JPS6147516B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、低級動物の腸から得られる細菌を分
離し、液体培地中で上記の細菌を突然変異し、ク
エン酸鉄アンモニウムおよび少なくとも１種のリ
ン酸塩を含有する窒素質栄養培地であつて、その
培地の窒素の一部が得られる物質により処理され
るべき組織と同じ起源の動物、人間あるいは植物
組織により提供されたものである培地の中で上記
の細菌を工業的に培養して、処理されるべき動
物、人間あるいは植物組織に対して生物活性を有
する物質を製造する方法において、突然変異によ
り得られ、使用される細菌がNCIB11144番のバク
テリア菌株（スコツトランドのアバデイーンにあ
る国立産業用細菌収納所即ち／“Natioual
Collection of Industrial Bacteria（NCIB）”に
提出されている）であることを特徴とする上記の
生物活性を有する物質の製造方法に関する。 本発明の方法によれば、使用される低級動物は
好ましくは棘皮動物、特に環形動物、さらにはヒ
ルド・メジシナリス（薬用ヒル）の幼虫である。 薬用ヒルの消化管のフローラ（flora）から分
離され、突然変異および工業的培養をされた後の
グラム陰性で、時には好気性である、非常に短か
い多形体の細菌から、生物活性を有する多数の特
有な物質を製造しうることは周知である。 この細菌は腸細菌科（eutevobocteriaceal
fawily）に関係あるものであるが、本発明の方法
から得られる突然変異した菌株とともに以下に詳
述する。さらに生物活性を有する物質の製造方法
ならびにその物質の生物特性ついても述べる。 培地を、チユーブまたはペトリ皿の中に入れ
る。細菌培養器中の細菌培養は18−22℃の温度で
２〜３日間行なう。 次に、数回再接種した後、極めて短かい、ほど
んど球菌状のグラム陰性細菌を容易に分離する。
新鮮な状態で試験したところ、それは極めて活動
的である。大ていは、独立した不特定に配向した
細菌として現われる。 最初の細菌（突然変異した菌株も同様である）
の確認試験を後に表で示すが、その表では突然変
異した菌株と最初の菌株との間の形態学上ならび
に反応上の相違が一層よく認識できる。 細菌（分離した純粋な菌株）の細菌培養を約18
℃の温度で３〜５日間行なつたときは、突然変異
培養も進行する。 工業的培養において、高収率で活性物質および
生物要因を与えることのできる突然変異した菌株
を得るために、多くの連続した試験から得られる
突然変異した菌株の活性について多くの試験を行
なつた。その結果、本発明による突然変異工程は
次のように行なうこととする。 最初に突然変異培地を準備する。 この培地は低い総窒含有量を有していなけけれ
ばならないが、比較的イオウ含有アミノ酸に富ん
でいなければならない。後者の条件は、本発明に
従つて、後述する工業的培養培地中で最も活性で
ある菌株を得るために絶対に不可欠なものであ
る。 培地の相対等張は塩化ナトリウムを添加するこ
とによつて得られる。 下記に突然変異培地の組成の例を示す。 ペプトン ２ ｇ メチオニン 0.5−１ ｇ シスチン 0.5−１ ｇ NaCl ５ ｇ 水 1000 ml 使用されるペプトンは、膵臓のペプトン、トリ
プシンによつて生じたペプトン、肉またはカゼイ
ンのパパインペプトンであつてもよく、好ましく
はペプシンによるペプトンである。PHをソーダで
6.8に調整する。 本発明による突然変異培養工程中の窒素源とし
てのペプトンは、他の適当な動物または植物起源
の窒素質の物質におきかえることもできる。しか
し培地が比較的イオウ含有アミノ酸に富んでいる
ことが必須である。 メチオニンおよびシスチンは、一部または全部
を（ほゞ等重量）他のイオウ含有アミノ酸、例え
ばグルタチオン、システインまたはホモシステイ
ンとおき代えてもよい。 上に述べた培養培地は、種々の成分を水に溶解
し、好ましくは過し、PHを制御し、必要ならば
PH＝6.8に調整することにより得られる。 上記の培地を次に120℃で約30分間殺菌消毒す
る。 培地を冷却した後、後者に、動物起源の固体ア
ルブミン質培地で培養し、３〜５日の細菌培養の
後、上記の細菌の分離および培養の方法により得
られた最初の純粋な菌株から得られた接種物を接
種する。 突然変異培養は、適当な容器、チユーブ、エー
レンマイヤー フラスコなどの中で行なう。それ
は急速に進展する。 突然変異は18〜22℃の温度で９〜12日間の細菌
培養した後に得られる。 突然変異した菌株を、次にかんてん培養基／新
鮮な血液に弱く再接種して維持し、18℃（±２
℃）で培養する。 これらの培養菌は凍結乾燥あるいは冷蔵庫中で
短期間あるいは長期間、あるいは数年にわたつ
て、保存されるが、必要ならばそれらを再び続け
て上述の突然変異培地上を通過させることにより
その菌株を再生させ、また若返らせることが極め
て容易にできるので多年にわたりその菌株を持続
することができる。 次に工業的培養を行なう。 この工業的培養は次の培地で行なわれるが、こ
れはほんの一例であつてこれに限定されるもので
はない。 ペプトン 18−20ｇ NaCl ５ｇ クエン酸鉄アンモニウム １％水溶液 ４ml リン酸二水素カリウム １％水溶液 １ml リン酸水素二ナトリウム １％水溶液 ４ml 水 1000ml PHをソーダを用いて6.8に調整する。 鉱物塩を含む培地のこの組成は、工業的培養培
地用の処方の必須成分である。というのは生合成
の最初において、培地の生物特性がその全発達過
程でその中から導かれるからである。 使用されるペプトンは膵臓のペプトン、トリプ
シンによつて生じたペプトン、肉またはカゼイン
のパパイン、ペプトンであつてもよく、好ましく
はペプシンによるペプトンである。 工業的培養工程における窒素源としてのペプト
ンは、他の適当な動物または植物起源の窒素質の
物質におきかえることができる。しかし上述のよ
うに培地の鉱物質組成が必須であることに注意す
べきである。ペプトンの一部を上で使用した遊離
のアミノ酸と結局はおきかえて第一の突然変異培
地を調製することもできる。 このように指示した培地の組成を「動物組織」
で補充する。 ここで「動物組織」という表現は最も広い意味
にとる必要がある。「動物組織」は「血液組織」
を意味し、従つて血液の全部あるいは血液成分の
み（血液細胞、漿液、リンパ漿、繊維素）の一部
および筋肉、器官、腺、骨あるいは動物体の明確
な部分から採られたその他のどんな動物組織も意
味する。 この「動物組織」からの組織抽出物の乾量は、
上述の工業的培養培地の基本処方中、使用される
ペプトンの重量の10〜50％である。 他の製造法として、この動物組織を、結局は動
物起源の内分泌液、例えば羊水おきかえることも
できる。この場合、補充剤としてペプトンを追加
して、同じ総窒素含有量になるようにする。 動物組織は、臓器療法調製法の通常の規則に従
つて、すなわち脂肪を除去し、使用されるまで低
温に保存することによつて調製する。 「血液組織」を使用する場合は、血液を全部使
用するか（安定化させたり、させなかつたりし
て）あるいは、その一部の成分またはそれ以上の
成分を使用する。 動物組織を即座に潰す。これらの操作は、でき
る限り無菌状態になるよう最大の注意を払いなが
ら行なう。 他の実施態様においては、新鮮な状態の動物組
織を使用するかわりに、凍結真空乾燥し、殺菌し
た動物組織を使用する。 上述のように調製したペプトン含有処理した培
地にこの動物組織を添加する。PHをコントロール
し、必要なら約PH＝6.8に調整する。 工業的培養は、例えば円錐形のエーレンマイヤ
ーフラスコ、あるいはあらゆる大きさのフラスコ
の中で、所定の肉汁の容積に応じて適当な容器を
用いて行なう。大量生産を行なうには、培養を適
当な公知の材料中で行なえばよい。その材料は殺
菌ができて、その中で種々の操作（接種、サンプ
リング、PH調整）を無菌状態で行なうことができ
ればよい。 培地はオートクレーブ中で120℃で約30分間殺
菌する。 その培地を冷却した後、接種される工業的培地
の容積の、好ましくは1/20〜1/200の容積を有す
るタンク沈降物（おり）でその培地に接種する。
工業的培地の組成と同じ組成（ただし動物組織を
追加していない）を有するこのタンク沈降物は、
突然変異した菌株の維持培養からサンプルした接
種物で接種した後、培養して得られたものであ
る。 この培養は、18〜20℃の温度で15日間行なう。 工業的培養用に作られた肉汁は、生物活性を有
する物質を得るために使用される。 このようにするために、肉汁をブージー、皮膜
あるいはその他の手段で、無菌状態で過する。 他の実施の態様においては、肉汁をその他の公
知の手段（紙、織物、真空）で過し、これに
使用目的に応じた防腐剤を添加する。 もとの（原起の）細菌および突然変異した細菌
は次のような特性を有する。

【表】

【表】 て不特定に配向した細 こともできる〓杆菌〓状
菌‐グラム‐陰性‐好 のものまで、活動的。
気的であつてもよい。 グラム陰性‐好気的で
あつてもよい。鞭毛有
り。 胞子無し。抗酸性
無し。

【表】

【表】 溶解

【表】 突然変異した細菌の各培地における生育状態 肉汗寒天平板培養 培養菌多産、コロニーは滑らかで、明るい灰色
がかつた色即ち少し白色を帯びた透明な色素の無
い色。コロニーは少し降起、直経は２〜３mm、ク
リーム質。 肉汁寒天斜面培養 養菌多産、滑らかで明るい灰色がかつた色。 肉汁液体培養 培養菌多産、弱い膜の表面を持つ、均質に濁
る。 肉汁ゼラチン穿刺培養 18℃で液化を伴なう漏斗状の形をした培養物。 リトマスミルク 酸性化、凝固、液化。 培養肉汁のPHの評価 突然変異培養 工業的培養 PH 6.8−7.2 6.8−8.8 以下のものは、本発明の方法より製造した生物
活性を有する合成物の特性である。 ニンヒドリンに対する反応 陰極 ビユレツトに対する反応 陽性 沸騰H₂SO₄に対する反応 深いオレンジ色 生物活性を有する合成物を生体外で調べた。さ
らに生体中の坑微生物および坑細菌作用が一層増
し、一層効果的であることを試験は示していた。
というのは特別に処理されるべき器官の組織に相
当する潰した動物組織を、上述のように工業的培
養培地に添加したからである。 得られた生成物のニンヒドリンおよびビユレツ
トに対する試験によれば、アミノ酸を放出してい
ないので、蛋白質は単に部分的に分解しているこ
とを示している。他方「媒介動物」として作用す
るのに十分な特異性を保ちつつペプタイドへの分
解があるが、静脈注射によるにせよ、筋肉内注射
によるにせよ、泌経口的に投与した場合には蛋白
衝撃を生じない。 これらの特異なペプタイドは、作られた免疫学
上のフアクターに対する「特異な刺激物」ならび
に「媒介動物」として作用する。それらの「媒介
動物」的特性は、結合しうるどんな治療上の生成
物にも適用できる。 得られた生成物の一般的な生物化学的特性の中
で、特徴のうちの一つでもある蛋白分解特性を以
下に示す。 １ 生物活性を有する物質を最初に、突然変異し
た細菌の破壊を起す最少量の防腐剤によつて殺
菌する。 ２ 白金針金（あるいはステンレス針、例えば培
養媒体を接種する目的でサンプリングのために
一般に使用される針金）を前もつて防腐剤を添
加した培地中に浸す。 ３ 無菌的に、あたかも接種の材料であるように
通常の培養管の栄養ゼラチンの中へ入する。 ４ その管を細菌培養器中で＋18℃に保持する。 この温度においてさえも、酵素活性は大いに低
下し、液化が観察され、それは最初に表面に現わ
れ（注入を受けた表面上の地点のまわり）そして
手袋の指の様に生長し、そしておそらく完全に液
化するまで続く。 蛋白分解作用による上記の液化は、一種の「限
定細胞溶解」に相当する。事実、それは全くきれ
いな粘性の液体を生成し、溶菌力のある起源の液
化によつて生じた、一層流動的でにごつた液体と
は全く異なつたものを生ずる。 得られた生成物のこの特徴によつて、上記生成
物を確認するための上述のニンヒドリン、ビユレ
ツトおよび硫酸反応は完了する。 膵臓生成物に対して生物活性を有する物質（以
下、膵臓生成物という）の製造例 ２リツトルの培養培地を以下のようにして作
る。 ペプトン 36ｇ クエン酸鉄アンモニウム １％水溶液 ８ml リン酸二水素カリウム １％水溶液 ２ml リン酸水素二ナトリウム １％水溶液 ８ml 蒸溜水 qsp 2000ml 潰して脱脂した豚の膵臓 40ｇ PHを6.8に調整 以上の混合物を30分間120℃で殺菌する。冷却
後、この培地に、突然変異した細菌（20〜36時間
のタンク沈降物）の約50mlの培養肉汁を接種す
る。 18℃で15日間放置した後、最大１％のホルマリ
ン培地を得るのに十分な量の30％のホルムアルデ
ヒド溶液を添加して培養を中止する。過する前
にこの培地を数時間かきまぜる。きれいな液
を、好ましくは＋４〜＋18℃の温度で暗所に貯蔵
する。 膵臓生成物の効果の検討 １ 兎における試験 (a) 第一段階で、20％のグルコース溶液を２羽
の兎の胃腸に４ml/Kgの割合で与えてひき起
された高血糖のテストを行なつた。

【表】 (b) ４日後、２羽の兎は同様の反応を示した
が、これに前回と同量のグルコースを与え
た。ただしNo.1には静脈注射で0.28インシユ
リン単位（20単位／ml溶液の1/50希釈までを
0.7ml）与え、No.2には、グルコースの吸収
の１時間半前に、生理水で1/100に希釈した
0.75mlの「膵臓生成物」を与えた。 結果は次の通りであつた。

【表】 インシユリンの作用は、一定の遅れの後、
血糖の急激な低下をひき起した。また「膵臓
生成物」は調整剤として作用した。事実、血
糖水準に評価できる低下はみられなかつた。
−高血糖のピークもなかつた。 ２ 人間における試験 誘発高血糖テストを健康な人間に48時間の間
隔（50ｇのグルコースの摂取）で行なつた。第
２回に被試験者は次のものを吸収した。 −前日の夜、「膵臓生成物」の２滴 −グルコース摂取の１時間前、「膵臓生成物」
の２滴

【表】 この試験では、「膵臓生成物」の「刺激剤」的
作用を示した。兎における試験では、この「刺激
剤」的効果と同様に「調整剤」的効果も示してい
る。このことは糖尿病患者の処置の場合に非常に
重要である。というのは低血糖低下の危険がより
少ないからである。 突然変異培地および工業的培養培地の組成を一
つの指示として単に与えれば、突然変異培地は窒
素の欠如およびイオウ含有アミノ酸の比較的豊富
なことによつて定義され、工業的培地は特別な鉱
物塩組成によつて定義されるが、両者において、
ペプトンからの窒素は他の源、例えば栄養肉汁か
ら由来するものであつてもよい。使用される動物
起源の内分泌液としては、他のどんな分泌液、例
えば羊水でも使用できる。培養は、細菌培養器中
あるいは水浴中でも、あるいはエア・コンデイシ
ヨン付の室あるいは囲いの中でもなされる。突然
変異培養および／または工業的培養は、どんな公
知の容器中でも、かきまぜをしてもしなくても、
不活性ガスの下で、あるいは液体の分離層の下で
も行なうことができる。突然変異した細菌が好気
性であろうが嫌気性であろうが問題ではない。細
菌培養の温度は、異なつた段階で上述したものか
ら±２℃で変化してもよい。活性を有する最終生
成物のPHは、意図される治療上の用途により調整
できる。生成物を、「媒介動物」および／または
「刺激剤」的特性を維持させながら、坑伝染活性
を減じたり、抑制したりするために物理的または
化学的処理をすることもできる。 工業的培養培地が動物起源の組織、腺、あるい
は器官で補充されているので、一部由来する組
織、腺あるいは器官に対して生成物が特殊な親和
性および特異性を有することが（経口的に投与さ
れた時でも、また非経口的に使用される時はなお
さら）観察された。従つて生成物は、（「媒介動
物」的効果のために）問題の組織、腺、器官に向
けて「運搬され」、そして工業的培養の間に作ら
れた、これら種々の生物学的ならびに坑伝染性要
因の有効な活性が相当に増加されている。 従つて動物の肝臓組織で得られた生成物は肝臓
病の処置に対して主成分として適当であるし、さ
らに肝臓の刺激剤としてもそれ自体作用する。 従つて、「媒介動物」的効果は生成物と結合し
て刺激剤あるいは治療剤的効果であることもでき
る。 これらの生成物が、好ましくは希釈して、経口
的にあるいは可飲的な溶液の形で使用できるとい
うことは、特記すべきことである。それらの物質
はまた非経口的に使用される溶液の処方に入れる
こともできる。 上記生成物は、さらに、工業的培養の終りに得
られた形で、固体状で（糖衣錠、ピル、タブレツ
ト、薬用オブラート）経口的に投与される生成物
を直接作るために使用することもできる。 もし消化液の作用から治療物質を除くことが好
ましいならば、しかしそれを非経口的に使用しな
いのであれば、同じ形状で、あるいは希釈して、
生成物を座薬の処方の内へ入れることもできる。 さらに、生成物を、複合処方用の基材を得るた
めにまたは即座に再び溶解する目的で、凍結真空
乾燥することも可能である。 化粧品に使用するときは、得られた生成物をク
リームや軟膏の中に入れることもできる。 本発明の方法によつて得られる生物活性を有す
る物質は、動物組織で、数多くの治療上の用途に
適しており、特にその活性を向上させるために、
活性な医薬品と結合することもできる。生物活性
を有する物質は、必経口的または経口的に投与で
きる全ての医薬複合材の製造に適している。しか
し、しばしば、上記の物質は、それ自体の特異性
を考慮して単独で使用することもできる。 例えば肺結核の処置には、肺組織に基づいた生
成物と血液に基づいた生成物を同じようにして同
時に使用することができる。腎臓結核の場合は、
腎臓組織に基づいた生成物と血液に基づいた生成
物とを同じようにして同時に使用される。 本発明の方法により得られる物質は、化粧品に
も使用することができ、また「媒介動物」および
器官の「刺激剤」が特に著しく領域でも使用する
ことができる。 本発明による方法では、上述の如く、次の製造
特徴を有する植物刺激剤を製造するのに使用する
こともできる。先に述べた方法と何も変るところ
はないが、ただペプトン化した培地に動物組織を
加えるかわりに、その培地に潰した若い植物を添
加することのみが違つている。適当な防腐剤で非
常に弱く希釈されたものを培養後得られた培地に
加えると、刺激剤を伴つた組織増殖を附与する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 部分的に分解された蛋白質を含み、蛋白分解
   特性を示すとともに、ニヒドリンに対する陰性の
   反応、ビユレツトに対する陽性の反応、および沸
   騰硫酸に対する深いオレンジ色の着色反応を示
   し、かつ、処理されるべき動物、人間あるいは植
   物の組織に対して生物活性を有する物質を製造す
   る方法において、低級動物の腸から分離した腸細
   菌科に関連する原起の細菌を液体培地中で突然変
   異して得られるNCIB11144番の菌株をクエン酸鉄
   アンモニウムおよび少なくとも１種のリン酸塩を
   含有する栄養窒素含有培地であつて、その培地の
   窒素の一部が前記処理されるべき動物、人間、あ
   るいは植物の組織と同じ起源の組織により提供さ
   れたものである培地の中で、工業的に培養するこ
   とを特徴とする上記の生物活性を有する物質の製
   造方法。 ２ 前記NCIB11144番の菌種が薬用ヒルの消化管
   から分離した原起の細菌を突然変異して得られた
   細菌であることを特徴とする前記第１項記載の方
   法。 ３ 前記原起の細菌を分離するためにかんてん培
   養基／新鮮な血液に薬用ヒルの消化管から得られ
   たサンプルを接種し、そこで原起の細菌の分離培
   養を18〜22℃の温度で２〜３日間行ない、分離
   後、固体アルブミン質培地中で18〜22℃の温度で
   ３〜５日培養することを特徴とする前記第２項記
   載の方法。 ４ 前記原起の突然変異を、２ｇのペプトン、
   0.5〜１ｇのメチオニン、0.5〜１ｇのシスチン、
   ５ｇの塩化ナトリウムおよび1000mlの水からなる
   液体培地中で、上記の液体培地のPHをソーダを添
   加して6.8に調整し、17〜18℃の温度で９〜12日
   間培養することにより行なうことを特徴とする前
   記第２項記載の方法。 ５ 前記原起の突然変異により得られた菌株を、
   ひきつづき５〜８日間、かんてん培養基／新鮮な
   血液上で17〜18℃の温度において培養することを
   特徴とする前記第２項記載の方法。 ６ 窒素含有量がペプトンにして18〜20ｇ/に
   相当し、塩化ナトリウムを５ｇ/、クエン酸鉄
   アンモニウム１％水溶液を４ml/、リン酸二水
   素カリウム１％水溶液を１ml/およびリン酸水
   素二ナトリウム１％水溶液を４ml/含有し、さ
   らに潰した動物組織および動物起源の内分泌液ま
   たはそれらの一方を含む、前もつて殺菌した栄養
   培地中で、18〜20℃の温度で15〜20日間、前記突
   然変異した細菌を工業的に培養することを特徴と
   する前記第２項記載の方法。 ７ 前記培養によつて得られた肉汁を過し、そ
   れに防腐剤を添加することを特徴とする前記第６
   項記載の方法。