JPS6149624B2 - - Google Patents
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- JPS6149624B2 JPS6149624B2 JP56153796A JP15379681A JPS6149624B2 JP S6149624 B2 JPS6149624 B2 JP S6149624B2 JP 56153796 A JP56153796 A JP 56153796A JP 15379681 A JP15379681 A JP 15379681A JP S6149624 B2 JPS6149624 B2 JP S6149624B2
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- Japan
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- antibody
- dacm
- labeled
- labeled antibody
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
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- Analytical Chemistry (AREA)
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- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な螢光標識抗体及びその製造方
法に関する。
法に関する。
螢光物質で標識した抗体は、各種生体組識にお
ける生物学的活性分子の検出に広く用いられてい
る。
ける生物学的活性分子の検出に広く用いられてい
る。
標識用螢光物質としては、主にフルオレセイン
シアネート及びその誘導体が多用されているが、
これらを抗体と結合させるためには、複雑な手技
と長時間を必要とするほか、得られた螢光標識抗
体が非特異的な反応を示すことから、特異的に反
応する螢光標識抗体を得るために、更に繁雑な操
作を必要とするなど多くの問題点がある。
シアネート及びその誘導体が多用されているが、
これらを抗体と結合させるためには、複雑な手技
と長時間を必要とするほか、得られた螢光標識抗
体が非特異的な反応を示すことから、特異的に反
応する螢光標識抗体を得るために、更に繁雑な操
作を必要とするなど多くの問題点がある。
抗体には免疫グロブリン（以下Igと略記する）
Ｇ、IgA、IgM、IgD及びIgEの５種の型があり、
それらは構造上２つのヘビーチエイン（Ｈ鎖）と
２つのライトチエイン（Ｌ鎖）を基本単位として
いる。Ｈ鎖とＬ鎖は相互にジサルフアイド結合
（−Ｓ−Ｓ−）により結合し、Ｈ鎖同士も同様に
ジサルフアイド結合により結合しているが、この
結合は２−メルカプトエタノール又は２−メルカ
プトエタノールアミン塩酸塩により容易に切断さ
れ、それぞれが−SH基となる。次いで中性の条
件下で２−メルカプトエタノール又は２−メルカ
プトエタノールアミン塩酸塩を除去すると、再び
ジサルフアイド結合が形成され、もとの抗体とし
ての活性を示す。この際に添加する２−メルカプ
トエタノール又は２−メルカプトエタノールアミ
ン塩酸塩の濃度を変えることによつて、切断され
るジサルフアイド結合の数を変えることができ、
また切断後に生じた−SH基の水素を他の物質で
置換しても、添加した２−メルカプトエタノール
又は２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩を除
去すると、再び分子結合によつて安定な型の抗体
となることが知られている。
Ｇ、IgA、IgM、IgD及びIgEの５種の型があり、
それらは構造上２つのヘビーチエイン（Ｈ鎖）と
２つのライトチエイン（Ｌ鎖）を基本単位として
いる。Ｈ鎖とＬ鎖は相互にジサルフアイド結合
（−Ｓ−Ｓ−）により結合し、Ｈ鎖同士も同様に
ジサルフアイド結合により結合しているが、この
結合は２−メルカプトエタノール又は２−メルカ
プトエタノールアミン塩酸塩により容易に切断さ
れ、それぞれが−SH基となる。次いで中性の条
件下で２−メルカプトエタノール又は２−メルカ
プトエタノールアミン塩酸塩を除去すると、再び
ジサルフアイド結合が形成され、もとの抗体とし
ての活性を示す。この際に添加する２−メルカプ
トエタノール又は２−メルカプトエタノールアミ
ン塩酸塩の濃度を変えることによつて、切断され
るジサルフアイド結合の数を変えることができ、
また切断後に生じた−SH基の水素を他の物質で
置換しても、添加した２−メルカプトエタノール
又は２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩を除
去すると、再び分子結合によつて安定な型の抗体
となることが知られている。
本発明者らは、以上の事実に着目し、Ｎ−（７
−ジメチルアミノ−４−メチルクマリニル）マレ
イミド（DACM）を抗体のジサルフアイド結合
切断後に生じた−SH基に結合させて螢光標識抗
体を製造した。そしてこの標識抗体が、現在広く
用いられているフルオレセインイソチオシアネー
ト（FITC）で標識した抗体（以下FITC標識抗
体と略記する）に比べて非特異的染色が少なく、
かつ螢光の退色も少ないことを見出して本発明を
完成した。
−ジメチルアミノ−４−メチルクマリニル）マレ
イミド（DACM）を抗体のジサルフアイド結合
切断後に生じた−SH基に結合させて螢光標識抗
体を製造した。そしてこの標識抗体が、現在広く
用いられているフルオレセインイソチオシアネー
ト（FITC）で標識した抗体（以下FITC標識抗
体と略記する）に比べて非特異的染色が少なく、
かつ螢光の退色も少ないことを見出して本発明を
完成した。
本発明は、DACMで標識した螢光標識抗体
（DACM標識抗体と略記する）、ならびに抗体を
２−メルカプトエタノール又は２−メルカプトエ
タノールアミン塩酸塩で処理し、次いでDACM
と反応させたのち、２−メルカプトエタノール又
は２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩を除去
することを特徴とする、前記の標識抗体の製造方
法である。
（DACM標識抗体と略記する）、ならびに抗体を
２−メルカプトエタノール又は２−メルカプトエ
タノールアミン塩酸塩で処理し、次いでDACM
と反応させたのち、２−メルカプトエタノール又
は２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩を除去
することを特徴とする、前記の標識抗体の製造方
法である。
本発明においてDACMは、チオール基と結合
することにより螢光を発する化合物で、チオール
基の検出用試薬として知られている（特公昭51−
13035号公報参照）。また抗体としてはIgG、
IgA、IgM、IgD及びIgEを用いることができる。
することにより螢光を発する化合物で、チオール
基の検出用試薬として知られている（特公昭51−
13035号公報参照）。また抗体としてはIgG、
IgA、IgM、IgD及びIgEを用いることができる。
本発明のDACM標識抗体を製造するに際して
は、まず抗体を２−メルカプトエタノール又は２
−メルカプトエタノールアミン塩酸塩で処理す
る。抗体としては、通常は抗血清の抗体を含む分
画を用い、これをPH6.5〜8.5の緩衝液に溶解す
る。緩衝液としては、例えばトリス塩酸塩緩衝液
（PH8.2）、燐酸緩衝液（PH8.2）等が用いられる。
抗体を含む分画の濃度は0.5〜１％（Ｗ／Ｖ）が
好ましい。
は、まず抗体を２−メルカプトエタノール又は２
−メルカプトエタノールアミン塩酸塩で処理す
る。抗体としては、通常は抗血清の抗体を含む分
画を用い、これをPH6.5〜8.5の緩衝液に溶解す
る。緩衝液としては、例えばトリス塩酸塩緩衝液
（PH8.2）、燐酸緩衝液（PH8.2）等が用いられる。
抗体を含む分画の濃度は0.5〜１％（Ｗ／Ｖ）が
好ましい。
次いでこの抗体溶液に、２−メルカプトエタノ
ール又は２−メチルメルカプトエタオールアミン
塩酸塩を添加する。これら化合物の添加量は、最
終濃度が0.25〜4mMになるように調整すること
が好ましい。この混合液を室温に約１時間放置す
ると反応が終了する。
ール又は２−メチルメルカプトエタオールアミン
塩酸塩を添加する。これら化合物の添加量は、最
終濃度が0.25〜4mMになるように調整すること
が好ましい。この混合液を室温に約１時間放置す
ると反応が終了する。
こうして得られた混合液にDACMを添加し、
更に約１時間室温で反応させる。DACMの添加
量は、２−メルカプトエタノール又は２−メルカ
プトエタノールアミン塩酸塩と等モル量程度が好
ましい。
更に約１時間室温で反応させる。DACMの添加
量は、２−メルカプトエタノール又は２−メルカ
プトエタノールアミン塩酸塩と等モル量程度が好
ましい。
反応終了後に２−メルカプトエタノール又は２
−メルカプトエタノールアミン塩酸塩を除去する
には、例えば反応液を中性の緩衝液に対して透析
する。中性の緩衝液としては、例えば燐酸ソーダ
緩衝液（PH7.4）等があげられる。この溶液をゲ
ル過して蛋白分画を採取すると、本発明の
DACM標識抗体が得られる。
−メルカプトエタノールアミン塩酸塩を除去する
には、例えば反応液を中性の緩衝液に対して透析
する。中性の緩衝液としては、例えば燐酸ソーダ
緩衝液（PH7.4）等があげられる。この溶液をゲ
ル過して蛋白分画を採取すると、本発明の
DACM標識抗体が得られる。
この分画がDACMにより螢光標識されている
ことは、第１図に示すように最大吸収波長が
395nmを示し、468nmに放出スペクトルがみられ
ることから確認される。またこの分画が目的の型
の抗体であることは、二元拡散ゲル内沈降反応又
は免疫電気泳動法により確認され、同時に反応す
る抗原とのみ反応することも確認できる。
ことは、第１図に示すように最大吸収波長が
395nmを示し、468nmに放出スペクトルがみられ
ることから確認される。またこの分画が目的の型
の抗体であることは、二元拡散ゲル内沈降反応又
は免疫電気泳動法により確認され、同時に反応す
る抗原とのみ反応することも確認できる。
本発明のDACM標識抗体は、非特異的染色及
び螢光の褪色が少ないため、螢光顕微鏡を用いた
螢光抗体法による生体組識中の特異的抗原物質検
出用螢光標識抗体として極めて好適である。
び螢光の褪色が少ないため、螢光顕微鏡を用いた
螢光抗体法による生体組識中の特異的抗原物質検
出用螢光標識抗体として極めて好適である。
抗体に結合する螢光色素量は、通常はＦ／Ｐ値
（螢光色素のモル濃度／蛋白質のモル濃度）とし
て表わされる。FITC標識抗体ではＦ／Ｐ値が大
きくなる程、電気泳動にかけた際の移動度が大き
くなるが、これはFITCが抗体に結合することに
より、標識抗体が負の荷電を帯びるためである。
このような標識抗体を用いて生体組織中の特異抗
原物質を染色すると、標識抗体が負の電荷を帯び
ていることから特異抗原物質のみならず、他の正
の電荷を帯びた部分とも結合して、非特異的螢光
像を示すこととなる。したがつて特異的螢光像を
得るためには、適当なＦ／Ｐ値（１〜２）の
FITC標識抗体を調製する必要があるが、これに
は繁雑な操作が必要となる。
（螢光色素のモル濃度／蛋白質のモル濃度）とし
て表わされる。FITC標識抗体ではＦ／Ｐ値が大
きくなる程、電気泳動にかけた際の移動度が大き
くなるが、これはFITCが抗体に結合することに
より、標識抗体が負の荷電を帯びるためである。
このような標識抗体を用いて生体組織中の特異抗
原物質を染色すると、標識抗体が負の電荷を帯び
ていることから特異抗原物質のみならず、他の正
の電荷を帯びた部分とも結合して、非特異的螢光
像を示すこととなる。したがつて特異的螢光像を
得るためには、適当なＦ／Ｐ値（１〜２）の
FITC標識抗体を調製する必要があるが、これに
は繁雑な操作が必要となる。
これに対し、本発明のDACM標識抗体は、後
記の実験例４に示すように、DACMが抗体に結
合しても荷電に変化が生じないので、Ｆ／Ｐ値の
大きい抗体を用いても、生体組織中の特異抗原物
質のみと結合するため、特異的螢光像を得ること
ができる。
記の実験例４に示すように、DACMが抗体に結
合しても荷電に変化が生じないので、Ｆ／Ｐ値の
大きい抗体を用いても、生体組織中の特異抗原物
質のみと結合するため、特異的螢光像を得ること
ができる。
生体組織中の特異抗原物質を、螢光標識抗体を
用いて染色する際、特異抗原物質が極微量である
場合は螢光量の多い標識抗体が必要であり、また
逆に特異抗原物質が比較的多い場合は螢光量の少
い標識抗体が用いられる。本発明の製造方法によ
れば任意のＦ／Ｐ値のDACM標識抗体を容易に
製造することができる。
用いて染色する際、特異抗原物質が極微量である
場合は螢光量の多い標識抗体が必要であり、また
逆に特異抗原物質が比較的多い場合は螢光量の少
い標識抗体が用いられる。本発明の製造方法によ
れば任意のＦ／Ｐ値のDACM標識抗体を容易に
製造することができる。
本発明方法では、２−メルカプトエタノール又
は２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩の濃度
を変えることにより、抗体のジサルフアイド結合
の切断後に生ずる−SH基の数を変えることがで
きるため、−SH基に結合するDACMの量も変える
ことができる。すなわち、２−メルカプトエタノ
ール又は２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩
の濃度を変えることにより螢光標識抗体のＦ／Ｐ
値を調節できる。
は２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩の濃度
を変えることにより、抗体のジサルフアイド結合
の切断後に生ずる−SH基の数を変えることがで
きるため、−SH基に結合するDACMの量も変える
ことができる。すなわち、２−メルカプトエタノ
ール又は２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩
の濃度を変えることにより螢光標識抗体のＦ／Ｐ
値を調節できる。
本発明方法により得られるDACM標識抗体の
Ｆ／Ｐ値と、DACMの添加濃度との間には、第
２図に示すような一定の関係のあることが認めら
れた。この図から明らかなように、本発明方法に
よれば、DACM濃度を変えることにより、任意
のＦ／Ｐ値を有するDACM標識抗体を得ること
ができる。
Ｆ／Ｐ値と、DACMの添加濃度との間には、第
２図に示すような一定の関係のあることが認めら
れた。この図から明らかなように、本発明方法に
よれば、DACM濃度を変えることにより、任意
のＦ／Ｐ値を有するDACM標識抗体を得ること
ができる。
実施例
抗ヒトIgGウサギ血清IgG（16mg／ml、DAKO
−イムノグロブリンズａ／Ｓ社製）１mlに同量の
1.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.2）を加え、0.8％
（Ｗ／Ｖ）抗ヒトIgGウサギ血清IgGの0.55Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH8.2）を調製する。２−メルカ
プトエタノール（東京化成社製）37μを再蒸留
水５mlに溶解して100mM溶液を調製し、その80
μｌを前記の0.8％抗ヒトIgGウサギ血清IgG緩衝
溶液２mlに加え、この混合液を室温で１時間反応
させる。
−イムノグロブリンズａ／Ｓ社製）１mlに同量の
1.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.2）を加え、0.8％
（Ｗ／Ｖ）抗ヒトIgGウサギ血清IgGの0.55Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH8.2）を調製する。２−メルカ
プトエタノール（東京化成社製）37μを再蒸留
水５mlに溶解して100mM溶液を調製し、その80
μｌを前記の0.8％抗ヒトIgGウサギ血清IgG緩衝
溶液２mlに加え、この混合液を室温で１時間反応
させる。
次いでDACM（和光純薬社製）10mgを3.35ml
のアセトンに溶解して最終濃度10mM溶液を調製
し、この溶液0.8mlを前記の混合液に加え、更に
室温で１時間反応させる。この反応溶液をシーム
レスセルロース透析膜チユーブ（ヴイスキング社
製、８／32型）に入れ、４℃で12時間、大量の
5mM燐酸ソーダ緩衝液（PH7.4）に対して透析
し、透析後セルローズチユーブ内の溶液をセフア
デツクスＧ−50（フアルマシア社製ゲル過剤）
を充填したカラム（フアルマシア社製、C26／40
型）により、0.9％食塩を含む5mM燐酸ソーダ緩
衝液（PH7.4）を用いてゲル過し、最初に流出
してくる蛋白分画を採取する。この蛋白分画を限
外過機（アミコン社製、202型）によりダイア
フローメンブレン（アミコン社製、PM10型）を
用いて任意の蛋白濃度に濃縮し、目的のDACM
標識抗体の蛋白分画を得る。
のアセトンに溶解して最終濃度10mM溶液を調製
し、この溶液0.8mlを前記の混合液に加え、更に
室温で１時間反応させる。この反応溶液をシーム
レスセルロース透析膜チユーブ（ヴイスキング社
製、８／32型）に入れ、４℃で12時間、大量の
5mM燐酸ソーダ緩衝液（PH7.4）に対して透析
し、透析後セルローズチユーブ内の溶液をセフア
デツクスＧ−50（フアルマシア社製ゲル過剤）
を充填したカラム（フアルマシア社製、C26／40
型）により、0.9％食塩を含む5mM燐酸ソーダ緩
衝液（PH7.4）を用いてゲル過し、最初に流出
してくる蛋白分画を採取する。この蛋白分画を限
外過機（アミコン社製、202型）によりダイア
フローメンブレン（アミコン社製、PM10型）を
用いて任意の蛋白濃度に濃縮し、目的のDACM
標識抗体の蛋白分画を得る。
この蛋白分画がDACMにより螢光標識されて
いることは、吸収スペクトラムの最大波長が
395nmを示し、放出スペクトラムの最大波長が
468nmを示すこと、及び寒天平板電気泳動により
蛋白泳動部分と螢光発色部分とが一致することか
ら確認された。またこの蛋白が抗ヒトIgGウサギ
血清IgGであり、対応するIgGとのみ反応するこ
とは、ヒト血清及びヒトIgGを用いた二元拡散ゲ
ル内沈降反応及び免疫電気泳動法により得られた
沈降線が単一バンドを示すことから確認された。
いることは、吸収スペクトラムの最大波長が
395nmを示し、放出スペクトラムの最大波長が
468nmを示すこと、及び寒天平板電気泳動により
蛋白泳動部分と螢光発色部分とが一致することか
ら確認された。またこの蛋白が抗ヒトIgGウサギ
血清IgGであり、対応するIgGとのみ反応するこ
とは、ヒト血清及びヒトIgGを用いた二元拡散ゲ
ル内沈降反応及び免疫電気泳動法により得られた
沈降線が単一バンドを示すことから確認された。
実験例 １
Ｂ−リンパ球は、その表面にIgGを有すること
が知られている。実施例と同様の方法で製造した
DACM標識抗IgG抗体（Ｆ／Ｐ＝2.3）を用いて
正常人末梢血リンパ球を染色して蛍光顕微鏡で観
察したところ、細胞表面に顆粒状の蛍光が見ら
れ、Ｂ−リンパ球が特異的に染色されていること
が確認された。
が知られている。実施例と同様の方法で製造した
DACM標識抗IgG抗体（Ｆ／Ｐ＝2.3）を用いて
正常人末梢血リンパ球を染色して蛍光顕微鏡で観
察したところ、細胞表面に顆粒状の蛍光が見ら
れ、Ｂ−リンパ球が特異的に染色されていること
が確認された。
実験例 ２
実験例１と同じDACM標識抗IgG抗体を用い、
IgGを含んだ免疫複合体の沈着物が表面に存在す
る膜性腎症の糸球体を染色したところ、塊状の沈
着物が蛍光顕微鏡で明瞭に確認できた。
IgGを含んだ免疫複合体の沈着物が表面に存在す
る膜性腎症の糸球体を染色したところ、塊状の沈
着物が蛍光顕微鏡で明瞭に確認できた。
実験例 ３
抗糸粒体抗体は原発性胆汁性肝硬変症の患者の
血中に見られることが知られている。この抗体を
ネズミ胃壁細胞で吸収し、実験例１と同じ
DACM標識抗IgG抗体を用い、免疫蛍光間接法に
より観察したところ、抗糸粒体抗体が確認され
た。
血中に見られることが知られている。この抗体を
ネズミ胃壁細胞で吸収し、実験例１と同じ
DACM標識抗IgG抗体を用い、免疫蛍光間接法に
より観察したところ、抗糸粒体抗体が確認され
た。
以上の実験から本発明のDACM標識抗体が対
応する抗原に対し特異的結合反応を示すことが確
認された。
応する抗原に対し特異的結合反応を示すことが確
認された。
実験例 ４
蛍光抗体法に用いる標識抗体には、非特異的結
合性の少ないものが要求される。そこで通常の蛍
光抗体法に用いられるFITC標識抗体と本発明の
DACM標識抗体とを用いて非特異的結合性の検
討を行つた。
合性の少ないものが要求される。そこで通常の蛍
光抗体法に用いられるFITC標識抗体と本発明の
DACM標識抗体とを用いて非特異的結合性の検
討を行つた。
FITC標識抗ヒトIgGウサギ血清IgG（Ｆ／Ｐ＝
2.3）、DACM標識抗ヒトIgGウサギ血清IgG
（Ｆ／Ｐ＝2.3）および未標識抗ヒトIgGウサギ血
清IgGを、それぞれ電気泳動にかけた結果、その
移動度はFITCを標識したものは−0.88×10-5
cm2／Volt／秒、DACMを標識したものは−1.00×
10-5cm2／VOlt／秒を示し、また未標識のものは
DACMを標識したものと同じ値を示した。
2.3）、DACM標識抗ヒトIgGウサギ血清IgG
（Ｆ／Ｐ＝2.3）および未標識抗ヒトIgGウサギ血
清IgGを、それぞれ電気泳動にかけた結果、その
移動度はFITCを標識したものは−0.88×10-5
cm2／Volt／秒、DACMを標識したものは−1.00×
10-5cm2／VOlt／秒を示し、また未標識のものは
DACMを標識したものと同じ値を示した。
FITC標識抗体ではFITCが抗体に結合するこ
とにより、負の荷電を帯びるため、Ｆ／Ｐ値が大
きくなる程、電気泳動による陽極方向への移動度
が大きくなることが知られている。このことは本
実験例４において、FITC標識抗ヒトIgGウサギ
血清IgGが、未標識のものに比較して陰極側への
移動度が少なかつたことから確認できた。FITC
が標識された結果、負の荷電を帯びた標識抗体
は、正の荷電を帯びる生体組織標本に対し非特異
的結合性を示すため、できるだけ負の荷電の少な
い、換言すればＦ／Ｐ値の小さい（２以下が望ま
しい）FITC標識抗体が必要とされている。一
方、本実験例４で用いたDACM標識抗ヒトIgGウ
サギ血清IgGは、Ｆ／Ｐ値が2.3であるにもかかわ
らず、未標識のそれと同値の電気泳動移動度を示
した。これはDACMが抗体に結合しても荷電に
変化を与えないことを意味する。このことから負
の荷電を帯びない本発明のDACM標識抗体は、
負の荷電を帯びるFITC標識抗体に比べて、生体
組織標本に対する非特異的結合性のないことが確
認された。
とにより、負の荷電を帯びるため、Ｆ／Ｐ値が大
きくなる程、電気泳動による陽極方向への移動度
が大きくなることが知られている。このことは本
実験例４において、FITC標識抗ヒトIgGウサギ
血清IgGが、未標識のものに比較して陰極側への
移動度が少なかつたことから確認できた。FITC
が標識された結果、負の荷電を帯びた標識抗体
は、正の荷電を帯びる生体組織標本に対し非特異
的結合性を示すため、できるだけ負の荷電の少な
い、換言すればＦ／Ｐ値の小さい（２以下が望ま
しい）FITC標識抗体が必要とされている。一
方、本実験例４で用いたDACM標識抗ヒトIgGウ
サギ血清IgGは、Ｆ／Ｐ値が2.3であるにもかかわ
らず、未標識のそれと同値の電気泳動移動度を示
した。これはDACMが抗体に結合しても荷電に
変化を与えないことを意味する。このことから負
の荷電を帯びない本発明のDACM標識抗体は、
負の荷電を帯びるFITC標識抗体に比べて、生体
組織標本に対する非特異的結合性のないことが確
認された。
実験例 ５
FITC標識抗体と本発明のDACM標識抗体を用
いて、紫外線に対する抵抗性を調べた。
いて、紫外線に対する抵抗性を調べた。
同じＦ／Ｐ値を示すFITC標識抗体及びDACM
標識抗体を波長395nm及び470nmの光線で暴露
し、蛍光の消退を蛍光光度計（日立製作所製分光
光度計MPF−３型）により測定した。その結果
を第３図に示す。
標識抗体を波長395nm及び470nmの光線で暴露
し、蛍光の消退を蛍光光度計（日立製作所製分光
光度計MPF−３型）により測定した。その結果
を第３図に示す。
この図から明らかなように、本発明のDACM
標識抗体は蛍光の褪色が非常に少ないので、蛍光
顕微鏡をを用いる蛍光抗体法による生体組織中の
特異抗原物質検出用蛍光標識抗体として極めて有
利である。
標識抗体は蛍光の褪色が非常に少ないので、蛍光
顕微鏡をを用いる蛍光抗体法による生体組織中の
特異抗原物質検出用蛍光標識抗体として極めて有
利である。
第１図は本発明のDACM標識抗体の励起スペ
クトラム及び蛍光スペクトラム、第２図は本発明
の製造方法によりDACMの添加量を変えた場合
の抗体結合蛍光色素量比（Ｆ／Ｐ）を示すグラ
フ、第３図は励起光照射によるDACM標識抗体
とFITC標識抗体の蛍光の褪色速度を示すグラフ
である。
クトラム及び蛍光スペクトラム、第２図は本発明
の製造方法によりDACMの添加量を変えた場合
の抗体結合蛍光色素量比（Ｆ／Ｐ）を示すグラ
フ、第３図は励起光照射によるDACM標識抗体
とFITC標識抗体の蛍光の褪色速度を示すグラフ
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Ｎ−（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマ
リニル）マレイミドで標識した螢光標識抗体。 ２ 抗体を２−メルカプトエタレール又は２−メ
ルカプトエタノールアミン塩酸塩で処理し、次い
でＮ−（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリ
ニル）マレイミドと反応させたのち、２−メルカ
プトエタノール又は２−メルカプトエタノールア
ミン塩酸塩を除去することを特徴とする、Ｎ−
（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリニル）
マレイミドで標識した螢光標識抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15379681A JPS5855861A (ja) | 1981-09-30 | 1981-09-30 | 新規な螢光標識抗体及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15379681A JPS5855861A (ja) | 1981-09-30 | 1981-09-30 | 新規な螢光標識抗体及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5855861A JPS5855861A (ja) | 1983-04-02 |
| JPS6149624B2 true JPS6149624B2 (ja) | 1986-10-30 |
Family
ID=15570311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15379681A Granted JPS5855861A (ja) | 1981-09-30 | 1981-09-30 | 新規な螢光標識抗体及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5855861A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016129444A1 (ja) * | 2015-02-12 | 2016-08-18 | コニカミノルタ株式会社 | 抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キット |
| US11105807B2 (en) | 2015-09-28 | 2021-08-31 | Konica Minolta, Inc. | Method for estimating pathological tissue diagnosis result (Gleason score) of prostate cancer |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6432170A (en) * | 1987-07-29 | 1989-02-02 | Agency Ind Science Techn | Production of novel fluorescent labeled antibody |
| US7563891B2 (en) * | 2004-05-21 | 2009-07-21 | Becton, Dickinson & Company | Long wavelength thiol-reactive fluorophores |
| JP7171702B2 (ja) * | 2018-03-23 | 2022-11-15 | 大塚製薬株式会社 | 標識化抗体分散液、ｓｐｆｓ用キット |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5113035A (en) * | 1974-07-23 | 1976-02-02 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | Nainenkikanno jidontensochi |
| JPS53124682A (en) * | 1977-04-08 | 1978-10-31 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Preparation of complex of enzyme and bioactive substance and its use |
-
1981
- 1981-09-30 JP JP15379681A patent/JPS5855861A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016129444A1 (ja) * | 2015-02-12 | 2016-08-18 | コニカミノルタ株式会社 | 抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キット |
| JPWO2016129444A1 (ja) * | 2015-02-12 | 2017-11-24 | コニカミノルタ株式会社 | 抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キット |
| US11105807B2 (en) | 2015-09-28 | 2021-08-31 | Konica Minolta, Inc. | Method for estimating pathological tissue diagnosis result (Gleason score) of prostate cancer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5855861A (ja) | 1983-04-02 |
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