JPS6130525A

JPS6130525A - リンパ球増殖因子

Info

Publication number: JPS6130525A
Application number: JP15222784A
Authority: JP
Inventors: ハービー　イラ　カンター; ゲーリー　ナーベル
Original assignee: DAANAA FUAABELL KIYANSAA INST
Current assignee: DAANAA FUAABELL KIYANSAA INST
Priority date: 1984-07-24
Filing date: 1984-07-24
Publication date: 1986-02-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、哺乳動物細胞の増殖を刺激する製品と、その
ような製品の製造方法および使用方法に関するものであ
る０本発明の好ましい実施態様下では、本発明は、哺乳
動物細胞、特にＴ−細胞リンパ球、Ｂ−細胞リンパ球、
マスト細胞、幹細胞、繊維芽細胞等が持っている生理学
的機能、例・えば病気に抵抗する免疫系統の有効力を増
強し、または回復するために、これらの細胞の増殖を刺
激することによって、哺乳動物の免疫系統およびその他
の系統の病気を治療する増強因子に関するものである。

（従来の技術）哺乳動物の免疫系統は、本来、体液性免疫応答および細
胞性免疫応答を目的として、Ｔ−細胞リンパ球およびＢ
−細胞リンパ球が如何に形成され、如何に増殖するかに
関係がある。哺乳動物はしばしば免疫不全にかかり、こ
れは先天的であることがあり、感染に対して十分な体液
性および／または細胞性応答を呈するのに発生学的にＪ
皇国がある不全のような例がある。免疫不全のいくらか
は後天的であり、例えばこれらは栄養不足、放射線、老
化、悪性腫瘍または衰弱に伴なうものである。

はとんどの免疫応答は、誘導物質細胞と呼ぶ一群のＴ−
細胞リンパ球によって生産された蛋白質によって始動す
る。異種生体を殺すリンパ球や単球を含む多くのタイプ
の細胞の増殖と分化を刺激するところのペプチドを、こ
れらの一群のＴ−細胞リンパ球は合成し、分泌する。こ
れらに関しては、Ｗｉｇｎｅｒ等、ＬＪｌ」工ｊＩユＩ
　４８　：　Ｉ　５２３（１９７８）およびＹａｍａｕ
ｃｈ等、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍ、１１：９０５（１９８１
）を参照し、またＢ−細胞リンパ球に関しては、　Ｎａ
ｂｅｌ等、江旦２３：ｌθ、（！θ８１）を参照し、マ
スト細胞に関しては、Ｎａｂｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ　２
９１：３３２（１９８１）、　また、造血前駆体細胞に
ついてはＮａｂｅ　Ｉ等、ρｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ、Ｓ、Ａ、７８：１１５７（１８８
１）を参照。これらの文献の記載内容は参考としてここ
で採用している。これらの誘導物質分子の生物学的活性
は、分子の観点からは完全には判明してはいない。

免疫不全に打ち勝つ１つの試みが、免疫応答を強化し、
また病気を予防する目的でリンパ球の迅速な成長を促が
すような投薬量を開発するためになされてきた。これら
については、Ｎｏｗｏｔｎｙ氏の米国特許Ｎｏ、　４，
３２３，５８１及びＫｉｎ氏の米国特許Ｎｏ、　４，３
３３，５６４を参照。これらの記述内容は参考として取
り入れである。

例えば、Ｗａｔｓｏｎ等、　紅藁り鼾史１５０：８４９
（１９７１１）およびその他は、ＷａｔｓｏｎがＩｎｔ
ｅｒｌｅｕｃｉｎ−２（ルー２）と呼び、またＴ−細胞
の増殖に効果があるので、Ｗａｔｓｏｎ等が「Ｔ−細胞
増殖因子」と呼んだところの誘導物質分子からの因子を
取得したことについて報告している。　Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ等、Ｌ■にユＮａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
、Ｓ、＾、７８１：２４８７（１１３８１）、Ｔａｋａ
ｔｕ等、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２５：２４６４（１９
８０）、　ＭｃＤｏｕｇａｌ　１等、ム」工Ｌ」恒ｄ、
　１４５：６９３（１１１１７？）を参照のこと。

これらの文献の記述内容はここに参考として採用されて
いる。然しながら、条件が色々と異なり、刺激用の薬剤
が色々と異なるために、ＩＬ−２分子の特性や大きさお
よび種々のＴ−細胞、Ｔ−細胞Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓが
生産するＬｉｍｐｈｏｋｉｎｅｓの多くの因子について
非常に多くの混乱と不一致な報告がある。　Ａｌｔｓａ
ｎと口、　Ｈ，Ｋａｔｚ、　　ｒＴ−細胞系統および）
１２ｂｒｉｄｏｍａｓが分泌する単クローンＬｉｓ＋ｐ
ｈｏｋｉｎｅｓの生態学Ｊ　、　Ａｄｖ、　ｌ５ｎｕｎ
ｏｌ、　３３ニア３−１８８（１１１１８２）を参照。

この記述内容はここに参考として採用しである。

（発明の要約）本発明は、種々の特性を持った一群の増殖因子に関する
ものであり、また生きている哺乳動物の細胞の１ＪＩｔ
ｉ■でこのような増殖因子を作りまた使用する方法に関
するものであり、またこの増殖因子を持っている製品に
関するものである。

この発明のこの増殖因子は、元来、適当な抗原、例えば
羊の血赤球（ＳＲＢＧ）または細胞分裂誘起物質、例え
ばコンカナバリン（ｃｏｌｃａｎａマａｌｉｎ　）Ａの
存在下で、誘導物質Ｔ−細胞を培養して得た上澄液から
分離した。この増殖因子に含有されているのは、Ｔ−細
胞リンパ球およびＢ−細胞リンパ球の両者およびその他
の多くのタイプの細胞の増殖を刺激する１４ｋｄ（キロ
ドルトン）のポリペプチド、Ｂ−細胞を刺激して免疫グ
ロブリンを増殖させ、分泌させるような５０ｋｄのボリ
プチド、およびＢ−細胞リンパ球による免疫グロブリン
の分泌を刺激し、ある種のマスト細胞、幹細胞およびあ
る種のその他の細胞の迅速な増殖を刺激するような４５
ｋｄの増殖因子である。

（発明の構成及び作用）本発明の本来の目的はＴ−細胞リンパ球およびＢ−細胞
リンパ球の両者に対して増殖因子として作用するところ
の蛋白質の発見と、この蛋白質の製造方法及び使用方法
から出発している。更に特定すれば、マスト細胞、繊維
芽細胞および幹細胞を含むその他のタイプの細胞はもと
より、Ｔ−細胞およびＢ−細胞の両者の増殖を刺激する
ところの約１４キロドルトン（ｋｄ）の分子量を持った
ポリペプチドを我々は生産し分離した。この１４キロド
ルトンのペプチドは、種々の種類の比較的大きいペプチ
ドが正規通りに会合したものだと考えられており、これ
らの大型ペプチドがいずれかの標的赤血球にその細胞分
裂誘起活性を集中させるのに役立っている。この発明の
主題であるこのポリペプチドは１４キロドルトンの分子
量があり、これはドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ
）ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法によって測定さ
れ、５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−１００カラムクロマトグ
ラフ４−によって確認されている。このポリペプチドの
等電点（ｐｌ）は約０．４であって、これは平板等電焦
点法（ｆｌａｔ　ｂｅｄ　１ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆ
ｏｃｕｓｉｎｇ　）によって測定されている。この１４
キロドルトンのリンパ球増殖因子は強力な作因であって
、１ミリメートル当たりこのポリペプチドが１ナノグラ
ムのような少ない量で顕著な増殖が誘導される。このよ
うに、このポリペプチドはペプチド中ホルモンの場合に
観察される濃度と同じ程度の濃度において活性を持って
いる。この１４キロドルトンのポリペプチドによって誘
導されるＴ−細胞増殖またはＢ−細胞増殖の速さは、Ｔ
−細胞増殖に対するｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ、また
はＢ−細胞増殖に対する１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａ
ｒｉｄｅ　（Ｌ　Ｐ　Ｓ　）の如き、リンパ球細胞分裂
誘起物質を使用する場合の速さと事実上一致している。

しかしながら、ＬＰＳとは違って、この１４キロドルト
ンのポリペプチドはＢ−細胞を誘導して免疫グロブリン
を分泌させるようなことはない。

ＬＰＳの如き細胞分裂誘起物質について更に問題となる
のは、これらは明らかに一度は細胞の増殖に影響力を持
つが、増殖のために一度刺激を与えた後は、これらの細
胞は今後の刺激に対して抵抗力を持つようになることで
ある。この発明の増殖因子についてはこうしたことはな
い。

この発明の１４キロドルトン・リンパ球増殖因子はいく
つかの方法で取得され１分離され得る。例えば、刺激を
受けた誘導物質Ｔ−細胞、好ましくはクローンしたＴ−
細胞によって合成されたペプチド上澄液からこの蛋白質
は分離することができる。このようにして、Ｎａｂｅ　
１等、にＩ＋　２３：１９（１９８１）に記載しである
ように生産した誘導物質Ｔ−細胞クローンＣ１，Ｌｙｌ
＋２−／９（このサンプルは既にメリーランド州ロック
ビル市のＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣＣＲＬ−８１７９と、
いう目録番号の下に供託されているが）は、例えば羊の
赤血球（ＳＲＢＣ）またはｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ
の如き適当な抗体または細胞分裂誘起物質と共に培養す
ることによって刺激を受ける。このようにして刺激した
誘導物質細胞から得た上澄液は数種の蛋白質を含有し、
例えばゲル電気泳動法またはクロマトグラフィーまたは
その他の分離方法によって、これらの蛋白質から１４キ
ロドルトン・リンパ球増殖因子を分離することができる
。好ましくは、これらの蛋白質の分離は次に述べるよう
な諸技術を組み合わせた方法で実施するのがよい。すな
わち、クロマトグラフィー法、例えば、蛋白質の分子＄
範囲で蛋白質を効果的に分離するような５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ社）、ＤＥＡＥセルロースまたはその他の親木性樹
脂のカラムでのクロマトグラフィー法、高圧クロマトグ
ラフィー法（ＨＰＬＣ）　、ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆ
ｏｃｕｓｉｎｇ（等主焦点法）および／またはＳＤＳポ
リアクリルアミドφゲル電気泳動法の如き諸技術である
。

また１４キロドルトン・リンパ球増殖因子は、尿素また
はＳＤＳのような解離剤でその他の成る種のポリペプチ
ドを処理するか、または担体蛋白質の非存在下の培養の
ように、蛋白質解離に都合のよい条件下でその他の成る
種のポリペプチドを処理するかして取得できる。

例えば、蛋白質解離には不都合な５ｅｐｈａｄｅｘＧ　
１００樹１指上でのクロマトグラフィーによって分離し
た誘導物質Ｔ−細胞、例えばクローンＣＩ／Ｌｙｌ＋２
−７９の培養から得た上澄液から、約３０キロドルトン
および約４５〜５０キロドルトンの分子量を持ったポリ
ペプチドの分離が可能となる。この３０キロドルトンの
フラクションはＴ−細胞の増殖を誘導するが、Ｂ−細胞
の増殖を誘導しない。５０キロドルトン・フラクション
にはＢ−細胞を刺激してこれを分割する性質があり、ま
たＢ−細胞を刺激して免疫グロブリンを分泌させる性質
があるが、この５０キロドルトン番フラクションにはＴ
−細胞を増殖させる効果はなかった。二の′５０キロド
ルトンのポリペプチドは、Ｂ−細胞に対する細胞分裂誘
起物質である１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　
（Ｌ　Ｐ　Ｓ　）と同じような方法でＢ−細胞増殖およ
び免疫グロブリン刺激に対して活性であるところの新し
く発見された増殖因子であると老兄られる。

これらの分子量が比較的大きいポリペプチドは解離剤お
よび／または解離的条件で処理することによって比較的
小さい蛋白質分節に分離することができる。好ましくは
、比較的大きい蛋白質を濃厚尿素液（１〜ＩＯＮ、好ま
しくは５〜７　Ｍ）またはｏ、ｏ１〜ＩＸ（好マシくは
、約０．０８−０．２％　）（７）　Ｓ　Ｄ　Ｓあるい
はその他の清浄剤で処理する。この技術では、その他の
解離剤またはその他のＣｈａｏｔｒｏｐｉｃな薬剤の作
用が知られている。ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔａｌ（Ｄ
ＴＴ）の如き還元剤は恐らく効果がないだろう。また、
この蛋白質は担体蛋白質の非存在下において、温度を上
げて、例えば、３０〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃
の温度で容易に培養できる。解離剤または高温にての処
理がこの分子に逆に作用するような場合には、余り過酷
でない方法、例えば１ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕ
ｓｉｎｇ（等主焦点法）を用いれば解離はうまく行く。

解離剤による３０キロドルトン蛋白質の処理は、Ｔ−細
胞増殖を誘起する能力を顕著に変化させはしないが、本
発明の１４キロドルトンのリンパ球増殖促進因子および
分子量が１６キロドルトン余りのもう一つのフラグメン
トに少くとも部分的に解離する。３０キロトルトンのも
のを解離して出来た生成物の中には１４キロドルトンの
ポリペプチドが存在するので、この生成物は公知のＢ−
細胞の細胞分裂誘起物質であるＬＰＳの場合と同じ速さ
でＢ−細胞の増殖を刺激する。

ＳＤＳのような解離剤を用いて処理した５０キロドルト
ン蛋白質はＢ−細胞に対して強力な分裂誘起活性を持っ
た解離生成物となり、この解は生成物は５０＋ロドルト
ン蛋白質それ自体とは違って、Ｔ−細胞の増殖を刺激す
る力がある。しかしながら、ＳＤＳによって処理したり
、または担体蛋白質の非存在下で３７℃で４時間培養し
てＩＷ＃を実施すると、この５０キロドルトン・ポリペ
プチドはＢ−細胞を刺激して免疫グロブリンを生産する
力を失なう。

Ｂ−細胞を刺激して免疫グロブリンを分泌する能力を失
うことのない５０キロドルトン蛋白質の解離は、Ｈａｔ
　ｂｅｄ　１ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ
　（平板等電焦点法）によって達成される。５０キロド
ルトン′　蛋白質を等主焦点法にかけると次の二つの生
成物を生産する：　（ａ）　Ｂ−細胞を刺激して免疫グ
ロブリンを生産し、約６．０の等重点を持つ４５キロド
ルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）蛋白質、および（ｂ）今ま
で述べた如く、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞およびその他の細胞
に対する増殖促進活性を持った上述の１４キロドルトン
蛋白質（等電点的４．０）。この４．５キロドルトン蛋
白質は、Ｔ−細胞またはＢ−細胞リンパ球の成長を引き
起しはしないけれど、Ｂ−細胞リンパ球を刺激して免疫
グロブリンを生産させるのに有用であるから、この蛋白
質はこの発明のもう１つの主要な点となる。更に、この
４５キロドルトン蛋白質は、ｈｅｐａｒｉｎ、　ｈｉｓ
ｔａｍｉｎｅｓ。

ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓおよびその他の生理学上
の重要な物質の重要な原料であるマスト細胞の増殖を誘
導することが発見されている。この同じ４５キロドルト
ン蛋白質はまた幹細胞を誘導して新しい単球や顆粒球を
生じさせ、これらは感染の防止に役立つ。この蛋白質は
マウスの幹細胞の成熟を刺激するのに口１１別で使用さ
れてきた。このように、種々の理由で白血球生産を抑さ
えられている哺乳動物に対して、幹細胞を刺激して成熟
を一層速やかにし、感染に対する哺乳動物の感受性を速
やかに減少させるためにこの増殖因子が使用され得る。

この発明の増殖因子は、現在成育状態に保つことが大変
困難とされている培養基中に多種類の細胞を成育させる
ためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ−で使用できる。このようにし
て、この増殖因子に応答する細胞、例えばヒトまたはそ
の他の哺乳動物の免疫系統、神経系統、表皮系統の細胞
を基調とする哺乳動物細胞系統、またはその他の方法で
は維持困難なその他の細胞系統を維持および／または増
殖させるために、培養基にこの増殖因子を添加すればよ
い。

これらの増殖因子の添加は、リンパ球、マスト細胞、繊
維芽細胞、幹細胞等の細胞系統の維持に特に効果的であ
る。適当な栄養物およびその他の標準的成分またはオプ
ショナルの成分を含む培養基に約０．１ｎｇ／ｍｌから
約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約１０
ｎｇ／■１まで添加することによって、細胞系統の成育
に体質的改善を生じる。多くの場合、この発明の増殖因
子を使用すると、細胞系統を維持するために被照射細胞
の如き飼養細胞を使用する必要がなくなる。生産する細
胞系統の純度の点から、これは大変な利点である。

ヒトまたはその他の哺乳動物における、毒性薬品による
反応、感染、放射線、栄養不足、悪性腫瘍に起因する免
疫不全と同様に、侵入に対して効果的な体液性（Ｂ−細
胞抗体）応答および／まだ細胞性（Ｔ−細胞）応答を表
わすのに先天的に不全である状態を含めて、遺伝的また
は後天的原因による免疫不全をＬｎ　ｖｉｖｏで処理す
るのに、この発明のリンパ球増殖因子が使用できる。

この増殖因子は単独または組み合わせて投与することが
できる０例えば、４５キロドルトン増殖因子はマスト細
胞およびその他の細胞に増殖−刺激効果を有するが、Ｂ
−細胞リンパ球に対しては持っていない、Ｂ−細胞に対
する４５キロドルトン因子の効果はＢ−細胞の免疫グロ
ブリン分泌を刺激することである。マスト細胞の増殖お
よびＢ−細胞の増殖ならびに免疫グロブリン分泌の両方
を望むならば、５０キロドルトン増殖因子または４５キ
ロドルトン因子と１４キロドルトン因子の混合物の何れ
かを投与すればよい。

動物体内の特別な標的細胞の増殖を促がすには、標的組
織と結合し、またはその他の方法で関係を持つようにな
るところの薬剤と、この増殖因子が共有的またはその他
の方法で結合したり、または関係を持つことによって効
果がｊｊｌｔ？’このようにして、例えば、多くのタイ
プの細胞に対して増殖刺激効果を有する１４キロドルト
ン増殖因子は、その動物のリンパ球の如き標的細胞に対
する抗体に付着させられることによって、対象動物への
この因子の効果を一層特殊なものとなしうる。このよう
な特殊作用を効果的に達成させる一つの方法としては、
その動物の標的組織の上に単クロース抗体を載せ、１４
キロドルトン増殖因子をこの単クローン抗体に結合させ
、そしてこの抗体と増殖因子が結合したものをその動物
の血の流れの中に注入させる方法がある。この抗体が増
殖因子を標的組織に送り、抗体は標的組織に付着または
その他の方法で結合し、増殖因子は標的組織の増殖（お
よび／または分泌）を刺激する。

（以Ｆ余白）特殊な抗原に対する抗体を取得するための諸技術支匹旦
碧は一般的に知られており、多くの単クローン抗体がマ
サチューセッツ州ボストン市ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎ
ｕｃｌｅａｒ社などから、市販品としては入手可能であ
る。単クローン抗体を作る諸技術はＮａｔｕｒｅ　２５
６：４９５（１９７５）にＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅ
ｉｎが最初に書いている。この記載内容はここに参考と
して採用する。この技術の−々の見方および変法が今ま
でに報告されてきた。例えば、ｌＬｕ等、Ｃ１ｉｎｉｃ
ａＣ１１ｎｉｃａｌ１　　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　１：
１　（ｌＥ１８０年８月）、Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ等の米
国特許４，１７２，１２４　（これには諸文献が記載さ
れている）、Ｗａｎｄｓ等の米国特許４，２１１，１４
５を参照のこと、これらの記載内容は参考としてここに
採用しである。もし必要ならば、処置すべき個々の動物
の標的細胞にこの抗体を載せることもできる０例えば、
マウス、ウサギ、取扱う動物と同じ種の他の動物の如き
抗体源に摂取した状態、また希望する哺乳動物から入手
したものであって、８０７２球細胞またはＢ細胞前駆細
胞の培養物の如き抗体を生産するところの細胞培養物を
用いて、Ｔ細胞またはＢｍ胞リンパ球は個々の動物また
はヒトから取得でき、それによって、本発明の増殖因子
は、細胞の増殖を維持し、抗体の分泌を誘導するという
点で有益に使用できる。生成された標的細胞に対する抗
体、好ましくは単クローン抗体、および抗体生成細胞は
、　ｈｙｂｒｉｄｏ■ａｓを形成して、あるいは適切な
りローン化及び培養技法によって維持できる。

標的細胞に対する抗体は、抗体の生理学的性質または増
殖因子の生理学的性質を損なうこと−なく、またはそれ
らに悪影響を与えることなく蛋白質と反応するところの
、何等かの多機能薬剤を使用することによって１本発明
の増殖因子蛋白質と共に結合することができる。好まし
くは、結合薬剤としては、比較的分子量の低い２Ｉａ能
生薬剤で、蛋白質分子の反応グループと反応するものが
良い。

このような薬剤はこの技術方面では多く知られており、
それには次のようなものも含む：すなわち、メタキシリ
リン・ジイソシアネート、トルエン２．４ジイソシアネ
ート、ｐ、ｐ′ジフルオロ−ｍ′ｍ−ジニトロジフェニ
ール・スルホン、トルエン−２−イソシアネート−４−
イソチオシアネート、　３−メトキシジフェニールメタ
ン−４゜４−ジイソシアネート、ベンジジン・ジイソシ
アネー４．１．５−ナフタレンジスルホニル・クロライ
ドおよび３．６−ビス（アセテートマーキュリメチル）
ジオキサン等、例えば、Ｄ、Ｎ、Ｗｅｉｇ、　Ｇ。

＾、Ａｎｄｒｅｓ等、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　Ｉｇｉｍｕ
ｎａユ’Ｊｉｌａ　”　”（１９７？　）、”　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｒ　ｆａｒ　ｔ
ｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇ
ｅｎｓ　ｏｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｂｙＥｌｅｃｔ
ｒｏ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ″を参照のこと、この記載
内容はここに参考として採用しである。最近ではメタキ
シリリン会ジイソシアネートが良く使用される。

好ましくは、両薬剤は相当に純粋でなければならない。

適当な細胞分裂誘起物質の吸収により、またはＤＥＡＥ
セルロースあるいはその他の適当な物質上でのクロマト
グラフィーの如き公知の他の技術によって、希望する抗
体から希望しない抗ているが、この方面の技術では公知
の如く、同じ蛋白質またはその外の同じ生物学的物質に
ついても見掛けの分子の大きさの変動が観察さている。

それは使用するテストの形式、テストを実施する時の諸
条件、蛋白質のグリコシール化の程度、確認する時の考
え方、クロマトグラフィーに使う媒体または電気泳動法
に使う媒体の変動およびその外の理由によるからである
。ここに報告する方法の変法は見掛けの分子量の如きパ
ラメータに若干の変動を示したが、他のテスト方法、他
のクロマトグラフィー媒体、他の条件ではいくらか異な
った結果を与える可能性がある。この発明に重要なのは
増殖と免疫グロブリン分泌を誘導する蛋白質そのもので
あり、この発明の意図と範囲は、ここに報告する数値と
は違った見掛けの分子量またはその他のパラメータにお
ける諸条件または諸方法を使用することによって生産ま
たはテストした蛋白質を製造、使用、販売することによ
って無効となるものではない、この方面の技術で公知の
如く、これらの蛋白質のアミノ酸配列を測定することが
できる。例えば、Ｓｔｒｉｃｋｂｅｒｇｅｒ、　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ［１１０頁以下（ＮｃＭｉｌｌａｎ、１９７
Ｂ　）を参照のこと。これの記載内容はここに参考とし
て採用する。Ｂｅｃｋ　−ｍａｎ　Ｉｎ５ｔｒｕ＋ｗｅ
ｎｔｓ社と静ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から
蛋白質自動分析器を入手できる。

口■■の治療で使用されるべき種々の増殖因子の必要量
（以下、活性成分量という）は、投与経路や治療すべき
状態の正常や程度によって変化し、結局は医師または獣
医の判断による。しかし、一般的には投与量は哺乳動物
の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから１Ｍｇの範囲であって
、好ましくは約ｌθ〜２００ｇ／ｋｇである。投与量は
全てペプチドベースで計算する。

活性成分は治療すべき状態に適した経路で投与すればよ
い。適当な経路としては、経口的、経鼻的（例えば、ス
プレー）および非経口的（皮ｒ的、筋肉的、静脈内的）
がある、治療すべき条件と共に好適経路が変化すると考
えればよい。

活性成分としては粗製在学量として投与することも可能
であるが、製剤的に調整した薬品とじて提供することが
好ましい。

家畜に使う場合にも、人間に使う場合にも、本発明の調
剤は１種またはそれ以上の適当な担体およびオプショナ
ルにその他の治療成分と共に、上記の活性成分を含む。

担体はこの調剤の他の成分と両立できるという意味にお
いて［受諾できる（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）Ｊものでな
くてはならず、また使用するものに対して有害なもので
あってはならない。好ましくは、調剤は酸化剤やペプチ
ドが共存しないと考えられているその他の物質を含んで
はならない。便宜−ト調剤は単位投与量の形式で提供さ
れ、また製薬−ヒの公知の方法で調整される。これらの
方法は全て１種またはそれ以上の付属的成分を含む担体
と活性成分を結合させる工程を含む。一般的に、活性成
分を液状担体または微細にした固形担体またはその両方
に均一に密接に結合させることによってこの調剤は作ら
れ、必要な場合には、希望する調剤形式に製品を成型す
る。

経口的投与に適した本発明の調剤は、予め定めた活性成
分量を含むカプセル、カシェ−またはタブレットのよう
な分割単位で提供され、または粒末ないし粒状で、また
、溶液または水性液体ないし非水性液体での懸濁液とし
て、または水中油の液状エマルジョンまたは油中水の液
状エマルジョンとして提供される。また活性成分は丸薬
、鼻スプレー、練り薬、ペーストとして提供される。

タブレットは圧縮するかまたは成型加工によって作るこ
とができ、オプショナルとして１種またはそれ以上の付
属成分を伴なう。圧縮したタブレットは適当な機械で圧
縮することによって調整され、その際活性成分は粉末、
粒状、オプショナルには結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤
、潤滑用薬剤、表面活性剤または分散剤などミックスし
′て自由に流動する形状のものとして使用する。成型タ
ブレットは適当な機械で不活性液状希釈剤で加湿した粉
末コンパウンドの混合物を成型することによって作られ
る。

非経口的投与５適した大調剤は、その溶液が好ましくは
、使用者の血液と等浸透圧であるというような活性成分
の無菌水溶液から出来ている。このような調剤は、固形
活性成分を水に溶解し、水溶液となし、この溶液を無菌
となし、ユニットまたは数単位の容器、例えば密封した
アンプルまたは密封したバイアルの形で提供される。

次の点を理解すべきである。すなわち上記した成分に加
えて、本発明の調剤は、１種またはそれ以−にの希釈剤
、緩衝剤、香料　、結合剤、表面活性剤、シックナー、
濶滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む）およびその他の同様
ものの如き添加成分を含んでいる。

人間に使う場合も、家畜に使う場合にも、例えば特定し
て上記した如く、この調剤が単位役グー形式で提供され
る場合には、単位製剤は各々約１００弘ｇから約１００
　ｍｇまでの範囲の量で活性成分（上に定義したように
）を含有する。

この発明を更に次の例示的技＃ｉ態様によって説明しよ
う。

クローン化するための細胞は、Ｃ５７８１／θＴＬ＋マ
ウスから取得した（Ｅ、Ａ、Ｂｏｙｓｅから入手した）
。

ＢＡＬＢ／ｃのマウスの細胞を調製培養基を作るのに使
用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスはＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙから手に入れた。

細胞系を開始させるのに使用した方法はＮａｂｅ　１等
、にＩＩ　２３：１９　（１１１８１）に記載された方
法であって、これはここに参考として採用されている。

細胞をクローン化し、維持するのに使用した調製培養基
は次の様に調製した：　　Ｃｅｒｒｏｔｉｎｉ等。

Ｊ」ｖ」恒〔１４０ニア０３　（１９７４）の方法に従
ってアルギニンおよびアスパラギンを補充して、Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏの修止Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉａ　　（ＤＭ
Ｅ）　　（Ｇ　Ｉ　ＢＣｏ　）を更に修正したもので、
この記録の内容はここに参考にして採用されており、こ
れに更に０．００６ｇ／ｌの葉酸、ピルビン酸ナトリウ
ムおよび必須ビタミンを補充した。この培養基は、今後
、修正ＤＭＥまたはＭＤＭＥと略す。

ＢＡＬＢ／Ｃ（７）　　腫細胞（５ｘ　１０　ｍｌ）を
３７℃で４５時間４０１のＮ０ＭＥの中で培養した。こ
のＭＤＭＥには更に１０２炭酸ガスを含む雰囲気を持つ
組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ　
３０２４０）中で５Ｘ１０　　Ｍ２−マルカブトエタノ
ール（２−ＭＥ　）、２ｍＭ追加グルタミン、４ｚ加熱
非活性胎児子ウシ血清（Ｆｅ２）および２ｍｇ／ｍｌの
ＣｏｎＡ　（Ｃａｌｈｉｏｃｈｅｓ−Ｂｅｈｒｉｎｇ社
製を添加してあった。この培養液の−１−澄液を０．２
０＋Ｉ　Ｎａｌｇｅｎｅ　Ｆｉｌｔｅｒで濾過し、調節
した培地（ＣＭ　）とした。

細胞は゛完全調節培地”（ＣＣＭ）中で生育し、この縞
地は、５０％ＣＭと５０％ＭＤＭＥを組み合わせて作ら
れており、更に、５×ｌ０−３Ｍ　２−ＭＥ、２ｍＭ！
ｉ１ｉ鮮グルタミンおよび十分な量の追加ＦＣ３が添加
されていたので、Ｆｅ２の最終的濃度は全容積の１０％
となった。細胞濃度は０．５と３Ｘ　１０５細胞／ｓｏ
ｌの間に保持され、１８置き゛に新鮮ＣＣＭ（約１：４
）が培地に添加された。細胞培地は抗生物質の無い状態
に維持され、Ｈａｙｂｌｉｃｋ。

“　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　　Ｃ１１ｔｕｒｅｓ　　ｆｏ
ｒ　　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　　Ｉｎｆｅｃ−ｔｉａｎ
ｓ”、　Ｋｒ１ｒｅ等、　（Ｅｄ、　）　Ｔｉ５ｓｕｅ
　ＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａ圧顕：ａ
ｔｉｏｎｓ　（−Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎ、Ｙ、　１８７３　）に従って、周期的にマイクロプ
ラズマ汚染について検査した。これの記載内容はここに
参考として採用する。

次のようなりローン化方法が使用された。細胞を最終想
定濃度が１（１０，ｔｏ、ｌおよび１細胞１つぼ（ｗｅ
ｌｌ　）となるように微小つぼ（Ｆａｌｃｏｎ　ｐｌａ
ｓｔｉｃｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅｓ　３０４
０　）の中に分けて入れた。

各々のつぼはＱ、　１ｍｌのＣＣＭと各種の組織から採
った照射した（’１５００ｒａｄ　）細胞単一層を含む
ことになった（最終濃度４〜８　Ｘ　１０５細胞１つぼ
）。

培地には、つぼの中にコロニーが見えるようになるまで
（１０８間から３週間）２日に１度３０＃ＬｌのＣＣＭ
を補充した。しかしそのつぼには最初は１００細胞１つ
ぼ以下しかなかった。

ヶ。−７化効よ（ＣＥ’）はボアツア分布、従９て計算
した（　Ｑｕｉｎｔａｎｓ　ａｎｄ’　Ｌ’ｅｆｋｏｗ
ｉｔｓ、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

１＋ｕ＋ｕｎｏｌ　　３　：　３９２　（Ｈ１７３）（
参考として採用しである））、少なくとも８６のつぼを
ＣＥを計算するために使用した。陰性つぼの比率を初期
細胞数の対数の関数としてプロットした。ＣＥが５％超
で、頻度が３８′９６未満でコロニーから出て来たもの
を、３細胞／１０つぼの割合に希釈した後、または単一
細胞を顕微鏡操作した後に２度生育させた単一細胞のこ
とをクローンを命名した。初期の細胞コロニーの特質は
安定しており、単一細胞顕微鏡操作または再希釈して得
たコロニーから採取′したクローン書コロニーの特質と
一致し、　１２種類以上の細胞のコロニーについて別々
に試験した結果は、各クローンから採取した３−１Ｏの
娘クローンは同一の細胞表面抗原、形態を示し、最適の
場合には、親コロニーの機能を示した。

クローン化した後、細胞を照射した細胞単分子膜の非存
在下で生育させた。それをＣＣ′Ｍ中ニ０．５ＸｌＯ’
細胞／ｍｌカら３ＸＩＱＪｌ胞／ｓ＋１の濃度に保った
。クローン化した細胞を２１のっぽ（Ｌｉｎｂｒｏ　ｐ
ｌａｔｅｓ　、　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂａ　）に初めて移植
し、ＣＣＭｏ、５■ｌを加え、　０．５Ｘ　１Ｇ’　／
禦１から３ＸＩＯ５／ｍｌに保った。細胞容量に応じて
、細胞はＬｉｎｂｒＯＩＬ、ペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ　
１００７．１００６．３００３　）ま虻は組織培養フラ
スコ（Ｆａｉｃｏｎ　３０２４　）の中で、この濃度で
保った。プラスチック製の組織培養フラスコに軽く付着
した細胞はペトリ皿で生育させて回収を容易にさせた。

　１８〜４８時間の間に全ての細胞について２回テスト
した。細胞の数は１０８超にもなった。

種々のクローンの表現型は、適当な抗体と共に培養し、
次に蛍光と結合して、フロー細胞蛍光測定法を用いて分
析することによって決定できる。

表現型は、また、適切な細胞表面抗原を表わすＢ６マウ
スの細胞の如きリンパ様細胞または適切な細胞表面抗原
の部位コードだけが異なるところのｃｏｎｇｅｎｉｃ（
ｃｏｎｇｅｎｅｒｉｃ　）近文「パートナ−」種の細胞
と共に培養することによってチェックができる。

Ｎａｂｅｌ等、阿上］、Ｃｅ旦ノ２３巻、２５頁を参照
。

単クローン抗体、例えばＴｂｙ　１．２　、　Ｌｙｔ　
１．２およびｔ、ｙｔ　２．２で特定される単クローン
抗体は市販されており、例えばＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｎｕｃｌｅａｒ社から入手でき、またその方法自体は
この方面では公知である。

クローンの１つであるＣ１．　Ｌｙｌ＋２−／　９はＴ
ｈｙ　１１４ｔ１２ｒ誘導物質ＪＴ細胞表現型を表わす
Ｔ細胞のクローン化コロニーである。このクローンはＣ
ＣＭ中で０．５Ｘ　１０５／ｍｌ〜３Ｘ１０５／＋＊Ｉ
の濃度で１５ケ月以上の連続培養によって生育した。

Ｂリンパ８９７２球を得るために、ウサギのマウス拮抗性免疫グ
ロブリンをコーテングしたシャーレ上でＣ５７Ｂ１／８
−マウス（Ｊａｃｋａｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　）の辞職細胞懸濁液を培養した。無癒着性の細胞を捨
てた後、免疫グロブリン士細胞を激しくピペット・アウ
トして溶離した。溶離した細胞は４℃で３５分間最適の
溶菌素生虞条件にて単りローン性抗１４１．２．抗Ｌｙ
２．２および抗Ｔｂｙ　１．２と共に培養し、洗浄し、
ウサギ補体と共に３７°Ｃで３０分追加して培養した。

抗ＳＢＣプラーク形成細胞応答が無いことによって、ま
た、単りローンＴｈｙ抗！、２抗体の免疫蛍光によって
、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの５ＲＢＣによる刺激の後には残存
Ｔ細胞が欠如していることが確認された争クローン化したＴ細胞コロニーの上澄液を刺激したもの
から取得した種々の増殖因子が、「ｉｎマ１ｔｒｏＪ　
Ｂ細胞の免疫グロブリン分泌をどれくらい刺激する能力
があるかは、非免疫給与者のＢ細胞の１−１０ＸＩＯに
対してこの因子を最終容積が０．２１になるまで加える
ことによって決定した。抗５ＢＲＣＰＦＣまたは全ＰＦ
Ｃ（免疫グロブリン分泌プラーク形成細胞の全数）がＮ
ａｂｅ　Ｉ等、阿上錦、２３販旦２６項に記載されてい
る溶血性プラーク定量法の変法によって計算される前に
、これらの細胞培養液は１０８３１　Ｂ　Ｃで５日間刺
激を受けた。馬の赤血球（２５ｕｌ　）をウサギ抗マウ
スＦ（ａｂ′）２を用いて計算し、テストすべき細胞培
養液の２５１を１２　Ｘ　２５龍の試験管で、特別均衡
塩類溶液（５ＢＳＳ　）にＳｅａ　−Ｐｌｅｑｕｅアガ
ロース（Ｎａ１ｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　）を０．８％
溶かした溶液の４５０ｕ　ｌと共に混合した。各試験管
の内容物を直ちに３０Ｘ１０■■のペトリ皿の中の１％
Ｓｅａ　Ｋｅ鵬アガロ−Ｘ　（Ｍａｉｎｓ　Ｃｏ１１ｏ
ｉｄｓ　）をゲルにしたもの２ｍｌの上に層状に置いた
。５％の炭酸ガスを含む湿った雰囲気中に３７°Ｃで１
時間放置後、ウサギ抗マウスＦ（ａｂ′）２展開血清（
最終希釈率は５ＢＳＳ中で０．０５鵬ｇ／腫ｌとなる）
をこのペトリ皿の上にピペットで載せた。３７°Ｃで更
に１時間数ｉｌ後、この抗血清をデカントし、ｌ：１０
に希釈した同容量の再構成したモルモット補体（Ｇｒａ
ｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉ。

ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏ、　）で置換した。溶解現象帯（
プラーク）を２時間後に数えた。全ての場合赤血球ＰＦ
Ｃと全ＰＦＣを同時３重培養して測定した。

Ｔ細胞を上記した方法でクローン化したＴｈｙ　１＋ｔ
、ｙｔ−２”コロニーを用いて測定した。このコロニー
の成長は全＜　ｒ　Ｌ−２に依存している。Ｂ細胞増殖
を高度に精製した休止Ｂ細胞を使用して測定した（これ
はＴ細胞を１〜３　Ｘ　１０４またはＢ細胞を２〜ｌ０
ＸＩＯ’をｆ底マイクロ適定用つぼの中で、０．２１の
Ｄｅｌｂｅｃｃｏ修正Ｅａｇｌｅｓ培地、４％の加熱非
活性ＦＣ３，５０ｕＮの２−■および種々の割合の上澄
液成分または種々の割合の細胞分裂誘起物質成分を持っ
た２ｍＭのグルタミンの中で培養した。　２０−６８時
間の培養後、３Ｈ−チミジンの０．５ｕＣｉを各つぼに
加えた。４時間後、細胞に取り入れられた放射活性をガ
ラス繊維フィルター上の残留量で測定した。

上澄　　　のクローン化細胞の放射標識上澄物質は次のようにして無
血清条件下で作った：増殖を続けているクローンの細胞
を６時間５ＲＢＣ（１０”）またはＣｏｎｃａｎａｖａ
ｌｉｎＡ（２ｕ　７ｍＭ　）と共に培養し、３回洗浄し
、無メチオニンＲＰＭ　Ｉ　１８４０培地（Ｒｏｓ−ｗ
ｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ　）中に１０６／ｍｌの細胞濃度で培養し、この培
地には２ｍＭのグルタミン、５ｕｇ／ｍｌのヒトのＴｒ
ａｎｓｆｅｒｒｉｎ　、　５ｕｇ／ｍ１（７）牛のイン
シュリン、　２０ｕ　／層１のａｐｒｏＨｎｊｎおよび
１００　ｕｃｊ　／＋ｓｌの３５　Ｓ　−ｍｅｔｈｉｏ
ｎｉｎｅを補足した。３７℃で４時間後、標識のないｍ
ｅｔｈｉｏｎｉｎｅを添加して１　’ｍＷのｍｅｔｈｉ
ｏｎｉｎｅ最終濃度とした。細胞を遠心分離し、使用前
の高速遠心分離（１００，０００Ｘｇ　）に先立ち担体
蛋白質として上澄液に０．７■ｇ／脂１ｃ７）Ｏｖａｌ
ｂｕｓｉｎを加えた。

操作は全て０〜４℃で実施した。遠心分離後、クローン
化したＣ１．Ｌｙ　１２−／９の５０Ｘ１０’の細胞か
ら得た３５３−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅで標識を付けた上
澄液を１０〜２０倍濃縮し、５％のグリセロール、１０
Ｇ−の塩化カリウムおよび０．５ｍＭのフェニルメチル
スルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む燐酸塩ａｖ
Ｒ食塩液ＣＰＢＳ　）へ透析した。同じ緩衝液で平衡状
態にした５ｅｐｈａｄｅｘＧ−１００カラム（１００Ｘ
　２ｃ■）に濃縮したＬ澄液を通した。２ｔｌｆつ集め
て、各フラクションを（１）ＴＣＡ−ｔ−沈殿する放射
能、（２）生物学的活性、すなわち、（ａ）精製Ｂ細胞
による免疫グロブリン分泌の刺激、（ｂ）Ｔ細胞が分割
するように刺激する力（これはトリチウム・チミジンを
結合する能力によって測定できる）につきテストした。

カラムを次のような標準物質で均衡させた：牛の自消ア
ルブミンＢＳ　Ａ　、　（８８，０００キロドルドア　
）、　０ｖａｌｂｕｓｉｎ　（ＯＶＡ　　）、（４５，
０００キロドルトン）およびリゾチーム（ＬＹＳ　）、
　（１３，０００キロドルトン）。

その結果を図１に示す、この図から明らかな如く、約４
５〜５０キロドルトンの分子量を持つ１つの放射能標識
を持つ蛋白質がＢ細胞からの免疫グロブリンを誘導する
のに活性があり、Ｔ細胞の増殖を誘導するのに活性がな
い、約８０〜８Ｂキロドルトンの分子量を持つもう１つ
の蛋白質は生物学的活性は両方とも持たない、　１２〜
３０キロドルトンという広い分子量帯で溶出されたとこ
ろの第三の蛋白質はＴ細胞増殖は活発に誘導したが、Ｂ
細胞による免疫グロブリンの分泌は誘導しなかった。

ポリアクリルアミド・ゲル　　゛ −Ｌｏｅｎｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　　２２７　：　１１
８０　（１９７０）＋７）方法の変法を使用して、　０
．７−■の厚さの板状ゲルで電気泳動を実施した。既に
記述した如く内部的に標識を付けた上澄液標本部分（２
５ｕｌ　）を同量の１８０■圓Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ　（
ｐＨＬａ　）２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、　４％ＳＤＳ、
０．２％ブロモフェノールブルーおよび２００膳阿ｄｉ
ｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔａｌと混合した。

１２．５％のアクリルアミドを含有するゲルを１２０ボ
ルトの一定電圧で電気泳動した。ゲルはＣｏｏｍａ−ｓ
ｓｉｅブルーで染色し、Ｌａ５ｋｅｙ等、　Ｅｕｒ、Ｊ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ５６　：　３３５　（１９７５）の方
法に従って蛍光写真法にかけ、乾燥し、ラジオオートグ
ラフにかけた。

図２はＣ１，Ｌｙ　１２　／９の３種の異なる上澄液に
ついての諸結果を示す：（ａ）ＳＲＢＣと共に培養して
刺激を受けたＣ１．Ｌｙ　１”２７９からの上澄液、（
ｂ）刺激を受けなかった、すなわち抗原または細胞分裂
誘起物質の非存在化で培養されたところのＣ１，Ｌｙｌ
ヤ２−／８からの上澄液、および（ｃ）　ｃａｎ　−ｃ
ａｎａｖａｌｉｎ　Ａと共に培養することによって刺激
を受けたところのＣ１，Ｌｙ　１”２／９から採取した
上澄液。図２で見る如く、刺激を受けない誘導物質細胞
によって合成された上澄ペプチドのＳＤＳポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動はいくつかの小さいバンドと共に
、５つの大きい標識蛋白質のバンド（見掛けの分子量が
８０．４５．３３．３０および１８キロドルトン）を示
した。正しい（ｃｏｒｒｅｃｔ　）抗原（５ＲＢＣ）ま
たはＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ　１７）存在下では、
細胞は見掛は分子量が１４キロドルトンの新しいポリペ
プチドを合成した。その他の内部的に標識を付けた蛋白
質は、抗原または細胞分裂誘起物質による刺激後も強度
の明らかな変化または再現性のある強瓜上の変化は示さ
なかった。

刺激を受けたＣ１．Ｌｙ　ｌ＋２　／９細胞および刺激
を受けないｃ＋、ｔ、ｙ　ｌ？２７１１１細胞の上澄蛋
白質にさらすことによって誘導されるＴ細胞およびＢ細
胞の増殖速度の増加量を、トリチウム処理チミジンのＴ
細胞またはＢ細胞による摂取速度の測定によって決定し
た。更に、刺激を受けたＢ細胞および刺激を受けないＢ
細胞を５ＲＢＣにさらし、Ｂ細胞によって分泌された抗
５ＲＢＣ免疫グロブリンの量を検定した。Ｃ１，Ｌｙ　
１”２７９細胞からの上澄液はＲＰＭ　Ｉ　ＩＥ１４０
培地中で培地量１０６細胞／鵬ｌを培養することによっ
て調製した。この培地には、この細胞を６時間刺激剤な
しに培養するか、または２ｕｇ／＋ｓｌのＣａｎ　Ａ　
、　１０６細胞／ｍｌの５ＲＢＣまたは１０６細胞／１
のニワトリの赤血球（ＣＲＢＣ）（これは抗５ＲＢＣ分
泌に対して間違った抗原である）で刺激することの何れ
かの状態で６時間培養した（そして２回洗浄する）直後
に、５ｐｇ／ｍｌのトランフェリンおよび５ＩＪｇ／ｍ
ｌのインシュリンが補充された。上澄液は５　Ｘ　１０
４の細胞を用いてＴ細胞またはＢ細胞増殖の誘導につい
て、および５　Ｘ　１０５の精製Ｂ細胞を用いて抗５Ｒ
ＢＣ分泌の誘導についてテストを受けた。

（表　１）ゼロ　　　　　　４８５±１２５　　３．７５１±５４
３０Ｃｏｎ　Ａ　　　　Ｉ７，５４３±５２８　２１．
８７８±５２８　２．３９７±１１０ＳＲＢＣＩ３，３
５３ｆ３８１　２０．７７？±１，５４３　３１０　：
ｆ−１８ＣＲＢＣ４８？±３９５　　　　ｎ、ｄ、　　
　　　　９Ｂ　±３５プラス　のコントロール（ＬＰＳ４ｗ＋ｃｇ／ｇｌ）　　　３８２土１１０　１
３０，９８７±２．３４５　４．２３０ｆ１３４（Ｃａ
ｎ　Ａ　２ｕｇｓ／ｍｌ）　６．１４６±８２　２，９
８４±８４０　　　　　０ｔｒシた１４キロドルトン　
ポリペプチド纒ｌしし袈通１１１力１４キロドルトンのペプチドおよびその他の活性は、予
備的ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で分離した後、
類似の方法でテストした。ｌ■■のスライスを１０〜２
０キロドルトンに該当する部分の板状ゲルから切り取っ
た。各スライスの蛋白質を抽出し、ＴＣＡ沈殿性放射能
と機能とをテストした。予期した如く、１４キロドルト
ンおよび１６キロドルトン帯に該当するスライスだけが
抽出可能な蛋白質を持っていた（　ＴＣＡ枕殿性放射能
によって測定した）、ＳＤＳを除くために広範な透析を
実施した後、２　ｎｇ／曹ｌのレベルでＴまたはＢ細胞
増殖の刺激について、ペプチドのテストをしたｓ　Ｃａ
ｎ　ＡおよびＬＰＳが２ｎｇ／ｍｌおよび４ｎｚ／１で
コントロールとして使用された。これらの結果を表ＩＩ
に示す。

（表出）ＳＯ３−ＰＡＧＥで精　し友不ノート白プ活五細胞培地
に　　　　４３）１チミジンの摂取ＩＢ細胞の免疫加え
たペプチド　　エ廻潤　　　　旦巖勘　　グロブリン分
泌Ω」ン）υ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
律匹Ｚ遷二）ゼロ　　　　　　１８？±１２　　　７，
８３１±３８５３±１１４Ｋｃ１　　　　　２５，２７
３±４３２　　　９３．３８７±４．３２１　　　０１
ｆｉＫｄ　　　　　　　　　２８９±２３　　　　　８
，７２３±１．３２３　　　０１４Ｋｄ　＆　１６Ｋｄ
　　　２０，１０４±１，２３４　　８２，３４３±６
．００１　　　０コントロールＣａｎ　Ａ　　　　２３，２４０±１．２３４　　７，
８５１：ｌ：８５２　　　０Ｌ　Ｓ　Ｐ　　　　　１９
９±５５　　１３０．７５９±３．２１１６．５３１±
４５６１４キロドルトンと標識を付けたバンドに該当す
るスライスから抽出したペプチドは、ＴおよびＢ細胞の
両者の増殖を誘導した。１６キロドルトンバンドからの
ペプチドは、最低限の細胞増殖を誘導し、残余のｌθ〜
２０キロドルトンスライスは分割を刺激しなかった。６
０キロドルトンバンドからの蛋白質は、十分なＴＣＡ沈
殿性放射能を含有したが、何れのタイプの細胞の分割を
も刺激しなかった。１４キロドルトンの各ペプチドの混
合物はＴ又はＢ細胞の増殖に対して殆ど加算的効果を示
した。

精製１４キロドルトン舎ペプチドは、細胞増殖の強力な
誘導物質である。ＳＤＳ含有ゲルから抽出した後でさえ
、１４キロドルトン・ペプチドは僅かｌｎｇ／＋ｓｌで
リンパ球増殖を誘導し、このようにしてペプチド争ホル
モンの場合に認めた濃度と同じような濃度で活性である
。同じような濃度で、１４キロドルトン・ペプチドが誘
導するＴまたはＢ細胞増殖速度は、実質上リンパ球細胞
分裂誘起物質、つまりｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡおよ
びｌ１ｐｏｐｏｌｙ　−５ａｃｃｈａｒｉｄｅ（Ｌ　Ｐ
　Ｓ　）による増殖の刺激と同一であった。しかし、な
から、ＬＰＳとは違って、１４キロドルトン・ペプチド
は如何なる濃度でもＢ細胞免疫グロブリン分泌を誘導し
なかった。

アミノ　ぐ　の２ｄゲルから得た１４キロドルトン・ポリペプチドをＧ
ａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＹで処理した。放出さ
れたアミノ酸を透析し、ポリアミド・シート上での２次
元クロマトグラフィーで同定した。２次元クロマトグラ
フィーの溶剤は蟻酸（１，５％　）で、次にベンゼンと
酢酸の９：ｌの混合物だった。得られたアミノ酸はアラ
ニン、フェニールアラニンおよ。

びグリシンだった。１４キロドルトン・ポリペプチドの
Ｃ末端の割当てはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａであると結論
された。

今まで述べた如く、上述した実施例における５ｅｐｈａ
ｄｅｘＧ　−１００クロマトグラフイーによって得た５
０キロドルトンポリペプチドは、新規のＢ細胞増殖因子
であって、今までに分離もされておらず、記録もない。

これに加えて５ｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフイーでの
約３０キロドルトンの分子量に該当する因子は、Ｔ細胞
を誘４して増殖させるが、Ｂ細胞は誘導しないところの
生物学的活性を示した。

これらの２つの活性フラクションが１４キロドルトン増
殖因子に対して何等かの関係を持っているかどうかを決
定するために、３０キロドルトンおよび５０キロドルト
ン−フラクションを解離剤および／または解離的条件の
下で処理した。「解離的条件」という言葉は、蛋白質の
構成成分の性質を損なうことはなく、蛋白質をその主要
構成成分に分離するのに役立つような条件を意味する。

５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−１００カラム”７ラクシヨン
３８〜４０（平均見掛は分子量５０キロドルトン）およ
びフラクション４８〜５０（平均見掛は分子量３０キロ
ドルトン）のアリクオツド（図１参照）を０．１％ＳＤ
Ｓ、６Ｍ尿素または０．ＯＩＭＤ　ＴＴ（ｄｉｔｈｉｏ
ｔｈｒｉ　−ｅｔｏｌ　）の何れかで室温で３０分間処
理するか、または３７℃で１２時間担体蛋白質なしで培
養した。培養後、サンプルを透析し、生物学的活性を定
量した。汚染した細胞を最小限に押えるために、２×１
０４のＢ細胞を増殖定量に使った。コントロールとして
、公知の細胞分裂誘起物質であるＣｏｎ　ＡおよびＬＰ
ＳをＴ細胞およびＢ細胞用にそれぞれ使用した。Ｃａｎ
　Ａが存在すれば、Ｔ細胞によっテ２３，２４０ｃｐｍ
が結合した。ＬＰＳで刺激したＢ細胞は１３．０？５ｃ
ｐｍのＨ−チミジンを吸収し、１０６細胞当り２５０の
全ＰＥＣおよび１０６細胞当り１８５の５ＲＢＣＰＦＣ
を形成した。その結果を表■に示す。

ス６Ｍの尿素または０．１％ＳＤＳで３０キロドルトン・
フラクションの処理は、Ｔ細胞増殖を誘導するそれの能
力を顕著に変化させはしなかった。また、担体蛋白質の
非存在下で３７℃で１２時間このフラクションＢを培養
してもＴ細胞増殖を誘導するその能力を変化させなかっ
た。しかしながら、これらの解離処理は全て、３０キロ
ドルトン・フラクションが新たな活性を取得する結果と
なった：すなわち、この解離生成物は今度はＢ細胞のは
げしい増殖を刺激し、この増殖はＢ細胞分裂誘起物質Ｌ
ＰＳが誘導する増殖と等しいものだった・５０キロドル
トン令フラクシヨンを同様に処理しても同様な結果が得
られた。３７℃で４時間の培養または０．１％ＳＤＳを
用いての培養は、Ｂ細胞を誘導して免疫グロブリンを分
泌するこのフラクションの能力を消失させたけれども、
これらの処理は結果的にはＢ細胞に対しては細胞分裂誘
起活性を強化することになり、またＴ細胞にとっては細
胞分裂誘起活性の取得となった。

これをまとめてみれば、３０および５０キロドルト拳フ
ラクシヨンはＳＤＳでの処理後共通の活性を獲得した：
すなわち、それらはＴおよびＢ細胞の両者の増殖を刺激
した。解離に伴なうこの分割された機能に関与している
ペプチドの見掛けの分子量を決定するために、内部的に
標識を付けた５０キロドルトン・フラクションを再度ク
ロマトグラフにかけた。図３で分かる如く、今度はＴお
よびＢ細胞増殖活性が約１４キロドルトンの場所に一緒
に溶出されてきた。この図において、Ｔ細胞増殖に関す
る曲線は黒マルで示し、Ｂ細胞増殖に関する曲線は白マ
ルで示す、Ａの部分は５ＤＳ−処理した５０キロドルト
ン・フラクションについての結果を示し、Ｂの部分は、
５ＤＳ−処理１７た３０キロドルトン・フラクションに
ついての結果を表わす。

（以下余白）、　　７　　　　占　　　　Ｆｌａｔ−Ｂｅｄ　　ｌ５
ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ５０キロドルトンおよび３０キロド
ルトン物質を更に研究するために、それらを平板等電焦
点法（Ｆｌａｔ−Ｂｅｄ　　ｌ５ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　
Ｆｏｃｕｓｉｎｇ　）にかけた。

その方法はＬＫＢシステム（Ｌ　Ｋ　Ｂ　　Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ社、　Ｒｏｃｋｖｌｌｅ、　Ｎｄ、　）を
用いた５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−７５の水平層で実施した
。ＤＥＡＥ−セルロースから溶出した活性物質を透析し
蒸留水に対して）した後、その７６１をゲル皿に入れる
前に、４ｍｌのＡｍｐｈｏｌｙｔｅｓ（ｐＨ３，５−８
）および４ｇｍのＵｌｔｒｏｄｅｘ（両方ともＬ　Ｋ　
Ｂ　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を含む溶液に加えた
。この皿を冷却用のプレート（１０°Ｇ上に置き、６４
０ボルトの一定電圧で１６時間電気泳動させる。電気泳
動後、ゲルを３０の部分にスライスし、各々のスライス
のｐＨを測定し、各スライドは、担体とし−ｃ　Ｏ，０
２％のＱｙｌｌｂｕ＋ｓｉｎを含む４１の燐酸塩緩衝塩
類溶液（ＰＢＳ　）で蛋白質を溶出する前に、５ｅｐｈ
ａｄｅｘＧ　−２５カラム（９Ｘ１ｃｍ）に通した。

等電焦点法は、特に５０キロドルトン蛋白質の成分を解
離するのに有益である。その理由は、蛋白質をＳＤＳを
使用して解離する時にＢ細胞の免疫グロブリン分泌活性
が破損されたが、等電焦点法ではそのようなことはなか
ったからである。５０キロドルトン・ペプチドについて
の結果を図４に示す。

図４に示す如く、Ｂ細胞免疫グロブリン分泌は約６．０
の等電点を持つ内部的に標識を付けたペプチドによって
誘導された。ＴまたはＢ細胞増殖は約４．０の等電点を
持つ内部的に標識を付けたペプチドによって誘導された
。前者の内部的に標識を付けたペプチド（等電点６．０
）は５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４５キロドルトンの分子
量の１つのバンドとなった。一方では、後者のペプチド
（等電点４．０）は１４キロドルトンの分子量の１つの
バンドとなった。　５ｅｐｈａｄｅｘ分割後の３０キロ
ドルトンの分子量を持つペプチドを５ＤＳ−ＰＡＧＥス
ラブ・ゲルにかけた。この物質を繰り返し分析して、■
４キロドルトンと１８キロドルトンの分子量の、２つの
分かれたバンドが判明した。それらは約同量のＴＣＡ沈
殿性ｃｐｓを含有し、ゲル中の全ｃｐｓの６０〜７５％
以上を占めた。このバンドをゲルから溶出し、細胞分裂
誘起活性をテストした。　１４キロドルトン・ペプチド
はＴおよびＢ増殖を刺激し、一方では１８キロドルトン
も２５キロドルトン〜３５キロドルトンからのフラクシ
ョンも検出できるような細胞分裂誘起活性を示さなかっ
た。　５ｅｐｈａｃｒｙｌクロマトグラフイーを終了し
た３０キロドルトン・フラクションは、等電焦点法によ
って分離した。

２２の異なったフラクションを細胞分裂誘起活性につい
てテストした。約３．８〜４．０の等電点を持つフラク
ションだけがＴおよびＢ細胞を刺激した。

細胞分裂誘起フラクションをＳＤＳポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動にかけるとｃｐ腸の８５％が１４−１８
キロドルトンに集まった。

図５はｃ＋、ｔ、ｙ　１＋２−７９上澄フラクシヨンの
５ＤＳ−ＰＡＧＥの密度計による操作の結果を示す：（
＾）　５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−１００クロマトグラフイ
ー後の５０キロドルトンφフラクション；（Ｂ）ＩＥＦ
での５０キロドルトン物質の分離後の等電点６．Ｏフラ
クション（図４参照　）：（Ｃ）ＩＥＦ下での分離後の
５０キロドルトン物質からの等重点４．０フラクシ、　
ｙ　；　（０）　５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−１００りａマ
ドグラフィー後の３０キロドルトン；（Ｅ）ＩＥＦでの
３０キロドルトンやフラクション分離後に得られた細胞
分裂誘起フラクション（等電点は約１０　）。

−−と　゛　　と　　　　　　　。

増殖が求められる標識細胞に特異的である蛋白質と増殖
因子の結合の１つの実施例として、Ｔ細胞と結合する抗
体に１４キロドルトン増殖因子が結合できる。例えば、
使用する抗体は単クローン抗体であるＡｎｔｉ−ｈｕｍ
ａｎ　Ｉａ　（クローン７．２）でも良く、これはＮｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社から市販されて
おり、このものは末梢性血球Ｂ細胞に特異的に結合する
。従って抗体の８８％以上がＢ細胞に結合し、１％以下
が末梢性血球Ｔ細胞または胸腺中の細胞と結合する。

結合剤（メタキシリレン−ジイソシアネート）は先ず１
４キロドルトン増殖促進蛋白質と結合する。生成した蛋
白質を、最終濃度がｏ、ＩＭｌｌ＃塩緩衝液中で約２０
〜２５■ｇ／■ｌの蛋白質となるような容量を十分に取
って、　０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐｉ（７，５）５よ
びｏ、３Ｍａｒ！＃塩ＩＩｌ衝液り　ｐＨ９，５）ト共
に水浴で混合する。冷たい液状メタキシリレン・ジイソ
シアネートを、蛋白質１００謄ｇ当リメタキシリレンΦ
ジイソアネートを０．１■ｌの割合で加える。次にこの
混合物を水浴で４５分間マグネチック攪拌器ではげしく
かきまぜ、３０分間４℃、　１５００ｇで遠心分離する
。上澄液は七ノー置換生成物を含有し、抗体との＃８合
に直接使用するのに適している。

燐酸塩緩衝塩類溶液（ｐＨ７，２）中の単クローンＡｎ
ｔｉ−ｈｕｍａｎ　　Ｉａ（クローン？、２．　ＮＥＮ
　）を、−り述の第１段階で調整した上澄液と１４キロ
ドルトン蛋白質の４部に対して抗体を約１部の重量比で
混合する。追加の硼酸塩緩衝液を約０．１．および約３
．５のＰＨを維持するように加える。これらの成分な　
℃で４８時間マグネチック攪拌器でゆっくりとかきまぜ
る。

抱合しなかった抗体および／まなは蛋白質は適当な技術
、例えば電気泳動、ショ糖密度勾配遠心法（Ｓｕｃｒｏ
ｓｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｅｎｔｒ
ｉｆｕｇａｔｊｏｎ）等で除去できる。上に述べた如く
、抱合抗体の満足できる拠金状態および不変の特異性は
免疫電気泳動によって確認できる。

得られた　合体含有溶液は、細菌用フィルター（例えば
、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社などから入手できる）を通過さ
せることによって無菌化でき、使用前の相当長期にわた
る期間低温（４°Ｃ）での貯蔵が可能である。

このようにして、この発明は多数のリンパ球増殖因子を
含みその１つは約１４キロドルトンの平均見掛は分子量
を持ち、それは約３．８〜４の等重点を有し、Ｔ細胞、
Ｂ細胞およびその他のタイプの細胞を刺激して増殖させ
るが、それ自身Ｂ細胞により免疫グロブリン分泌を促進
はしない。１４キロドルトン増殖因子は抗原の存在下で
誘導物質Ｔ細胞を培養し、上澄液から増殖因子を分離す
ることで生成できる。誘導物質Ｔ細胞を抗原または細胞
分裂誘起物質の存在下または非存在下において培養する
時に上澄液中に生成される比較的大きいペプチドの解離
によって、１４キロドルトン増殖因子は生成できる。更
に、平均見掛は分子量がやく５０キロドルトンであり、
それ自体新規に発見されたＢ細胞に対する増殖因子を含
むようなそのような上澄液に見出される蛋白質からも生
成可能である。このＢ細胞増殖因子は、また、このよう
に刺激を受けた上澄液から、例えばクロマトグラフィー
、電気泳動または等主焦点法などの分離技術によって生
成することができる。１４キロドルトン増殖因子は５０
キロドルトンの分子量を持つ上澄液から別の蛋白質をそ
れらの主要構成部分に解離することによって生成できる
。比較的大きい蛋白質を解離条件下で解離剤と共に外押
するかまたは等主焦点法によってこのことは実施できる
。

本発明の製品は、また、遺伝工学例えば希望する物質の
アミノ酸配列順序を少なくとも部分的に分析し、ＤＮＡ
またはＲＮＡ消息子を得るためにアミノ酸配列順序を利
用し、問題とする増殖因子を作っている遺伝因子を決定
するためにこの消息子を使用し、この遺伝因子を適当な
媒介者を使って適当なバクテリアまたはイーストに移し
、この遺伝因子およびその細菌的宿主を複製し、問題と
する増殖因子を発現させることによって１作ることがで
きる。このようにして出来るリンパ球増殖因子は上述し
た如く免疫不全を治療するのに使用できる。

ここに述べた特定的技術態様は単に例示的であると解釈
すべきであって、種々の変法がこの技術分野の有識者に
は自明である。これらの変法を網羅するために以下に特
許請求の範囲を述べる。

【図面の簡単な説明】

図１は、誘導物質Ｔ−細胞のクローン培養を刺激して得
た上澄液を溶離して５ｅｐｂａｄｅｘＧ　１００のカラ
ムに分別された種々の蛋白質を示すグラフであって、種
々のフラクションが、　（ａ）　Ｂ−細胞からの免疫グ
ロブリン分泌をどれだけ誘導する効果があるか、（ｂ）
　Ｔ−細胞の増殖をどれだけ誘導する効果があるか、を
トリチウム・チミジンで賦形させて測定したものである
。図２は、種々の液体の成分を示している５Ｏ３−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動のコピーである。図３は、（Ａ）　５０キロドルトンの物質の成分を用い
て処理し、（Ｂ）　３０キロドルトンの物質の成分を用
いて処理した場合の、Ｔ−細胞増殖とＢ−細胞増殖のグ
ラフを示す。図４は、５０キロドルトンのポリペプチドを等電画に分
離した成分による等電点電気泳動、免疫グロブリン分泌
およびリンパ球刺激を示す。図５は、種々のフラクションおよび種々の物質の光学的
濃度スキャニングによる結果を示す１組のグラフである
。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）哺乳動物の誘導物質Ｔリンパ球を分離し、この誘
導物質リンパ球を抗体または細胞分裂誘起物質と接触さ
せることによって増殖因子生成を促進し、この刺激を受
けたリンパ球が生成した物質から少なくとも１つの増殖
因子を分離することから成る、哺乳動物細胞用の増殖因
子を生成する方法。
（２）誘導物質リンパ球を羊の赤血球に接触させること
を特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（３）誘導物質リンパ球をコンカナバリン（Ｃｏｎ−ｃ
ａｎａｖａｌｉｎ）Ａに接触させることを特徴とする、
特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（４）刺激したリンパ球が生産した物質をクロマトグラ
フ的に分別することによって増殖因子を分離することを
特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（５）刺激したリンパ球が生産した物質を電気泳動法に
かけることによって増殖因子を分離することを特徴とす
る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（６）誘導物質Ｔリンパ球がクローン化したマウス誘導
物質Ｔリンパ球であることを特徴とする、特許請求の範
囲第１項に記載の方法。
（７）誘導物質Ｔリンパ球がクローンＣｌ．Ｌｙ１＾＋
２＾−／９の特性を有することを特徴とする、特許請求
の範囲第１項に記載の方法。
（８）刺激したリンパ球が生産した物質からの約５０キ
ロドルトンの分子量を持つ蛋白質を分離し、この蛋白質
を解離して約１４キロドルトンの見掛け分子量を持つ第
１番目の増殖因子と約４５キロドルトンの見掛けの分子
量を持つ第２番目の増殖因子を生成することを特徴とす
る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（９）第１番目の増殖因子を分離し、第２番目の増殖因
子を分離することを特徴とする、特許請求の範囲第８項
に記載の方法。
（１０）刺激したリンパ球が生産した物質から約３０キ
ロドルトンの分子量を持つ蛋白質を分離し、この３０キ
ロドルトンの蛋白質を解離させ、約１４キロドルトンの
分子量を持つ哺乳動物の細胞の増殖因子を生産すること
を特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（１１）特許請求の範囲第１項の方法に従って生産した
哺乳動物細胞増殖因子。
（１２）約１４キロドルトンの分子量を持つポリペプチ
ドからなり、その増殖因子がＴ細胞リンパ球およびＢ細
胞リンパ球の両者の増殖を刺激する機能を有することか
らなる、哺乳動物細胞の増殖因子。
（１３）当該増殖因子が、また、マスト細胞および繊維
芽細胞の増殖を刺激する機能も有することを特徴とする
、特許請求の範囲第１２項に記載の増殖因子。
（１４）増殖因子が約３．８〜４．０の等電点を有する
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１２項に記載の増
殖因子。
（１５）約５０キロドルトンの分子量を持つポリペプチ
ドから成り、Ｂ細胞リンパ球を刺激する機能を有するこ
とから成る、哺乳動物細胞増殖因子。
（１６）当該増殖因子がＢ細胞による免疫グロブリン分
泌を刺激する能力があることを特徴とする、特許請求の
範囲第１５項に記載の増殖因子。
（１７）増殖因子が約６．０の等電点を有することを特
徴とする、特許請求の範囲第１５項に記載のリンパ球増
殖因子。
（１８）哺乳動物細胞増殖因子および製薬的に受け入れ
ることができる担体からなり、その増殖因子が（ａ）約
１４キロドルトンの分子量を持ち、Ｂリンパ球およびＴ
リンパ球の両方の増殖を刺激する機能を持つ蛋白質、（
ｂ）約５０キロドルトンの見掛けの分子量を持ち、Ｂリ
ンパ球の増殖を刺激する機能を持つ蛋白質、または（ｃ
）約４５キロドルトンの見掛けの平均分子量を持ち、マ
スト細胞の増殖を刺激する機能を持つ増殖因子から成る
、製薬的組成物。
（１９）増殖因子が約１００μｇから１００ｍｇ単位投
与量であることを特徴とする、特許請求の範囲第１８項
に記載の製薬的組成物。
（２０）増殖因子が治療すべき細胞と結合するところの
標的物質に付着していることを特徴とする、特許請求の
範囲第１８項に記載の製薬的組成物。
（２１）標的物質が治療すべき細胞と結合するところの
抗体であることを特徴とする、特許請求の範囲第２０項
に記載の製薬的組成物。
（２２）細胞を哺乳動物増殖因子と接触させ、その増殖
因子は（ａ）約１４キロドルトンの分子量を持ち、また
ＢおよびＴリンパ球の増殖を刺激する機能を有する蛋白
質、（ｂ）約５０キロドルトンの分子量を持ち、またＢ
リンパ球の増殖を刺激する機能を有する蛋白質、または
（ｃ）約４５キロドルトンの見掛け上の平均分子量を持
ち、またマスト細胞の増殖を刺激する機能を有する増殖
因子からなる、細胞の増殖を増進する方法。
（２３）増殖因子が治療すべき細胞と結合するところの
標的物質に付着していることを特徴とする、特許請求の
範囲第２２項に記載の方法。
（２４）標的物質が治療すべき細胞と結合するところの
抗体であることを特徴とする、特許請求の範囲第２３項
に記載の方法。