JPS6131096A - ビリルビンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１を用い
て、被検液例えば体液中のビリルビンを定量する方法に
関する。

〔従来の技術〕

従来、体液中のビリルビンの定量法としては、ジアゾス
ルファニル酸の如きジアゾニウム塩を用いるジアゾ法と
いう化学的測定法が主番ごもちいられている（金井泉、
金井正光共著、臨床検査法提要、第２８版、第Ｍ−２４
頁、昭和５３年、金属出版発行）。しかしながらかかる
化学的測定法では反応の特異性、操作の煩雑性、試薬の
刺激腐食性などの欠点があり、自動分析装置への導入、
維持、管理および正確な測定などの点で多くの問題があ
ることが指摘されている。

また、最近、ビリルビンΦオキシダーゼを用いて体液中
のビリルビンを定量する方法が開発されつつある。特公
昭５８−１１１９４号にアガリカス・ビスポーラス（Ａ
ｇａｒｉｃｕａ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）から調製したビリ
ルビン特異性菌性酵素組成物がビリルビンと特異的に反
応して色変化を生じる作用を有するとの記載がある。該
酵素組成物とビリルビンの反応において、過酸化水素は
該酵素組成物の調製法により生成する場合と生成しない
場合がある。それ故、該酵素組成物をビリルビン含有被
検体に作用させ、過酸化水素生成量からあるいはビリル
ビンの変化を光学的に測定することからビリルビンを定
量する方法が提案されているが、該酵素組成物のビリル
ビンに対する反応が単一の酵素によって触媒されるのか
、あるいは複数の酵素系によって触媒されるのか非常に
不明確である。また、ビリルビンに対する該酵素組成物
の性質も充分に記載されていないのでビリルビンの定量
に有利な方法であるとはいい難い。また特開昭５９−１
７９９９号には、ミロセシウム属の生産するビリルビン
・オキシダーゼ（このビリルビン・オキシダーゼについ
ては特開昭５８−１４１７８３号参照）を用いて体液中
のビリルビンを定量する場合、該酵素単独では血清中の
ビリルビンの存在形態の中のアルブミン結合型ビリルビ
ンに作用しないため、反応促進剤として界面活性剤、好
ましくはコール酸ナトリウムを添加した状態で、ビリル
ビンの変化を光学的に測定し、ビリルビンを定量する方
法が報告されてい局。本発明者らは先に担子菌、エビタ
ケ（Ｔｒａｃｈｙｄｅｒｍａ　ｔｓｕｎｏｄａｅ）の生
産する新規とりルピン・オキシダーゼＭ−１（特願昭５
８−２１８８９５号参照）を含有するビリルビン用試薬
組成物をビリルビン含有被検液に作用させ、それにより
生じるビリルビンの変化を光学的に測定するビリルビン
の定量方法について提案した（特願昭５９−１０５６０
４号）。該方法は反応促進剤無添加でもビリルビンの定
量が可能である点および反応促進剤を使用する場合コー
ル酸ナトリウムより約１３倍効果の高いデオキシコール
酸ナトリウムを用いる点で従来法より優れている。

上記酵素法は反応の特異性による正確な定量が可能であ
る点で化学的方法より優れた方法であるが、臨床診断方
法としての性格上、より迅速な測定方法の開発が望まれ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、被検液中のビリルビンの新規定量法の
開発にあり、新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１を用
いて、迅速にそして正確かつ簡単にビリルビンを定量す
る方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明はビリルビンの定量方法に
関する発明であって、ビリルビン含有被検液に３−メチ
ル−２−ベンゾチアゾリノン−ヒドラゾン（以下ＭＢ　
ＴＨと略記する）および新規ビリルビン・オキシダーゼ
Ｍ−１を作用させた後、酸性にして生成する青色色素を
光学的に測定することよりなる。本発明者らはビリルビ
ンの定量方法について鋭意検討を重ねた結果、新規ビリ
ルビン・オキシダーゼＭ−１がＭＢＴＨとビリルビンと
の縮合反応を触媒し、生成する縮合物質を酸性条件下比
色定量することによりビリルビンの定量が可能であるこ
とおよび新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１の存在下
、ＭＢＴＩ（とビリルビンの縮合反応がビリルビンの酸
化よりも迅・速に進、行することを見い出した。

まず、本発明に使用される新規ビリルビン・オキシダー
ゼＭ−１の各性質を示す。

新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１の酵素化学的およ
び理化学的性質 （１）作用： 本酵素は、酸素の存在下、ビリルビン（アルブミン結合
型、グルクロン酸結合型、遊離型）を醗化し、ビリベル
ジンを生成し、さらに淡緑色物質、淡赤色物質を経て、
はぼ無色の物質を生成する作用を有するが、過酸化水素
を生成しない。

（２）基質特異性： ビリルビンに作用する。ビリベルジンにも作用するが、
ビリルビンの酸化速度の約１２％である。またヒドロキ
ノン、ピロカテコール、パラ−フェニレンジアミン、ピ
ロガロール、４−アミノアンチピリンおよびモノフェノ
ールに作用する。ヘミン、ビタミンｌ１ｔｔおよびヘモ
グロビンには全く作用しない。

（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性： 本酵素の至適ｐＨは５．５付近にあり、また３７°Ｃに
おいて、それぞれのｐＨで６０分間処理したときｐＨ５
〜ｐＨ９の間で安定である。

（４〕至適温度および熱安定性： 本酵素の至適温間は５０°Ｃ付近にあり、ｐＨ７，０に
おいて、それぞれの温度で１０分間処理したとき５５”
Ｃまで安定である。

（５）分子ｌｉｔ： 本酵素の分子社は、セファクリルＳ−２００（ファルマ
シア製）によるゲル濾過法では約８３０００である。

（６）均一性： ７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ９，４）を用い
てディスク電気泳動を行ない、タンパク染色と活性染色
を行なった。１本のタンパクの染色帯が認められ単一で
あった。また、本酵素は４−アミノアンチピリンとフェ
ノールを定遺的に赤色に発色させる作用を有しているた
め活性染色を行なうとタンパクの染色帯と同じ位置に赤
色のバンドが認められた。

（７）等電点： ファルマライト（ｐＨ３〜ｐＨ１０、ファルマシア製）
を用いた焦点電気泳動法により求めると本酵素の等電点
は３．９２±０．０５である。

（８）金属イオン、阻害剤などの影響：本酵素はＬ−ア
スコルビン酸、アジ化＋　）　ＩＪウム、ジチオスレイ
トール、シアン化カリウム、■、−システィン、ＥＤＴ
Ａ１Ｆθ′＋などによって阻害される（第１表）。

第　　　　１　　　　表 添　　加　　物　　　　　　　　　　　　　　阻害率（
（６）Ｌ−アスフルビ７１！！　　　　　　（１ｍＭ）
　　　　　　１００アジ化ナトリウム　　　　　　　Ｃ
ｒｔ＞　　　　　　　６０（５ｍＭ）　　　　　　１０
０ ジチオスレイトール　　　　　（１ｍＭ　）　　　　　
　　８６シアン化カリウム　　　　　　　（ｐ）　　　
　　　　　８４Ｌ−システィン　　　　　　　　（ｔｔ
）　　　　　　　７４゜ＤＴＡ　　　　　　　　　　　
　　Ｃｒｙ）　　　　　　　５９１・。什　　　　　　
　　　　　　　（＝）　　　　　　　５７還元型グルタ
チオン　　　　　（〃）　　　　　　　３８０−フェナ
ントロリン　　　　Ｃ１／）３４２−メルカプトエタノ
ール　　（〃）３１α、Ｃ１−ジピリジル　　　　　（
＃）　　　　　　　３０ヨード酢酸　　　　　　　　　
　（ｔｔ）　　　　　　　１０（９）可視部吸収スペク
トル： 本酵素溶液の可視部吸収スペクトルを測定したところ、
６１０ｎｍに吸収極大が認められブルータンパクであっ
た。

（１０）糖含量ニ ア、５％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ９，４）を用い
て、ディスク電気泳動を行ない、ＰＡＳ染色ｔ′ 〔アナリテイ力ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第３０巻第１４８頁（１９６９年）
〕を行なったところ、タンパク染色位置と同一部分が染
色され′た。このことより、本酵□素は糖を含む糖タン
パクである。糖含量をフェノール硫酸法で測定すると約
４．５％である。

（１１）調合ｌｔ： 原子吸光分析機を用いて、本酵素中の銅の定量を行なっ
たところ、酵素１モルに対して４モルの銅が含まれてい
た。

（１２）酵素活性測定法： 酵素活性の測定はビリルビンの４６０　ｎｍの吸収の減
少より求めた。１０ち、オメガ高ビリルビンコントロー
ル血清（米国ハイランド社製）０１ｍｌ、リン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）３００フィクロモルおよび適当に希釈し
た酵素液０．１　ｍＪ、反応液量３０ｍ／で３７°Ｃ１
１０分間反応させ、ビリルビンに基づ＜４６０ｎｍの吸
収減少を測定した。新曳ビリルビンーオキシダーゼＭ−
１の１単位は上記反応系で１分間に１マイクロモルのビ
リルビンを酸化する酵素量として表示した。

以上本発明に使用する新規ビリルビン・オキシダーゼＭ
−１を従来のビリルビン・オキシダーゼと比較すると、
第２表のごとくである。

なお新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１の製造方法に
ついては特願昭５８−２１８８９５号に記載されている
。

ビリルビンの定量法 本発明者らは、体液中のビリルビンの定量方法について
鋭意検討を重ねた結果、新規ビリルビン・オキシダーゼ
Ｍ−１がさらに、ＭＢＴＨとビリルビンとの酸化縮合を
触媒することを見出した。本発明に従えば、上記の性質
を利用してビリルビン含有被検液、例えば血清および尿
など体液中のビリルビンを定量することができる。

例えば血清などの検体１０〜１０　ａｐｌ−にＭＥＴＨ
ｏ、　１〜３マイクロモル、ｐＨ５，０〜７．０の緩衝
液および新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１、ｏ、ｏ
ｏｓ〜０．１単位を加えて、２０〜４０°Ｃ１好ましく
は３７°Ｃで１〜２０分間、好ましくは３〜６分間反応
させると、５２０ｎｍおよび５５０ｎｍ付近に極大吸収
をもつ赤色色素を生成する。

この赤色色素は酸性条件下、例えば塩酸または硫酸酸性
下の条件では（ｉｌＱｎｍに極大吸収をもちかつ分子吸
光係数が大きい青色色素に変換するので、この青色色素
を６１０ｎｍで測定することにより検体中のビリルビン
を定量することができる。

例えば、オメガ高ビリルビンコントロール血清（２０■
／ｄｔ）　（米国ハイランド社製）１００ｐｔに、ＭＢ
ＴＨ１マイクロモル、０．３Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５
，５）１．９ＷＬｌおよび新規ビリルビン−オキシダー
ゼＭ−１０，０５単位を加えて、総液量２．０−で、３
７°Ｃ１５分間反応させると、５２０ｎｍおよび５５０
ｎｍ付近に極大吸収をもつ赤色色素を生成する。この物
質にＩＮのＨｏｔｌ、０−を添加し、酸性下の条件にす
ると６１０ｍｍに極大吸収をもちかつ分子吸光係数が大
きい青色色素が生成する（第１図参照）。すなわち第１
図は、波長（ｎ）（横軸）とｒＭ光度（縦軸）との関係
で示したグラフであり、第１図において赤色色素の吸収
スペクトルは点線で青色色素の吸収スペクトルを実線で
示す。

〔実施例〕

以下に本発明によるビリルビンの定量方法を実施例をも
って示すが１本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。

実施例　１ ５η／ｄｔ、１０η７’ａｚ、ｘｓ■／ａｔ、２０ｙａ
ｐ　／　ｄｔの各ビリルビン溶液〔アルブミン結合瓢箪
−化学薬品（株）製〕を調整し、この各溶液０．１肩ｌ
に０．３Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，５）１．０ｗｔ１
．　ｌ　ＯｍＭのＭＢＴＨＱ、　Ｉ　ｍｌおよび新規ビ
リルビン・オキシダーゼＭ−１０，０５単位を加え、各
々総液量を２．　ＯＷｌｌとし、３７°Ｃ１５分間反応
させた後、ＩＮのＨｏｔ　　１、Ｏｔｔｒｌを添加して
６１０ｎｍの吸光度（ＯＤサンプル）を測定する。別に
対照として各ビリルビン溶液で新規ビリルビン・オキシ
ダーゼＭ−１無添加の場合の６１０ｎｍの吸光１１ｉ（
ＯＤブランク）を測定し、△ＯＤａ＋ｏ　（ＯＤサンプ
ル−〇Ｄブランク）を求めた。結果を第２図に示す。す
なわち第２図は、検量線をビリルビン濃度Ｃ”ｉ／ｄｔ
）（横軸）と吸光度差（八〇Ｄｓ＋ｏ）（縦軸）との関
係で示したグラフである。

第２図から明らかなように本発明に使用される新規ビリ
ルビン・オキシダーゼＭ−１を用いれば体液中のビリル
ビンを６１０ｎｍにおける吸光度から正確に測定するこ
とが可能である。

実施例　２ 実施例１に用いたビリルビン〔アルブミン結合型、第一
化学薬品（株）製〕の代りにオメガ高ビリルビンコント
ロール血清（米国ハイランド社製）を用い、同様にビリ
ルビンの希釈系列を調整し、実施例１と同様に反応を行
ない、ΔＱＤａ＋・を求め検量線を作成した。結果を第
３図に示す。すなわち第３図は検量線をビリルビン濃度
（”Ｐ／ｄ／Ｓ）（横軸）と吸光度差（ΔＯＤｓ＋ｏ　
）（縦軸）との関係で示したグラフである。

〔発明の効果〕

以上説明したとおり、本発明により新規ビリルビン・オ
キシダーゼＭ−１およびＭＢＴＨを用いるビリルビンの
新規定量法が提供される。本発明の方法は被検液中のビ
リルビンを、迅速に正確かつ簡単に定量できるという顕
著な効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１ｖ！Ｊは新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１によ
るビリルビンとＭＢＴＨの反応生成物（赤色色素）の吸
収スペクトル（無線）と塩酸酸性下生成した青色色素の
吸収スペクトル（実線）を示したグラフである。 １２図は本発明の定量方法の実施例１における検量線を
ビリルビン濃度と吸光度との関係で示したグラフである
。 第３図は実施例２における検量線をビリルビン濃度と吸
光度との関係で示したグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ビリルビン含有被検液に３−メチル−２−ベンゾチ
   アゾリノン−ヒドラゾンおよび新規ビリルビン・オキシ
   ダーゼＭ−１を加え反応を行なわせ、次いで反応液を酸
   性とした後、光学的にビリルビンを定量することを特徴
   とするビリルビンの定量法。