JPS61275221A

JPS61275221A - タンパク質

Info

Publication number: JPS61275221A
Application number: JP60115502A
Authority: JP
Inventors: Juji Noguchi; 野口　重次; Akira Awaya; 昭粟屋; Tatsuro Koike; 達郎小池
Original assignee: Mitsui Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Mitsui Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1985-05-30
Filing date: 1985-05-30
Publication date: 1986-12-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はヒト又は他の動物の腫瘍、癌ならびに脳神経系
疾患の治療用剤、診断用剤に適応しうるタンパク質に関
する。

従来の技術癌の診断においてα−フェトプロティン、癌胎児性抗原
（ｃＨＡ）　、ＣＡ　１９−９などの癌関連抗原がｌＩ
ｔ瘍マーカーとして用いられて来た。さらにまた各種の
癌の発現、進行に伴い、生体内に正常とは異なる物質が
消長することが明らかにされ、これらをマーカーとして
新しい癌の診断法を確立する試みが、ますます盛んに行
われている。

本発明者はかかる見地より動物の胚発生の初期段階にの
み出現する物質について研究を行い、マウスの脳神経系
の発生・分化の時間的経過において出現しかつ消失する
タンパク質について鋭意研究を行った結果、ある種のタ
ンパク質が時期特異的に脳胚に出現し、成熟した正常動
物においては存在しないことを見い出した。これらのタ
ンパク質は増殖細胞に特異的であり、過剰増殖に対する
マーカーとなり得るものと考え、その有用性から特許出
願した（特願昭５８−２０６８９９）。

更に本発明者は脳外科手術により得られた患者の脳神経
系腫瘍組織についても検討した結果、ヒト脳神経系細胞
にも、マウス脳神経系細胞と同様、特異的なタンパク質
が存在することを発見し、その脳神経系疾患やがんの領
域での有用性に鑑み、特許出願した（特願昭６０−７３
５５０　）。

発明が解決しようとする問題点前記特許出願にかかわるタンパク質抗原は、マウス胎児
の肺肝や患者の脳神経系腫瘍組繊細胞から抽出・分離・
精製されるもので、これらタンパク質を工業的に大量に
確保するためには時間と手間をきわめて要し、経済的で
はない。特に患者の腫瘍組織を量的に集めることは実際
的には大変困難であり、前記特願昭６０−７３５５０に
あるようにわずかに得られた腫瘍組織をヌードマウスあ
るいはハムスターなどに植えて増殖させる手段をとる必
要がある。

問題点を解決するための手段そこで、本発明者は外科手術により得られる動物の脳神
経系組織にたよることなく、既に株細胞として樹立され
たマウス、ラット、ヒトなどに由来する脳神経系腫瘍細
胞を大量に集めれば、正常マウス、正常ラット、正常ヒ
トの脳神経組繊細胞には存在しないで、胎児に特異的な
あるいは腫瘍に特異的なタンパク質が発見できるのでは
ないかと想到した。そして本発明者は各種動物の脳神経
系細胞を培養器内で培養するか、あるいは動物体内で増
殖させた後細胞を集め、正常動物脳神経組織には存在し
ない、脳神経系腫瘍細胞特異的なタンパク質を分離・精
製・同定するに到り、本発明を完成した。

本発明のタンパク質は継代培養された各種動物由来の脳
神経腫瘍細胞に存在し、二次元電気泳動法による分子量
が５５，０００ないし１４０．０００であり、等電点が
４．５ないし５．８であることを特徴とするタンパク質
である。

本発明者の用いた動物細胞には次のものがある。

マウス由来細胞としては神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏｂｌ
ａｓｔｏｍａ　）　Ｎ−１８株、同Ｎ−１１５株、同Ｎ
Ｂ４１Ａ３株、同Ｎｅｕｒｏ　２ａ株、平滑筋様脳腫瘍
（Ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ−１ｉｋｅｂｒａｉｎ　
ｔｕｍｏｒ）　ＢＣ３Ｈ１株、ラット由来細胞としては
褐色細胞腫（Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）　Ｐ
Ｃｌ３株、ダリア細胞腫（Ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｔｕ
ｍｏｒ）　Ｃ６株、下垂体腫瘍（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　
　ｔｕｍｏｒ）　ＧＨ３％骨格筋筋原細胞腫（５ｋｅｌ
ｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅ　ｍｙｏｂｌａｓｔ　＞　Ｌ　
６株、またヒト由来細胞としてはＩＭＲ−３２株、ヒト
胎児脳Ｆｌｏｗ３０００株である。

本発明者はこれら細胞をそれぞれに適当な培養液、血清
を用いて適当な培養日数、培養器内で培養するか、動物
体内で増殖させた後大量に集め、下記試剤を用いてホモ
ジネートにし、タンパク質を抽出し、二次元電気泳動法
で分析した結果、培養脳神経系腫瘍細胞のタンパク質の
主要のものは約１００種存在し、正常マウス脳および正
常ラット脳には検出されないか、わずかしか存在せず、
培養脳神経系腫瘍細胞にのみ検出されるか、より多く検
出されるタンパク質が、各脳神経系腫瘍細胞について計
８種類以上（ＮＡＫ−１ないしＮＡＫ−８など）存在す
ることが明らかとなった。

本タンパク質の分離・精製は公知の技術で行うことがで
きる。たとえば脳神経系腫瘍細胞をトリトンＸ−１００
、フェニルメチルスルフォニルフルオライドなどを含む
トリス・塩酸緩衝液でホモジナイズし低温で抽出を行い
、次いで高速遠心分離し得られた上清にエタノールなど
のアルコールを加え沈澱させた分画を、ゲル口過および
イオン交換クロマトグラフィーなどにより処理すること
によって各タンパク質を分離・精製することができる。

また各タンパク質の物理化学的性質は、ホモジネート粗
分画中の各タンパク質をＳＯＳポリアクリルアミドゲル
上での二次元電気泳動法により分離し、それらの分子量
および等電点を測定することにより確認された。表−１
に各タンパク質の物性をまとめた。

表−１かられかるように各タンパク質の等電点は酸性に
よっており、これらタンパク質のあるものは、本発明者
が先に出願した前記特願昭５８−２０６８９９および特
願昭６０−７３５５０に記載したタンパク質と同様に、
シアル酸を含むシアロ糖タンパク質である可能性がある
。一般に糖タンパク質の場合、電気泳動法による分子量
の測定はみかけ上の値を測っている。また表−１に示し
た分子量は、±２゜０００程度の誤差があると考えられ
る。

脳神経系腫瘍細胞のあるものは神経成長因子（ｎｅｒｖ
ｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、　ＮＧＦ）を存在さ
せることにより分化が誘導され、また神経突起の数が増
加し、突起が進展する。その間に各種タンパク質の消長
が起こる。本発明者は褐色細胞腫ＰＣ１２株細胞につい
てＮＧＦの処理時間を変えることにより、タンパク質の
消長を調べ、ＮＧＰで処理しない株細胞におけると同様
、正常ラット脳および正常マウス脳には見られないか、
わずかしか存在せず、本細胞には見られる、タンパク質
ＮＡＫ−１ないしＮＡＫ−８を見い出した。そのうちＮ
ＡＫ−４およびＮＡＫ−５タンパク質の量はＮＧＦ処理
処理３定後処理期間中最大に達した。

以下実施例により本発明をさらに詳述するが、本発明は
これらに限定されない。

実施例１ラット副腎髄質由来褐色細胞腫（Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏ
ｃｙｔｏｍａ）　ＰＣ１２株細胞（Ｓ、Ｅ、Ｐｆｅｉｆ
ｆｅｒ博士より入手）をコラーゲン塗布した９０ｍｍプ
ラスチック皿（Ｎｕｎｃ社製）にまき、炭酸ガス培養器
（５％ＣＯ２＋９５％ａｉｒ　）中、３７℃、ＰＨ７，
０〜７．２で培養した。培養液は牛胎児血清（ＦＢＳ　
、　５％）と馬血清（ＨＳ、　１０％）を含むＤｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍ
ｓｄｉｕｍ（ＤＭＥ　、　８５％）を用いた。細胞が１
０日間の培養で定常期に達した後、培地を除き水冷した
Ｃａ−Ｍｇを含まないリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ＋　Ｐ）１７゜０）で２回洗い、細胞をはがし
、遠心管に集め、冷却遠心機（日立社製）内で１　、０
００ｒｐｍ、５分で遠沈して一皿あたり３Ｘ１０”の細
胞を集めた。これに２％トリトンＸ−１００、０，１５
Ｍ食塩、５０ｔｒｇ　／ｍｇフェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む１０ｍＭ　）リス・
塩酸緩衝液（ＰＨ７，６）　０．１ｍｌを加え、ホモジ
ナイズし、４℃で３０分間抽出を行った。次いで高速遠
心分離（４０，ＯＯＯｒｐｍ　）を６０分間行い、得ら
れた上清に１０倍量のエタノールを加え、１０分間遠心
分離（３，００Ｏｒｐｍ）　Ｌ、上清を除去した。得ら
れた沈澱に９．５Ｍ尿素、２％ＮＰ−４０（半井社製）
、２％アンホライン（ＰＨ３，５〜１０）（ファルマシ
ア製）、５％メルカプトエタノール、０．２５％ソジウ
ムドデシルサルフェート（以下ＳＯＳと略記）よりなる
可溶化溶液に溶かし溶液とした。次いでこの溶液の二次
元電気泳動を行い、各タンパク質を分離し、分子量及び
等電点を測定した。対照のタンパク質として、いずれも
Ｓｉｇｍａ社製のチログロブリン（分子量３３０，００
０　＞　　、ラクトフェリン（同８８，０００）　、ウ
シ血清アルブミン（同６７、０００）、卵白アルブミン
（同４３，０００）及びアルドラーゼ（同３４，０００
）を用いた。一次元目の電気泳動には次の処方のゲルを
使用した。〔尿素２．７６ｇ　、３０％アクリルアミド
０．６７ｍ１．１０％ＮＰ−４０１ｍｌアンホライン（
ＰＨ３，５−１０）　０．２５ｍ１．１０％過硫酸アン
モニア１０Ａ１１，５％ＴＥＭＥＤ　０．１４ｍ１．水
０．９１ｍ１）　　（６本分）。サンプルをこの一次元
ゲルにかけ、陽極液として１０ｍＭ　Ｈ３ＰＯ４、陰極
液として２０ｍＭ　ＮａＯＨをそれぞれ用い、４００ｖ
で１３時間、次いで８００Ｖで１時間電気泳動を行った
。次いで泳動後のゲルをＳＯ３試料緩衝液（１０％グリ
セリン、５％β−メルカプトエタノール、２．３％ＳＯ
３，６２，５ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ＰＨ６，８）
　）と平衡化し、７．５％のアクリルアミドスラブゲル
（２５ｍＭ　）リス、１９２ｍＭグリシン、０．１　％
ＳＯＳ　）　ニかけ、１２０Ｖテ４時間二次元目の電気
泳動を行った。分離した各タンパク質を０．０５％クマ
シブルー、１０％メチルアルコール、１０％酢酸で１時
間染色した後、１０％メチルアルコール、１０％酢酸で
脱色し各タンパク質スポットを測定した。正常ラット脳
および正常マウス脳には見い出せないスポットをＮＡＫ
−１ないしＮＡＫ−６と名づけた。更に正常ラット脳に
はわずかじか存在しないが、本ＰＣ１２株細胞には多量
に存在するスポットをＮＡＫ−７およびＮＡＫ−８と名
づけた。

結果を表−１に示す。

実施例２実施例１と同様の条件で培養開始したラット褐色細胞腫
ＰＣ１２株細胞の培養液を、２日後捨て、２゜５Ｓ　Ｎ
ＧＦ　（Ｖ、Ｂｏｃｃｈｉｎｉ　ａｎｄ　Ｐ、Ｖ、Ａｎ
ｇｅｌｅｔｔｉ＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、ｓｃ
ｉ、Ｕ、ｓ、Ａ、、旦（１９６９）　７８７−７９４を
参照）を５０ｎｇ／ｍｌ含む新しい培養液を１０ｍ１加
え、ＮＧＦ処理を行った（Ｔａｔｓｕｒｏ　Ｋｏｉｋｅ
、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　２羽（１９８３
）　２９３−３０３を参照）。ＮＧＦを加えた後、１日
後、２日後、３日後、５日後、ＮＧＦ処理時間の異なる
それぞれの皿の培養液を捨て、氷冷したリン酸緩衝生理
食塩水で２回洗い、以下実施例１と同様の方法で、Ｉ　
ＸＩＯ”の細胞を集めた。次いで実施例１と同様の方法
で本細胞を処理し、そのホモジネートを二次元電気泳動
して抽出タンパク質を分離・検出し、その性状を確認し
た。正常ラット脳および正常マウス脳には見い出せない
ＮＡＫ−１ないしＮＡＫ−６タンパク質が検出された。

ＮＡＫ−４およびＮＡＫ−５タンパク質の量はＮＧＦ処
理３日後に、処理期間中最大に達した。また正常ラット
脳にはわずかしか存在しないが、本ＰＣ１２株細胞には
多量に存在するスポットが実施例１の定常期のｐｃ株細
胞同様に見られ、同じ＜　ＮＡＫ−７およびＮＡＫ−８
と名づけた（表−１参照）。

実施例３ラット由来ダリア細胞腫Ｃ６株（ＡＴＴＣ由来）を、培
養液の組成がＤＭＥ９５％とＦＢ３５％であること以外
は実施例１と同様の条件で、皿１枚中、７日間培養した
。そして２枚の皿から実施例１と同様の方法で１×１０
８の細胞を集めた。次いで実施例１と同様の方法で本細
胞のタンパク質を抽出し、二次元電気泳動で分離し、正
常ラット脳および正常マウス脳には見い出せないタンパ
ク質スポットを検出し、ＮＡＫ−１、ＮＡＫ−２、ＮＡ
Ｋ−３およびＮＡＫ−６と名づけた。ＮＡＫ−３は他の
細胞の場合に比しその量が多かった。また正常ラット脳
にはわずかしか存在しないが、本細胞には多量に存在す
るスポットが見られＮＡＫ−７と名づけた（表−１参照
）。

実施例４ラット由来下垂体腫瘍ＧＨ３株細胞（ＡＴＴＣ由来）を
、実施例１と同様の条件で、皿３枚、７日間培養した。

そして実施例１．と同様の方法で５Ｘ１０７の細胞を集
めた。次いで実施例１と同様の方法で本細胞のタンパク
質を抽出、分離し、正常ラット脳および正常マウス脳に
は見い出せないタンパク質スポットを検出し、ＮＡＫ−
１、ＮＡＫ−２、ＮＡＫ−３およびＮＡＫ−６と名づけ
た。また正常ラット脳にはわずかじか存在しないが、本
細胞には多量に存在するスポットが見られＮＡＫ−７と
名づけた（表−１参照）。

実施例５ラット由来骨格筋筋原細胞Ｉｆ！Ｌ６株（＾ＴＴＣ由来
）を実施例３と同様の条件で、皿３枚、６日間培養した
。そして実施例１と同様の方法で３Ｘ１０？の細胞を集
めた。次いで実施例１と同様の方法で本細胞のタンパク
質を抽出、分離し、正常ラット脳および正常マウス脳に
は見い出せないタンパク質スポットを検出し、ＮＡＫ−
１、ＮＡＫ−２、ＮＡＫ−３およびＮＡＫ−６と名づけ
た。また正常ラット脳にはわずかしか存在しないが、本
細胞には多量に存在するスポットが見られＮＡＫ−７お
よびＮＡＫ−８と名づけた（表−１参照）。

実施例６マウス由来神経芽細胞腫Ｎ−１８株細胞を実施例３と同
様の条件で、皿５枚、７日間培養した。そして実施例１
と同様の方法で４　ＸＩＯ”の細胞を集めた。次いで実
施例１と同様の方法で本細胞のタンパク質を抽出し、二
次元電気泳動で分離し、正常マウス脳には見い出せない
タンパク質スポットを検出し、ＮＡＫ−１、ＮＡＫ−２
、ＮＡＫ−３、ＮＡＫ−６、ＮＡＫ−７およびＮＡＫ−
８と名づけた（表−１参照）。ＮＡＫ−６タンパク質は
ノイラミニダーゼ処理を行った後、二次元電泳法により
分析してもそのスポットの位置に変化はなかった。

実施例７マウス由来神経芽腫癌細胞Ｎ−１１５株細胞を実施例３
と同様の条件で、皿５枚、７日間培養した。

そして実施例１と同様の方法で３Ｘ１０７の細胞を集め
た。次いで実施例１と同様の方法で本細胞のタンパク質
を抽出、分離し、正常マウス脳には見い出せないタンパ
ク質スポットを検出し、ＮＡＫ−１、ＮＡに−２、ＮＡ
Ｋ−３、ＮＡＫ−６、ＮＡＫ−７およびＮＡＫ−８と名
づけた（表−１参照）。ＮＡＫ−６タンパク質はノイラ
ミニダーゼ処理を行った後、二次元電泳法により分析し
てもそのスポットの位置に変化はなかった。

実施例８マウス由来の平滑筋様脳腫瘍ＢＣ３８１株細胞（＾ＴＴ
Ｃ由来）を、培養液の組成がＤＭＢ　９０％とＦＢ５１
０％であること以外は実施例１と同様の条件で、皿３枚
、１４日間培養した。そして実施例１と同様の方法でｌ
Ｘｌ０”の細胞を集めた。次いで実施例１と同様の方法
で本細胞のタンパク質を抽出、分離し、正常マウス脳お
よび正常ラット脳には見い出せないタンパク質スポット
を検出し、ＮＡＫ−１、ＮＡに−２、ＮＡＫ−３および
ＮＡＫ−６と名づけた。ＮＡＫ−１およびＮＡＫ−２は
他の細胞の場合に比し、その量が多かった。また正常ラ
ット脳にはわずかしか存在しないが、本細胞には多量に
存在するスポットが見られＮＡＫ−７と名づけた（表−
１参照）。

本実施例により明らかにされたこれらＮＡＫ−１ないし
ＮＡＫ−８タンパク質は、本発明者の先に出願した前記
特願昭５８−２０６８９９および特願昭６０−７３５５
０に記載したタンパク質とは、分子量が近似していても
等電点の違いやノイラミニダーゼに対する感受性などで
違いがあり、別なタンパク質と考えられる。

作用本発明のタンパク質は脳神経系の組繊細胞の成長の必須
因子あるいは促進物質として作用し、生体に投与するこ
とによりその効果を発揮する。また本タンパク質は各種
の腫瘍マーカーなどとしても有用であり、これらに対す
る抗体を利用した癌の診断および治療が期待される。

Claims

【特許請求の範囲】

動物由来脳神経系腫瘍細胞に存在し、二次元電気泳動法
による分子量が５５，０００ないし１４０，０００であ
り、等電点が４．５ないし５．８であることを特徴とす
るタンパク質。