリウム属菌株を用いることにより、高
い収率でＬ−７エニルアラニンを生産することができる
。かかる微生物として具体的には例えばコリネバクテリ
ウム・グルタミタムＫ−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６
８）、コリネバクテリウム・グルタミタムＫ−５２（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−７６９）等があげられ、その宿主菌コリネ
バクテリウム・グルタミタムＫ−５０（ＦＥＲＭＢＰ−
７６７）とともに工業技術院微生物工業技術研究所（微
工研）に寄託されている。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１゜
（１）エシェリシア・コリのＣＭおよびＰＤの遺伝子を
含むｐｈｅ＾を含むプラスミドＤＮＡの調製本発明者ら
が特開昭６０−３４１９７に開示したように、エシェリ
シア・コリの野性型ｐｈｅＡ遺伝子はエシェリシア・コ
リに一１２株亜株ＪＡ１９４〔プロシイ−ディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オプ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
含むｐｈｅ＾を含むプラスミドＤＮＡの調製本発明者ら
が特開昭６０−３４１９７に開示したように、エシェリ
シア・コリの野性型ｐｈｅＡ遺伝子はエシェリシア・コ
リに一１２株亜株ＪＡ１９４〔プロシイ−ディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オプ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、）、 ９４．４８７（１９７７）
）の染色体ＤＮＡを供与源とし、ｐＢＲ３２２をベクタ
ーに用いて約４，２ＫｂのＥｃｏＲｉ−Ｈｉｎｄｌ［７
１断片としてクローニングした。この組換え体プラスミ
ドｐＢａｒｏＦ１は、第１図に示すようなＥｃｏＲＩ、
ＢａｍＨＩ、Ｈｉ ｎｄｌ［［等の各種制限酵素）切断
部位を育し、プロウスキーらがクローニングしたＤＮＡ
断片〔プロシイ−ディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンｘ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、 ７５．４２７１（
１９７８） ）との比較によりクローニングしたＤＮＡ
断片上にはｐｈｅＡ遺伝子とともに他の遺伝子ａｒｏＰ
およびｔｙｒ八をも含むことが判明した。
）の染色体ＤＮＡを供与源とし、ｐＢＲ３２２をベクタ
ーに用いて約４，２ＫｂのＥｃｏＲｉ−Ｈｉｎｄｌ［７
１断片としてクローニングした。この組換え体プラスミ
ドｐＢａｒｏＦ１は、第１図に示すようなＥｃｏＲＩ、
ＢａｍＨＩ、Ｈｉ ｎｄｌ［［等の各種制限酵素）切断
部位を育し、プロウスキーらがクローニングしたＤＮＡ
断片〔プロシイ−ディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンｘ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、 ７５．４２７１（
１９７８） ）との比較によりクローニングしたＤＮＡ
断片上にはｐｈｅＡ遺伝子とともに他の遺伝子ａｒｏＰ
およびｔｙｒ八をも含むことが判明した。
そこでｐ８ａｒｏＦ１からｐｈｅＡ遺伝子のみを含むＤ
ＮＡ断片をサブクローニングするため、まずｐ［！ａｒ
ｏＦ１をその保有株エシェリシア・コリＡ３３２４８株
（この菌株の製造方法は特開昭６０−３４１９７に記載
されている）の培養菌体から次の方法で単離した。
ＮＡ断片をサブクローニングするため、まずｐ［！ａｒ
ｏＦ１をその保有株エシェリシア・コリＡ３３２４８株
（この菌株の製造方法は特開昭６０−３４１９７に記載
されている）の培養菌体から次の方法で単離した。
アンピシリン１００ｇ／ｍｌを含む４０ ＱｍｌＬＢ培
地（バクトドリプトン１０ｇ５酵母エキス５ｇ、ブドウ
糖１ｇおよび塩化ナトリウム５ｇを水ｌｉに含み、ｐ
Ｈ７，２に調整した培地）に種培萎を接種し、３７℃で
振盪培養し、対数後期まで生育させた。培養液より集菌
後、菌体を日中らの方法〔ジャーナル・オブ・バタテリ
オロジ４（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、 １２１．
３５４（１９７５） ）に従い溶菌した。得られた溶菌
液を２８．００Ｏｒｐｍ、４℃で１時間遠心し、上清を
採取した。
地（バクトドリプトン１０ｇ５酵母エキス５ｇ、ブドウ
糖１ｇおよび塩化ナトリウム５ｇを水ｌｉに含み、ｐ
Ｈ７，２に調整した培地）に種培萎を接種し、３７℃で
振盪培養し、対数後期まで生育させた。培養液より集菌
後、菌体を日中らの方法〔ジャーナル・オブ・バタテリ
オロジ４（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、 １２１．
３５４（１９７５） ）に従い溶菌した。得られた溶菌
液を２８．００Ｏｒｐｍ、４℃で１時間遠心し、上清を
採取した。
上滑に１１５容の５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）６０００水溶液を加え、ゆるやかに混合
した後、４℃で一夜放置した。生じた沈澱を、４℃、３
．ＯＯＯｒｐｍ、５分間の遠心で集め、５ｍＭのＴＥ緩
衡液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ−Ｎａ２、ｐＨ７，５）に溶解し、１．５■／ｍ
ｌ濃度のエチジウムブロマイド１ｍｌを加え、さらにＴ
Ｅ緩衝液で正確に７．５ｍＭとした。この溶液に、Ｃ５
Ｃｊ！７．８７５ｇを加え、完全に溶解した後、１０５
．ＯＯＯＸｇ１２０℃、４０時間遠心した。紫外線照射
下検出されるプラスミドバンドを注射器でぬき取り、１
５％（Ｖ／Ｖ）のＴＥＩｆｒ液を含むインプロパツール
で３回、エチジウムブロマイドを抽出した後、４℃で一
夜ＴＥ緩衝液に対して透析し、透析液をプラスミドＤＮ
Ａ溶液として用いた。
ール（ＰＥＧ）６０００水溶液を加え、ゆるやかに混合
した後、４℃で一夜放置した。生じた沈澱を、４℃、３
．ＯＯＯｒｐｍ、５分間の遠心で集め、５ｍＭのＴＥ緩
衡液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ−Ｎａ２、ｐＨ７，５）に溶解し、１．５■／ｍ
ｌ濃度のエチジウムブロマイド１ｍｌを加え、さらにＴ
Ｅ緩衝液で正確に７．５ｍＭとした。この溶液に、Ｃ５
Ｃｊ！７．８７５ｇを加え、完全に溶解した後、１０５
．ＯＯＯＸｇ１２０℃、４０時間遠心した。紫外線照射
下検出されるプラスミドバンドを注射器でぬき取り、１
５％（Ｖ／Ｖ）のＴＥＩｆｒ液を含むインプロパツール
で３回、エチジウムブロマイドを抽出した後、４℃で一
夜ＴＥ緩衝液に対して透析し、透析液をプラスミドＤＮ
Ａ溶液として用いた。
（２） ｐｈｅ＾遺伝子のサブクローン化上記で調製し
たプラスミドｐＢａｒｏＰＩ Ｄ Ｎ Ａより、ｐｈｅ
＾遺伝子部分のＤＮＡ断片を取得し、エシェリシア・コ
リのベクターｐＢＲ３２２に連結する。
たプラスミドｐＢａｒｏＰＩ Ｄ Ｎ Ａより、ｐｈｅ
＾遺伝子部分のＤＮＡ断片を取得し、エシェリシア・コ
リのベクターｐＢＲ３２２に連結する。
プラスミドｐＢａｒｏＦＩ Ｄ ＮＡ３ ｇを含む制限
酵素反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、６ｍＭ
ＭｇＣｌ２．１００ｍＭ ＮａＣ１，ｐＨ７，５）１０
０ｍに各５単位のＥｃｏＲＩ、およびＢａｍＨＩ （宝
酒造社製）を加え、３７℃で６０分間反応させた。また
、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ３肩を含む制限酵素反応液（
同上）１００ｍに各５隼位ＥＣ０ＲＩ、および３ａｍＨ
Ｉを加え、３７℃で６０分間反応させた。反応後、６５
℃で１０分間加温して反応を停止させた。両反応液を混
合し、Ｔ４リガーゼ用緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ、６６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、１００ｍＭジチ
オスレイトール、ｐＨ７，６）４０ｄ、ＡＴＰ （５ａ
＋Ｍ） ４０ＪＩＩ２、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製、１
単位／ＪＩＩｔ）０．４パおよびＨ２Ｏ１２０屑を加え
、４℃で２４時間反応させた。反応後、６５℃で１５分
間加温して反応を停止させた。
酵素反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、６ｍＭ
ＭｇＣｌ２．１００ｍＭ ＮａＣ１，ｐＨ７，５）１０
０ｍに各５単位のＥｃｏＲＩ、およびＢａｍＨＩ （宝
酒造社製）を加え、３７℃で６０分間反応させた。また
、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ３肩を含む制限酵素反応液（
同上）１００ｍに各５隼位ＥＣ０ＲＩ、および３ａｍＨ
Ｉを加え、３７℃で６０分間反応させた。反応後、６５
℃で１０分間加温して反応を停止させた。両反応液を混
合し、Ｔ４リガーゼ用緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ、６６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、１００ｍＭジチ
オスレイトール、ｐＨ７，６）４０ｄ、ＡＴＰ （５ａ
＋Ｍ） ４０ＪＩＩ２、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製、１
単位／ＪＩＩｔ）０．４パおよびＨ２Ｏ１２０屑を加え
、４℃で２４時間反応させた。反応後、６５℃で１５分
間加温して反応を停止させた。
このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。
形質転換に供する受容菌として、ｐｈｅ＾遺伝子を欠損
したエシェリシア・コリに一１２株ＧＳ２４５ （ｐｉ
ｅ＾９０５． ａｒａＤ１３９． Δ１ａｃＵ１６９
． Δｇｌｙ＾。
したエシェリシア・コリに一１２株ＧＳ２４５ （ｐｉ
ｅ＾９０５． ａｒａＤ１３９． Δ１ａｃＵ１６９
． Δｇｌｙ＾。
ｓｔｒ＾、 ｔｈｉ） （ジーｙ（Ｇｅｎｅ）、
１４．６３． （１９８１）］を用いる。３７℃で一
夜培養液を、ＬＢ培地に植菌し、Ｍ、 Ｄａｇｅｒｔ
らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ） 。
１４．６３． （１９８１）］を用いる。３７℃で一
夜培養液を、ＬＢ培地に植菌し、Ｍ、 Ｄａｇｅｒｔ
らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ） 。
６、２３． （１９７９） ）に従って、コンピテン
トな細胞を調製した。
トな細胞を調製した。
コンピテントな細胞１０”／ｎｌを含む液０．２１１１
１にリガーゼ反応混合物５０屑を加え、水冷下１０分間
放Ｉｂた。次いで３７℃で５分間熱旭理した後、ＬＢ培
地２１１を加え、３７℃で９０〜１２０分間静萱した。
１にリガーゼ反応混合物５０屑を加え、水冷下１０分間
放Ｉｂた。次いで３７℃で５分間熱旭理した後、ＬＢ培
地２１１を加え、３７℃で９０〜１２０分間静萱した。
その後、菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後、５０．１
１／ＩＩのグリシンを含むＭ９平板培地（ブドウ糖２ｇ
５ＮＨ４ＣＩ２１ ｇ、ＮａｔＨＰＯ４６ｇ、ＫＨｚＰ
Ｏ＊ ３ｇ５Ｍｇ５０４・７Ｈ７００，１ｇ５ＣａＣ
１２・２Ｈ２０１５■、サイアミン塩酸塩４■および寒
天１５ｇを水１１に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地
）に塗布した。Ｍ９平板培地に生育したコロニーを各々
アンピシリン１００に７ｍＭ。
１／ＩＩのグリシンを含むＭ９平板培地（ブドウ糖２ｇ
５ＮＨ４ＣＩ２１ ｇ、ＮａｔＨＰＯ４６ｇ、ＫＨｚＰ
Ｏ＊ ３ｇ５Ｍｇ５０４・７Ｈ７００，１ｇ５ＣａＣ
１２・２Ｈ２０１５■、サイアミン塩酸塩４■および寒
天１５ｇを水１１に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地
）に塗布した。Ｍ９平板培地に生育したコロニーを各々
アンピシリン１００に７ｍＭ。
テトラサイクリン２０■／ａ＋１を含むＬＢ平板培地に
塗布し、アンピシリン含有培地で生育し、テトラサイク
リン含有培地で生育しないコロニーを選択した。
塗布し、アンピシリン含有培地で生育し、テトラサイク
リン含有培地で生育しないコロニーを選択した。
このようにして選択したグリシンを含むＭ９平板培地で
生育し、アンピシリン耐性、子トラサイタリン感受性の
形質転換株より前記と同様にして、プラスミドＤＮＡを
単離した。形質転換株の一株から得たプラスミドにｐＰ
ＨＥＡｌを各種制限酵素で消化後、アガロースゲル電気
泳動で解析した結果、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩとＢａ
ｍＨＩの間の領域に、約１，８ＫｂのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ切断ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドであるこ
とが判明した（第１図参照）。
生育し、アンピシリン耐性、子トラサイタリン感受性の
形質転換株より前記と同様にして、プラスミドＤＮＡを
単離した。形質転換株の一株から得たプラスミドにｐＰ
ＨＥＡｌを各種制限酵素で消化後、アガロースゲル電気
泳動で解析した結果、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩとＢａ
ｍＨＩの間の領域に、約１，８ＫｂのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ切断ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドであるこ
とが判明した（第１図参照）。
（３） ｐｈｅ＾遺伝子のシャトルベクターｐｃＥ５
１への連結 上記で調製したプラスミドｐＰＨＥＡＩＤＮＡより、ｐ
ｈｅＡ遺伝子部分のＤＮＡ断片を取得し、エシェリシア
・コリとコリネバクテリウム・グルタミクムとのシャト
ルベクターｐｃＥ５１に連結する。
１への連結 上記で調製したプラスミドｐＰＨＥＡＩＤＮＡより、ｐ
ｈｅＡ遺伝子部分のＤＮＡ断片を取得し、エシェリシア
・コリとコリネバクテリウム・グルタミクムとのシャト
ルベクターｐｃＥ５１に連結する。
ｐｃＥ５１は本発明者らが先に特許出願したコリネバク
テリウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ１（特開昭
５７−１３４５００ ）とエシェリシア・コリのプラス
ミドｐＧＡ２２（ジャーナルオブ・バタテリオロジイ（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） １４Ｑ。
テリウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ１（特開昭
５７−１３４５００ ）とエシェリシア・コリのプラス
ミドｐＧＡ２２（ジャーナルオブ・バタテリオロジイ（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） １４Ｑ。
４００、 （１９７９） ）を連結せしめたプラスミ
ドである。詳しくは、本発明者らによる特開昭５８−１
４２８０４に記載されているが、ｐｃＧｌ上に１カ所し
かないＢｇｌ ＩＩ切断部位とｐＧＡ２２のカナマイシ
ン耐性遺伝子を含む方のＢａｍＨＩ断片とを両制限酵素
の同一接着末端を利用して連結したものである。
ドである。詳しくは、本発明者らによる特開昭５８−１
４２８０４に記載されているが、ｐｃＧｌ上に１カ所し
かないＢｇｌ ＩＩ切断部位とｐＧＡ２２のカナマイシ
ン耐性遺伝子を含む方のＢａｍＨＩ断片とを両制限酵素
の同一接着末端を利用して連結したものである。
プラスミドｐＰＨＥＡＩ ＤＮＡ ３■を含む制限
酵素反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭＭ
ｇＣ１２、ｌｏＯｍＭ ＮａＣｊ！、ｐ Ｈ７，５）
１００薦に各５単位の５ｃａｉ、ＮｒｕＩ （全酒造社
製）を加え、３７℃で６０分間反応させた。また、ｐｃ
Ｅ５１を保有するＢ、 ｃｏｌｉ Ｊ＾１９４株より
前記と同様にして調製したプラスミドｐｃＥ５１ Ｄ
ＮＡ ３塊を含む制限酵素Ｆ、ｃｏＲＶ反応液（ｌＱ
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ６ｍＭ ＭｇＣ１＊、
１５０ｍＭ ＮａＣ１、ｐＨ７，５）１００Ｊ１１に
５単位のＥｃｏＲＶ［全酒造社製）を加え、３７℃で６
０分間反応させた。
酵素反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭＭ
ｇＣ１２、ｌｏＯｍＭ ＮａＣｊ！、ｐ Ｈ７，５）
１００薦に各５単位の５ｃａｉ、ＮｒｕＩ （全酒造社
製）を加え、３７℃で６０分間反応させた。また、ｐｃ
Ｅ５１を保有するＢ、 ｃｏｌｉ Ｊ＾１９４株より
前記と同様にして調製したプラスミドｐｃＥ５１ Ｄ
ＮＡ ３塊を含む制限酵素Ｆ、ｃｏＲＶ反応液（ｌＱ
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ６ｍＭ ＭｇＣ１＊、
１５０ｍＭ ＮａＣ１、ｐＨ７，５）１００Ｊ１１に
５単位のＥｃｏＲＶ［全酒造社製）を加え、３７℃で６
０分間反応させた。
物にＴ４リガーゼ用緩衝液４０ｄ、ＡＴＰ（５ｍＭ）４
０ｍ、Ｔ４リガーゼ（全酒造社製 １単位／ｄ）０．４
１１１およびＨｉＯ１２０ｍを加え、４℃で２４時間反
応させた。
０ｍ、Ｔ４リガーゼ（全酒造社製 １単位／ｄ）０．４
１１１およびＨｉＯ１２０ｍを加え、４℃で２４時間反
応させた。
このリガーゼ反応混合物を用い、前記と同様に、エシェ
リシア・コ１ＪＧｓ２４５株を形質転換し、菌体を５０
ｇ／ｍｌのグリシンを含むＭ９平板培地に塗布する。Ｍ
９平板培地に生育したコロニーを各々アンピシリン１０
０■／ｍｌ、 ｆトラサイクリン２０■／ｍｌ 、カナ
マイシン２０ｇ／ｍＩを含むＬＢ平板培地に塗布し、カ
ナマイシン含有培地で生育し、アンピシリン、テトラサ
イクリン含有培地で生育できないコロニーを選択した。
リシア・コ１ＪＧｓ２４５株を形質転換し、菌体を５０
ｇ／ｍｌのグリシンを含むＭ９平板培地に塗布する。Ｍ
９平板培地に生育したコロニーを各々アンピシリン１０
０■／ｍｌ、 ｆトラサイクリン２０■／ｍｌ 、カナ
マイシン２０ｇ／ｍＩを含むＬＢ平板培地に塗布し、カ
ナマイシン含有培地で生育し、アンピシリン、テトラサ
イクリン含有培地で生育できないコロニーを選択した。
このように選択した形質転換株より、前記と同様にして
プラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から得
たプラスミドｐＥｐｈｅＡ１を各種制限酵素で消化後、
アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＥ５１の
ＥｃｏＲＶ切断部位に約２．Ｂｂのｐｈｅ＾遺伝子を含
むＳｅａ １−ＮｒｕＩ切断ＤＮＡ断片が挿入されたプ
ラスミドであることが判明した（第１図参照）。
プラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から得
たプラスミドｐＥｐｈｅＡ１を各種制限酵素で消化後、
アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＥ５１の
ＥｃｏＲＶ切断部位に約２．Ｂｂのｐｈｅ＾遺伝子を含
むＳｅａ １−ＮｒｕＩ切断ＤＮＡ断片が挿入されたプ
ラスミドであることが判明した（第１図参照）。
（４） ｐ Ｅ ｐ ｈ ｅ Ａ １によるコリネバ
クテリウム・グルタミクムの形質転換およびフェニルア
ラニンアナログ耐性プラスミドｐＥｐｈｅ＾２２の取得
上記で調整したｐＢｐｈｅ＾ｌＤＮＡを形質転換に供し
た。形質転換に供する受容菌として、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムＡ Ｔ ＣＣ３１８３０から誘導され
たりゾチーム感受性変異株コリネバクテリウム・グルタ
ミクムＬ−１５ＡＴＣＣ３１８３４を用いた。Ｌ−１５
株の種培養をＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ１酵母エキ
ス５ｇを水１１に含みｐ Ｈ７，２に調整した培地）に
植菌し、３０℃で振盪培養した。ＯＤ ｌ）、 ６にな
った時点で集菌し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔グルコース
５ｇ１カザミノ酸５ｇ１酵母エキス２，５ｇ、に２ＨＰ
Ｏａ ３．５ｇ５ＫＨｉＰＯａ １．５ｇ。
クテリウム・グルタミクムの形質転換およびフェニルア
ラニンアナログ耐性プラスミドｐＥｐｈｅ＾２２の取得
上記で調整したｐＢｐｈｅ＾ｌＤＮＡを形質転換に供し
た。形質転換に供する受容菌として、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムＡ Ｔ ＣＣ３１８３０から誘導され
たりゾチーム感受性変異株コリネバクテリウム・グルタ
ミクムＬ−１５ＡＴＣＣ３１８３４を用いた。Ｌ−１５
株の種培養をＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ１酵母エキ
ス５ｇを水１１に含みｐ Ｈ７，２に調整した培地）に
植菌し、３０℃で振盪培養した。ＯＤ ｌ）、 ６にな
った時点で集菌し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔グルコース
５ｇ１カザミノ酸５ｇ１酵母エキス２，５ｇ、に２ＨＰ
Ｏａ ３．５ｇ５ＫＨｉＰＯａ １．５ｇ。
ＭｇＣＡ２・６Ｈ２００，４１ｇ５ＦｅＳＯｓ・７Ｈｚ
０ １０■、 Ｍｎ３Ｏ４・４〜６Ｈ１Ｏ２■、Ｚｎ５
Ｏ，・７Ｈ２００，９ｍｇ、（ＮＨ４）＠ＭＯｖＯ２ｓ
ｌ ４ＨｚＯＯ，０４ｍｇ、ピオチン３０■、サイア
ミン塩酸塩２■、コノ１り酸二ナトリウム１３５ｇ、ポ
リビニルピロリドン（分子量１０．０００）３０ｇを水
１１に含む培地〕に１＊ｇ／ｍｌのりゾチームを含む液
（ｐＨ７，６）に約１０９細胞／ｍｌとなるように懸濁
し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩やかに振盪反
応してプロトプラスト化した。
０ １０■、 Ｍｎ３Ｏ４・４〜６Ｈ１Ｏ２■、Ｚｎ５
Ｏ，・７Ｈ２００，９ｍｇ、（ＮＨ４）＠ＭＯｖＯ２ｓ
ｌ ４ＨｚＯＯ，０４ｍｇ、ピオチン３０■、サイア
ミン塩酸塩２■、コノ１り酸二ナトリウム１３５ｇ、ポ
リビニルピロリドン（分子量１０．０００）３０ｇを水
１１に含む培地〕に１＊ｇ／ｍｌのりゾチームを含む液
（ｐＨ７，６）に約１０９細胞／ｍｌとなるように懸濁
し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩やかに振盪反
応してプロトプラスト化した。
このプロトプラスト懸濁液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり
２．５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ１ｌ衝液
（１３ｍＭ塩化マグネシウム、３０＋ｎＭ塩化カルシウ
ム、５０ｍＭ）リス、４００ｍＭショ糖、ｐＨ７，５）
１ｍＭに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ８ｔ衝液Ｑ、
１ｍＭに再懸濁した。この懸濁液に２倍濃度の７３ＭＣ
緩衝液と上記ｐＢｐｈｅ＾ｌＤＮＡ混合物の１対１混合
液１００屑を加えて混和し、次いで７３ＭＣ１Ｉ衡液中
に２０％ポリエチレングリコール６．０００ （ＰＥＧ
６．０００）を含む液Ｑ、３ｍｌを添加して混合した。
２．５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ１ｌ衝液
（１３ｍＭ塩化マグネシウム、３０＋ｎＭ塩化カルシウ
ム、５０ｍＭ）リス、４００ｍＭショ糖、ｐＨ７，５）
１ｍＭに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ８ｔ衝液Ｑ、
１ｍＭに再懸濁した。この懸濁液に２倍濃度の７３ＭＣ
緩衝液と上記ｐＢｐｈｅ＾ｌＤＮＡ混合物の１対１混合
液１００屑を加えて混和し、次いで７３ＭＣ１Ｉ衡液中
に２０％ポリエチレングリコール６．０００ （ＰＥＧ
６．０００）を含む液Ｑ、３ｍｌを添加して混合した。
３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）釦ｌを添加し、２
．５００×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除去
し、沈澱したプロトプラストを１ｍＭのＲＣＧＰ培地に
懸濁してから３０℃で２時間緩やかに振盪した。このプ
ロトプラスト懸濁液の０．２１１１１をカナマイシン２
００ｘ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に
１．４％寒天を含む培地、ｐ Ｈ７，２）に塗布し、３
０℃で７日間振盪した。
．５００×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除去
し、沈澱したプロトプラストを１ｍＭのＲＣＧＰ培地に
懸濁してから３０℃で２時間緩やかに振盪した。このプ
ロトプラスト懸濁液の０．２１１１１をカナマイシン２
００ｘ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に
１．４％寒天を含む培地、ｐ Ｈ７，２）に塗布し、３
０℃で７日間振盪した。
選択プレート上に生育したカナマイシン耐性コロニーの
培養菌体から前記と同様にプラスミドＤＮＡを単離した
。形質転換株の一株から得られたプラスミドを各種制限
酵素消化後アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐ
ＥｐｈｅＡｌと同一のプラスミドであることがわかった
。
培養菌体から前記と同様にプラスミドＤＮＡを単離した
。形質転換株の一株から得られたプラスミドを各種制限
酵素消化後アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐ
ＥｐｈｅＡｌと同一のプラスミドであることがわかった
。
次に、ｐＥｐｈｅＡｌを保有するし一１５株をカナマイ
シン１０■／ｍｌを含むＮＢ培地で対数増殖の後期まで
増殖させた。菌体を５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液
（ｐＨ６，０）で２回遠心洗浄後、Ｎ−メチル−Ｎ′−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン４００Ｍ／ｍｌを含む
５０ｍＭ）リス−マレイン酸緩衝液（ｐ Ｈ６，０）中
で、室温で３０分間処理した。処理菌体を５０１１１Ｍ
）！Ｊスス−レイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２回遠心
洗浄後、洗浄菌体をカナマイシン１０■／ｍｌを含むＮ
Ｂ培地中、３０℃で１６時間培養し、前記と同様の方法
でプラスミドＤＮＡを単離した。
シン１０■／ｍｌを含むＮＢ培地で対数増殖の後期まで
増殖させた。菌体を５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液
（ｐＨ６，０）で２回遠心洗浄後、Ｎ−メチル−Ｎ′−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン４００Ｍ／ｍｌを含む
５０ｍＭ）リス−マレイン酸緩衝液（ｐ Ｈ６，０）中
で、室温で３０分間処理した。処理菌体を５０１１１Ｍ
）！Ｊスス−レイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２回遠心
洗浄後、洗浄菌体をカナマイシン１０■／ｍｌを含むＮ
Ｂ培地中、３０℃で１６時間培養し、前記と同様の方法
でプラスミドＤＮＡを単離した。
単離したプラスミドを用い、Ｌ−１５株を前記と同様の
方法で形質転換した。カナマイシン２００ｕ／ｍｌを含
むＲＣＣ，Ｐ寒天培地上に生育したカナマイシン耐性コ
ロニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗浄後
、ｐ−フルオロフェニルアラニン０．８■／ｍｌあるい
はｍ−フフエ＝ル ルオロｉラニン０．１■／ｍｌを含む最少寒天培地Ｍｌ
（ブドウ糖１０ｇ−（ＮＨｉ）ｔｓＯｎ ４ｇ、Ｋ
Ｃｌ ０．２ｇ、Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２００，２ｇ、 Ｆ
ｅ ＳＯａ ・７ Ｈｚｏ １０１ｇ、ＭｎＳＯ４
・４〜６ＨｚＯ０，２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏｎ・７ＨｚＯＯ，
９ｍｇ、Ｃｕ５Ｏａ・５ＨｉＯ０，４ｇ、Ｎａ。
方法で形質転換した。カナマイシン２００ｕ／ｍｌを含
むＲＣＣ，Ｐ寒天培地上に生育したカナマイシン耐性コ
ロニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗浄後
、ｐ−フルオロフェニルアラニン０．８■／ｍｌあるい
はｍ−フフエ＝ル ルオロｉラニン０．１■／ｍｌを含む最少寒天培地Ｍｌ
（ブドウ糖１０ｇ−（ＮＨｉ）ｔｓＯｎ ４ｇ、Ｋ
Ｃｌ ０．２ｇ、Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２００，２ｇ、 Ｆ
ｅ ＳＯａ ・７ Ｈｚｏ １０１ｇ、ＭｎＳＯ４
・４〜６ＨｚＯ０，２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏｎ・７ＨｚＯＯ，
９ｍｇ、Ｃｕ５Ｏａ・５ＨｉＯ０，４ｇ、Ｎａ。
Ｂ＊Ｏ−＋’１Ｏ８２００，０９ｍｇ、（Ｎ Ｈ４）Ｉ
ＩＭ ｏｆｆｏ２４・４Ｈ２００，０４ｍｇ、ピオチン
５０■、ｐ−アミノ安息香酸２．５＋ｇ、サイアミン塩
酸塩１■、寒天１６ｇを水１１中に含み、ｐＨ７，２に
調整した培地〕に塗布して、３０℃で３日間培養した。
ＩＭ ｏｆｆｏ２４・４Ｈ２００，０４ｍｇ、ピオチン
５０■、ｐ−アミノ安息香酸２．５＋ｇ、サイアミン塩
酸塩１■、寒天１６ｇを水１１中に含み、ｐＨ７，２に
調整した培地〕に塗布して、３０℃で３日間培養した。
出現したコロニーから、ｐ−フルオロフェニルアラニン
１．０■７ｍｌＳｍ−フルオロフェニルアラニン１．０
■／ｍｌをそれぞれ単独で含むＭ１寒天培地、およびカ
ナマイシンＬｏｇ／ｍｌを含むＮＢ寒天培地上で生育で
きるコロニーを選択した。その−株から分離したプラス
ミドをｐＥｐｈｅＡ２２と命名した。
１．０■７ｍｌＳｍ−フルオロフェニルアラニン１．０
■／ｍｌをそれぞれ単独で含むＭ１寒天培地、およびカ
ナマイシンＬｏｇ／ｍｌを含むＮＢ寒天培地上で生育で
きるコロニーを選択した。その−株から分離したプラス
ミドをｐＥｐｈｅＡ２２と命名した。
Ｌ−１５株、および、ｐＥｐｈｅＡｌあるいはｐＥｐｈ
ｅＡ２２を保有するＬ−１５株について、フェニルアラ
ニンアナログに対する耐性度を比較した。Ｌ−１５株は
ｐ−フルオロフェニルアラニンを０．０５ ｍｇ／ｉｆ
を含むＭ１寒天培地では生育できないが、ｐＥｐｈｅＡ
ｌあるいはｐＥｐｈｅＡ２２を保有するし一１５株はｐ
−フルオロフェニルアラニンをそれぞれ０．２■／ｍｌ
、１．２ｑ／１を含むＭ１寒天培地でも生育した。同様
に、ｐＥｐｈｅＡｌあるいはｐＥｐｈｅＡ２２を保有す
るし一１５株は同時にｍ−フルオロフェニルアラニンに
対する耐性形質も獲得していた。
ｅＡ２２を保有するＬ−１５株について、フェニルアラ
ニンアナログに対する耐性度を比較した。Ｌ−１５株は
ｐ−フルオロフェニルアラニンを０．０５ ｍｇ／ｉｆ
を含むＭ１寒天培地では生育できないが、ｐＥｐｈｅＡ
ｌあるいはｐＥｐｈｅＡ２２を保有するし一１５株はｐ
−フルオロフェニルアラニンをそれぞれ０．２■／ｍｌ
、１．２ｑ／１を含むＭ１寒天培地でも生育した。同様
に、ｐＥｐｈｅＡｌあるいはｐＥｐｈｅＡ２２を保有す
るし一１５株は同時にｍ−フルオロフェニルアラニンに
対する耐性形質も獲得していた。
（５） ｐ Ｅ ｐ ｈ ｅ Ａ ｌあるいはｐＥｐ
ｈｅＡ２２保存株によるフェニルアラニンの生産 フェニルアラニン生産性菌株コリネバクテリウム・グル
タミタムＫ−５０をＮＢ培地にて３０℃で１６時間振盪
培養し、その種培養を３３Ｍ培地〔グルコース２０ｇ、
（ＮＨ４）ｔｓＯｎ １０ｇ１尿素３ｇ、酵母エキス
１ｇ、ＫＨｚＰＯｉＩｇ、Ｍｇ（Ｊ！ｚ・６Ｈ＊ＯＯ，
４ｇ、Ｆｅ５０゜・７Ｈ２０１０Ｍ、ＭｎＳＯ４’ ４
〜６Ｈ２００，２ｍｇ、ＺｎＳＯｓ ・７Ｈ２００，９
ｍｇ５ＣｕＳＯ４’ ５ＨｉＯＯ，４ｇ＋ｇＳ Ｎａｚ
ＢｓＯｔ４０ＨｔＯ０，０９ｍｇ５ （ＮＨａ）ｓＭ
Ｏｔｏ２＊ ’ ４Ｈ＊００．０４■、ビオチン３０鴻
、サイアミン塩酸塩１■を水１１に含みＩ） Ｈ７，２
に調整した培地〕に接種して３０℃で振盪培養した。Ｏ
Ｄ ０．２になった時点で０．５単位／ｍｌになるよう
にペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、ＯＤ約
０．６になったところで細胞を集菌し、ＲＣＧＰ培地に
１■／ｍｌのリゾチームを含む液（ｐＨ７，６）に約１
０９細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移し
て３０℃で１４時時間中かに振盪してプロトプラスト化
した。
ｈｅＡ２２保存株によるフェニルアラニンの生産 フェニルアラニン生産性菌株コリネバクテリウム・グル
タミタムＫ−５０をＮＢ培地にて３０℃で１６時間振盪
培養し、その種培養を３３Ｍ培地〔グルコース２０ｇ、
（ＮＨ４）ｔｓＯｎ １０ｇ１尿素３ｇ、酵母エキス
１ｇ、ＫＨｚＰＯｉＩｇ、Ｍｇ（Ｊ！ｚ・６Ｈ＊ＯＯ，
４ｇ、Ｆｅ５０゜・７Ｈ２０１０Ｍ、ＭｎＳＯ４’ ４
〜６Ｈ２００，２ｍｇ、ＺｎＳＯｓ ・７Ｈ２００，９
ｍｇ５ＣｕＳＯ４’ ５ＨｉＯＯ，４ｇ＋ｇＳ Ｎａｚ
ＢｓＯｔ４０ＨｔＯ０，０９ｍｇ５ （ＮＨａ）ｓＭ
Ｏｔｏ２＊ ’ ４Ｈ＊００．０４■、ビオチン３０鴻
、サイアミン塩酸塩１■を水１１に含みＩ） Ｈ７，２
に調整した培地〕に接種して３０℃で振盪培養した。Ｏ
Ｄ ０．２になった時点で０．５単位／ｍｌになるよう
にペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、ＯＤ約
０．６になったところで細胞を集菌し、ＲＣＧＰ培地に
１■／ｍｌのリゾチームを含む液（ｐＨ７，６）に約１
０９細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移し
て３０℃で１４時時間中かに振盪してプロトプラスト化
した。
このプロトプラスト懸濁液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり
２．５００ ｘ ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝
液１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衡液Ｑ、
１ｍｌに再懸濁した。この懸濁液に２倍濃度のＴＳＭ（
ｊｌｆｉ液とｐＥｐｈｅＡｌあるいはｐｅｐｈｅ＾２２
ＤＮＡの１対１混合液１００４を加えて混和し、実施例
１（４）と同様にＰＥＧ６．０００を介した形質転換を
行い、形質発現させた後、０．２ｍｌをカナマイシン２
０ ＯＮ／１１１１を含むＲＣＧＰ寒天培地に塗布し、
３０℃で１０日間培養した。
２．５００ ｘ ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝
液１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衡液Ｑ、
１ｍｌに再懸濁した。この懸濁液に２倍濃度のＴＳＭ（
ｊｌｆｉ液とｐＥｐｈｅＡｌあるいはｐｅｐｈｅ＾２２
ＤＮＡの１対１混合液１００４を加えて混和し、実施例
１（４）と同様にＰＥＧ６．０００を介した形質転換を
行い、形質発現させた後、０．２ｍｌをカナマイシン２
０ ＯＮ／１１１１を含むＲＣＧＰ寒天培地に塗布し、
３０℃で１０日間培養した。
出現したコロニーの中からカナマイシンｌＯ■／ｍｌを
含むＮＢ寒天培地上で生育できる株が得られた。
含むＮＢ寒天培地上で生育できる株が得られた。
カナマイシンに耐性になった形質転換株を４００ｍｌＳ
ＳＭ培地で振盪培養し、ＯＤ ０．２になったところで
０．５単位／ｍｌとなるようにペニシリンＧを添加し、
さらにＯＤ約０．６まで培養し、集菌した菌体から実施
例１（１）と同様な方法でプラスミドを単離した。これ
らのプラスミドを制限酵素消化後アガロースゲル電気泳
動で解析した結果、ｐＥｐｈｅＡｌあるいはｐＨ：ｐｈ
ｅ＾２２と同一のプラスミドであることがわかった。こ
のようにして得られたｐＥｐｈｅＡｌあるいはｐＢｐｈ
ｅ＾２２を保有する形質転換株は、各々、コリネバクテ
リウム・グルタミタムＫ−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７
６８）、およびコリネバクテリウム・グルタミタムＫ−
５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９）として微工研に寄託
されている。
ＳＭ培地で振盪培養し、ＯＤ ０．２になったところで
０．５単位／ｍｌとなるようにペニシリンＧを添加し、
さらにＯＤ約０．６まで培養し、集菌した菌体から実施
例１（１）と同様な方法でプラスミドを単離した。これ
らのプラスミドを制限酵素消化後アガロースゲル電気泳
動で解析した結果、ｐＥｐｈｅＡｌあるいはｐＨ：ｐｈ
ｅ＾２２と同一のプラスミドであることがわかった。こ
のようにして得られたｐＥｐｈｅＡｌあるいはｐＢｐｈ
ｅ＾２２を保有する形質転換株は、各々、コリネバクテ
リウム・グルタミタムＫ−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７
６８）、およびコリネバクテリウム・グルタミタムＫ−
５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９）として微工研に寄託
されている。
コリネバクテリウム・グルタミタムＫ−５０゜Ｋ−５１
、およびに−５２のＬ−フェニルアラニン生産試験を行
った。ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養した種培
養Ｑ、５ａ＋Ｉを５ｍｌの生産培地Ｐ４（廃糖蜜２００
ｇ、（ＮＨａ）ａｓＯｔ２０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ
、、に２ＨＰ０゜０．５ｇ５ＭｇＳＯ４・７８ｉ○ ０
．２５ｇ、ＮＺ７ミ７２．５ｇ、ＣａＣＯ５２０ｇを水
１１に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地〕の入った試
験管に接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。
、およびに−５２のＬ−フェニルアラニン生産試験を行
った。ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養した種培
養Ｑ、５ａ＋Ｉを５ｍｌの生産培地Ｐ４（廃糖蜜２００
ｇ、（ＮＨａ）ａｓＯｔ２０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ
、、に２ＨＰ０゜０．５ｇ５ＭｇＳＯ４・７８ｉ○ ０
．２５ｇ、ＮＺ７ミ７２．５ｇ、ＣａＣＯ５２０ｇを水
１１に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地〕の入った試
験管に接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。
培養後、培養炉液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定置してＬ−フェニルアラ
ニンの生成量を測定した。
、ニンヒドリン発色後、比色定置してＬ−フェニルアラ
ニンの生成量を測定した。
対照株コリネバクテリウム・グルタミタムＫ−５０とと
もにＬ−フェニルアラニンの生成量を１１表に示す。
もにＬ−フェニルアラニンの生成量を１１表に示す。
実施例２゜
（１）各種コリネ型グルタミン酸生産菌の形質転換株に
よるフェニルアラニンの生産 コリネバクテリウム・ハーキユリスＡＴＣＣ１３８６８
、ブレビバクテリウム・フラブムΔＴＣＣ１４０６７、
およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴ
ＣＣ１３６５５、ミクロバクテリウム・アンモニアフィ
ルムＡＴＣＣ１５３５４を実施例Ｌ（５）と同様にペニ
シリンＧ存在下で培養し、該細胞をリゾチームで処理し
てプロトプラスト化した。このプロトプラストを実施例
１（４）と同様な方法により、ＰＥＧ６、０００を介し
てｐＢｐｈｅ＾２２で形質転換し、カナマイシン耐性の
形質転換株を得た。
よるフェニルアラニンの生産 コリネバクテリウム・ハーキユリスＡＴＣＣ１３８６８
、ブレビバクテリウム・フラブムΔＴＣＣ１４０６７、
およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴ
ＣＣ１３６５５、ミクロバクテリウム・アンモニアフィ
ルムＡＴＣＣ１５３５４を実施例Ｌ（５）と同様にペニ
シリンＧ存在下で培養し、該細胞をリゾチームで処理し
てプロトプラスト化した。このプロトプラストを実施例
１（４）と同様な方法により、ＰＥＧ６、０００を介し
てｐＢｐｈｅ＾２２で形質転換し、カナマイシン耐性の
形質転換株を得た。
各株の形質転換株のペニシリン処理菌体から、実施例１
（５）と同様な方法でプラスミドを単離した。これらの
プラスミドを制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動
で解析した結果、形質転換株はｐＥｐｈｅ＾２２と同一
のプラスミドを有していることがわかった。
（５）と同様な方法でプラスミドを単離した。これらの
プラスミドを制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動
で解析した結果、形質転換株はｐＥｐｈｅ＾２２と同一
のプラスミドを有していることがわかった。
これらのｐＥｐｈｅ＾２２を保有する形質転換株と各々
の親株を実施例１（５）と同一条件でＬ−フェニルアラ
ニンの生産試験を行った。
の親株を実施例１（５）と同一条件でＬ−フェニルアラ
ニンの生産試験を行った。
その結果を第１表に示す。
第１表
−３３（２）皇月一
本発明によれば、エシェリシア属に属する微生物のＣＭ
およびＦＤの合成に関与する遺伝子とベクタープラスミ
ドとの組換え体を保有させて、コリネバクテリウム属、
ブレビバクテリウム属、またはミクロバクテリウム属菌
種におけるＬ−フェニルアラニンの生産性を付与、ある
いは向上させることができる。
およびＦＤの合成に関与する遺伝子とベクタープラスミ
ドとの組換え体を保有させて、コリネバクテリウム属、
ブレビバクテリウム属、またはミクロバクテリウム属菌
種におけるＬ−フェニルアラニンの生産性を付与、ある
いは向上させることができる。
第１図はｐＢｐｈｅ＾１の制限酵素切断地図とその作製
工程を示す。矢印は遺伝子の転写される方向を示しであ
る。プラスミドの分子量はキロペース（にｂ）で表示さ
れている。 第１図
工程を示す。矢印は遺伝子の転写される方向を示しであ
る。プラスミドの分子量はキロペース（にｂ）で表示さ
れている。 第１図
Claims (5)
- （１）エシェリシア属に属する微生物のコリスメートム
ターゼおよびプリフェネートデヒドラターゼの合成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組
換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属、ブレビ
バクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属する微
生物を培地中に培養し、培養物中にＬ−フェニルアラニ
ンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−フェニルアラニ
ンを採取することを特徴とするＬ−フェニルアラニンの
製造法。 - （２）ベクターがコリネバクテリウム属に属する微生物
由来のｐＣＧ１、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１、ｐ
ＣＥ５１、ｐＣＢ５２、ｐＣ８５３、ｐＣＢ１０１およ
びそれらから誘導されるプラスミドから選ばれる特許請
求の範囲第１項記載の方法。 - （３）エシェリシア属に属する微生物由来のコリスメー
トムターゼおよびプリフェネートデヒドラターゼの合成
に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片が、フェニルアラニ
ンのアナログに対する耐性をコリネバクテリウム属、ブ
レビバクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属す
る微生物に付与することができるＤＮＡ断片であること
特徴とする組換え体ＤＮＡ。 - （４）エシェリシア属に属する微生物のコリスメートム
ターゼおよびプリフェネートデヒドラターゼの合成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組
換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属、ブレビ
バクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属する微
生物。 - （５）コリネバクテリウム・グルタミタムＫ−５１（６
）コリネバクテリウム・グルタミタムＫ−５２
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60102101A JPS61260892A (ja) | 1985-05-14 | 1985-05-14 | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60102101A JPS61260892A (ja) | 1985-05-14 | 1985-05-14 | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61260892A true JPS61260892A (ja) | 1986-11-19 |
Family
ID=14318397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60102101A Pending JPS61260892A (ja) | 1985-05-14 | 1985-05-14 | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61260892A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63273469A (ja) * | 1986-12-13 | 1988-11-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 乳糖資化性を有する新規微生物 |
| EP0488424A3 (en) * | 1990-11-30 | 1992-09-09 | Ajinomoto Co., Ltd. | Recombinant dna sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant dna sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation |
| US5605818A (en) * | 1992-12-03 | 1997-02-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-tryptophan, L-tyrosine or L-phenylalanine |
| WO1997048790A1 (fr) * | 1996-06-17 | 1997-12-24 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de substance-cible par fermentation |
| WO2010090330A1 (ja) | 2009-02-09 | 2010-08-12 | 協和発酵バイオ株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| CN103146773A (zh) * | 2013-03-08 | 2013-06-12 | 江南大学 | 一种增强大肠杆菌l-苯丙氨酸胞外分泌的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6024192A (ja) * | 1983-05-28 | 1985-02-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | フエニ−ルアラニンの製造法 |
| JPS6030693A (ja) * | 1983-07-29 | 1985-02-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
-
1985
- 1985-05-14 JP JP60102101A patent/JPS61260892A/ja active Pending
Patent Citations (2)
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