JPS6146117B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6146117B2 JPS6146117B2 JP52089347A JP8934777A JPS6146117B2 JP S6146117 B2 JPS6146117 B2 JP S6146117B2 JP 52089347 A JP52089347 A JP 52089347A JP 8934777 A JP8934777 A JP 8934777A JP S6146117 B2 JPS6146117 B2 JP S6146117B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lysine
- enzyme
- present
- reagent
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はＬーリジンの微量分析用試薬に関する
ものである。 本発明の目的は、たんぱく系食品、天然物、生
体試料、臨床検査用検体、化学反応生成物、培養
液などに含有されるＬーリジンの定量分析用試薬
を提供することにある。 本発明試薬の特徴は、Ｌーリジンに特異性の高
いＬーリジン−αケトグルタール酸ε−トランス
アミナーゼ（Ｅ，Ｃ，class ２，６，１，36）を
利用して他のアミノ酸の存在下でも、Ｌーリジン
のみを簡単な操作で、短時間に、しかも極めて正
確に比色定量するところにある。 従来、リジンの定量方法としては、マイクロバ
イオアツセイ法や、クロマトグラフイー・ニンヒ
ドリン法、およびリジン脱炭素酵素を用いる検圧
法などがあるが、マイクロバイオアツセイ法とニ
ンヒドリン法は、Ｄ−およびＬーリジン双方に反
応する欠点を有しているし、検圧法は操作が非常
に繁雑である。 本発明者らは、上記の欠点を有しない、Ｌーリ
ジンのみを正確に定量できて、しかも操作が簡便
な比色定量法に用いる分析用試薬について種々、
研究を重ねた結果、Ｌーリジンのみに特異的に作
用するＬーリジン−α−ケトグルタール酸ε−ト
ランスアミナーゼを含有する本発明試薬を利用す
ることにより、Ｌーリジンを高精度で定量できる
ことを見出して、本発明を完成した。 詳しくは、本発明は、Ｌーリジンを含有する分
析対象物に、該酵素含有液と充分量のα−ケトグ
ルタール酸を作用させて、その酵素作用により、
α−アミノアジピン酸δ−セミアルデヒドとＬ−
グルタミン酸とを生成する。生成したα−アミノ
アジピン酸δ−セミアルデヒドは不安定なため
に、脱水してΔ１−ピペリジン−６−カルボン酸
になる。このΔ１−ピペリジン−６−カルボン酸
は、発色試薬としてオルト−アミノベンズアルデ
ヒドが存在すると、オレンジ色の吸収極大465nm
の呈色物質を生成するので、この呈色物質を比色
定量すると元の分析対象物中のＬーリジンが定量
できる。 これを化学反応式を用いて説明すれば次のよう
になる。
ものである。 本発明の目的は、たんぱく系食品、天然物、生
体試料、臨床検査用検体、化学反応生成物、培養
液などに含有されるＬーリジンの定量分析用試薬
を提供することにある。 本発明試薬の特徴は、Ｌーリジンに特異性の高
いＬーリジン−αケトグルタール酸ε−トランス
アミナーゼ（Ｅ，Ｃ，class ２，６，１，36）を
利用して他のアミノ酸の存在下でも、Ｌーリジン
のみを簡単な操作で、短時間に、しかも極めて正
確に比色定量するところにある。 従来、リジンの定量方法としては、マイクロバ
イオアツセイ法や、クロマトグラフイー・ニンヒ
ドリン法、およびリジン脱炭素酵素を用いる検圧
法などがあるが、マイクロバイオアツセイ法とニ
ンヒドリン法は、Ｄ−およびＬーリジン双方に反
応する欠点を有しているし、検圧法は操作が非常
に繁雑である。 本発明者らは、上記の欠点を有しない、Ｌーリ
ジンのみを正確に定量できて、しかも操作が簡便
な比色定量法に用いる分析用試薬について種々、
研究を重ねた結果、Ｌーリジンのみに特異的に作
用するＬーリジン−α−ケトグルタール酸ε−ト
ランスアミナーゼを含有する本発明試薬を利用す
ることにより、Ｌーリジンを高精度で定量できる
ことを見出して、本発明を完成した。 詳しくは、本発明は、Ｌーリジンを含有する分
析対象物に、該酵素含有液と充分量のα−ケトグ
ルタール酸を作用させて、その酵素作用により、
α−アミノアジピン酸δ−セミアルデヒドとＬ−
グルタミン酸とを生成する。生成したα−アミノ
アジピン酸δ−セミアルデヒドは不安定なため
に、脱水してΔ１−ピペリジン−６−カルボン酸
になる。このΔ１−ピペリジン−６−カルボン酸
は、発色試薬としてオルト−アミノベンズアルデ
ヒドが存在すると、オレンジ色の吸収極大465nm
の呈色物質を生成するので、この呈色物質を比色
定量すると元の分析対象物中のＬーリジンが定量
できる。 これを化学反応式を用いて説明すれば次のよう
になる。
【表】
本発明に使用する前記の酵素は、該酵素生産能
を有するアクロモバクタ−リクイダム
（Achromobacter liquidum）IFO 3084，フラボ
バクテリウム フスカム（Flavobacterium
fuscum）IFO 12997，フラボバクテリウム フ
ラベセンス（Flavobacterium flavescens），のう
ち、いずれか１種又は２種以上の菌種を液体培養
し、その菌体より該酵素を採取するが、本発明者
の一人は、すでにアクロモバクタ−リクイダムか
ら単離・精製結晶化に成功している。
（Biochemistry ７，4102〜4109，4110〜4119
（1968））。 このようにして製造された該酵素は、純粋に結
晶化された世界最初の例であり、当然のことなが
らこの結晶酵素を用いる本発明の定量分析用試薬
は、該酵素の基質となるＬーリジンを単独に定量
的に測定することを可能にした世界最初のＬーリ
ジンの分析用試薬である。 次に該酵素を用いるＬーリジンの定量操作につ
いて説明する。 本発明に使用する該酵素は、精製結晶化した標
品でもよいし、部分精製酵素でも合目的に使用で
きる。 本発明試薬を用いる場合の反応温度は、該酵素
最適温度、30〜40℃とりわけ37℃が望ましい。そ
の反応時間は、該酵素の必要反応時間40分間が望
ましく、そのPHは、該酵素の最適PH7.5〜8.5とり
わけPH８が望ましい。 本発明試薬によるＬーリジン塩酸塩の定量可能
範囲は標準的な反応液組成物の場合、0.05〜２μ
molesであり、この範囲内において、Ｌーリジン
の量と吸光度の間には直線関係が成立する。 本発明に用いる標準的な反応液組成物の場合、
α−ケトグルタール酸は充分量を添加する必要が
あり、Ｌーリジン塩酸塩の定量範囲0.05〜２μ
molesの場合は、α−ケトグルタール酸は20μ
molesを添加するのが望ましい。 本発明に使用する該酵素は、補酵素として、ピ
リドキサール−５−燐酸を必要とするので、反応
液組成物には、必要量のピリドキサール−５−燐
酸を添加する。 更に反応液組成物には、発色試薬としてオルト
ーアミノベンズアルデヒドを存在させることが必
須であり、0.2M燐酸カリウム緩衝液（PH８）に
溶解したオルトーアミノベンズアルデヒドを必要
量添加する。 反応液のPHは、0.2M燐酸カリウム緩衝液でPH
８に保つ。必要な反応時間が経過後は、反応を停
止させるために、50％トリクロール酢酸液を必要
量添加する。反応の結果、分析対象物中に元来存
在していたＬーリジンの量に比例して、呈色物質
が生成する。この呈色物質は吸収極大465nmであ
り、オレンジ色である。これを分光光度計を用い
て465nmで吸収を測定することにより、分析対象
物中のＬーリジンの量を定量できる。 以下実施例によつて本発明の分析用試薬を用い
た比色定量反応の操作を説明する。 実施例 酵素反応液の組成を下記第１表の如く調整す
る。
を有するアクロモバクタ−リクイダム
（Achromobacter liquidum）IFO 3084，フラボ
バクテリウム フスカム（Flavobacterium
fuscum）IFO 12997，フラボバクテリウム フ
ラベセンス（Flavobacterium flavescens），のう
ち、いずれか１種又は２種以上の菌種を液体培養
し、その菌体より該酵素を採取するが、本発明者
の一人は、すでにアクロモバクタ−リクイダムか
ら単離・精製結晶化に成功している。
（Biochemistry ７，4102〜4109，4110〜4119
（1968））。 このようにして製造された該酵素は、純粋に結
晶化された世界最初の例であり、当然のことなが
らこの結晶酵素を用いる本発明の定量分析用試薬
は、該酵素の基質となるＬーリジンを単独に定量
的に測定することを可能にした世界最初のＬーリ
ジンの分析用試薬である。 次に該酵素を用いるＬーリジンの定量操作につ
いて説明する。 本発明に使用する該酵素は、精製結晶化した標
品でもよいし、部分精製酵素でも合目的に使用で
きる。 本発明試薬を用いる場合の反応温度は、該酵素
最適温度、30〜40℃とりわけ37℃が望ましい。そ
の反応時間は、該酵素の必要反応時間40分間が望
ましく、そのPHは、該酵素の最適PH7.5〜8.5とり
わけPH８が望ましい。 本発明試薬によるＬーリジン塩酸塩の定量可能
範囲は標準的な反応液組成物の場合、0.05〜２μ
molesであり、この範囲内において、Ｌーリジン
の量と吸光度の間には直線関係が成立する。 本発明に用いる標準的な反応液組成物の場合、
α−ケトグルタール酸は充分量を添加する必要が
あり、Ｌーリジン塩酸塩の定量範囲0.05〜２μ
molesの場合は、α−ケトグルタール酸は20μ
molesを添加するのが望ましい。 本発明に使用する該酵素は、補酵素として、ピ
リドキサール−５−燐酸を必要とするので、反応
液組成物には、必要量のピリドキサール−５−燐
酸を添加する。 更に反応液組成物には、発色試薬としてオルト
ーアミノベンズアルデヒドを存在させることが必
須であり、0.2M燐酸カリウム緩衝液（PH８）に
溶解したオルトーアミノベンズアルデヒドを必要
量添加する。 反応液のPHは、0.2M燐酸カリウム緩衝液でPH
８に保つ。必要な反応時間が経過後は、反応を停
止させるために、50％トリクロール酢酸液を必要
量添加する。反応の結果、分析対象物中に元来存
在していたＬーリジンの量に比例して、呈色物質
が生成する。この呈色物質は吸収極大465nmであ
り、オレンジ色である。これを分光光度計を用い
て465nmで吸収を測定することにより、分析対象
物中のＬーリジンの量を定量できる。 以下実施例によつて本発明の分析用試薬を用い
た比色定量反応の操作を説明する。 実施例 酵素反応液の組成を下記第１表の如く調整す
る。
【表】
【表】
以上の反応液組成物1.4mlを、そのまゝ遠心分
離できる試験管に入れ、37℃で40分間酵素反応を
おこない、50％トリクロール酢酸0.1mlを加えて
のち、遠心分離にかけて、その上澄の吸光度を
465nmで分光光度計を用いて測定する。 あらかじめ既知量のＬーリジン塩酸塩により作
成した検量線と対比して、分析対象物中のＬーリ
ジンの含量を知る。 測定結果を下記の第２表に示す。
離できる試験管に入れ、37℃で40分間酵素反応を
おこない、50％トリクロール酢酸0.1mlを加えて
のち、遠心分離にかけて、その上澄の吸光度を
465nmで分光光度計を用いて測定する。 あらかじめ既知量のＬーリジン塩酸塩により作
成した検量線と対比して、分析対象物中のＬーリ
ジンの含量を知る。 測定結果を下記の第２表に示す。
【表】
更に本発明試薬の高い分析精度と正確な再現性
を証明するために、回収試験（Recovery Test）
を実施した。 即ち、天然物（微生物培養液）に既知量のＬー
リジン・HC1を添加した区と、添加しない区とに
ついて、Ｌーリジンの量を本分析試薬を用いて測
定した結果、リカバリーは98.4％であつた。
を証明するために、回収試験（Recovery Test）
を実施した。 即ち、天然物（微生物培養液）に既知量のＬー
リジン・HC1を添加した区と、添加しない区とに
ついて、Ｌーリジンの量を本分析試薬を用いて測
定した結果、リカバリーは98.4％であつた。
Claims (1)
- １ Ｌーリジン−α−ケトグルタール酸−ε−ト
ランスアミナーゼ、α−ケトグルタール酸、ピリ
ドキサール燐酸及びオルトーアミノベンズアルデ
ヒドを含有することを特徴とするＬーリジンの分
析用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8934777A JPS5424691A (en) | 1977-07-27 | 1977-07-27 | Reagent for analyzing lllysin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8934777A JPS5424691A (en) | 1977-07-27 | 1977-07-27 | Reagent for analyzing lllysin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5424691A JPS5424691A (en) | 1979-02-24 |
| JPS6146117B2 true JPS6146117B2 (ja) | 1986-10-13 |
Family
ID=13968164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8934777A Granted JPS5424691A (en) | 1977-07-27 | 1977-07-27 | Reagent for analyzing lllysin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5424691A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6057838A (ja) * | 1983-09-09 | 1985-04-03 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | ハロゲン化銀カラ−写真感光材料 |
-
1977
- 1977-07-27 JP JP8934777A patent/JPS5424691A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5424691A (en) | 1979-02-24 |
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