JPS61288872A - 光により誘導するガン細胞壊死法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は光により誘導されるガン細胞の壊死作用に関す
る。

ガン細胞にレーザー光線に対して感光性を与える化合物
、例えばヘマトポルフィリン類とレーザーとを組合辺た
ガン治療法に関する多数のレポートがある。例えばＨＣ
ｋｅｎＺｉｅ　（１９８５）　ｐｈｙｓ、　１ｎＷｅｄ
、　Ｂｉｏｌ、　３０　９９　；　　Ｃｕｂｅｄｄａ　
ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）Ｊ、　　Ｏｐ、　　Ｓｏｃ
、　　＾−，！、　　５５６：　　　５ＶａａＳａｎｄ
　　（１９８４）　　Ｊ。

ＯＤ、　ＳＯＣＡｍ、　１．５５５：及びＴａｔｓｕｔ
ａ　ａｔ　ａｌ、（１９８４）ＪＮＣＬ　７３１ユ５９
；最後の論文では引用論文３報を挙げてヘマトポルフィ
リン１ｌＩｓ体（ＩＩＰＤ、）はｉ！瘍組織に蓄積する
傾向にあることを述べている。また皮膚やその他組織に
お番プるＨＰＤの蓄積により、非特異的光毒性が起るこ
とも報告されている。

（ＤＯｕＯｈｅｒｔｙ　ｅ″”ｔ　ａｔ、　（１９８３
）　Ａｄｖ、　Ｅｘｐ、　Ｗｅｄ、　Ｂｉｏ。

１ｅｏ、　３：　　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ａｔ　ａ＋、　
（１９８４）　匡■捜坦」ｉｎ　　Ｔｕｍｏｒ　　Ｐｈ
ｏｔｏｔｈｃｒａ　　（Ｐｌｅｎｕｎ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎ、Ｙ、））さらにＩＩＰＤはｉｎ　ＶｉｔｒＯ（試験
管内）において正常細胞と比較し、ガン細胞に対し若干
の選択性を示す。

本発明の特徴は、通常、前もって設定した波長の光（１
１も好ましくはレーザー光線）を使用して正常細胞と接
着したガン細胞を壊死させる方法であり、水沫は（ａ）
前もって設定した濃度の発色物質と細胞とを接触させる
こと、および（ｂ）ガン細胞を光線に暴露することから
なる。ここで、本発色物質はガン細胞およびそのミトコ
ンドリアに蓄積されやすいよう陽電荷にチャージしてお
り、さらに十分に脂質親和性であり、さらに正常細胞ミ
トコンドリア内よりもガン細胞ミトコンドリア内により
多く摂取され、および／または十分長期にわたり保持さ
れる。さらに本発色物質は光−誘導細胞壊死作用に対す
る治療指数（以下に定義する）少くとも５００を該光線
に対し有する。

好ましくは、本発色物質は光−誘導細胞壊死作用に対す
る少くとも５窩療比（以下に定義した）を有する。

発色物質がガン細胞を同様正常細胞で摂取される場合に
先の方法ａ）とｂ）の間に時間差があり、この時間差は
ｌＩｌ胞を光線に暴露するまでに正常細胞の少くとも８
０％が壊死から免れるだけの発色物質がｖＪｒ＆するに
十分長く、また発色物質と接触したガン細胞の少くとも
８０％が壊死するに十分な発色物質がミトコンドリアに
保持されるに充分短い。

本発明は周囲の正常組織に対し最小の作用をしか与えず
、迅速なガン細胞壊死作用を提供する。

この作用は主として正常細胞に比ベガン細胞ミトコンド
リアによる発色物質の選択的な摂取および／または保持
と、さらには該物質の高度な治療指数にもとづく。

本発明の別の特徴および優越性は以下に記載した本発明
の好ましい実施例および特許請求の範囲より明らかどな
る。

図面の説明を最初に記述する。

第１図は３８ｉ類の濃度に於る発色物質を光に対し暴露
及び非暴露した時の毒性のグラフである。

第２図は本発明の一発色物質のガン細胞に対する選択的
光−誘導毒性を示す対のグラフである。

発色物質および治療への応用をよりｒＪＩＩｌに記述す
る。

ｊン　　に　　　　ｒよび　“ ガン細胞およびミトコンドリア膜を通過して濃縮される
ために発色物質は水溶液中で１ないしそれ以上の非局在
性正の電荷を持ち、さらに相当に脂質親和性でなければ
ならない。また高保持および摂取性（低抗原性であると
同時に）は低分子ｍ１すなわち１０００以下により促進
される。これらの特徴を有した８種の適切な発色物質の
構造と名称を表１に示す、後段に示した現在、最も好ま
しい発色物質である化合物８は化学名１．１’　　−（
２−エチル）−１，３−ジオキソランクリプトシアニン
（”ＥＤにＣ°゛）を有する。表１に提示した発色物質
は合成し、かつ適切な治療指数および治療比に基づきス
クリーニングした一連の発色物質より選択したものであ
る二また適切な先の指数および治療比を示さないことか
ら、本発明の実施に有用でない化合物は表１より除外し
たため、番号に欠番が生じている。

？）１．１’−エチルバレレートチ７カルポシ７ニンプ
１２ｊド　　　　　　　　　５５５Ω　　　４．５Ｒ＝
（Ｇ（、）４ＣＫ馬ｃｌＨ。

短）４臭化ローダ１ン１２３　　　　　　　　　　　　
　　　　　　５１０２　　８．０凡例：ａ０図ＩＫ示し
た化合物　　　　　　ｂ０分子量範囲５００−Ｚｏｏの
色素Ｃ，リン酸酸塩緩衝化生食食塩水　　ｄ、メチルア
ルー−ルｅ、光分解に対する量子収量、（へ＝ｏ、ｏは
く、。−４に＊Ｒする）。

ｆ、活性酸素発生に対する量子収量 ｇ、４ツマ−の凝集ピークの吸収と凝集パン「は同等で
ある。

２．３６　　　０．０ １＋７９　　　０．Ｏ Ｏ，０２１０，０ ０，８３フ０．９１ ０．２７９　　０．Ｏ Ｑ、Ｑ　　　　Ｏ，０ 上記基準を満たす多くの発色物質が１１ＰＯと異なり正
常細胞に比ベガン細胞ミトコンドリアに選択的に摂取さ
れ、かつ長時間（３倍あるいはそれ以上）保持されうる
と予想されるが、その理由は明らかでない。一般に多く
のこの様な発色物質が光による破壊に対し比較的耐性を
有する程度まで、正常細胞からＷ４ｒｌｉするのに４−
８時間を要し、一方、ガン細胞は２４時間、もしくはそ
れ以上にわたり、光−誘導壊死作用に対し、十分ｍの色
素を保持づ゛る（゛色素”および°゛発色物貿゛′を木
用１１Ｉｍでは同意語として使用する）。

Ｌ亀皿土旦ス１ 本発明の方法で使用する発色物質はガン細胞の壊死作用
に対する治療指数（色素の毒性＋光：色素の毒性−光）
が少なくとも５００のものｒある。

それらはまた、等しい色素、および光暴露を用いて正常
細胞に対するガン［１胞壊死の治療比（色素毒性＋ガン
細胞における光毒性：色素毒性十正常細胞における光毒
性）が好ましくは少くとも５０のものである。高治療比
および指数はそれぞれミトコンドリアの保持および光−
Ｍ導壊死作用の選択性、ガン１ｌｆｌ＆に接触した正常
細胞に必然的におこる壊死を保護すること、さらに発色
物質を安全な低濃度で使用することで得られる。通常、
本方法は光の非存在下で正常細胞に対しく以下に定義し
た）“什パ毒性度の少くとも１／１−の発色物質の濃度
を使用する。例えば［０にＣのガン細胞に対する光化学
壊死作用は光の非存在下、正常細胞に対し“１ド毒性度
の　／１゜０　　　”１００Ｇ”ａ濃度を用いて実施で
きる。

部分的に低用量で治療効果をあげることができるＥＤＫ
Ｃおよび表、１の他の発色物質の高治療指数は１回の実
験で示され、その結果を第１図に示す（発色物質の番号
は表１に対応する）。ＥＪ（ＨＧＨ−■）膀胱ガン細胞
のサブ−コンフルエント培養と各発色物質とを３７℃、
２０分間インキュベーション後、洗浄し、４時間後室温
で広域バンド１　、０００ワツトキセノンアークランプ
を光源にして、フィルターを通した約０．５Ｘ　１０−
”ワット／　ｃｒｓ　２／　Ｍ　（５００−８００７Ｉ
ｍ）の光をとり出し暴露した。その後、細胞を洗浄し、
再びインキュベーターへ４８時間戻した。毒性（ＩＩＩ
胞数、形態および生存数で証明）は顕微鏡下で評価した
；毒性度は“０”（未処理コント０−ルと同一）；±′
°（細胞死２０％以下および丸くなりかつ空胞化するよ
うな最小限の形態変化）　；　”−１−”　（細胞死２
Ｏ−６０％および中程度の形態変化）；および“什″（
６０％以上の細胞死および明らかな形態変化）で評価し
た。第１図の如く、発色物質は低濃度において高毒性指
数を呈する。　ＥＯにＣについてさらに試験した結果を
第２図に示す。ＥＪ（ＨＧＩＩ　−０１）細胞のサブ−
コンフルエント単相培養およびコントロールのＣＶ−１
サル腎臓細胞どＥＯにＣ（１０−６−１０−９Ｍ　）と
を２０分間インキュベーション後、３度洗浄した。４時
間後、細胞な０−６４Ｇｏ＋Ｊ　／ｌｓ２／趨レーザー
光で暴露した。複！［Ｊｔｒｉ、　ａをトリブウム標識
チミジンでパルス標識し、１２−２４時ｎ後、回収し、
カウントした。

第２ａ図は被暴露および暴露下でのＥＤＫＣ１１度の影
響を示す。１０’Ｍ以下の色素濃度においてＥ、１（Ｈ
ＧＨ−０１）に対する非暴露下毒性および試験した全色
素濃度でｃｖ−ｉに対する非暴露、暴露毒性とも有意に
は認められなかった。第２ｂ図には１０　　Ｈおよび１
Ｏ−７Ｎ　［０にＣを用いた場合の異なった一〇 光量の影響を示す。再度、ここで毒性がガン細胞に選択
的であった。ＥＪ（ＨＧＩＩ−旧）細胞に対し典型的な
光毒性壊死カーブが得られ、さらに非暴露毒性（＜２０
％）のほぼｉ　、　ｏｏｏ倍の増強作用が得られた。ト
リバンプルー排除およびＲｈ１２３摂取試験はチミジン
取込活性が低いのは、ミトコンドリアの破壊と細胞死に
起因することを示唆した。キセノンアーク光源よりも色
素レーザーの使用は知時圓暴露において低色素濃度での
使用を可能にするような少くとも１００倍の光量増加が
容易になる。

の　カニ　ム 本発明の選択的保持の特徴は２つの公知の光分解メカニ
ズム：即ら光化学および熱性壊死作用に基づきガン細胞
を壊死させる発色物質の使用を可能にするものである。

熱性壊死作用は高レーザー光吸収能および電子の励起状
態エネルギーを熱にすみやかに（好ましくは１ｏ−１１
秒より早く）内部変換する能力を有する発色物質を使用
することで最良に達せられる。

数種のシアニン色素はある種の０−ダミン誘導体がそう
であるように上記性状を有している。

熱性壊死作用はまた良い光安定性を必要とする。

表１に示すように提示した発色物質のあるものの量子収
量は非極性環境下で０．００１以下であり、このことは
それらが分解前に１　、０００以上の光子を吸収できる
ことを示す；このことはより高い光安定性が望まれるが
、受容可能な光安定性があり、さらに発色物質の低投与
量および高い効率の光線の使用を可能にする。

表１の発色物質の一つ、ローダミン６Ｇに対す、る熱性
壊死作用を以下に示す。２重ネオジウム：ＷＡＧレーザ
ー（５３０１纏）由来の２０ナノ秒パルスと１０−６Ｍ
ローダミン６Ｇを使用し、ＨＣＦ−７ガン細胞において
ミトコンドリアの選択的熱性壊死を達成した。（所望す
るような”光化学および熱性壊死作用であるのでローダ
ミン６Ｇの吸収ピークバンドはレーザーの波長と対応し
ている。）ミトコンドリアの破壊は暴露後のローダミン
６Ｇの螢光消失および添加したＲｈ−１２５摂取能の欠
如により評価された。

同様にＱ−スイッチルビーレ−＋ｆ　−（６９４ｍ　）
由来の５０ナノ秒パルスをジャナス（ＪａｎＵＳ）グリ
ーンＢで染色したＮＩｔｌ　：　ＯＶＣ＾ト３卵果ガン
細胞のミトコンドリアの熱性破壊に用いた。ジャナス（
Ｊａｎｕｓ）グリーンおよびＲｈ６Ｇの双方では、非累
露下での毒性レベルに近似した濃度を、さらにレーザー
出力は非直線、非特異的吸収量に近いところを必然的に
使用しなければならない。両色素に対する限定因子は熱
に変換すべき電子エネルギーに対する内部変換時間が比
較的長いことのようである。当該色素の不十分な光安定
性もまた該因子のひとつである。短い内部変換時間、ま
たはより長いパルスをもったより適切な色素を使用する
ことで熱性破壊過程の効率を増加さけることがでさ゛た
。

熱性細胞壊死作用のより効果的な達成が期待できるロー
ダミン誘導体の一つは３．６ピスーインドリンーフルオ
ランであり、このものはＣｏｕｒｎｏｙｅｒらが米国特
許番号第４，２９０，９５０　ｒｆｆｆｌ示した方法に
基づき合成できる。ジメチルスルフオキシド中、パラト
ルエンスルホン酸を触媒として３．６ジクＯロフルオラ
ンをインドリンと反応させる。その結果、生じる色素は
３．６ビスインドリンローダミンを得るべく酸性エタノ
ールでエステル化される。必要なら、ミトコンドリアで
の摂取を最大に、かつ毒性を最小にするため、該化合物
は誘導体とされる。

熱性発色物質のその他の望ましい性質は６０〇−１３０
０Ｍの範囲での吸収スペクトルであり；このことは発色
物質に対向する吸収光から周囲の血液を保護する（ヘモ
グロビンは主としてスペクトルの紫色端を吸収する）。

また発色物質は好ましくは短期ｆｉ１１３１１−励起状
態を有するものであり、このことによりレーザーパルス
期間中に多光子吸収ができる。

また光化学細胞壊死作用は好ましくは６０〇−１３００
／１１１１の範囲に吸収ピークを有する発色物質を使用
する。光化学細胞壊死作用のメカニズムは光安定性の如
何に主に左右される。酵素と反応して活性酵素を発生さ
せることで壊死させる発色物質に対しても高い光安定性
が望ましい、従って該色素が分解するまで出来る限り長
く酸素発生が続くものが良い。該発色物質は好ましくは
高い内部変換率を為し、トリプレット状態へ変換し、か
つその状態を長期に保持するものである。発色物質が分
解し、生じた毒性物の効力により壊死させる発色物質に
対しては、該発色物質の分解過程そのものが所望する効
果を生じるものであるから、光安定性は一般には必要と
しない。

１亀監ｉ立立羞 表工の発色物質のあるものは以下の如く合成した：その
他のものもこの方法を適当に変更することで合成できる
。

１．１’　　−（３−ブＯビルアミンヒドロプロミド’
）−３，３，３’　、３’　　−テトラメチルインド−
トリカルボシアニン　プロミド（化合物５）を以下の方
法で製造した。２当間の活性四級塩１−（３−プロピル
アミン　ヒドロプロミド）−２，３，３−トリメチルイ
ンドリン　プロミドおよび１当量の１−（４−ピリジニ
ル）ピリジニウム　り０リド塩酸をピリジンに添加し、
１１０℃まで３時間加熱した。シアン様に着色した混合
物を室温まで冷却し、濾過後アセトンで洗浄し、さらに
エタノールから再結晶し、金属性緑色結晶を得た。該色
素は中圧ポンプを装着した逆ｌ１Ｃ１８カラムにて水お
よび水−メタノール混液にて溶出し、さらに精製した。

ＥＤＫＣ（化合物８）は、ｆｌａｓｈｅｒがその著書“
シアニン色素とその関連化合物（Ｊｏｈｎ　＆　５ｏｎ
ｓ、　Ｎ、Ｙ。

１９６４年）で開示した方法で以下の如く製造した。

２当ｍの活性四級塩１−エチルー１．３−ジオソランレ
ビジニウムブロミドを予じめピリジンに１１０℃で溶解
し、本溶液に１当邑のオルトギｌｌｉチルを加えさらに
２ｖＩ間撹拌した。生じたシアン溶液をエチルエーテル
に注いだ後沈殿を炉別した。粗色素を塩化メヂレンに溶
解しざらにシリカ゛（Ｗｏｅｌｍ　３２−６３）を充填
したカラムへ注いだ。該生成物は、中圧でメタノール−
塩化メチレン混液により溶出させた。溶出溶媒を蒸発さ
せて固型色素を得た。

化合物６、不斉４．４′　−カルボシアニンは、前記Ｈ
ａｌＯｒおよびｏｇａｔａ（前記著書中）の変法を用い
て製造゛した。１当出の１−（３−プロビルフタールイ
ミド）−４−（β−アセトアニリドビニル）キノリニウ
ムブ０ミドと１当量のベタイン１−（３−スルフオブロ
ビル）レビジンとを１１５℃で１当量のトリエチルアミ
ンを含む０８８０中で反応させた。本溶液を１０分間加
熱後冷却し、ＤＨ３Ｏをエチルエーテルで抽出除去し青
色の残渣を得た。

本残渣をアセトンで洗浄し、さらにメタノールから結晶
化し緑色結晶を冑、さらにこれを２当ｍのヒドラジン水
和物を含む無水エタノールに加え４時間還流した。つい
で減圧下にエタノールを除去した残渣にアセトンを加え
て４時間還流した。混合物を濾過し、減圧乾燥し４．４
′　−カルボシアニンを得た。

１．１′　−ジエヂルバレレートチア力ルポシアニンブ
ロミド（化合物７）は、先駆１ＤｏｒｉａｃｌがＳＣｉ
、　Ｉｎｄ、　Ｐｈｏｔ、　２０巻４５１頁（１９４９
年）で開示した方法に基き実施しだ。２当借の活性四級
１−エチルバレレート−２−メチルベンゾチアゾリウム
プロミドおよび１当ｍのオルトギ酸エチルをピリジン中
１１０℃で１時間加熱した。赤紫色溶液を室温まで冷却
し、エチルエーテルで抽出し固型残漬を得た。この粗色
素を塩化メチレンに溶解し、シリカ（Ｗｏｅｌｍ　３２
−３６）を充填したりＯマドカラムにかけ中圧でメタノ
ール−塩化メチレン混液で溶出した。

面１！聾化１ｍ 発色物質の投与は、ＨＰＤに対して現在使用されている
方法に基き実施する。一般に発色物質を生理食塩水に溶
解し、静脈内、または腹腔内注射する。また必要ならば
本発色物質溶液は、組織の摂取率を促進するような適当
な担体賦形剤に加えることで皮下、病巣内または局所投
与できる。このどさの発色物質は一般に０．１−１００
　ａｙ／に’ｉ体重の範囲で患省に発色物質を投与した
ときガン細胞内１１度が光−誘導壊死作用に対して十分
濃度（通常１０’　−１０”５Ｍ）どなるような濃度で
ある。好ましくは、発色物質が標的組織に到達し、さら
に正常組織から選択的に演散しガン細胞ミトコンドリア
と正常細胞内での発色物質の濃度差を＾めるような投与
−レーザー光暴露操作の時間差を用いる。この時間差は
通常２−２４時間であり、最も好ましくは約４−８時間
である。

本発明に基いたガン細胞の光−誘導壊死作用は、体表面
もしくは光ファイバーを通して普通の光源（例えばキセ
ノンアークランプ）またはレーザー光源由来の光を感受
できるものならどんなガン細胞に対しても実施できる；
レーザー光の照射は現在１１ＰＤ−伝達レーザー療法に
おいて使用される周知の方法に従って実施する。

治療は、組織または皮フの表層に集中したガン、例えば
膀胱の移行上皮ガン、皮フ丁細胞リンパ腫、皮フの鱗屑
状細胞ガンおよび腺鰻、呼吸器および胃腸ガンさらには
卵巣ガンに対し最も効果的であろう。後者の疾病ではｌ
ｕ膜鏡で観察下に操作された光ファイバーを用いて腹膜
表面が手術により容易にかつ十分な時間レーザーｌ露で
きる。

１夙宜１１ 他の実施例も記載した特許請求の範囲である。

例えばシアニンおよびローダミン以外の発色物質類も所
望する性質を得るよう化学的に修飾して使る。

【図面の簡単な説明】

第１図は３種類の濃度に於ける発色物質を光に対し暴露
した時どしない時の毒性のグラフである。 第２図は本発明の一発色物質のガン細胞に対する選択的
光−誘導毒性を示す対のグラフである。 （外５名） −ＬＯと４（侶−集二しフー、）（＾罐）０・！Ｉｌｌ
きｎラム　紺屋１１象性 ２ｓＸｊ＊ラム　　　　０．３２　Ｊ／ｃｒｎ”／ｎｍ
　Ｍ　Ｗ４ｋａ４＋’＆　（４５０−８００ｎｍ）ＦＩ
Ｇ　１　　　′ θ　　　　　　１０　　　　　　／２ ｊ 罎 Ｆ：１ ぐ （′ ローＧＶ−１◆３２　Ｊ／ｃｍ’／ｎｍＩＧ　　２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、前もつて設定した波長の光を使用し正常細胞と組合
   せたガン細胞を壊死させる方法であつて； 該方法は、（ａ）上記細胞を前もって設定した濃度の発
   色物質と接触させること、および（ｂ）前記ガン細胞を
   前記光線に暴露することからなり、ここで前記発色物質
   は、前記ガン細胞およびそのミトコンドリアに摂取され
   るよう正に荷電し、かつ十分に脂質親和性であり、 前記正常細胞のミトコンドリア中より前記ガン細胞のミ
   トコンドリア中に十分長く保持されるか、または前記発
   色物質と接触した前記正常細胞より前記ガン細胞により
   多く摂取されるものであり、 上記前もって設定した波長の光における光−誘導細胞壊
   死作用の治療指数が少くとも５００のものであり、 さらに、該前もって設定した波長の光における光−誘導
   細胞壊死作用の治療比が少くとも５０のものであること
   を特徴とする方法。 ２、前記発色物質が前記正常細胞および前記ガン細胞に
   摂取され、さらに前記方法（ａ）と（ｂ）との間に時間
   差があり、その時間差は、細胞を前記レーザー光に暴露
   するときに前記正常細胞の少くとも８０％が壊死から免
   れるだけの前記発色物質が消散するに十分な長さであり
   、上記細胞を上記光線に暴露するとき、前記発色物質と
   接触した前記ガン細胞の少くとも８０％が壊死するに十
   分な発色物質がガン細胞ミトコンドリアに保持されるの
   に十分短い特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記発色物質を前記光に暴露して前記ガン細胞ミト
   コンドリア内の該発色物質に該物質より強い毒性物質を
   産生する化学反応に関与させる特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 ４、前記発色物質を前記光に暴露して前記ガン細胞の熱
   性壊死を起させる特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、前記発色物質は前もって設定した６００ｎｍを越え
   る前記波長を強く吸収するものである特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。