JPS61282077A - 窒素固定調節遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （従来技術） 豆科植物の根粒における生物学的窒素固定は。

世界の食糧生産の主要な成分であり、それゆえに当分野
の実際的な応用は非常に興味深い。

原核生物は細胞の窒素の単−源として広範囲の窒素化合
物を使うことができる。この範囲は、無機化合物ではア
ンモニア、Ｎ２．硝酸塩、そして複合有機化合物ではプ
ロリン、アルギニン、グルタミンを含む。それぞれの種
は異なる系列の窒素化合物を利用できる。グルタミン、
グルタミン酸。

アスパラギン酸は中間代謝において鍵となる窒素化合物
である。後者の２つはアミノ酸生合成の多くの経路の出
発化合物であり、多くの反応のアミノ基供与体として働
く。すべての他の場合は、アミノ基はグルタミンにより
供給される。Ｎ２固定により生じるアンモニアの同化に
要求される主要な酵素はグルタミンシンセターゼで、こ
れは次の反応を触媒する。

グルタミン酸　十　Ｎ＋（３＋　　ＡＴＰ　　　→　グ
ルタミン　十　ＡＤＰ　　＋　　Ｐｉ高ＮＨ４＋濃度（
＞１ｍＭ）では、グルタメートデヒドロゲナーゼも見ら
れる。同化アンモニアの利用はグルタメートシンターゼ
の触媒活性に依存する。

グルタミン＋２−ケトグルタル酸＋ＮＡＤＰＨ→　２グ
ルタミン酸＋ＮＡＤＰ” ＡＴＰが加水分解されるので、これらの反応は好都合の
平衡を有し、培地中のアンモニア、あるいは他の窒素源
より酵素的に生じたアンモニアが利用される（　Ｍｅｅ
ｒｓ、　Ｊ、、　Ｔｅｍｐｅｓｔ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｃ
。

Ｂｒｏｗｎ　（１９７０）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　６４　：　１Ｂ？−１９４）。

アンモニアの形成は、このように生物学的窒素循環の鍵
となるステップである。

生物学的窒素固定は様々な微生物により行われ。

大気中の窒素をアンモニアに変°摸する酵素複合体。

すなわちニトロゲナーゼの誘導を通して起こる。

この変換は９通性嫌気性菌（例えば、タープシェラＣニ
ューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ）やロドスピリラム・ルプラン（Ｒｈｏｄｏｓｐｉ
ｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕｍ））＋絶対嫌気性菌（例え
ば、クロストリディウム・バスツーリアナム（ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｒｕｉａｎｕｍ））。

絶対好気性菌（例えば、アゾトバクタ−・ビネランディ
（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ））
そして藍藻類の数珠（例えば、アナベナ・シリンドリカ
（Ａｎａ−ｂａｅｎａ　ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ））を含
む、生理学的に多様な原核生物のあるグループで起こる
（Ｓｐｒｅｎｔ、　Ｊ、　Ｉ。

（１９７９）　Ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏ　　ｏｆ　ｎｉｔｒ
ｏｇｅｎ　ｆｉｘｉｎ　　ｏｒ　ａｎ−ｉｓｍｓ、　Ｌ
ｏｎｄｏｎ、　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ＋　ｐｐ８４１
）。この酵素複合体はすべての特徴を持った窒素固定生
物に共通であるにもかかわらず２発現する条件が種によ
りかなり変わる（Ｂｕｒｎｓ、　Ｒ，Ｃ，、Ｈａｒｄｙ
、　Ｒ，Ｗ、　Ｆ。

（１９７５）　：　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｆｉｘａｔｉｏ
ｎ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄｈｉｇｈｅｒ　ｐ
ｌａｎｔｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂ
ｅｒｌｉｎ）、窒素固定の第１段階、窒素のアンモニア
への変換、はりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属とい
う窒素固定菌を含む豆科植物の根粒で共生的に成される
。いくつかの非豆科植物２例えば、はんのき、ちまた窒
素固定者である共生細菌と相互作用する。さらに、遊離
に存在している細菌２例えば、タレプシェラ・ニューモ
ニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｒ＋ｔａｅ
）や光合成藍藻細菌、も窒素を固定する。豆科植物の根
粒における生物学的窒素固定は１世界の食糧生産の主要
な成分である（Ｂｕｒｒｉｓ、　Ｒ，Ｈ，（１９８０）
　Ｉｎ　ＦｒｅｅＬｉｖｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ａｎ
ｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｅｌｓ　；　Ｎｉｔｒｏ
ｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎ、　Ｎｅｗｔｏｎ、　Ｗ、　Ｅ
、、　０ｒｎｅ−Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｗ、　Ｈ，。

ｅｄｓ、　ｖｏｌ　Ｉ　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ＋ｐｐ７−１６
）。

植物とりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌との
間の共生関係は、細菌とその宿主の間の複雑な相互作用
の結果であり、細菌と植物の両方の遺伝子が互いにきっ
ちりと整合した仕方で発現することを要する（　Ｖｉｎ
ｃｅｎｔ＋　Ｊ、　Ｍ、　（１９８０）　Ｉｎ　Ｓｙｍ
ｂｉｏｔｉｃ八５ｓｏｃｉａｔへｏｎｓ　　ａｎｄ　　
Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、　　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　
　Ｆｉｘ−ａｔｉｏｎ　ｖｏｌ、２　（Ｗ、　Ｅ、　Ｎ
ｅｗｔｏｎ、　Ｗ、　＋（、０ｒｎｅ−Ｊｏｈｎｓｏｎ
。

ｅｄｓ、）　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ、１０３−１２９；
およびＶｅｒｍａ、　Ｄ、　Ｐ、　Ｓ、、　Ｌｅｇｏｃ
ｋｉ、　Ｒ，Ｐ。

ａｎｄ　Ｓ、　Ａｕｇｅｒ　（１９８１）　Ｉｎ　Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｉｎ　Ｎｉｔｒ
ｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ　（Ａ、　Ｈ，Ｇｉｂｓｏ
ｎ、　Ｗ、　Ｅ。

Ｎｅｗｔｏｎ、　ｅｄｓ、）　Ｃａｎｂｅｒｒａ　：　
Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　ｐｐ−２０５−２０８）、遊離に存在してい
るリゾビア（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）では、ニトロゲナーゼ
合成は抑制されており、共生関係が確立されると誘導さ
　　　　　　　、。

れるだけである。さらに、いくつかのりゾビウム（Ｒｈ
ｉｚｏｂｉｕｍ）種は限られた範囲の植物種と相互作用
し合うだけであるが、他の種は広範囲に相互作用し合う
。

細菌は現れてくる植物の根毛に結合し、感染糸を形成し
て根の組織に侵入する。植物はこの感染に応答して高度
に分化した根粒を発達させる。これら根粒はニトロゲナ
ーゼ複合体合成部位である。

窒素固定に続いて、固定された窒素は植物組織へ移動し
、植物由来の酵素により同化される（Ｓｃｏｔｔ。

Ｄ、　Ｂ、＋　　Ｆａｒｎｄｅｎ、　Ｋ、　Ｊ、　Ｆ、
　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｊ。

Ｇ、　（１９７６）　Ｎａｔｕｒｅ　２６３　：　７０
３−７０５）。

はとんどのりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の共生は
豆科植物に限られている。さらに、農業的に重要な温帯
性の豆科植物と共同して窒素を固定するリゾビウム（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ）株は、ふつう宿主域としては単一の
豆科属に限定されている。しかし、豆科種の広範囲のグ
ループで窒素を固定できるが、非豆科のものとも、また
効果的な共生を形成することができる数珠のりゾビウム
（Ｒｈ　１ｚｏｂ　ｉ　ｕｍ）が単離されている。

ある植物があるリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種と
の共生関係でニトロゲナーゼ活性を誘導する能力がある
にもかかわらず、以前より生物学的窒素固定の遺伝解析
は、遊離に生存している窒素固定生物。

特にクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａｐｎｅｕｍｏｎ　１ａｅ）に限られていた。１７の連
関した窒素固定（旦旦遺伝子が、クレブシェラ（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ）の」豆クラスター内の少なくとも７つ
の転写単位に並んでいる（Ｋｅｎｎｅｄｙ、　Ｃ，、Ｃ
ａｎｎｏｎ、　Ｆ、、　Ｃａｎｎｏｎ。

Ｍ、、　Ｄｉｘｏｎ、　Ｒ，、Ｈｉｌｌ、　Ｓ、、　Ｊ
ｅｎｓｅｎ＋　Ｊ、、　Ｋｕｍａｒ＋Ｓ、、　ＭｃＬｅ
ａｎ、　Ｐ、、　Ｍｅｒｒｉｃｋ＋　Ｍ、、　Ｒｏｂｓ
ｏｎ、　Ｒ，ａｎｄＰｏｓｔｇａｔｅ、　Ｊ、　（１９
８１）　Ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖ
ｅｓｉｎ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ　（Ａ
、　Ｈ，Ｇｉｂｓｏｎ、　Ｗ、　Ｅ。

Ｎｅｗｔｏｎ、　ｅｄｓ、）　Ｃａｎｂｅｒｎａ　：　
Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ＋　ｐｐ、１４６−１５６　；およびＲｉｅｄｅ
ｌ＋　Ｇ、　Ｅ−＋Ａｕ５ｕｂｅｌ、　Ｆ、　Ｍ、　ａ
ｎｄ　Ｆ、　Ｍ、　Ｃａｎｎｏｎ　（１９７９）　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７６
　：　２８６６−２８７０）、この遺伝子のうちの３つ
、　ｎｉｆ　）Ｉ＋　ｎｉｆ　Ｄ＋およびｎｉｆには、
ニトロゲナーゼ酵素複合体（すなわち、　Ｆｅ　−タン
パク質サブユニット（ジニトロゲナーゼレダクターゼ）
）の構造タンパク質やＭｏ−Ｆｅタンパク賞（ジニトロ
ゲナーゼ）のα−サブユニットおよびβ−サブユニット
をそれぞれコードしている。

ジニトロゲナーゼは、２つの不同−なαとβのサブユニ
ットが５５，０００から６０．０００の同様の分子量を
持つα２β２の４量体である。ジニトロゲナーゼレダク
ターゼは、約３５，０００の分子量を持つ２つの同一サ
ブユニットからなる２１体である。

これらの遺伝子は、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）では同じオ
ペロン上に連関しており、　　ｎ１ｆＨ遺伝子近傍のプ
ロモーターから転写される。同様の状態（ｎ１ｆＨＤＫ
）が２つの成長の速いリゾビア、リゾビウム・メリロテ
ィ　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）　　（
Ｒｕｖｋｕｎ、　Ｇ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ。

（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　２９　：　５５１−５５９）
とりゾビウム・レグミノサラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　
ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ　（Ｓｃｈｅｔｇｅｎｓ。

Ｔ、Ｍ、Ｐ、ｅｔ　　ａｔ、　　（１９８４）　　Ｉｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａｔｔｏｎ　　ａｎｄ　　ａｎａｌ−ｙ
ｓｉｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　
　ｏｆ　　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　　Ｉｅ　　ｕｍｉｎｏ
−ｓａｒｕｍ　ＰＲＥ　Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ　ｇｅｎｅ
ｓ＋　　ｐ、６９９＋　　Ｉｎ　Ｃ，Ｖｅｅｇｅｒａｎ
ｄ　　Ｗ、Ｅ、　　Ｎｅｗｔｏｎ　　（ｅｄｓ、）　　
Ａｄｖａｎｃｅｓ　　ｉｎ　ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａ
ｔｉｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ
１ｊｈｏｆｆ／叶、Ｗ、ＪｕｎｋＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
、Ｔｈｅ　Ｈａｇｕｅ）に見られる。成長の遅いリゾビ
ウム・ジャポニカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｊａｐｏｎ
ｉｃｕｍ）では、　　ｎ１ｆＤＫが１つのオペロンを形
成しており。

しかもｎ１ｆＨはゲノム上のいたるところに位置してい
るということがわかっている（Ｆｕｈｒｍａｎｎ、　Ｍ
。

ａｎｄ　Ｈ，Ｈｅｎｎｅｃｋｅ　（１９８２）　Ｍｏ１
．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　　１８７：４１９−４２
５）。同様の観察が他の成長の遅い根粒＠（リゾビア）
、すなわちリゾビウム種パラスポニア（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ　ｓｐ、　Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ）で行われ、　ｎ
ｉｆ　Ｈ領域はｎ１ｆＤには連関していないということ
がわかった（Ｓｃｏｔｔ、　Ｋ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ
、　（１９８３）　ＤＮＡ　　２　：１４１−１４８）
。しかし、らん藻のアナベナ種７１２０では順序が異な
っており、　　ｎ１ｆＨＤがｎ１ｆＫから分離されてい
るということが検出された（Ｒｉｃｅ、　Ｄ、。

ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、　２５７　：　１３１５７−１３１６３）。

共生遺伝子の残りは、細菌接着、根毛のカーリング、根
粒の開始と発達、そして共生関係の確立。

に必要な情報を含む。加えて、プロモーター、オペレー
ター、アテニュエーター、そしてリボゾーム結合部位の
ような調節配列が、コード領域近傍に見つかっている。

このような調節配列は構造遺伝子、すなわちＤＮＡ読み
取り鎖の３′方向の下流のコード配列の発現を制御する
。

プラスミド、制限酵素、リガーゼ、およびＤＮＡ合成に
関する他の酵素の発見と研究により、遺伝子工学の分野
は急速的な進歩をとげた。これらの技術の使用により２
種の境界を越えて、すなわち真核生物から原核生物へ、
あるいは原核生物から真核生物へＤＮＡを転送すること
が可能となった。他には、“ヌクレオチド配列を合成し
たり、この合成配列を生物体に取り込ませてそこで発現
させることが可能となった。例えば、大腸菌での発現は
、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｃｈａｎｇ。

Ａ、　Ｃ，Ｙ、、　Ｎｕｎｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｈ，、Ｋ
ａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｋ、。

Ｅｈｒｌｉｃｈ、　Ｈ，＾、、　５（１１Ｈｉｌ（Ｂ、
　ＲｏＴ、　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ。

Ｓ、　Ｎ、　（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２１５−：
　６１７−６２４）や肝炎Ｂウィルス抗原（Ｂｕｒｒｅ
ｌｌ、　Ｃ，Ｊ、、　Ｍａｃｋａｙ、　Ｐ、。

Ｇｒｅｅｎａｗａｙ、Ｐ、Ｊ、、Ｈｏｆｃｈｎｅｉｄｅ
ｒ、Ｐ、Ｈ，ａｎｄ　　Ｋ。

Ｍｕｒｒａｙ　（１，９７９）　Ｎａｔｕｒｅ−η’９
　：　４３−４７）をコードしているＤＮＡ配列で達成
された。２つの補乳動物のホルモンがまた３合成りＮＡ
を用いて細菌内で生産された（Ｉｔａｋｕｒａ、　Ｋ、
、　Ｈｉｒｏｓｅ、　Ｔ、、　　Ｃｒｅａ。

Ｒ，、Ｒ４ｇｇｓ＋　Ａ、　Ｄ、、　１ｌｅｙｎｅｃｋ
ｅｒ、　ｔｌ、　Ｌ、、　Ｂｏｌｉｖａｒ。

Ｆ、、　ａｎｄ　Ｈ，ＩＡ、　Ｂｏｙｅｒ　（１９７７
）　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８　：　１０５６；および、
　Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、　Ｂ、＋　Ｋｌｅｉｄ、　Ｄ
、　Ｇ、、　Ｂｏｌｉｖｅｒ。

Ｆ、、　Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ、、　Ｙａｎｓ
ｕｒａ＋　Ｄ、　Ｇ、、　Ｃｒｅａ。

Ｒ，、旧ｒｏｓｅ、　　Ｔ、、　　Ｋｒａｓｚｅｗｓｋ
ｉ、　　Ａ、、　　ｒｔａｌ＜ｕｒａｌ　　Ｋ。

ａｎｄ　Ａ、　Ｄ、　Ｒｉｇｇｓ　（１９７９）　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６　：　１０６　’）。

ＤＮＡ組み換えを実際的に応用するには、いくつかの異
なる主要点が成功しな′ければならない。

まず第１に、興味ある化合物をコードするＤＮＡ断片を
認識することが可能でなければならないし。

そのＤＮＡ断片を単離することが可能でなければならな
い。２番目に、そのＤＮＡ断片の情報の発現を制御する
メカニズムを理解すること、およびその情報の生産能力
を最大限にする調節配列の制御下にその情報を転送でき
ることが必要である。

この増加した生産能力は同じ生物内あるいは異なる生物
間で、コード情報および制御情報を再編成することによ
り達成できる。関与する生物は原核生物あるいは真核生
物である。３番目に、コード情報の貯蔵タンパク質やホ
ルモンのような有用生産物への変換は、それらがあとで
分解されない環境で起こらなければならない。

（発明の背景） リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌では、ニト
ロゲナーゼ合成はふつう遊離生存状態では抑制されてお
り、はとんど豆科植物と形成された複合共生内でだけ誘
導される。リゾビウム・トリフオリ　（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕａ＋　ｔｒｉｆｏｌｉｉ）は狭い宿主域を持つ成長の
速いリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の例で１通常で
は培養中は窒素を固定するよう誘導され得ない。これに
対し、パラスボニア・リゾビウム（Ｐａｒａｓｐｏｎｉ
ａＲｈｉｚｏｂｉｕｍ）種が単離されており、この種は
非豆科植物のパラスボニア（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ）　
　（ウルマシ−（ｔｌｌｍａｃｅａｅ））と同様に広範
囲の熱帯性豆科植物とも効果的な共生関係を持てるよう
な非常に広い宿主域を持つ成長の遅い生物である（Ｔｒ
ｉｎｉｃｋ、　Ｍ。

Ｊ、（１９８０）　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、　４９　：　３９−５３）。バラスポニア・リゾ
ビウム（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）
は、培養中窒素固定するよう誘導されるが、この固定の
レベルは遊離に生存している細菌クレブシェラ・ニュー
モニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
）に比較して約１００倍低い。他の成長の遅いリゾビア
（Ｒｈ　１ｚｏｂ　ｉａ　）は、商業的に重要な、大豆
に根粒を形成するりゾビウム・ジャポニカム（Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍｊａｐａｎ　ｉｃｕｍ）を含む。

生物学的窒素固定の遺伝学は、遊離に生存している生物
、クレブシェラ・ニューモニエ工（Ｋｌｅｂｓｉ−ｅｌ
ｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ではよく特徴づけられて
いる。

ニトロゲナーゼの構造遺伝子（Ｆｅ−タンパク質のサブ
ユニット、オよびＭｏ　−Ｆｅタンパク質のαとβサブ
ユニットをそれぞれコードしているｎ１ｆＨ。

ｎｉｆ　Ｄ　、そしてｎ１ｆＫ　）は遺伝的かつ物理的
に。

マツプされている（Ｋｅｎｎｅｄｙ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ
、　（１９８１）Ｉｎ　　Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｐｅｒｓ
　　ｅｃｔｉｖｅｓ　　ｉｎ　　Ｎ１ｔｒｏ　　ｅｎ　
　Ｆｉｘａｔｉｏｎ（ｅｄｓ、Ｇｉｂｓｏｎ、Ａ、Ｈ，
ａｎｄ　Ｗ、Ｅ、Ｎｅｗｔｏｎ）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ
　　Ａｃａｄ、　　５ｃｉｅｎｃｅ＋　　Ｃａｎｂｅｒ
ｒａ＋　　ｐｐ、１４６−１５６；および、　Ｒｅ１ｄ
ｅｌ、　Ｇ、　Ｅ、、　Ａｕ５ｕｂｅｌ、　Ｆ、　Ｍ。

ａｎｄ　　Ｆ、　　Ｍ、　　Ｃａｎｎｏｎ　　（１９７
９）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　八ｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ。

ｔｌ、ｓ、Ａ、　７６　：　２８６６−２８７０）、こ
れらの配列を持つクローン化ＤＮＡ断片が、リゾビウム
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）を含む広範囲の窒素固定生物に
おいてその相同配列とハイブリダイズすることが、サザ
ンプロット分析により示された（　Ｒｕｖｋｕｎ、　Ｇ
、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｍ。

＾ｕｓｕｂｅｌ　（１９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｋ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ。

７７　：　１９１−１９５）。

窒素固定生物の生態学的多様性にもかかわらず。

ニトロゲナーゼ酵素複合体の生理的構造は非常に保存さ
れているようである。酵素複合体が精製されているすべ
ての場合で、２つのタンパク質が存在している。大きい
方のタンパク質（ジニトロゲナーゼ）はモリブデン、鉄
、そして酸に不安定な硫黄を含み、窒素に対する結合部
位を持ち、　ｎｉｆ　Ｄやｎ１ｆＫ遺伝子にそれぞれコ
ードされている２つのサンプユニットタンパク質αとβ
を含む。小さい方のタンパク質（ジニトロゲナーゼレダ
クターゼ）は鉄と酸に不安定な硫黄を含み、ジニトロゲ
ナーゼの還元に、またこの還元に使われるＭｇＡＴＰの
結合に必要である。ジニトロゲナーゼレダクターゼは、
　ｎｉｆ　ｔ（遺伝子にコードされている。精製したタ
ンパク質の構成成分の化学的およびスペクトル的分析は
、生物間のタンパク質の構造の保存を支持する（Ｓｃｏ
ｔｔ、　Ｋ、　Ｆ、、　Ｒｏｌｆｅ、　Ｂ、　Ｇ、　ａ
ｎｄＪ、　５ｈｉｎｅ　（１９８１）　Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　１　：　７ｌ−８１）、
ある場合には、精製した構成成分１例えば。

アゾトバクタ−・ビネランデイ　（Ａｚｏｔｏｂａｃｔ
ｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉ　ｉ）とクレブシェラ・ニュー
モニエ（Ｋｌｅ−ｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）、の間で活性のあるハイブリッド酵素が形成される
に充分な程類似している（Ｅａｄｙ、　Ｒ，Ｒ，ａｎｄ
　Ｂ、　Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈ　（１９７９）　Ｉｎ　：　
Ａｔｒｅａｔｉｓｅ　ｏｎ　ｄｉｎｉｔｒｏ　ｅｎ　　
１ｘａｔｉｏｎ　　Ｉ　、　　ＩＴ、　ｅｄｓ。

Ｈａｒｄｙ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ、　Ｆ
、ａｎｄ　Ｒ，Ｃ，Ｂｕｒｎｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｗｉｌｅｙ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ、
３９９−４９０）、それゆえに。

驚くことではないが、ジニトロゲナーゼレダクターゼと
ジニトロゲナーゼα−サブユニ・シトをコードしている
亘オペロンの領域（ｎ１ｆＨと−ｎｉｆＤ　）は、少な
くとも１９の他の細菌株において核酸配列レベルで、相
当する配列に相同性がある（Ｒｕｖｋｕｎ。

Ｇ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｍ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　（
１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　［１，Ｓ、Ａ、　７７　：　１９１４９５）
、この構造の保存性は一般的に真実であるが、異なる生
物由来のニトロゲナーゼ間では重要な違いもまた存在す
る。これは精製後の変化しやすい安定性や、すべての場
合で活性のあるハイブリッド複合体を形成するのではな
いという事実により示される（Ｅａｄｙ、　Ｒ，Ｒ。

ａｎｄ　Ｂ、　Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈ　（１９７９）上記）
。

クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　
ｐｎｅｕ−ｍｏｎｉａｅ）のｎ１ｆＫ、　　ｎ１ｆＤお
よびｎ　ｉ　ｊＨ遺伝子を持つＤＮＡ断片を皿　株ＵＮ
Ｆ８４１（Ｔｎ５：：　ｎ１ｆＫ　）より単離しくＣａ
ｎｎｏｎ、　Ｆ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　（１９７９）　
Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１７４　：　５９−６６）、
　エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｔ）のプラスミドｐＢＲ３２５にクローン化した。ｎ
１ｆＨ遺伝子と６２２ヌクレオチドｎ１ｆＤ遺伝子のヌ
クレオチド配列が決定された（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ、
　Ｖ、　ａｎｄ　Ｆ、　Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅｌ　（１９８
１）　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６　：　２８０８−２８
１２　；　５ｃｏｔｔ、　　Ｋ、　Ｆ、。

Ｒｏｌｆｅ、　Ｂ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｊ、　５ｈｉｎｅ
　（１９１３１）上記）、加えて。

アナベナ（八ｎａｂａｅｎａ）　７１２０のｎ１ｆＨ遺
伝子のＤＮＡ配列が決定されている（Ｍｅｖａｒｅｃｈ
、　Ｍ、、　Ｒｉｃｅ。

Ｄ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｈａｓｅｌｋｏｒｎ　（１９８０）
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７７　：　６４７６−６４８
０）、この２つの配列を比較すると興味ある２点がある
。（１）亘遺伝子の観察されている種間の相同性の説明
となっている少しの範囲（２５ｂｐまで）では保存され
ているが。

ヌクレオチド配列レベルでは２つの配列の間にはほとん
ど相同性がない（Ｒｕｖｋｕｎ、　Ｇ、　Ｂ、　ａｎｄ
　Ｆ、　Ｍ。

Ａｕ５ｕｂｅｌ　（１９８０）上記）、（２１一般に、
プロモーター領域は、ふつうの機能９例えばＲＮＡポリ
メラーゼの認識、に関与するような短い領域を除いては
ほとんど配列に相同性はない。

これに対し、２種および他の種について、ジニトロゲナ
ーゼレダクターゼのアミノ酸配列、そしてジニトロゲナ
ーゼのα−サブユニットの最初の２０７アミノ酸の配列
を比較すると、非常にきわだった保存性がわかる。この
比較に用いた３種は。

クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　（Ｋｐ）　、アナベナ（Ａｎ
ａｂａｅｎａ）　Ｔｌ２Ｏ（＾ｂ）とクロストリディウ
ム・バスツーリアナム（ｃ１ｏｓｔｒｉ−ｄｉｕｍ　ｐ
ａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ　）　（ｃｐ）である（Ｔａｎ
ａｋａ、　Ｍ、ＩＨａｎｉｕ、　Ｍ、、　Ｙａｓｕｎｏ
ｂｕ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｌ、　Ｍｏｒｔｅｎｓｏｎ（１
９７７）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、じ２５２　：　
７０９３−７１００）　　、　Ｋｐタンパク質とＣｐタ
ンパク質では６７％のアミノ酸配列相同性を有し、　Ｋ
ｐタンパク質とＡｐタンパク質では７１％。

Ｃｐタンパク質とＡｂタンパク質では６３％のアミノ酸
　。

配列相同性を存する。このアミノ酸配列の相同性はタン
パク質を通して平等に分布しているのではない。ある領
域では事実同一である（９０％から９５％の相同性）が
、他の領域ではほんの弱い相同性がある（３０〜３５％
の相同性）だけである。構造的な保存性は、３つのＦｅ
タンパク質すべてに共通な５つのシスティン残基のまわ
りに集まっているようである。これらのシスティン残基
は活性中心へのりガントであると信じられている。

ＣｐとＫｐのジニトロゲナーゼのα−サブユニットのＮ
末端のアミノ酸配列を比較すると、この領域にはほとん
ど配列の相同性は見られない。このことはタンパク質の
アミノ末端領域に見られるアミノ酸配列が非常に高度に
保存されているのとは対照的である。ＣｐとＫｐのαサ
ブユニット間でほとんど相同性がないことは、　Ｆｅタ
ンパク質と同様に。

システィン残基周辺域についても認められている。

このような相同性領域は、ニトロゲナーゼ酵素複合体の
触媒機能に関与していると考えられている。

それゆえに、この構造的保存性は、　ｎｉｆ遺伝子の最
近の進化や分散の結果ではないと考えられており　　（
Ｐｏｓｔｇａｔｅ、　　Ｊ、　　Ｒ，（１９７４）　　
Ｓｙｍ、　　Ｓｏｃ、　　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２４　：　２６３−２９２）、
それよりもむしろ機能の保存に関係していると提唱され
ている。

ニトロゲナーゼ複合体の構造遺伝子をコードするタレプ
シエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅ
ｕ−ｍｏｎｉａｅ）　Ｄ　Ｎ　Ａを単離すること（Ｒｕ
ｖｋｕｎ、　Ｇ、　Ｂ。

ａｎｄ　Ａｕ５ｕｂｅｌ、Ｆ、　Ｍ、　（１９８０）　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７７　：　１９１．．１．９５）　ニより、そ
れに相当するリン゛ビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）の構造遺伝子を同定するこ
とが容易になった。リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）は、エセリシア・コリ
ー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）プラスミドベ
クターへクローン化されたＥｃｏＲＩ断片上に見出され
た（　Ｒｕｖｋｕｎ　、　Ｇ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｆ、　
Ｍ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２
８９　ニー８８）。さらにエセリシア・コリー（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）内で断片に特異的な突然
変異をおこさせその突然変異をリゾビウム・メリロティ
’（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ゲノムへ
転送させる研究により、クローン化断片は皿特異的遺伝
子を持つことが実証された（Ｒｕｖｋｕｎ、　Ｇ、　Ｂ
。

ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　１（ａｒｂ、　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ。

Ｂｉｏｌ、　４５　：　４９２−４９７　；　Ｒｕｖｋ
ｕｎ、　Ｇ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｃ
ｅ１ｌ　２９　：　５５１−５５９）。このクローン化
リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌ
ｉｌｏｔｉ）断片はミニセル技術を用いて分析され、リ
ゾビウム・メリロテＩ　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌ
ｉｌｏｔｉ）のｎ１ｆＨ遺伝子がエセリシア・コリー（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のミニセル中で発
現されることが示された（Ｗｅｂｅｒ。

Ｇ、　　ａｎｄ　Ａ、　　Ｐｕｈｌｅｒ　　（１９８２
）　　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、１　　：３
０５−３２０）、遊離状態のりゾビウム・メリロティ　
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）内では、　
　ｎ１ｆｌｌ遺伝子は発現されない。更なる実験により
、共生性の窒素固定に関係する多くのりゾビウム・メリ
ロティ　（Ｒｈｉ−ｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）
遺伝子が同定され、そしてリゾビウム・メリロティ（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）の」豆および
」ハ遺伝子の予備地図が発表された（Ｐｕｈｌｅｒ、＾
、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｉｎ　：　Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｎｉ−ｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏ
ｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（ｅｄ、　ｂｙ　Ｖｅｅｇｅｒ
、　Ｎｅｗ−−ｔｏｎ）　Ｔｈｅ　ｌｌａｇｕｅ、　Ｂ
ｏｓｔｏｎ、　Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）、　この地図には
次のようなりゾビウム・メリロティ　（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）遺伝子、　　ｎ１ｆＫ　、　
　ｎ１ｆＨ、ｎ１ｆＤ　。

」旦Ａ、ｆｉｘＢ、およびユ亘Ｃ９のコード領域が示さ
れている（第１図）。この図はりゾビウム・メリロティ
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）の」■およ
びｆｉｘ遺伝子そしてそれらのプロモーターの予備制限
酵素地図である。さらに、様々な」豆およびｆｉｘ遺伝
子のコード領域が黒矢印で示されている。転写および翻
訳の方向もまた矢印で示されている。

ｎ１ｆＫおよびｎ１ｆＤはハイブリッド遺伝子として表
される。示されたプロモーター（Ｐ）はエセリシア・コ
リー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）内で同定さ
れた。ユバＡプロモーターと同様にｎ１ｆＨプロモータ
ーもタレプシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　　ｎｉｆＡｇｐタンパク質
により活性化され得る。制限酵素地図で使われた省略記
号は以下の通りである。Ｃ：コＩ、Ｅ：Ｅ並Ｒ１，Ｆｌ
　：Ｅｎｄ　Ｕｌ＋　Ｐ　：　　Ｐｓｔｌ　＋　Ｓ　：
　　ＳｍａＩ　＋　そしてｘ：」肚■・ 特に興味深いのはりゾビウム・メリロテイ　（Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｆｉｘ／ｎｉｆ領域
の転写時の調節である。第１図に、２つのプロモーター
が示されている。１つはｎ１ｆＨに隣接しており、他方
はｆｉｘＡに隣接している。ｎ１ｆＨプロモーターおよ
びユｉｘＡプロモーターの両方について、タレブシエラ
（Ｋｌｅ−ｂｓｉｅｌｌａ）　ｎ１ｆＡ遺伝子産物によ
りエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｔ）内で活性化され得ることが証明されている。（Ｐ
ｕｈｌｅｒ、　Ａ、ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）上記参
照）、　ｎ１ｆＨプロモーターおよびｆｉｘＡプロモー
ターは逆方向で読み取る。５ｕｎｄａｒｅｓａｎ、　Ｖ
、等ｒ（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０１　：　７２
８−７３２　）および５ｕｎ−ｄａｒｅｓａｎ、　Ｖ、
等（（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８０　：　４０３０−４０３４）は」且Ｈプロ
モーターを同定し、その塩基配列を決定してクレブシェ
ラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ）　ｎ１ｆＨプロモーターとのいくらかの相
同性をみつけた。Ｃｏｒｂｉｎ＋Ｄ３等（（１９８３）
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　Ｕ
ＳＡ　８０　：３００５−３００９　）もまた、リゾビ
ウム・メリロティ　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌ
ｏｔｉ）の」±１プロモーターと同様にｆｉｘＡプロモ
ーターを同定した。対照的に。

リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌ
ｉｌｏｔｉ）ｎｉｆＨプロモーターがエセリシア・コリ
ー（Ｅｓｃｈｅ−ｒｉｃｈｉａ　ｃａｄｉ）」旦Ｇ遺伝
子産物により活性化され得るのに対し、クレブシェラ・
ニューモニエ（Ｋｌｅ−ｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）　　ｎ１ｆＨプロモーターはエセリシア・コ
リー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　」ハＧ遺
伝子産物によって活性化され得ない。これらの結果はク
レブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐ
ｎｅｕ−ｍｏｎ　１ａｅ）およびリゾビウム・メリロテ
ィ　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）では、
　　ｎ１ｆ−Ｈのアクティベーターおよび／もしくはプ
ロモーターが異なることを示唆している。確かに、リゾ
ビウム・メリロティ　（Ｒ旧ｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌ
ｏｔｉ）のｎ１ｆＨ遺伝子およびユｔｘＡ遺伝子の内在
性アクティベーターは知られていない。

（以下余白） （発明の要旨） リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌ
ｉｌｏｔｉ）が植物と共生関係にある場合そのリゾビウ
ム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔ
ｉ）の窒素固定遺伝子を活性化する遺伝子を単離するこ
と、およびその特徴について述べる。この遺伝子の性質
を誘導状態から構成性状態へ変換する方法を示す。さら
に、活性化遺伝子のプロモーターを他の遺伝子のコード
領域に結合することも可能である。この組み換えは、細
菌と植物が共生関係にあるときのみその遺伝子の発現が
望ましいような場合に有用である。

本発明の組換ＤＮＡプラスミドは、（ａ）ベクター。

（ｂ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種の、窒素固
定を正規に活性化できる産物をコードする遺伝子のプロ
モーター、および（ｃ）前記プロモーターの制御下にあ
る外来構造遺伝子または外来ＤＮＡ断片、を有する。前
記ベクターがｐＳＵＰ２０４である。前記遺伝子がｆｉ
ｘＤ遺伝子である。前記プロモーターがヌクレオチド配
列５’　−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−
Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ
−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−八−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−八−Ｔ−Ｇ−Ｃ
−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−ＡｍＧ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−
Ｇ−八−Ａ−八−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−八−Ｇ
−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−＾−Ｃ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−＾−Ｔ
−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−
八−Ｔ−Ｇ−Ｃ−八−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ
−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−
Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−ＡｍＣ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ
−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−
Ｇ−ＡｍＧ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ
−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−
Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ
−＾−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ
−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−
Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−八−Ｇ
−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−＾−Ｔ−Ｃ−Ｃ−
Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−＾−Ｇ−＾−＾−Ｃ−Ｃ−Ａ−八
−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−ＣへＴ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−
Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−
Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ
−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−八−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ
−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−
Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ
−Ｔ−Ｃ−ＡｍＧ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−
Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ
−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−
Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ
−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−
Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−ＡｍＡ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−八−Ｔ−Ｃ−八−Ａ−
Ａ、Ｇ、Ｇ−ＣＴ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−３’または厳密な条件
下でそれとハイブリダイズできる機能的に同等な配列を
含む。前記外来構造遺伝子がバシラス・チューリンギエ
ンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ）の細菌トキシン遺伝子である。

本発明の組換ＤＮＡプラスミドは、（ａ）ベクター。

（ｂ）構成性に発現される遺伝子のプロモーター、およ
び（ｃ）窒素固定を活性化できる産物をコードする遺伝
子のコー・ド配列、を有する組換ＤＮＡプラスミドを含
有しかつそこで複製する。前記ベクターがスイサイドベ
クターである。前記スイサイドベクターがプラスミドｐ
ＳＵＰ１０１１およびトランスポゾンＴｎ５を有する。

前記プロモーターがカナマイシン耐性遺伝子のプロモー
ターである。前記カナマイシン耐性遺伝子の前記プロモ
ーターがヌクレオチド配列５’　Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ，
Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−ＡｍＡ
−Ｔ−Ｔ−Ｇ−，Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ
、、Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−、
Ｔ−八−Ａ−Ｇ−１，、Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−
Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−八−Ａ−ＡｍＧ−，Ｔ　
　八−八−Ａ、、Ｃ−Ｔ−、Ｇ−Ｇ・Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｇ−
Ｃ・Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−４−Ｔ−Ｇ−Ｃ−、Ｃ，Ｇ−Ｃ−
Ｃ−八−八−Ｇ−Ｇ−八−Ｔ−、Ｃ−Ｔ−Ｇ−ＡｍＴ　
−、Ｇ　−、Ｇ　−Ｃ・Ｇ−Ｃ−八〜Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−
Ａ　Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−３’または厳密な条件下でそれと
ハイブリダイズできる機能的に同等な配列を含む。前記
コード配列がコＤ遺伝子のコード配列である。前記−ｆ
ｉｘ、Ｄ遺伝子がヌクレオチド配列５”−Ａ−Ｔ−Ｇ−
Ｇ−Ｃ−Ｃ１，Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ、、Ｔ
１．Ｃ−Ｔ−Ｔ−、Ｇ−＾−Ｇ−、Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ
−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−八−Ａ−Ｃ−Ａ−八−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ｃ−Ｔ、、Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−τ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−，Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ
−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｇ−
Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−、Ｇ−
Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−八−Ｇ−へ−Ｇ−Ａ−Ｃ−へ−Ａ
−へ−Ｇ−へ−Ｔ−八−八−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−
Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−へ一へ−Ｃ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−、Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−＾−Ｔ−Ｔ−八−
Ｔ−八へＣ−，へ−Ｇ−、Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ、−
Ａ−’ｌ；−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ、、
Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ・Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ
−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ｔ−Ｇ−、Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−
八−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−、Ｃ−Ａ−＾−Ｃ−Ｔ−
Ｃ−Ｔ−Ｇ−八−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−ＴへＴ−Ｃ−Ａ−Ａ
−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ−＾−Ａ−
八−ＴへＧ・Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−、Ａ−Ａ−Ｔ−
Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ
−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇへ
、Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−八〜Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−
Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−八−Ａ−八、、Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−八−＾−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ
−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−ＡｍＧ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ・Ａ
、、Ｔ−、Ｔ−Ａ４−Ｇ−八−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ
−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ　１．Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ、、Ｃ
−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−、Ｔ−Ａ
−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Δ−Ｔ−Ｃ−
Ｔ−Ｔ−、Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ
−Ｔ−、Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ａ−（ニー八−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ１Ｇ−八−
Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−八−Ｇ−Ａ−八
−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−へ−Ｇ−へ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−＾−
Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−ＡｍＧ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ
−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ
−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−＾−Ｇ−Ａ−＾−Ｔ−Ｇ−八−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−ＡへＴ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ
−Ｃ，４−Ａ−ＡｍＧ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−
Ｃ−Ｔ−Ｃ−八−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ
−Ｔ−八−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−
Ａ−へ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−へ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ
−Ｇ−ＡｍＣ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−八−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ
−Ｇ−Ｇ−＾−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−＾−Ｇ−Ｇ−Ａ−
へ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−＾−八へＴ
−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−
Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−へ−Ｇ−Ｃ−Ａ
−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−へ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−
Ａ−八−八−＾−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ
−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−八−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−ＡｍＡ−Ｔ−
Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ
−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−
Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ
−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−八−
Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ
−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−
Ｇ−Ｃ−Ｔ−、Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−八−Ｇ−Ｔ−Ａ−
Ｇ−Ｇ−Ｃ−、Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−
Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−八−八−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ａ−八−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−
Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−八−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−ＡｍＧ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−
Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ
−八−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−＾−Ｃ−Ｇ−Ｃ−
Ｇ−Ｔ〜へ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ・八−Ａ−Ｇ
−Ｇ−Ｔ−Ｇ−＾−八へＴ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−
Ｇ−ＡｍＧ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−八−Ｃ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−
Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ
−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−八−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−
八−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−へ一へ−Ｇ−Ｇ−＾−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−
Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−＾−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−＾
−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−八−Ｇ−Ａ−
Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−八−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ
−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ
−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ
−Ｃ−八−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−
Ｔ−Ｇ−Ｃ−ＡｍＡ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ
−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−＾−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−
Ａ−八−Ｃ−Ｇ−八−八−Ｇ−＾−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−
Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−ＡｍＣ−Ｃ−Ａ−
Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−八−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ
−Ａ−ＡｍＧ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−
Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−八−Ｇ−Ｃ
−Ｔ−Ｇ−Ｇ−八−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−
τ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ
−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−
Ｇ−Ｔ−Ｃ−＾−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｔ−Ｃ
−ＡｍＣ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−＾
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ
−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−＾−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−
Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ
−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−
Ａ−Ｔ−、Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−
Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−八−Ｃ−八−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ
−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−八−Ｇ−Ｃ−Ｃ−八−Ａ−Ｔ−Ｇ−八
−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−
ＡｍＧ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ
−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−
Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−＾−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−
Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ
−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−、Ｃ−Ｇ−Ｇ
−Ｔ−Ｔ−Ｇ、、Ｇ−Ａ−＾−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ
−八−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−ＡへＧ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−＾−Ａ−Ａ
−Ａ−Ｃ−Ｇ−ｃ−ｃ−ｃ−ｃ−ｃ−ｃ−ｃ−八−Ｇ−
Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ
−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−ＡｍＴ−
Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−＾−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ
−Ｇ−Ａ−Ａ−ＡｍＧ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−
Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−３’または
厳密な条件下でそれとハイブリダイズできる機能的に同
等な配列を含む。

本発明の、窒素固定遺伝子を、遺伝子操作により構成性
に発現された活性化遺伝子の制御下に置（ことにより、
前記窒素固定遺伝子の発現を活性化する方法は、（ａ）
構成性遺伝子のプロモーターを活性化遺伝子を制御でき
るような位置に結合し。

それによって活性化遺伝子の構成性発現を生じること、
（ｂ）エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ）のある株を、スイサイドベクターおよびトラ
ンスポゾンを有し構成性に発現される活性化遺伝子がト
ランスポゾン内に挿入されている構成性遺伝子転送系を
用いて形質転換すること、（ｃ）前記構成性遺伝子転送
系を前記窒素固定遺伝子を保持するグラム陰性菌のある
株に転送すること、および（ｄｌ前記構成性に発現され
る活性化遺伝子が含有され。

前記グラム陰性菌内で複製されかつ発現する前記グラム
陰性菌の組換株を選択すること、を含有し。

それにより前記窒素固定遺伝子の発現を活性化してＮ２
固定を活性化する。前記構成性遺伝子がカナマイシン耐
性遺伝子である。前記活性化遺伝子がｆｉｘＤ遺伝子で
ある。前記構成性遺伝子転送系がｐＳＵＰ１０１１−Ｔ
ｎ５−　ｎｅｏ！！−！−？　ｆｉｘ　Ｄである。グラ
ム陰性菌の前記株がリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）
種の株である。前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）
種がリゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍ
ｅｌｉｌｏｔｉ）である。

本発明の細菌株は、（ａ）ベクター、（ｂ）リゾビウム
（Ｒｈ　１ｚｏｂ　ｉｕｍ）種の、窒素固定を正規に活
性化できる産物をコードする遺伝子のプロモーター、お
よび（ｃ）前記プロモーターの制御下にある外来構造遺
伝子または外来ＤＮＡ断片、を有する組換ＤＮＡプラス
ミドを含有しかつそこで複製する。前記ベクターがｐＳ
ＵＰ２０４である。前記遺伝子がｆｉｘＤ遺伝子である
。前記プロモーターがヌクレオチド配列　５゛−Ａ−八
−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−＾−八へ八へＣ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−
Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ
−Ｇ−八−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−八−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−＾−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−八−Ａ−
Ｃ−Ｔ−ＧへＧ−Ｇ−Ｃ−Ａ−ＡｍＧ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ
−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−＾−
Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−＾−Ｇ
−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−
Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−＾−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−
Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｇ−Ｇ−
Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ
−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−＾−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−
Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｔ−Ｔ−Ｃ−
＾−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−＾−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−
Ｇ−Ｇ−Ｇ−八−Ｃ−Ｇ−Ａ−＾−Ｇ−Ｔ−ＧへＣ−Ｃ
−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−八−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−
Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ
−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−＾−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−八−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ
−Ａ−Ｔ−Ｔ−八−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−＾−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ
−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−
Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ
−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−
Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ
−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−
Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ
−Ａ−Ｃ−Ａ−八−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−ＡｍＴ−＾−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−３’または厳密な条件下でそれとハイ
ブリダイズできる機能的に同等な配列を含む。前記外来
構造遺伝子がバシラス・チューリンギエンシス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細菌トキ
シン遺伝子である。

本発明の細菌株は、（ａ）ベクター、（ｂ）構成性に発
現される遺伝子のプロモーター、および（ｃ）窒素固定
を活性化できる産物をコードする遺伝子のコード配列、
を有する組換ＤＮＡプラスミドを含有しかつそこで複製
する。前記ベクターがスイサイドベクターである。前記
スイサイドベクターがプラスミドｐＳＵＰ１０１１およ
びトランスポゾンＴｎ５を有する。前記プロモーターが
カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターである。前記カ
ナマイシン耐性遺伝子の前記プロモーターがヌクレオチ
ド配列５゛−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−八−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−八−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−
Ｃ−Ａ　−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−
Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ
−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−＾−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ
−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−ＡｍＧ−Ｇ−＾−Ｔ−Ｃ−Ｔ
−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−
Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−＾−３′または厳密な条件下でそ
れとハイブリダイズできる機能的に同等な配列を含む。

前記コード配列がｆｉｘＤ遺伝子のコード配列である。

前記ｆｉｘＤ遺伝子がヌクレオチド配列５゛−＾−Ｔ−
Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ
−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−＾−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−＾−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−
Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−＾−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ
−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ
−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−＾−Ａ−
Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−＾−Ｇ−＾−Ｃ−Ａ−Ａ−＾−Ｇ−Ａ
−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−八−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−ＴへＡ−
Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ
−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ
−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−
Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ
−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ａ−＾−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−＾−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−＾−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−
Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−
Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−八−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ
−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−
Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ
−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ
−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ
−Ｔ−Ｇ−八−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−
＾−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ
−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ
−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−
八−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ
−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−
Ｃ−Ａ−八−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−＾−Ｃ
−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−八−Ｇ−Ａ−
Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ
−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−
Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ
−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ４−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−
Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ
−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−＾−
Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ
−Ａ−Ｃ−Ｃ−八−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−
Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ
−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−
Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ
−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−
Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ
−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−＾−
Ａ−＾−＾−＾−＾−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ
−Ｔ−Ｃ−＾−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−
Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−＾−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−
Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ
−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−＾−Ｇ−Ｇ
−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−ＡｍＡ−Ｔ−Ｃ−
Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ
−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−
Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−＾−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ
−＾−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−＾−Ａ
−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−
Ａ−Ａ−Ｔ−＾−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ
−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−
Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−＾−Ｃ−＾−Ａ
−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−八−Ｇ−
Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ
−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−
Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−
Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ
−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−＾−Ｇ−八−ＣへＣ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ
−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−
Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ
−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−八−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ
−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ
−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−八−Ａ−
Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−＾−八へＣ−Ｇ−Ｇ−Ｔ
−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−八−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−
Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ
−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−
Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
−Ｇ−Ａ−八−＾−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ
−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−＾−Ｇ−Ｇ−Ｔ−
Ｃ−Ａ−Ａ−＾−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ
−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ
−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−
Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ
−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ｇ−Ｔ−＾−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−
Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ
−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−
Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ
−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−
Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ
−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−＾−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−八
−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−
Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ
−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−
Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ
−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−ＡｍＡ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−
Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ
−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−
Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａｍ３′または厳密な条件下で
それとハイブリダイズできる機能的に同等な配列を含む
。

（以下余白） 以下に本発明を詳細に述べる。

リゾビウム・メリロテイ　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅ
ｌｉｌｏｔｉ）の加工」プロモーターおよびｆｉｘ　Ａ
プロモーターのいずれについても、それらがクレブシェ
ラ（Ｋｌｅｂ−ｓｉｅｌｌａ）　ｎｉｆ　Ａ遺伝子産物
によってエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ）内で活性化され得ることは以前から証明さ
れていた（Ｐｕｈｌｅｒ、　Ａ、　ｅｔ　　ａｌ。

（１９８３）上記）。本研究において１　リゾビウム・
メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）
　ｆｉｘ　Ｄ遺伝子の単離および同定に用いたエセリシ
ア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を
表に示す（第１表）。最初に、　ｐＲｍ２９０５　（Ｒ
ｕｖｋｕｎ、　Ｇ、　Ｂ、　ｅｔ　　ａｌ、（１９８２
）Ｃｅｌｌ　２９：５５１−５５９）の３６５キロベー
スＨｉｎｄｌ［［断片をエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）ベクタープラスミドルＡｃ
１フフーＣヘクローニンケしてプラスミドｐＲｍＷ５４
を得た。ｐＲｍ２９Ｄ５はニトロゲナーゼ（紅旦に対す
る遺伝子に隣接しかつそれを囲む１８キロベ一ス断片を
カバーしており、これをリゾビウム・メリロティ　（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のゲノムからク
ローン化した。クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂ
−ｓｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　ｎｉｆ　
Ａプローブ（第２図）をハイブリダイゼーション実験に
用いてｐＲｍＷ５４゜ｐＲｍＲ３，およびｐＲｍＷ５２
におけるいかなる相補性ＤＮＡ断片をも検出した。第２
図に、クレブシェラ１ニユーモニエ（に１ｅｂｓｉｅｌ
ｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　ｎｉｆ　Ａおよびｎｉ
ｆ　Ｌ遺伝子のコード領域を制限地図に関連させて示す
。（Ｐｕｈｌｅｒ、Ａ、　ａｎｄ　Ｗ、　Ｋ１１ｐｐ（
１９８１）Ｉｎ：　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｉｎｏｒｇ
ａｎｉｃ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ａｎｄ　５ｕｌｆｕｒ；
ｅｄ、　　Ｂｏｔｈｅ、Ｈ，ａｎｄ　Ａ、　　Ｔｒｅｂ
ｓｔ　；　　Ｂｅｒｌｉｎ、　　Ｈｅｉｄｅｌ−ｂｅｒ
ｇ）。２つの長方形は制限断片を示しており。

それらはｆｉｘ遺伝子を持つリゾビウム・メリロティ（
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）　Ｄ　Ｎ　
Ａとのハイブリダイゼーション実験用に放射活性ＤＮＡ
プローブとして用いた。使用した制限エンドヌクレアー
ゼは。

Ｅ：に虹Ｒ１，Ｓ：と虹Ｉ、　Ｐ：ハ辷Ｉおよび１肚ｎ
ｄｕＩである。リゾビウム・メリロテイ　（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）プラスミドｐＲｍＷ５４．
　ｐＲｍＲ３およびｐＲｍＷ５２の制限断片をアガロー
スゲル上で分離しそしてニトロセルロースフィルターに
プロットした（第３図ａ）。本図は、リゾビウム・メリ
ロテイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）　　
およびクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の各制限断片をアガロー
スゲル電気泳動にかけた後、リゾビウム・メリロティ（
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ｆｉｘ　ＤＮ
Ａとクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ　ｐｎｅｕｍｏ−ｎｉａｅ）　ｎｉｆ　Ａおよび旦ｆ
Ｌ特異的ＤＮＡプローブとのサザンハイプリダイゼーシ
ョンを行なった結果を示す。種々の分解の結果は第３図
のレーンに示したがそれらは次の通りである。レーン１
は。

ｐＵＣＢ内でサブクローン化したＥｃｏ　ＲＩ−Ｂｉｎ
　ｄｍ断片（第２図参照）のＥｃｏ　Ｒ１−Ｗｉｎ　ｄ
ｍ分解の結果を示す。レーン２は標準分子量としてＨｉ
ｎｄｌｌＩおよび且虹Ｒ１で分解したλ−ＤＮＡを、レ
ーン３はハＬ旧および１１工■で分解したｐＲｍＷ５４
　Ｄ　Ｎ　Ａを、レーン４は…ｎｄｌｌｌおよび…ｏＩ
で分解したｐＲｍＲ３Ｄ　Ｎ　Ａを、そしてレーン５は
Ｂａｎ＋　Ｈｌおよび…ｏＩで分解したｐＲｍ　Ｋ５２
　ＤＮＡを示す。これらのフィルターを放射能ラベルし
たクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂ−５ｉｅｌｌ
ａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｎｉｆ　Ａ断片とハイブリ
ダイズさせた（第３図ｂ）。この第３図すは、６ｘＳＳ
Ｃ，５５℃でクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　ｎｉｆ　Ａプ
ローブとハイブリダイズさせた後のニトロセルロースフ
ィルターのオートラジオグラフを示すものである。この
ようなハイブリダイゼーション条件をここでは「厳密な
条件」とする。ｐＲｍＷ５４の１．８キロベースＢａｎ
　ＩＩ断片および０．９キロベ一スＢａｍ旧−ｈ［Ｉ［
がレーン３に示されており（第３図ｂ）それらはクレブ
シェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ）　ｎｉｆ　Ａプローブと相同であること
がわかる。他のバンドとの強いハイブリダイゼーション
はベクター−ベクター相同性もしくはレーン１に示され
たクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂ−ｓｉｅｌｌ
ａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）制御ＤＮＡに因る。ハイ
ブリダイズし゛た断片を第４図に概括する。

さらに（第３図ｃ）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　ｎｉｆ
　Ｌプローブを６ｘＳＳＣ、５５℃でのハイブリダイゼ
ーション用に使用した場合の、ニトロセルロースフィル
ターに移された様々な断片のオートラジオグラフを示す
。

ｎｉｆ　Ｌプローブに対する特異的なハイブリダイゼー
ションがないことがわかる。ハイブリダイズしたりゾビ
ウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏ
ｔｉ）遺伝子領域は１．８キロベースＢａｎ　ＨＩ断片
によってカバーされており、その領域はｆｉｘ　Ｄ遺伝
子を含む（第３図および第４図）。小さい範囲ではある
が、隣接した０、９キロベ一スハｍＨＩ−ｈＬＩｒ断片
もまたハイブリダイズしていた。この小範囲ハイブリダ
イゼーションは、　ｎｉｆ　Ｄ遺伝子が１．８−ｔ−。

ベースＢａｍ旧断片から０．９キロベ一スＢａｍ旧−虱
■断片までのわずかな範囲にわたってのびているという
事実によって生じることが見出された。第４図に、リゾ
ビウム・メリロティ（ＲｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅＬｉｌｏ
ｔｉ）　ｆｉｘ遺伝子領域の制限酵素地図を、　ｎ１ｆ
Ａプローブにハイブリダイズした断片とともに示す。黒
い長方形は強いハイブリダイゼーションを意味し、斜線
の長方形は弱いハイブリダイゼーションをそして白い長
方形はハイブリダイゼーションがないことを意味する。

この結論はコード領域のヌクレオチド配列（第５図）お
よび活性化実験（第６図および第７図）によって確証さ
れた。

第６図はプラスミドｐｌＪ６　（第２表参照）の制限酵
素地図であり、また対照実験の結果をも示している。対
照実験ではりゾビウム・メリロティ　（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）　ｎｉ工」プロモーターは、
クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　
ｐｎｅｕｍｏｎｉ−ａｅ）　ｎｉｆ　Ａ遺伝子産物によ
って活性化させた。プラスミドｐＧＷ６はｐＭｃ１４０
３ヘサブクローン化したｐＲ＋ｓＲ２（ＤＥｃｏ　ＲＩ
−Ｓｍａ　Ｉ断片を含有する。プラスミドベクターｐＭ
ｃ１４０３　　はエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　　ｌａｃ　Ｚ遺伝子第８コドン
への翻訳時融合を可能にする。β−ガラクトシダーゼ活
性は、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）旦ｆＡ遺伝子を構成性に発
現する第２のプラスミドが同じ菌体に存在すれば検出可
能である。プラスミドｐＧＷ７　　（第２表）はｐＧＷ
６の誘導体であり、そこでは融合遺伝子のリーディング
フレームが８１ヌクレア一ゼ分解によってＢａｇ■■部
位に補正されていた。第７図は、　　ｐＧＷＴ内におい
てリゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｓ＋　ｍ
ｅｌｉ−１ｏｔｉ）のｆｉｘ　Ｄ遺伝子産物によってリ
ゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉ
ｌｏｔｉ）旦ｆＨプロモーターが活性化されることを実
証している。いくつかのプラスミド組合せを含有するエ
セリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）　ＥＴ　８８９４株のβ−ガラクトシダーゼ活性を測
定した。独立した６実験の結果を黒棒として示し平均値
は横線で示した。プラスミドの組合せとしては（１）　
ｐＡｃ１７７−Ｃ＋　ｐＧＷ？。

（２１ｐＲｍＷ５４　＋　ｐＧＷ７．（３）　ｐＲｍＷ
５４　：：Ｔｎ５−１　＋　ｐｌＪ７゜（４）　ｐＲｓ
Ｗ５４　：：Ｔｎ５−２＋　ｐＧＷ７　、　（５）　ｐ
ＲｍＷ５４　：：Ｔｎ５−５＋　ｐＧＷ？、（６）　ｐ
ＲｍＷ５４　：：Ｔｎ５−７　＋ｐＧＷ７．　（７）　
ｐＲｍＷ５４：：Ｔｎ５−８　＋　ｐＧＷ７そして　（
８）　ｐＲｍＷ５４　：：Ｔｎ５−９　＋ｐＧＷ７であ
る。図の左側にプラスミドを図式化して示した。Ｐはベ
クタープラスミドｐＡｃ１７７−ＣのｍＩプロモーター
（すなわち、カナマイシン耐性遺伝子）を表し、二重線
はｐＲｍＷ５４由来のりゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉ
ｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）　Ｈｉｎ　ｄｌｌ［
制限断片を表す。三角形は様々なＴｎ５挿入の位置を、
そして黒の横矢印はｆｉｘ　Ｄコード領域を示す。

Ｔｎ５がｆｉｘＤｊｉｌ域内に存在すると、リゾビウム
・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ
）　ｎｉｆ　Ｈプロモーターの活性化が（コントロール
阻１と比較して）検出されないことに注目すべきである
。その上。

クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　
ｐｎｅｕｍｏ−ｎｉａｅ）　！７）ｎｉｆ　Ｌプローブ
は、ｐＲｍＷ５４　、　ｐＲｍＲ３およびｐＲｍＷ５２
　（第２表）にハイブリダイズしないことが示された。

リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌ
ｉｌｏｔｉ）のｆｉｘ　Ｄ遺伝子は、　　ｐＲｍＷ５４
をエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）のミニセル内で既に詳述されている方法（Ｐｕｈ
ｌｅｒ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｗ、　Ｈｉｐｐ　（１９８１
）Ｉｎ：　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ
　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ａｎｄ　５ｕｌｆｕｒ；Ｂｏｔｈ
ｅ、　Ｈ，ａｎｄ　Ａ、　Ｔｒｅｂｓｔ　ｅｄｓ、　Ｂ
ｅｒｌｉｎ、　Ｈｅｉｄｅｌ−ｂｅｒｇ；　ａｎｄ　Ｗ
ｅｂｅｒ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｐｕｈｌｅｒ（１９
８２）　ＰｌａｎｔＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１　：　３
０５−３２０）を用いて発現させて検出した。エセリシ
ア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ミニ
セル内で、プラスミドｐＲｍＷ５４は分子量が６８００
０および６６０００の２個のポリペプチドを合成した（
第８図）。

第８図において、１番上にｐＲｍ２９Ｄ５　　（第２表
）由来のＨｉｎ　ｄｌ［Ｉ断片の制限酵素地図を示し、
そこにいくつかのＴｎ５挿入の位置（矢印１から９）も
示した。使用した制限酵素は次の様に表す旧ＨｉｎｄＩ
［［、Ｂ：　Ｂａｍ旧、　Ｘ：Ｘｈｏ　ｒ、　Ｅ：　Ｅ
ｃｏ　Ｒ１，Ｂｇ：　ｕｆＬＬＩＩ。

ソシテＰ：　Ｐｓｔ　Ｉ。ｍ遺伝子（ベクタープラスミ
ドｐＡｃ１７７−Ｃのカナマイシン耐性遺伝子）のプロ
モーターはＰで示す。第８図に示されたマツピングは、
　ｐＲｍＷ５４：：Ｔｎ５−１からｐＲｍＷ５４　：：
Ｔｎ５−４を含有するミニセルでは６８０００／６６０
００ポリペプチドが５Ｏ５−アクリルミドゲルで検出で
きなかったという事実とよく一致する。その代わりに、
より分子量の低いポリペプチドが見出され、それはρＲ
ｍＷ５４　：　：Ｔｎ５−１からｐＲｍＷ５４　：：Ｔ
ｎ５−４では、　Ｔｎ５がｆｉｘ　Ｄ遺伝子のコード領
域内に挿入されていることを示唆している。クローン化
した１ｌｉｎｄｌＵ断片内にＴｎ５を様々に挿入させた
ものを用いて、　ｆｉｘ　Ｄで示したコード領域を再び
１．８キロベ一スＢａｍ旧断片（第３図および第４図）
に局在させた。特に、２つのＴｎ５ｎ５挿入ｐＲｍＷ５
４　：：Ｔｎ５−２およびｐＲｍＷ５４　：：Ｔｎ５−
４）の場合では、推定上の截形ポリペプチドが検出され
、この発見は仮定していたコード領域とよく一致した。

明らかに、　６８０００および６６０００分子量のポリ
ペプチドはいずれも同じＤＮＡ断片によって暗号化され
ており、異なるＡＴＧ−開始コドンを使用して生じた可
能性がある。両ポリペプチドともエセリシア・コリー（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）のミニセル内では
非常に低レベルでしか発現されないが、このように発現
のレベルが低いのはりゾビウム・メリロテ４　　（Ｒｈ
ｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）　とエセリシア・
コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）とでは異
なるコドンを使用しているからではない。なぜなら。

同じコード領域が、エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉ−ｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）ベクター遺伝子すなわちアミ
ノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ）を用
いると。

融合ポリペプチドの形で非常によく発現されるからであ
る（実施例６）。

このように１本発明で開示された実験結果はりゾビウム
・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ
）のｆｉｘ　Ｄ遺伝子の境界を決め、かっｆｉｘ　Ｄ遺
伝子のタンパク質がリゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）　ｎｉｆ　ＨＤＫおよび
旦ｘ　ＡＢＣ遺伝子プロモーター活性化に対して責任を
負っていることを示すものである。このリゾビウム・メ
リロティ（Ｒｈｉｚ−ｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）
　ｎｉｆ　ＩＩＤＫおよびｆｉｘ　ＡＢＣ遺伝子プロモ
ーターは、窒素固定に必要とされる産物をコードする遺
伝子の発現を次々と導く。しかしながら、　ｆｉｘ　Ｄ
遺伝子の発現にはまず第一に、リゾビウム・メリロティ
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）が特異的な
宿主植物と共生関係にあることが必要である。すなわち
、リゾビウム・メリロティ　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｎ
＋ｅｌｉｌｏｔｉ）は遊離状態で生存しているときは窒
素を固定しない。さらに、リゾビウム・メリロティ（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）はたとえ同じ宿
主植物と共生関係にあったとしても、土壌中に既に相当
量の硝酸塩が存在すれば、窒素を固定しない。

ｆｉｘ　Ｄ遺伝子を遺伝子操作して、遊離生存時または
硝酸塩を多量に含む土壌中で生育する特異的宿主植物と
共生関係にある時にも一貫して発現されるようにするこ
とは、窒素固定において大いに宵月である。第１に、ア
ルファルファーリゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）共生関係が存在しても肥沃
な土壌中の高い硝酸塩含有量は低下しないであろうし、
かえって土壌はいっそう硝酸塩に富むことになろう。さ
らに、杜りが抑制解除された株を使用すると、共生性の
窒素固定は粒形成のより早い時点で開始され、またリゾ
ピア野性株を用いた粒においてよりも長く持続させるこ
とが可能である。

第２に、紅りが抑制解除されたりゾビウム（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ）株は、他の植物種との弱い共生関係によって
リゾピア野性株が無効な粒形成を行う場合に非常に好都
合である。無効な粒形成とは、適当に説明すると、　ｎ
ｉｆ遺伝子の転写に正規に必要な特別な植物信号が欠け
ているということである。ここで述べられているｎｉｆ
が抑制解除された株は、このような植物信号なしでも窒
素を固定する能力を存する。

第３に、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種は、経済
的に重要な非マメ科植物の根と強く結合して生育するよ
うに誘導され得る。ｎｉｆが抑制解除されたリゾビウム
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種は遊離状態においても窒素を
多量に固定できるので、■Ｌが抑制解除されたリゾビア
（Ｒｈ　１ｚｏｂ　ｉ　ａ）と重要な非マメ科植物農業
種の根とのこのような結合には広大な実用性がある。こ
こで述べる発明は、このようなｎｉｆが抑制解除された
りゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）株の作り方および利
用法を教示する。

本発明は、　ｆｉｘ　Ｄプロモーター領域の他の有用な
適用を開示する。リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）が遊離状態で生存すると
きは、ｆｉｘＤ遺伝子のプロモーターは不活性のままで
あり。

そしてｆｉｘ　Ｄ遺伝子がほとんどおそら（植物からの
信号に直接あるいは間接的に応答して活性化されるのは
共生関係が確立したときのみである。リゾビア（Ｒｈｉ
ｚｏｂｉａ）が植物と共生結合するようになったときだ
け遺伝子が発現されるような状態で。

リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種に遺伝子を組み込
ませることはときとして有用である。この目的は、遺伝
子組み換えにおいて、所望の遺伝子のコード領域をリゾ
ビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉ−
１ｏｔｉ）　ｆｉｘ　Ｄ遺伝子プロモーター領域の制御
下に置くことによって達成できる。そのような遺伝子。

すなわちリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種と植物と
の間に共生関係が確立したときのみ発現が望まれるよう
な遺伝子の例として、バシラス・チューリンギエンシス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の
毒素結晶性タンパク質のような殺虫剤のタンパク質をコ
ードする遺伝子の発現がある（実施例３および実施例４
参照）。

（以下余白） （実施例） 以下に本発明の実施例について述べる。

ＤＮＡ塩基配列分析のための２つの主要な技術は化学的
分解法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｗ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｇ１
１ｂｅｒｔ（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４　：　５６０−５６４）
およびジデオキシ−塩基配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ、　
Ｆ。

ｅｔ　ａｌ、　（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　：５４６３−５
４６８）である。両方法ともりゾビウム・メリロティ（
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｆｉｘ　Ｄ
遺伝子の一次構造を決定するために用いた。

Ｍ１３　　クローニング−シーフェンシングベクターｍ
ｐ８．ｍｐ９．ｎ＋ｐｌｏおよびｍｐＨ（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ、　Ｊ、　ａｎｄＶｉｅｉｒａ、　Ｊ、　（１９８２
）　Ｇｅｎｅ１９　：　２６９−２７６　；　Ｎｏｒｒ
ａｎｄｅｒ。

Ｊ、　ｅｔ　　ａｌ、（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２６　
：　１０１−１０６）を、プラスミドｐＲｍＷ５４の…
ｎ　ｄｌｌ３．５キロベ一ス挿入体をサブクローン化す
るために用いられた。この目的のために＋　Ｈｉｎ　ｄ
ｌｌ［で分解してベクターから匡ｄＩ［Ｉ断片を切断し
、その後アガロースゲル電気泳動にかけて分離および単
離した。作為的な塩基配列決定法として、ＤＮＡを種々
の制限酵素（匡虹Ｒｒ、ハｍ　ＨＩ、匡ｄＩＩＩ、錘Ｉ
Ｔ、■虹■）で切断し、そしてＭ１３シークエンシング
ベクターの適当な制限部位へサブクローン化した。制限
エンドヌクレアーゼＳａｕ　３Ａ、　並虹ＩＩ　、およ
びＬＩ−Ｉでｌ細工ｄｌｌ［断片を分解することにより
「ショットガン」クローニングを行なった。得られた断
片は再びＭ１３シークエンシングベクターへクローン化
した。

組換クローンの塩基配列決定はＳａｎｇｅｒの方法を若
干変えて（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　（
１９８１）　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、９　
　：　３０９−３２１）行なった。ジデオキシ塩基配列
決定のための戦法を示す（第９図）。

塩基配列決定戦法を実施するために、　ｆｉｘ　Ｄコー
ド領域を含有するＤＮＡ断片のサブクローンを作り、そ
して作為的塩基配列決定法および「ショットガン」法に
より塩基配列を決定した。第９図に。

断片の最終的な制限酵素地図に関連させてサブクローン
の位置および範囲を示す。矢印（第９図）は塩基配列決
定の方向を表し、また長方形は分析されたＤＮＡ断片中
の唯一のオープンリーディングフレームを意味する。

１１ｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地図を作ることにより
。

化学的方法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｗ、
　Ｇ１１ｂｅｒｔ（１９７７）上記）を用いた塩基配列
決定に適したいくつかの便利な制限部位が存在すること
がわかった（第９図）。Ｈｉｎ　ｄＩ［Ｉ断片を記述に
従って（上記）単離し、制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩ、ハｍ　
ＨＩ、鎖ＩＩおよび摺り一■で分解しそしてρＵＣ８シ
ークエンシングベクター（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、ａｎｄ
　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１
３　：２５９−２６８）へサブクローン化した。断片（
第９図）におけるいくつかの制限部位周辺の塩基配列を
決定することにより、ジデオキシ塩基配列決定から得ら
れたデータをさらに整理しかつ確認することができた。

２つの塩基配列決定法の結果を組み合せると、３．５キ
ロベースＨｉｎ　ｄＩ［Ｉ断片中の２１２７塩基対の塩
基配列が得られた（第１０図）。ヌクレオチド配列にお
ける６つの可能なリーディングフレームを１周べると、
ただ１つのフレームのみがｆｉｘＤポリペプチドをコー
ドするのに充分な大きさを有することがわかった。他の
リーディングフレームは全て終止コドンによって多くの
場所が閉鎖されていた。リゾビウム・メリロティ　（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｆｉｘ　Ｄ遺伝
子を意味する大きなオープンリーディングフレームはＨ
ｉｎ　ｄｌＩ［部位から４１５ヌクレオチドのＡＴＧで
始まり、１６２８ヌクレオチドにわたっていた。ミニセ
ル法により決定されたｆｉｘＤのコード領域は次の一組
の制限部位、すなわち…ｏ　Ｉ　、　Ｅｃｏ　ＲＩおよ
びＢａｍ　ＨＩを含有していた。同様の一組の制限部位
はまた。オープンリーディングフレーム内にも存在した
。さらに、そのオープンリーディングフレームにより暗
号化されたポリペプチドの分子量決定の結果は５９００
０であり、これはミニセル法により決定された６６００
０　／６８０００という不正確な分子量決定の結果に匹
敵し得る。ｆｉｘ遺伝子および旦り遺伝子の全体地図を
示す（第１１図）。

ミニセル法において検出された６６０００／６８０００
のポリペプチド二重バンドが、異なるＡＴＧ開始コドン
によって生じるという仮説は、ヌクレオチド配列によっ
て支持される。ヌクレオチド４１５の所のＡＴＧ開始コ
ドンに加えて、さらに他のＡＴＧコドンが部位４６９お
よび部位５３５に位置している。

ｆｉｘ　Ｄ遺伝子をｐＲｍＷ５４上に局在させたハイブ
リダイゼーション実験の結果、リゾビウム・メリロティ
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）　ｆｉｘ　
Ｄ遺伝子産物はエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）内でリゾビウム・メリロティ（Ｒｈ
ｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ｎｉｆＨプロモー
ターを活性化することが証明された。

これらの実験用にプラスミドｐＧＷ６を構築した。

このプラスミドｐＧＷ６　　（第６図）はりゾビウム・
メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ａ＋ｅｌｉｌｏｔｉ
）　ｎｉｆ　Ｄ遺伝子を含有し、該遺伝子はｌａｃ　Ｚ
遺伝子を運ぶプラスミドに翻訳レベルで融合されている
。対照実験は。

クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　
ｐｎｅｕｍｏ−ｎｉａｅ）　ｎｉｆ　Ａ遺伝子を構成性
に発現するプラスミドｐＷＫ１３１．（第２表）を用い
て行い、それによりｐＧＷ６のｎｉｆ　Ｄ　−１ａｃ　
Ｚ融合体は活性化されることがわかった。この活性化は
β−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより検出さ
れた（第６図）。リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ｎｉｆＨ遺伝子およびク
レブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂ−ｓｉｅｌｌａ　
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｎｉｆ　Ｈ遺伝子のエセリシア
・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ｇｉｎ
　Ｇ遺伝子による活性化には相違があるにもかかわらず
、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅ
ｌｉｌｏｔｉ）　ｆｉｘ　Ｄ遺伝子産物がリゾビウム・
メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉ−１ｏｔｉ
）　ｎｉｆ■プロモーターを活性化し、かつ同様の方法
で検出され得る可能性があると考えられた。

実際に実験するために、エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＥＴ８８９４株（第１表
）を使用した。この株は、染色体上のユａｃ　Ｚ遺伝子
内にＩＳＩ挿入体を有し、またＬＬＬ調節領域が欠失し
ている。

この株をプラスミドｐＧＷ７およびプラスミドｐＲｍＷ
５４を用いて形質転換した。結果（第７図）は次の通り
であった。旦ｆ　Ｄ　：：ユ匹Ｚ融合体（ｐＧＷ？）お
よび構成性に発現されるｆｉｘ　Ｄ遺伝子（ｐＲｍＷ５
４）を含有するＥＴ８８９４は、プラスミドｐＡｃ１７
７−Ｃを含有する対照株ＥＴ８８９４に比較して１．５
倍のβ−ガラクトシダーゼ活性を有していた（第３表、
第７図）。この非常に低レベルでの活性化の意義はクロ
ーン化したｆｉｘＤ遺伝子内へＴｎ５を挿入することに
より示された。コード領域にＴｎ５が挿入された場合に
のみ活性化が検出されたなかった（第３表、第７図）。

合成りＮＡプライマーを構築する。該合成りＮＡプライ
マーは、リゾビウム・メリロティ　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ｆｉｘ　Ｄコード配列の直接上
流（すなわち、ＡＴＧ翻訳開始コドンの５゛−側）にお
けるＤＮＡ配列に相補的である。合成りＮＡプライマー
は塩基配列５’−ＣＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＡＴＡＴＧＣ
ＴＧＴＡ−３’を存する。またｐＡｃ１７７−Ｃ内のｐ
ＲｍＷ５４のＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＸｈｏｒＤＮＡサブクロ
ーン（第２表でｐＲｍＷ６９と示される）を切り取って
精製し、一本積ＤＮＡファージへサブクローン化し、そ
してエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｔ）　ＪＭ１０３へ形質転換する（第１１図）。こ
のＨｉｎ　、ｄｌｌ［Ｘｈｏ　Ｉサブクローンは、リゾ
ビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｌ１ｅｌ
ｉ−１ｏｔｉ）　ｆｉｘ　Ｄ遺伝子の完全なプロモータ
ー配列。

およびｆｉｘ　Ｄコード配列の５゛−末端側の８２ヌク
レオチドを含有する。サブクローン化した断片をその中
で増幅させ、その後宿主細菌を遠心分離してその上清か
ら一本鎖の鋳型（約１μｇ）を回収する。４つのデオキ
シヌクレオチド三リン酸（うち１つは放射活性がある）
およびＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片）の存在
下で、１０倍量の合成りＮＡプライマーをこのｆｉｘＤ
ｖ！型上のプライマーとして用いて二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　
（ｄｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ）を作る（第１２図）。混合物を適
当な温度（例えば、２５°Ｃ〜３７℃）である時間（例
えば、１５〜４５分）インキュベートすると、この間に
相補的な鎖がＨｉｎ　ｄＩ［Ｉ部位を越えて伸長される
。旧ｎｄＩ［Ｉ部位とＡＴＧ開始コドンとの間の４６８
ヌクレオチド領域は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉ
ｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｆｉｘ　Ｄ遺伝子
の完全なプロモーター領域を含有する。残った一本鎖Ｄ
ＮＡはＳ１ヌクレアーゼで分解して除去する（第１２図
）。その後肢ｏ　ＲＩリンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を
ｄｓＤＮＡ断片に連結しそしてＥｃｏ　Ｒｒで分解する
（第１３図）。断片をアガロースゲル電気泳動で分離し
てプロモーター配列を含有する断片を溶出し、そして広
い宿主域をもつプラスミドｐＳＵＰ２０４ヘクローン化
する（第１３図）。このプラスミドｐＳＵＰ２０４はあ
らかじめ制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩで切断しておく。得られ
た組換プラスミドをｐＲｍ　ｆｉｘＤ−Ｐ／５Ｓ２０４
と称する。適当なエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）宿主株１例えば１７−１　（この
株は制限切断ネガティブ、すなわちｒ−である）の中で
形質転換させ増幅させた後、　Ｅｃｏ　ＲＩで部分的に
切断すると、いかなる外来構造遺伝子または外来ＤＮＡ
断片をも線状化プラスミドのｆｉｘ　Ｄプロモーター断
片下流につけることができる。外来構造遺伝子または外
来ＤＮＡ断片とは、ここではｆｉｘＤプロモーターの直
接的もしくは間接的制°御下において正規には見出され
ないようなどのような構造遺伝子またはＤＮＡ断片をも
定義する。例えば。

バシラス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｔｈｕ−ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の毒素結晶性タンパク
質をコードする遺伝子が挿入され「構成」組換体ができ
る。構成組換体とは、ここではベクター、プロモーター
配列および該プロモーター配列の制御下で発現されるよ
うないかなる外来ＤＮＡをも含有する組換ＤＮＡプラス
ミドと定義する。

腫大 既に記述されている技術（Ｗｏｎｇ、　Ｈ，Ｃ，、５ｃ
ｈｎｅｐｆ。

ｔｌ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ　（
１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５８　；１９６０−１９６７）を用いて組換プラスミ
ドを得る。

この組換プラスミドはバシラス・チューリンギエンシス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の
毒素結晶性タンパク質をコードする遺伝子挿入体を含有
する。

組換プラスミドＰＥ５１．　　（ＡＴＣＣ患３１９９５
）をに虹Ｒ１で部分的に切断して線状分子を作る。この
組換プラスミドＰＥ５Ｉ　は、プラスミドベクターｐＢ
Ｒ３２２と。

バシラス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｔｈｕ−ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の非常に大きなプラス
ミドの線状型に相同なりＮＡ同様、　３０　、３２およ
び３７メガダルトンのプラスミドに相同なりＮＡとから
成る。これらの部分切断産物をさらに酵素Ａｖａ　Ｉで
制限切断する。分解条件は製造者が推める通りである。

毒素結晶性タンパク質遺伝子用のプローブを単離し既に
記述されているように（Ｗｏｎｇ、　Ｈ，Ｃ，ｅｔ　　
ａｌ。

（１９８３）上記）放射能ラベルする。制限断片をアガ
ロースゲル電気泳動で分離すると、ラベルされたプロー
ブが約１５キロベース（ｋｂ）の１断片にハイブリダイ
ズすることが見出される。この断片はＥｃ。

ＲＩ断片りおよびＦを含む（Ｗｏｎｇ、　Ｈ，Ｃ，ｅｔ
　ａｌ、　（１９８３）上記）。その後１５ｋｂ断片を
標準的な方法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｊ、
　Ｖｉｅｉｒａ　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９　：２
６９−２７６）に従ってＭ１３ｍｐ８またはＭ１３ｍｐ
９にクローン化しエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０３へ形質転換する。溶
出ファージ粒子由来の一本鎖ＤＮＡを精製しそして合成
ブライマー５’　−ＴＧＴＴＡＴＣＣＡＴＧＧＧＴＴＡ
ＣＣＴＣＣ−３’を用いてインビトロで複製させる（部
位特異的な突然変異を起こさせる一般的な方法はＺｏｌ
ｌｅｒ、　Ｍ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓｍ１ｔｈ　（
１９Ｂ２）　Ｎｕｃｌｅ−ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　１０：６４Ｂ？−６５００に述べられている
）。得られた二本鎖組換プラスミドをエセリシア・コリ
ー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０３
へ戻し形質転換し増幅させる。増幅した二本鎖プラスミ
ドＤＮＡをエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３菌体から精製しそして制限エ
ンドヌクレアーゼＮｃｏ　ＩおよびＡｖａ　Ｔで切断す
る。Ｎｃｏ　Ｔは合成プライマ一部位（毒素結晶性タン
パク質遺伝子の開始部位）を切断し、またＡｖａ　Ｉは
毒素結晶性タンパク質遺伝子の３”−末端の下流部位を
切断する。その後突出部をプラント末端結合する（Ｍａ
ｎｉａ−ｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｊｅｆｆｒｅｙ、　Ａ、　
ａｎｄ　Ｄ、　Ｇ、　Ｋｌｅｉｄ　（１９７５）ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、
八、　　７２：１１８４−１１８８）　　。

最後に、　ｐＳＵＰ２０４由来のｐＲｍｆｉｘ　Ｄ−Ｐ
／５Ｓ２０４組換プラスミド（第１３図）をＥｃｏ　Ｒ
Ｉで切断し突出部をプラント末端結合する。そしてＨ４
ｎｄＩＩＩリンカ−をバシラス・チューリンギエンシス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕ−ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）
毒素結晶性タンパク質遺伝子断片およびｐＲｍｆｉｘ　
Ｄ−Ｐ／５Ｓ２０４組換体へ連結する。両成分をＨｉｎ
　ｄｌ［ｒで分解した後、毒素結晶性タンパク質遺伝子
およびｐＲｍｆｉｘ　Ｄ−Ｐ／５Ｓ２０４組換プラスミ
ドを互いに連結させてｐＲｍ旦ｘ　Ｄ−Ｐ／５Ｓ２０４
−バシラス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｔｈｕｒｉｎ−ｇｉｅｎｓｉｓ）毒素結晶性タンパク
質遺伝子構成体を得る。混合物を適当なエセリシア・コ
リー（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａｃｏｌｉ）宿主３例え
ばに８０２．１７−１またはＲＲＩへ形質転換する。プ
ラスミドを個々のコロニーから単離しそして制限マツピ
ングによって方向性を決定する。プラスミドを正しい方
向で含有するコロニーをリゾビウム・メリロテ４　　（
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉ−１ｏｔｉ）へ接合させ
、そしてプラスミドを既に記述したように（実施例７）
転送させる。ｍＲＮＡの産物および／もしくは毒素結晶
性タンパク質を既に記述の方法でモニターする（Ｗｏｎ
ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、上記）。

去止炎工：リゾビウム・メリロティ　（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ　　のｆｉＸＤ゛　　−人　　る
　　ブースカナマイシン耐性遺伝子の源はトランスポゾ
ンＴｎ５およびスイサイドベクターｐＳＵＰ１０１１で
ある（Ｓｉｍｏｎ、　　Ｒ，、Ｐｒ１ｅｆｅｒ、　　Ｕ
、　　ａｎｄ　　Ａ、　　Ｐｕｈｌｅｒ　　（１９８１
）Ｐｒｏｃ、　ｏｆ　Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ　Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）　　（第１４図参照）。ト
ランスポゾンＴｎ５は長さ５．７キロベース（ｋｂ）の
ＤＮＡ要素であり、１．５キロベースの逆反復配列を含
有する。この逆反復配列は２．７キロベースの中心領域
の両端にある。逆反復中には転位に必要な機能がコード
されている。トランスポゾンの中心領域は抗生物質カナ
マイシンに対する耐性を与える遺伝子（Ｋｍ’）を運ん
でいる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子
（ｎｅｏ）　（別名、アミノグリコシドホスホトランス
フェラーゼ遺伝子−ａｐｈ）のコード領域を制限酵素」
しＩＩ　（！！ＬＬ　ＩＩ部位は翻訳開始コドンＡＴＧ
の上流３６ヌクレオチドに存在する）およびＳａｌ　Ｉ
　（Ｓａｌ　１部位はＴＧＡ終止コドンの下流３４２ヌ
クレオチドに存在する）で分解して削除する（第１５図
参照）。

（以下余白） カナマイシン耐性遺伝子の塩基配列は既に示されており
、ここで第１５図のように再生する（Ｂｅｃｋ。

Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９　
：３２７−３３６）。Ｔｎ５ＤＮＡのヌクレオチド配列
を１４０１部位から２７００部位まで示す。ａｐｈコー
ド領域は一本線の四角で囲んである。いくつかの制限部
位を塩基配列中に示す。

主逆反復の末端（閉じ角形かっこ“〕”で示す）および
プロモーター領域においても同様に示す。

このような欠失によりネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）のプロモーター領域は完全な状
態で保存される。これら２つの制限エンドヌクレアーゼ
によって作られた一本鎖の重なりをプラント末端に変え
そして１細工ｄｎＩリンカ−を連結し、その後現ｎ　ｄ
ｎＩ制限エンドヌクレアーゼ　。

で分解する。この構築物をここではｐＳＵＰ１０１１−
ＢｉｎｄｌｌＩ　（第１６図）と定義する。

並行して、　ｐＲｍ２９Ｄ５（Ｒｕｖｋｕｎ、　Ｇ、　
Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）Ｃｅｌｌ　２９　：５
５１−５５９）の３．５キロベースｌｌ１ｎｄＩ［［断
片をエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）ベクタープラスミドｐＡｃ１７７−Ｃ（第２表
）へクローン化することによりプラスミドｐＲｍＷ５４
を得た。適当な宿主株へ形質転換し増幅させた後２組換
プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎ　ｄＩ［Ｉ
で部分分解して線状化する。線状化はｆｉｘ　Ｄ遺伝子
の上流側または下流側のいずれかで起こる。これら２つ
のいずれで起こるかは制限酵素地図を用いて区別できる
。切断が上流（すなわち、　ｆｉｘ　Ｄ遺伝子の読み取
り鎖の５′側）で生じているような線状化体を保存し、
そしてエンドヌクレアーゼＢＡＬ３１で充分な時間処理
して、リゾビウム・メリロティ　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）　ｆｉｘ　Ｄ遺伝子のＡＴＧ開始
コドンから最適な距離にプラント末端を作る。この様に
してｆｉｘ　Ｄ遺伝子の５′−終端方向に短くされた線
状化組換体をさらにｈＬＩＩで制限切断する。

単一のＬ■部位がｆｉｘ　Ｄ遺伝子終止コドンの下流（
すなわち、読み取り鎖のＴＧＡ終止コドンの３′側）に
存在する（第１７図）。ｆｉｘ　Ｄ構造遺伝子を含有す
るこの断片をプラント末端に変えそして…ｎｄｍリンカ
ーを連結する。Ｈｉｎ　ｄ［［で分解した後、　ｆｉｘ
　Ｄ遺伝子を含有する断片を精製しそして線状化ｐＳＵ
Ｐ１０１１−　Ｈ４ｎ　ｄＩＩ［（上記）に連結する（
第１８図）。このような構築物はｐＳＵＰ１０１１スイ
サイドベクターおよびＴｎ５　）ランスボゾンを含有す
る。Ｔｎ５の逆反復の間には、ネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼプロモーター（ｎｅｏＤｒｏ）が含まれ
ており、さらに、　ｆｉｘ　Ｄ構造遺伝子がｎ　ｅ　ｏ
　Ｄ　ｒ　Ｏ制御下にあるように位置している。この構
築物をここではｐＳＵＰ１０１１　−Ｔｎ５−ｎｅ−二
ｆｉｘ　Ｄと定義する。　　　′ このような融合遺伝子およびタンパク質産物を得るため
に、　ｐＲｍＷ５４の■虹ｌ−肛ｎｄＩＩ［小断片をｐ
Ａｃ１７７−Ｃ（第２表）へクローン化した。制限マツ
ピング実験（実施例１）によりＸｈｏ　Ｉ部位はｆｉｘ
Ｄコード領域内に位置することがわかった。他方。

ベクタープラスミドｐＡｃ１７７−Ｃの■ｏＩ制限部位
は鉦ＬＩ遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子）内に存在し
た。融合ポリペプチドの正しいリーディングフレームを
得るために、　Ｘｈｏ　Ｉ部位を一方ではＳ１ヌクレア
ーゼで処理し、また他方ではＤＮＡポリメラーゼＩで処
理した。ＤＮＡポリメラーゼＩで処理した場合１強く出
現した６００００の融合ポリペプチドが得られた。ここ
で述べられている。構成性に発現されるｆｉｘ　Ｄ遺伝
子を含有する組換プラスミドをｐＲｍＷ６９　（第２表
）とする。

本実施例は次の一般的な原理に基づく。２つの基本的な
成分を用いる。これらは、（１）スイサイドベクター、
および（２）トランスポゾンである。

スイサイドベクターとは、ある細菌宿主（本場合はエセ
リシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
）内では安定に複製されるが他の細菌種（例えば、リゾ
ビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　＋ＩＩｅｌ
ｉｌｏｔｉ）　）では複製されないようなプラスミド分
子である。

トランスポゾンとは、ＤＮＡ内である位置から他の位置
へ動く　（転位する）ことができるような遺伝的要素で
ある。転位過程はトランスホモン上にコード化された遺
伝子産物によって媒介され。

またトランスポゾンの各末端に存在する反復配列（直接
的または間接的反復）がどれだけ完全であるかに依存す
る。トランスポゾンは普通、１つまたはそれ以上の抗生
物質に対する耐性をコードする１つの遺伝子（または複
数の遺伝子）を運ぶ。

ベクターは、カナマイシン耐性プロモーターｐＳＵＰ１
０１１−Ｔｎ５−ｎｅ−二ｆｉｘ　Ｄ（実施例５参照）
の制御下にある挿入ｆｉｘ　Ｄ遺伝子を含有しており、
これをエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ）　５Ｍｌ０株へ形質転換（導入）する。この
タイプの組換プラスミドはスイサイドベクター、トラン
スポゾンおよび構成性に発現される構造遺伝子を含有し
、こ。

のプラスミドをここでは「構成性遺伝子転送系」と定義
する。（本枕はｐＳＵＰ１０１１誘導体（組換プラスミ
ド）を他のゲノム陰性菌へ動員することができる（Ｍｏ
ｂ＋）　（Ｓｉｍｏｎ、　Ｒ０＋　Ｐｒ１ｅｆｅｒ、　
Ｕ、　ａｎｄ　Ａ。

Ｐｕｈｌｅｒ　（１９８３）Ｐｒｏｃ、　ｏｆ　Ｂｉｅ
ｌｅｆｅｌｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）。得られた形質転換体をＧｒｕｎｓｔｅｉｎお
よびＨｏｇｎｅｓｓによるコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、　ａｎｄＤ、　Ｓ
、　Ｈｏｇｎｅｓｓ　（１９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７２　：３９６１ｆｆ）を用いて選別して、所
望のクローン化ＤＮＡ断片を含有する形質転換体を検出
する。

クローン化ＤＮＡ断片を、いかなるゲノム陰性菌（例え
ば、リゾビウム・メリロティ　（Ｒｈ　１ｚｏｂ　ｉｕ
ｍ−ｍｅｌｉｌｏｔｉ））でもそのゲノム内へ導入する
ことは。

細菌接合と呼ばれる過程を経て達成される。エセリシア
・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）ＳＭＩ
Ｏ誘導体。

これは所望のｐＳＵＰ１０１１組換体を持っているが。

この誘導体を栄養性寒天プレート面上で共生（Ｓｙｍ）
プラスミドを持つリゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）菌体と混合する。プレー
トを２９℃〜３０℃（リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉ
ｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉ−１ｏｔｉ）に対する最適温度
）で適当な時間（４〜１６時間）インキュベートする。

この間に各タイプの菌体は物理的に接触（接合’）　Ｌ
、　ｐＳＵＰ１０１１組換誘導体はエセリシア・コリー
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）からリゾビウム
・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ
）へ転送される。菌体混液をプレートから洗い出し別の
寒天プレートへまく。このプレートは、構成性に窒素固
定できる場合にのみ生育できるような生物に対して選択
的である。構成性に窒素固定できるこのコロニーはりゾ
ビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚ−ｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉ
ｌｏｔｉ）の誘導体であろう。この誘導体では、クロー
ン化ＤＮＡ断片がＴｎ５に含まれた状態でゲノムのある
位置に挿入されていると思われる。構成性に窒素固定で
きる能力が選択されるということは、挿入ＤＮＡが保持
されていることを確証する。

この段階では、　ＴｎＳ中のＤＮＡ断片がリゾビウム・
メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）
の染色体へ転送されたか、またはそのいくつかのプラス
ミドの１つへ転送されたかはわからない。この問題は、
アガロース水平ゲル電気泳動（Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ。

Ｍ、　Ａ、　ｅｔ　　ａｌ、（１９８２）　Ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、１５１　：　５６０−５６８）　した
後エチジウムプロミド染色して、プラスミドおよび細菌
の染色体を視覚化することにより解決される。いづれの
場合でも、転送りＮＡ断片は機能的である。というのは
ｆｉｘ　Ｄ遺伝子産物がインドランスに作用して窒素固
定を活性化するからである。

β−ガラクトシダーゼの発現を、記述に従って（ｐＧＷ
７　、実施例２．第６図）　ｎｉｆ　ＨＤＫプロモータ
ー制御下で行なった。ｎｉｆ　ＨＤＫの制御下で合成さ
れたβ−ガラクトシダーゼ量を、　ｐＧＷ７を含有する
エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　ＥＴ８８９４（第１表）を用いて測定した。この
系における活性β−ガラクトシダーゼの合成は、　ｎｉ
ｆ　ＨＤＫプロモーターの活性化に依存している。ｐＲ
ｍＷ５４　（肛Ｌ■の制御下で、融合タンパク質として
ｆｉｘＤを発現する）の導入により、β−ガラクトシダ
ーゼ活性はコントロールレベル以上に存意に増加する（
第３表）。上述の実験は２次の事を試験するために計画
した。すなわち、β−ガラクトシダーゼの発現はｆｉｘ
　Ｄ遺伝子産物のレベルを増加させることによって増強
され得るかどうか、またｆｉｘ　Ｄ遺伝子産物のレベル
は鉦ＬＩプロモーターとｆｉｘ　Ｄ遺伝子の開始点との
間の距離もしくはアミノ酸の数を短縮することによって
増加され得るかどうかを試験するために計画した。

鉦し■プロモーターとｆｉｘ　Ｄコード領域の間のコー
ド領域にあるアミノ酸の数を減らすような一連の欠失を
構築した。まず第１に、　ｐＲｍＷ５４の２つのｔｌｉ
ｎ　ｄ　ｍ−ＬＩＩ断片のうち、大きい方をｐＡＣＹＣ
１７７−Ｃ（ここではまた、　ｐＡｃ１７７−Ｃとも称
する）へクローン化した。ｐＡｃＹｃ１７７−Ｃはあら
かじめＷｉｎ　ｄ■およびＢａｍ　Ｈｌで切断しておく
。得られたプラスミドをｐＲｍＷ５４１と表すが、これ
は」戸■プロモーターとｆｉｘ　Ｄコード領域の間に位
置する特異的なＨｉｎ　ｄ　ｍ部位を含有していた。欠
失は、　　ｐＲｍＷ５４１をＢｉｎ　ｄｎ［で切断し、
エキソヌクレアーゼ１１工３１で様々な時間分解するこ
とによって導入した。得られた分解混合物を３１ヌクレ
アーゼで分解した後再連結させ、そしてその混合物をエ
セリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）　ＥＴ８８９４　（ｐＧＩＡ７）のカルチャーを形質
転換するために用いた。３０℃で４８時間インキヱベー
トした後、形質転換体をアムピシリン、クロラムフェニ
コール、グルタミンおよヒＸ−ｇａｌ（５−プロモー４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄガラクトシド、色原
体β−ガラクトシダーゼ基質）を加えた寒天プレート上
にプレートした。

エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　ＥＴ　８８９４（ｐＧＷ？　、Ｉ）ＲｍＷ５４）
は検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性を生じるが、そ
の活性は低くまたＸ−ｇａｌプレート上でのインキュベ
ーションにより白いコロニーを作る。欠失混合物由来の
いくつかの形質転換体は青いコロニーを作り、これはβ
−ガラクトシダーゼの発現が質的に増強されたことを示
唆する。より高い活性を有する株からプラスミドを単離
し、エセリシア・コリー　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ）ＥＴ８８９４　（ｐＧＷ７）へ形質転換した
。β−ガラクトシダーゼ活性を定量的に測定しその結果
を第１９図に示した。ｐＲｍＷ５４１欠失プラスミドの
それぞれの構造を、さらに様々なｐＲｄ５４１単離体の
Ｘｈｏ　Ｉ断片の塩基配列を決定することにより分析し
た。１つのエンドヌクレアーゼＸｈｏ　１部位はｆｉｘ
　Ｄ遺伝子内に存在し、またもう１つの部位は且ＬＩコ
ード領域の翻訳開始点のちょうど上流に位置する（第１
０図参照）。Ｘｈｏ　Ｉ断片は、それらをファージ旧３
ｍｐ８のＳａｌ　Ｉ部位へクローン化した後塩基配列決
定した。Ｘｈｏ　Ｉ断片内に含有されているこれら欠失
部分のヌクレオチド配列を決定することにより。

ｐＲｍＷ５４１−５を除く全ての恒ニーＨＤＫ活性化タ
ンパク質は融合ポリペプチドであることがわかった。第
１９図にそれらの構造を図式的に示す。

第１９図は、ｐＲｍＷ　５４１欠失プラスミドの構造、
およびその結果として起こるＥＴ８８９４　（ｐＧＷ７
）内での−活性化のレベルを図示している。各プラスミ
ドについて最終的なポリペプチド構造を図式的に示す。

黒丸はｌ　並ＬＩプロモーターを表す。白い長方形は、
翻訳されたポリペプチドのＡＰＲ−Ｉ部分を示す。

不完全な黒長方形は、ＦＩＸ−Ｄ部分を示す。斜線部分
は、構築によって生じた翻訳されたオーブンリーディン
グフレーム領域を表す。これらの領域は融合ポリペプチ
ド内でのみ発現される。四角の中の数字は、アミノ酸残
基を示す。ｐＲｍＷ５４１　５の斜線部分右手の版状末
端は、翻訳終止信号を表す。

ＦＩＸ−Ｄ部分の上に示した番号は融合が起こったコド
ンを表す。右欄にＥＴ８８９４　（ｐＧＷ７）内での各
プラスミドのβ−ガラクトシダーゼ活性を表す。

ＦＩＸ−Ｄポリペプチドの発現におよぼす欠失の効果も
また測定した。プラスミドｐＲｍＷ５４１内の欠失は、
　ｎｉｆ　ＨＤＫプロモーターの高レベルの活性化を起
こすが、またＦＩＸ−Ｄポリペプチドのより強い発現も
誘導する。

以上の結果からｌ　ＩＩプロモーターとｆｉｘ　Ｄ遺伝
子間の領域における欠失により１合成されるＡＰＩ−１
−ＦＩＸ−Ｄ融合タンパク質のレベルを増加すせ。

そしてｎｉｆ　ＨＤＫ　−１ａｃ　Ｚ融合の活性化を増
加させることができることが証明される。対照実験によ
り、　ｆｉｘ　Ｄ遺伝子産物によるｎｉｆ　ＨＤＫプロ
モーターの活性化は、宿主生物内の完全なれＬＦ遺伝子
の存在に強く依存することがわかった。麩ＬＦ遺伝子は
、またｎｔｒ　Ａとも称されるが、この遺伝子はグルタ
ミンシンセターゼに対する正の調節遺伝子であり、　Ｅ
Ｔ８８９４内で活性である。

エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　Ｃ６００（ｃ６００（ｐＲは１９８４年６月４日
、　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ
ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌ
ａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ。

Ｒｏｃｋ　ｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２に寄託され
ている。受理番号はｌｌ＆Ｌ３９７２２である。

（以下余白） ４、ズ　の　′な普゛日 第１図は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）の旦り遺伝子およびｆｉｘ遺伝子
の予備地図である。

第２図は、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂ−ｓ
ｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｎｉｆ　Ａおよび
ｎｉｆ　Ｌ遺伝子のコード領域を示す制限酵素地図であ
る。長方形は制限断片を表す。

第３図は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）プラスミドｐＲｍＷ５４．　ｐＲ
ｍＲ３およびｐＲｍＷ５２の制限断片をアガロースゲル
電気泳動にかけた後ニトロセルロースフィルターにプロ
ットしくａ）。

各フィルターをクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂ
−ｓｉｅｌｌａ　ｐ、ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｎｉｆ　Ａ
プローブ（ｂ）　、およびクレブシェラ・ニューモニエ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕ−ｍｏｎｉａｅ）　
ｎｉｆ　Ｌプローブ（ｃ）とハイブリダイゼーションさ
せた場合のオートラジオグラフである。

第４図は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）旦と遺伝子領域の制限酵素地図で
あり。

ｎｉｆ八プへ−ブとハイブリダイズした断片を長方形で
示す。

第５図は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍｎ＋ｅｌｉｌｏｔｉ）　ｆｉｘ　Ｄコード領域のヌク
レオチド配列である。

第６図は、プラスミドｐＧＷ６の制限酵素地図。

および加工ＨＤＫプロモーターの活性化によるリゾビウ
ム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔ
ｉ）旦しＤ：：ユａｃ　Ｚ融合遺伝子の発現をβ−ガラ
クトシダーゼ活性測定により検出した結果を示す。

第７図は１種々のプラスミド組合せを含有するエセリシ
ア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｅ
Ｔ８８９４株のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。グラ
フの左側にプラスミドを図式的に示す。

第８図は、　ｐＲｍ２９Ｄ５由来の肛ｎｄｌｌＩ断片の
制限酵素地図であり、いくつかのＴｎ５挿入の位置を矢
印１〜９で示す。ｐは並ＬＩ遺伝子のプロモーターを表
す。

′第９図は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｆｉｘＤコード領域を含有す
るＤＮＡ断片の最終的な制限酵素地図であり、サブクロ
ーンの位置とその範囲、塩基配列決定の方向（矢印）。

およびオープンリーディングフレーム（長方形）を示す
。

第１０図は、上記ＤＮＡ断片の３．５キロベース…Ｌｄ
Ｉ［ｒ断片中の２１２７塩基対の、塩基配列である。

第１１図は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｆｉｘ遺伝子およびｎｉｆ遺
伝子の全体制限酵素地図である。

第１２図は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ、ｍｅｌｉｌｏｔｉ）旦ｘＤプロモーターの構築手
順を示す説明図である。

第１３図は９組換プラスミドルＲｍｆｉｘ　Ｄ−Ｐ／５
Ｓ２０４の構築手順を示す説明図である。

第１４図は、カナマイシン耐性遺伝子を持つトランスポ
ゾンＴｎ５とスイサイドベクターｐＳＵＰ１０１１を示
す。

第１５図は、トランスポゾンＴｎ５のヌクレオチド配列
を１４０１部位から２７００部位まで示す。一本線で囲
んだ部分は！コード領域である。

第１６図は、ｐＳＵＰＩＯＩＩ　−Ｈｌｎ　ｄＩ［［の
構築手順を示す説明図である。

第１７図は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｆｉｘ　Ｄ遺伝子を含有する
断片の構築手順を示す説明図である。

第１８図は、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｆｉｘＤ遺伝子を含有する断
片をｐｓ［ＩＰ１０１１−Ｈｉｎ　ｄｌ［Ｉに連結して
、ｐＳＵＰ　１０１１−Ｔｎ５−ｎｅｏｐ！−？ｆｉｘ
　Ｄを構築する手順を示す説明図である。

第１９図は、　　ｐＲｍＷ５４１欠失プラスミドの構造
、およびＥＴ８８９４　（ｐＧＷ７）内での活性化のレ
ベルを図示したものである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ベクター、 （ｂ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種の、窒素固
   定を正規に活性化できる産物をコードする遺伝子のプロ
   モーター、および （ｃ）前記プロモーターの制御下にある外来構造遺伝子
   または外来ＤＮＡ断片、 を有する組換ＤＮＡプラスミド。 ２、前記ベクターがｐＳＵＰ２０４である特許請求の範
   囲第１項に記載の組換ＤＮＡプラスミド。 ３、前記遺伝子が￥ｆｉｘ￥Ｄ遺伝子である特許請求の
   範囲第１項に記載の組換ＤＮＡプラスミド。 ４、前記プロモーターがヌクレオチド配列 【遺伝子配列があります】 または厳密な条件下でそれとハイブリダイズできる機能
   的に同等な配列を含む特許請求の範囲第１項に記載の組
   換ＤＮＡプラスミド。 ５、前記外来構造遺伝子がバシラス・チューリンギェン
   シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
   ）の細菌トキシン遺伝子である特許請求の範囲第１項に
   記載の組換ＤＮＡプラスミド。 ６、（ａ）ベクター、 （ｂ）構成性に発現される遺伝子のプロモーター、およ
   び （ｃ）窒素固定を活性化できる産物をコードする遺伝子
   のコード配列、 を有する組換ＤＮＡプラスミドを含有しかつそこで複製
   する組換ＤＮＡプラスミド。 ７、前記ベクターがスイサイドベクターである特許請求
   の範囲第６項に記載の組換ＤＮＡプラスミド。 ８、前記スイサイドベクターがプラスミドｐＳＵＰ１０
   １１およびトランスポゾンＴｎ５を有する特許請求の範
   囲第７項に記載の組換ＤＮＡプラスミド。 ９、前記プロモーターがカナマイシン耐性遺伝子のプロ
   モーターである特許請求の範囲第６項に記載の組換ＤＮ
   Ａプラスミド。 １０、前記カナマイシン耐性遺伝子の前記プロモーター
   がヌクレオチド配列 【遺伝子配列があります】 または厳密な条件下でそれとハイブリダイズできる機能
   的に同等な配列を含む特許請求の範囲第６項に記載の組
   換ＤＮＡプラスミド。 １１、前記コード配列が￥ｆｉｘ￥Ｄ遺伝子のコード配
   列である特許請求の範囲第６項に記載の組換ＤＮＡプラ
   スミド。 １２、前記￥ｆｉｘ￥Ｄ遺伝子がヌクレオチド配列 【遺伝子配列があります】 または厳密な条件下でそれとハイブリダイズできる機能
   的に同等な配列を含む特許請求の範囲第１１項に記載の
   組換ＤＮＡプラスミド。 １３、窒素固定遺伝子を、遺伝子操作して構成性に発現
   された活性化遺伝子の制御下に置くことにより、前記窒
   素固定遺伝子の発現を活性化する方法であって、該方法
   は以下の工程 （ａ）構成性遺伝子のプロモーターを活性化遺伝子を制
   御できるような位置に結合し、それによって活性化遺伝
   子の構成性発現を生じること、 （ｂ）エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
   ｃｏｌｉ）のある株を、スイサイドベクターおよびトラ
   ンスポゾンを有し構成性に発現される活性化遺伝子がト
   ランスポゾン内に挿入されている構成性遺伝子転送系を
   用いて形質転換すること、 （ｃ）前記構成性遺伝子転送系を前記窒素固定遺伝子を
   保持するグラム陰性菌のある株に転送すること、および （ｄ）前記構成性に発現される活性化遺伝子が含有され
   、前記グラム陰性菌内で複製されかつ発現する前記グラ
   ム陰性菌の組換株を選択すること、を含有し、それによ
   り前記窒素固定遺伝子の発現を活性化してＮ＿２固定を
   活性化する方法。 １４、前記構成性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子であ
   る特許請求の範囲第１３項に記載の窒素固定遺伝子の発
   現を活性化する方法。 １５、前記活性化遺伝子が￥ｆｉｘ￥Ｄ遺伝子である特
   許請求の範囲第１３項に記載の窒素固定遺伝子の発現を
   活性化する方法。 １６、前記構成性遺伝子転送系がｐＳＵＰ１０１１−Ｔ
   ｎ５−ｎｅｏ＾￥＾ｐ＾ｒ＾ｏ＾￥￥ｆｉｘ￥Ｄである
   特許請求の範囲第１３項に記載の窒素固定遺伝子の発現
   を活性化する方法。 １７、グラム陰性菌の前記株がリゾビウム（Ｒｈｉｚｏ
   ｂｉｕｍ）種の株である特許請求の範囲第１３項に記載
   載の窒素固定遺伝子の発現を活性化する方法。 １８、前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種がリゾ
   ビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌ
   ｏｔｉ）である特許請求の範囲第１７項に記載の窒素固
   定遺伝子の発現を活性化する方法。 １９、（ａ）ベクター、 （ｂ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種の、窒素固
   定を正規に活性化できる産物をコードする遺伝子のプロ
   モーター、および （ｃ）前記プロモーターの制御下にある外来構造遺伝子
   または外来ＤＮＡ断片、 を有する組換ＤＮＡプラスミドを含有しかつそこで複製
   する細菌株。 ２０、前記ベクターがｐＳＵＰ２０４である特許請求の
   範囲第１９項に記載の細菌株。 ２１、前記遺伝子が￥ｆｉｘ￥Ｄ遺伝子である特許請求
   の範囲第１９項に記載の細菌株。 ２２、前記プロモーターがヌクレオチド配列 【遺伝子配列があります】 または厳密な条件下でそれとハイブリダイズできる機能
   的に同等な配列を含む特許請求の範囲第１９項に記載の
   細菌株。 ２３、前記外来構造遺伝子がバシラス・チューリンギェ
   ンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
   ｓ）の細菌トキシン遺伝子である特許請求の範囲第１９
   項に記載の細菌株。 ２４、（ａ）ベクター、 （ｂ）構成性に発現される遺伝子のプロモーター、およ
   び （ｃ）窒素固定を活性化できる産物をコードする遺伝子
   のコード配列、 を有する組換ＤＮＡプラスミドを含有しかつそこで複製
   する細菌株。 ２５、前記ベクターがスイサイドベクターである特許請
   求の範囲第２４項に記載の細菌株。 ２６、前記スイサイドベクターがプラスミドｐＳＵＰ１
   ０１１およびトランスポゾンＴｎ５を有する特許請求の
   範囲第２５項に記載の細菌株。 ２７、前記プロモーターがカナマイシン耐性遺伝子のプ
   ロモーターである特許請求の範囲第２４項に記載の細菌
   株。 ２８、前記カナマイシン耐性遺伝子の前記プロモーター
   がヌクレオチド配列 【遺伝子配列があります】 または厳密な条件下でそれとハイブリダイズできる機能
   的に同等な配列を含む特許請求の範囲第２４項に記載の
   細菌株。 ２９、前記コード配列が￥ｆｉｘ￥Ｄ遺伝子のコード配
   列である特許請求の範囲第２４項に記載の細菌株。 ３０、前記￥ｆｉｘ￥Ｄ遺伝子がヌクレオチド配列【遺
   伝子配列があります】または厳密な条件下でそれとハイ
   ブリダイズできる機能的に同等な配列を含む特許請求の
   範囲第２９項に記載の細菌株。