JPS6146479B2

JPS6146479B2 -

Info

Publication number: JPS6146479B2
Application number: JP11805082A
Authority: JP
Inventors: Sakanori Ideie; Mieko Amaya; Kaoru Nojiri; Seiichiro Igarashi
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1982-07-07
Filing date: 1982-07-07
Publication date: 1986-10-14
Also published as: JPS5911190A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なオリゴ糖、その製造法及び該
オリゴ糖を活性成分とするビフイドバクテリウム
菌の増殖促進剤に関する。ビフイドバクテリウム菌（以下ビフイズス菌と
称する）は、人腸内に生育する有用細菌であつ
て、その生理的活性として腸内の腐敗抑制作用、
ビタミンB₁及びB₂の合成能及びタンパク質代謝
作用等が知られている。したがつて、生体内にお
けるビフイズス菌の増殖を促進する物質の提供が
強く要望されている。従来、ビフイズス菌の増殖を促進する物質（以
下ビフイズス増殖因子と称する）について多くの
研究がなされており、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン、人参エキス、ラクチユロース等がビフイ
ズス増殖因子として知られている。しかしながら、これらのビフイズス増殖因子の
効果についてはその多くはin vitroで確認された
ものであつて、in vivoでの効果については未確
認かもしくは極めて不十分である。本発明者は上述したような現状に鑑み、生体内
で優れた活性を示すビフイズス増殖促進物質につ
いて検討した結果、新規なオリゴ糖が上記活性を
示すことの知見を得て本発明をなすに至つた。したがつて、本発明は、生体内で活性を示すビ
フイズス増殖因子としてのオリゴ糖、その製造法
及び該オリゴ糖を活性成分として含有するビフイ
ズス増殖促進剤を提供することを目的とする。以下本発明を詳しく説明する。本発明におけるビフイズス増殖因子としてのオ
リゴ糖は、一般式 β−Ｄ−Gal−（１→４）−〔｛β−Ｄ −GlcNAc−（１→４）｝ｎ−β−Ｄ −GlcNAc−（１→２）〕−Ｄ−Glc （）（式中GlcNAcはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
を表わし、Galはガラクトースを表わし、Glcは
グルコースを表わす。ｎは０又は１〜３の整数を
表わす）で示される新規物質であつて、各式（
〜）で示されるオリゴ糖を包含する。式で示される（上記一般式（）でｎ＝０のもの）
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−〔２−
アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１→２）〕−Ｄ−グルコース。式で示される（上記一般式（）でｎ＝１のもの）
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−〔２−
アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デ
オキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）〕
−Ｄ−グルコース。式で示される（上記一般式（）でｎ＝２のもの）
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−〔２−
アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デ
オキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グル
コピラノシル−（１→２）〕−Ｄ−グルコース。式で示される（上記一般式（）でｎ＝３のもの）
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−〔２−
アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１−４）−２−アセトアミド−２−デ
オキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グル
コピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２
−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
２）〕−Ｄ−グルコース。これらのオリゴ糖の理化学的性質を示すと次の
とおりである。理化学的性質： (1) 溶剤に対する溶解性式（）〜（）の各オリゴ糖とも水に可溶
性であるが、アセトン、クロロホルム及びベン
ゼンに不溶であり、含水アルコールには難溶性
である。 (2) 呈色反応式（）〜（）の各オリゴ糖ともアニリ
ン・ジフエニルアミン反応及びアンモニア・硝
酸銀反応では陽性を示し、ニンヒドリン反応及
び塩化２・３・５−トリフエニルテトラゾリウ
ム−苛性ソーダ反応では陰性を示す。 (3) 色調上記各オリゴ糖は乾燥粉末の形態でいずれも
白色を呈する。 (4) 酸性、塩基性、中性の別上記各オリゴ糖はいずれも中性である。本発明に係るオリゴ糖は、キチンと乳糖又は乳
糖含有物との混合物もしくはキチンの部分加水分
解物と乳糖又は乳糖含有物との混合物に、キチン
及びキチンの部分加水分解物に対して加水分解能
を有する酵素を作用させることにより調製し得
る。ここで出発物質として用いるキチンは動物界
に広く存在する多糖類の一種であつて、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンがβ−１・４で結合した
直鎖分子から成る。本発明では市販のキチンを濃
塩酸に溶解した後、これに大量の水を加えて沈殿
させて得られるコロイダルキチンを用いることが
好ましい。又、本発明では、キチンのほかに、キチンの部
分加水分解物も出発原料として使用し得る。この
キチンの部分加水分解物は、濃塩酸に溶解したキ
チンを、40℃で２〜３時間加水分解後、アルカリ
で中和し、生成した分解物を活性炭に吸着させた
後、アルコールで溶出することにより調製し得
る。このようにして調製したキチンの部分加水分
解物は、２〜10分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンが結合したオリゴ糖を含む。本発明で一方の出発原料として用いる乳糖はガ
ラクトースとグルコースがβ−１・４で結合した
２糖類であつて、市販品をそのまま用いることが
でき、更に全乳、脱脂乳のような乳糖を一成分と
して含有する物質も上記出発原料として使用し得
る。本発明で上記両方の出発原料の混合物の加水分
解に用いる酵素は、キチン又はキチンの部分加水
分解物に対して加水分解能（活性）を有するもの
であればよく、このような酵素としては、卵白か
ら調製したリゾチーム、微生物から調製したキチ
ナーゼ及び細胞壁溶解酵素等が有効に使用し得
る。本発明で上記出発原料としての混合物に上記酵
素を作用させるには、キチンを２〜10重量％と乳
糖10〜50重量％を含むもの、或はキチンの部分加
水分解物10〜50重量％と乳糖10〜50重量％を含む
ものをそれぞれ基質とし、基質のPHを３〜７に調
整し、これに酵素を５〜20mg/mlの濃度で作用さ
せるとよい。酵素を作用させる反応温度は20〜50
℃が適当であり、又反応時間は、反応混合物中の
オリゴ糖の収量に大きく影響するので、実験に基
いてコントロールすることが望ましい。上記酵素
反応を所望時間行つた後は、得られる反応混合物
を90℃以上の温度で２〜30秒間加熱して反応を停
止させる。上記酵素反応によりキチン又はその部分加水分
解物から遊離した〔β−Ｄ−GlcNAc〕_o（ただ
し、GlcNAcはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
を、ｎは１〜４の整数を表わす）の一部が乳糖に
転移して前記一般式（）のオリゴ糖が生成す
る。因みに、キチンの酵素による糖転移反応によつ
て得られるオリゴ糖についての報告は未だ見当ら
ない。このようにして得られる反応混合物は、そのま
ま濃縮後乾燥して粉末化することによりビフイズ
ス増殖因子として適用し得るが、活性成分である
オリゴ糖の濃度を高めるために、上記反応混合物
を粉末化に先立つて精製してもよい。この精製には種々の方法が適用でき、例えば反
応混合物を、水で平衡化処理した活性炭のカラム
に通して該反応混合物中のオリゴ糖を活性炭に吸
着させ、次いでアルコール水溶液で吸着オリゴ糖
を溶出させるとよい。上述のようにして得られるオリゴ糖の分析例を
示すと添付の第１図のとおりである。第１図は標
準的な条件下での製造法を例示した後記実施例１
により得られた反応混合物についての薄層クロマ
トグラフを示したものであつて、同図にみられる
ように４種類（式（）〜式（）のオリゴ糖）
の転移オリゴ糖が確認される。この各オリゴ糖を高速クロマトグラフイにより
分離、精製後マススペクトルにより分子量測定
と、塩酸加水分解により構成糖測定を行つた結果
を表１に示す。

【表】表１にみられるごとく、上記反応混合物には、
乳糖に１分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
が結合した３糖類（式（）のオリゴ糖）、乳糖
に２分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが結
合した４糖類（式（）のオリゴ糖）、乳糖に３
分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが結合し
た５糖類（式（）のオリゴ糖）及び乳糖に４分
子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが結合した
６糖類（式（）のオリゴ糖）の存在が確認され
る。因みに、本発明の製造法により得られる上記反
応混合物中のオリゴ糖の種類及び生成量は、使用
する出発物質及び製造条件によつて変動するが、
前記式（）〜（）で示されるオリゴ糖の少く
とも１種が生成するこれらのオリゴ糖は前記一般式（）で示さ
れ、その各構成糖の結合様式については、式
（）のオリゴ糖をメチル化分析することによつ
て２・３・４・６−テトラ−Ｏ−メチル−Ｄ−ガ
ラクチトールと３・６−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−グ
ルシトールという２種のアルジトールアセテート
が検出されたことから解析した。GlcNAcと乳糖
の結合位置については、３・６−ジ−メチル−Ｄ
−グルシトールのアセチル化部分がそれを示して
いる。すなわち、第１位の炭素は還元末端となつ
ており、第４位の炭素はガラクトースとβ−１→
４結合してラクトースを形成し、第５位の炭素は
ピラノース環を形成し、第２位の炭素はGlcNAc
と結合していることから、GlcNAcと乳糖のグル
コース間がβ−（１→２）結合していることを示
す。又、式（）〜（）の各オリゴ糖のGlcNAc
間の結合については、これらオリゴ糖を部分加水
分解したものについて薄層クロマトグラフイで処
理したところ、キトビオース（GlcNAc）₂、キト
トリオース（GlcNAc）₃及びキトテトラオース
（GlcNAc）₄がそれぞれ確認されたので、上記
GlcNAc間はβ−（１→４）結合であることが分
る。本発明に従つて得られる前記一般式（）で示
されるオリゴ糖のビフイズス増殖因子としての特
徴は、生体内で顕著な増殖促進作用を示すことで
ある。本発明による上記オリゴ糖は、ビフイドバクテ
リウム菌の種類に関係なく優れた増殖作用を示す
ものであつて、例えばビフイドバクテリウム・ブ
リーベ、ビフイドバクテリウム・ロンガム、ビフ
イドバクテリウム・ビフイダム、ビフイドバクテ
リウム・インフアンテイス、ビフイドバクテリウ
ム・アドレスセンテイス等の人腸内定着性ビフイ
ドバクテリウム菌に対して活性を示す。本発明による上記オリゴ糖は前述したように、
それを含有する反応混合物をそのまま乾燥粉末化
してビフイズス増殖因子として適用し得るが、ま
た、粉乳、発酵乳のような飲食物に添加して、さ
らには経口薬剤の一成分として添加して適用する
ことも可能である。以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。実施例１乳糖100ｇとキチンを濃塩酸を用いて40℃で２
時間部分加水分解して得られる生成物50ｇを、
900ｇの温水に溶解後、この混合溶液にクエン酸
を加えてそのPHを5.0に調整後、市販卵白リゾチ
ーム１ｇを加えて、37℃で５時間反応させた。次いで、得られた反応混合液を、100℃で30秒
間加熱して反応を停止後、直径10cm×高さ20cmの
活性炭カラムに通して、上記反応混合液中に生成
したオリゴ糖を吸着させた上記カラムに十分量の
水を流して、上記反応で副生した単糖類を溶出
後、上記吸着オリゴ糖を５％エタノール10、次
いで、50％エタノール10で溶出した。50％エタ
ノール溶出区分を減圧濃縮後、凍結乾燥して白色
のオリゴ糖粉末10ｇを調製した。このオリゴ糖は
前記表１に示した式（）〜式（）の４種類の
オリゴ糖から成つている。実施例２卵白リゾチームの代りに市販の細胞壁溶解酵素
（Lytic enzyme、協和醗酵K.K.製）を用いるほ
かは実施例１に記載と同様の手順でオリゴ糖粉末
を調製した。得られたオリゴ糖粉末中には式（）で示され
る３糖類、式（）で示される４糖類、式（）
で示される５糖類及び式（）で示される６糖類
が各々50重量％、25重量％、15重量％及び10重量
％含まれていた。実施例３本例は本発明によるオリゴ糖を活性成分とする
ビフイズス増殖促進剤の効果を示したものであ
る。生後６ケ月以内のカニクイザルの３匹から成る
群をそれぞれ試験動物として用い、その各群に、
最初乳糖を５重量％添加した市販育児用粉乳を３
週間与えた後、１群には実施例１により得られた
オリゴ糖粉末を５重量％添加した育児用粉乳を他
の群には乳糖とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
の等量混合物を５重量％添加した育児用粉乳をそ
れぞれ引き続き３週間与えた。その間各群のサル
の糞便を採取して糞便中のビフイドバクテリウム
菌を測定した。その結果は添附の第２図に示すと
おりである。第２図にみられるごとく、オリゴ糖
の投与により糞便中の全菌数に占めるビフイドバ
クテリウム菌の比率が約４倍に増加し、比較例と
しての乳糖とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの
混合物の投与区に比して約３倍増加する。実施例４本例も本発明によるオリゴ糖のビフイズス増殖
活性を示したものである。年令６才以上の成長サルの３匹から成る群を試
験動物として用い、最初の３週間乳糖を１日当り
４ｇ投与し、次いで１群には実施例１で得られた
オリゴ糖粉末を１日当り４ｇ投与し、他の群には
乳糖とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの等量混
合物を同じく４ｇ／日投与し、その間各群のサル
の糞便を採取し、糞便中のビフイドバクテリウム
菌を測定した。その結果は添附の第３図に示すと
おりである。第３図にみられるごとく、乳糖の投
与期間、並びに乳糖とＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンの混合物の投与区ではビフイドバクテリウ
ム菌がほとんど検出されなかつたが、オリゴ糖の
投与により上記菌の著しい増殖がみられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の製造法により得られる反応
混合物中に生成した転移オリゴ糖の分析例を示す
薄層クロマトグラムを示したものであり、第２図
及び第３図は本発明によるオリゴ糖のビフイズス
増殖促進活性をそれぞれ示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式 β−Ｄ−Gal−（１→４）−〔｛β−Ｄ −GlcNAc−（１→４）｝ｎ−β−Ｄ −GlcNAc−（１→２）〕−Ｄ−Glc （）（式中GlcNAcはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
を表わし、Galはガラクトースを表わし、Glcは
グルコースを表わす。ｎは０又は１〜３の整数を
表わす）で示される新規なオリゴ糖。２式で示される化合物である特許請求の範囲第１項記
載のオリゴ糖。３式で示される化合物である特許請求の範囲第１項記
載のオリゴ糖。４式で示される化合物である特許請求の範囲第１項記
載のオリゴ糖。５式で示される化合物である特許請求の範囲第１項記
載のオリゴ糖。６キチンまたはキチンの部分加水分解物と、乳
糖または乳糖含有物との混合物に、卵白リゾチー
ム、微生物キチナーゼ及び細胞壁溶解酵素から成
る群から選択される、キチン及びキチンの部分加
水分解物に対して加水分解能を有する酵素を作用
させることを特徴とする下記一般式（）で示さ
れるオリゴ糖を製造する方法。 β−Ｄ−Gal−（１→４）−〔｛β−Ｄ −GlcNAc−（１→４）｝ｎ−β−Ｄ −GlcNAc−（１→２）〕−Ｄ−Glc （）（式中GlcNAcはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
を表わし、Galはガラクトースを表わし、Glcは
グルコースを表わす。ｎは０又は１〜３の整数を
表わす）。７一般式（） β−Ｄ−Gal−（１→４）−〔｛β−Ｄ −GlcNAc−（１→４）｝ｎ−β−Ｄ −GlcNAc−（１→２）〕−Ｄ−Glc （）（式中GlcNAcはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
を表わし、Galはガラクトースを表わし、Glcは
グルコースを表わす。ｎは０又は１〜３の整数を
表わす）で示されるオリゴ糖を活性成分として含
有するビフイドバクテリウム菌の増殖促進剤。