JPS61500611A - 抗イデイオタイプ抗体によって誘発される、腫瘍およびウイルスに対する免疫応答 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗イデイオタイプ抗体によって誘発される、腫瘍およびウィルスに対する免疫応 答 〔技術分野〕 この発明は、抗原、特に腫瘍やウィルスに対する免疫学的反応を誘発することに 関するものである。さらに詳細には、この発明は、このような免疫学的反応の誘 発に対するアンチイディオタイプ抗体の使用、並びに、抗体およびこれを産生ず るセルラインに関するものである。

〔発明の背景〕

（ＶＬ）の可変領域中のアミノ酸配列は、抗原結合部位（すなわちパロトープ］ 中に、特異的な抗原と上記抗体とを相互作用させるコンホメーションを形成する 。

異種の受容体動物に免疫グロブリンを注射すると、抗ゼノタイプ（種に特異的な 〕、抗アイソタイプ（免疫グロブリンのクラスに特異的な）および抗イデイオタ イプ（抗体の可変領域に特異的な〕抗体を作ることになる。抗イデオタイプの抗 体には２種の機能的クラスが存在することができ、その１つはパロトープに作用 するものであり、他の１つはＨｊｌｌおよび／またはＬ鎖（Ｄ７Ｌ／−ムワーク に作用するもの（フレームワーク決定基）である。一般的に、ジ五−ハ、二ニー ・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ、Ｅｎｇｌ　、Ｊ　。

Ｍｅｄ、）　３０５巻２５−２８頁（１９８１年）、ジエーン、アナレス・デ・ イミノロジー（Ａｎｎ　、Ｉｒｒｍｕｎｏ　ｌ　、）１２５巻Ｃ２３７３−３８ ９頁（１９７４年）参照＠〔発明の概要〕 この発明は、腫瘍、特に固形腫瘍のような腫瘍や狂犬病ウィルスのようなウィル スに対する免疫学的応答を誘発させる方法を提供することを目的とするものであ る。

この発明は、上記のような免疫学的応答の生起に抗イデイタイプ抗体を使用する ことをも目的としている。

さらに他のこの発明の目的は、腫瘍特に固形Ｗ１瘍や狂犬病ウィルスのようなウ ィルスに対し、免疫学的応答を誘導するのに有用なモノクロナール抗イデイオタ イプ抗体および上記抗体のためのイモータル（不死）Ｂリンパ球源を提供するこ とにある。

そして、本発明における上述および他の目的は、１あるいはそれ以上の後述の実 施態様によって達成され実施態様の１つとして、この発明は、腫瘍またはウィル スから選択した抗原に対する免疫学的応答を誘発する方法において、 （ａ）抗イデイオタイプ抗体をもたらし、上記抗イデイオタイプ抗体によって同 定されるエピトープは抗腫瘍または抗ウイルス抗体のパトロープであり、（ｂ） 上記抗イデイオタイプ抗体をひとに投与することにより腫瘍細胞またはウィルス 粒子上のエイトープを同定する抗（抗イディオタイプ〕抗体の産生を患者に促す こと からなる方法を提供するものである。

この発明は、ポリクローナル抗イデイオタイプ抗体であって、上記抗イデイオタ イプ抗体によって同定されるエピトープが実質的に抗アイソタイプ抗体を含まな い抗腫瘍および抗ウイルス抗体のパロトープであるものをも提供するものである 。

他の実施態様としては、この発明は、抗イデイオタイプ抗体であって上記抗イデ イオタイプ抗体によって同定されるエピトープが抗腫瘍および抗ウイルス抗体の パロトープである抗体を産生するイモータルＢのリンパ球を提供するものである 。

適当な腫瘍は、固形消化器系腫瘍のような固形腫瘍である。適当なウィルスは、 インフルエンザ、単純性ヘルペス、肝炎、および特に狂犬病ウィルスである。

この発明にしたがって抗イデイオタイプ抗体の投与に際しては、対象、特に哺乳 類、ざらにひとを刺激して、腫瘍細胞またはウィルス粒子上のエピトープを同定 する抗（抗イディオタイプ〕抗体を産生させる。

〔発明の詳細な記載〕

本発明は、がん療法およびウィルス免疫に対して独特な万策を提供する。従来、 腫瘍療法における万策は。

腫瘍を破壊しようと意図する患者に対し抗ＷＬ瘍抗体（すなわち、固形＊ｇ細胞 上のエピトープを同定する抗体〕を投与することを意味した。従来、抗ウイルス 療法は調製ワクチンによる免疫を意味した。しかしながら、本出願人は、腫瘍ま たはウィルス抗原を認識する抗体に対して抗イデイオタイプな抗体によって、患 者自身の腫瘍あるいはウィルスに対する免疫応答を引き起こさせうることを発見 した。この免疫応答を誘導するのは、治療法として有益であり、少なくともウィ ルスの場合には、予防法として有益である。

出願人は、実施に関する゛いかなる特定の理論とも結びつくことを望まないが、 本発明によって達成される上記免瘍応答は、抗イデイオタイプ抗体分子と患者の 免疫系との間の相互作用のため起こると思われる。抗イデイオタイプ抗体分子の イディオタイプ（すなわち可変〕領域は、患者によって抗原と見なされる抗原決 定基（エピトープ）を含む。これは、患者に抗（抗イデイオタイプ）抗体の産生 を誘発させる。抗（抗イデイオタイプ）抗体のセットの中には、抗イデイオタイ プ抗体のパロトープに対して直接相補的なものがある。

抗−イディオタイプ抗体のバロトープは、イディオタイプ抗体によって同定した （すなわち選択的に結合した）腫瘍細胞またはウィルスのエピトープの「内部の 」イメージを現出させ、したがって、抗（抗イデイオタイプ）抗体は、腫瘍また はウィルスの抗原にも結合すると考えられる。実際２本号法は、患者の産生ずる 抗体の一部に腫瘍またはウィルス抗原と本質的に区別がつかない抗原（抗イデイ オタイプ抗体のバロタイプ）を出現させることにより、腫瘍およびウィルスに対 する免疫応答を誘発する。

意外にも、上記方法は、腫瘍成長を抑制し、または。

ウィルスに対する免疫応答を誘発するための効果的方法である。さらに、多くの 従来方法に対していくつかの長所を持っている。第１＆ζ、はとんどの外来抗原 を患者に投与する必要がない。第２に、患者の抗イデイオタイプ応答が、目めと する効果に対して有利であり。

決定的である。第３に、患者自身の抗体が抗腫瘍または抗ウイルス抗体であり、 したがって、外因性抗腫瘍抗体を繰り返し投与する必要性が除かれる。他の利点 は当業者に容易に理解される。

抗体のイディオタイプは、抗体分子の可変領域またはイディオタイプ領域におけ る個々の明白な抗原決定基によって定義される。これらのイディオタイプ抗原決 定基の一部は抗体のパワトープ上またはその近接位にあり、他のものは可変領域 のフレームワーク中にある。各々の抗体がそれ自身のイディオタイプを持つが、 以下、特定の抗体は下記の用語によって示す。「イディオタイプ抗体」または「 ｌｄ　ＡｂＪは、抗腫瘍または抗ウイルス抗体（すなわち、イディオタイプ抗体 によって同定されるエピトープは腫瘍細胞またはウィルス粒子上に存在する）を 意味する。「抗イデイオタイプ抗体」または「抗Ｉｄ　Ａｂｊは、イディオタイ プ抗体の可変領域上のエピトープを同定する抗体を意味する。そのような抗体の 一部は、イディオタイプ抗体のパロトープであるエピトープを同定し、従って、 イディオタイプ抗体によって同定される腫瘍細胞上のエピトープの「内部」イメ ージを現わす。「抗（抗イデイオタイプ）抗体」または「抗（抗Ｉｄ）ＡｂＪは 、抗イデイオタイプ抗体の可変領域上のエピトープを同定する抗体である。抗（ 抗イデイオタイプ）抗体の一部は、（Ｎ）抗イデイオタイプ抗体のパロトーブお よびφン腫瘍細胞上のエピトープに対応するエピトープを同定する。

後記のように、この発明の方法は、宿主生物に抗イデイオタイプ抗体を投与する ことを企図している。抗イデイオタイプ抗体は生理学上適切な任意の担体（例え ば、減菌した発熱性物質不含の生理食塩水）中に入れて宿主に投与し、その製剤 は当業界で公知である。

担体の選択は、限定的なものではなく、抗体は、これを循環系に投入する任意の 方法（例えば静脈内、筋肉内マたは皮下注射）によって投与することができる。

宿主生物は、どんな動物でもよいが、最も一般にはひとであり、ウィルスの場合 ねこまだはいぬも加わる。

宿主に投与する大低の抗体の量は、例えば用いられる個々の抗体および接種され る患者によって、広範囲に変化する。患者の免疫系によって抗（抗イデイオタイ プ）抗体が産生されるのを刺激するのに十分な量の抗イデイオタイプ抗体を投与 することのみが必要条件である。しかしながら、免疫反応を誘発するにはほんの 少量の抗体しか必要としないので、用いる抗体の総量は極めて多い必要はない。

多くの場合、抗体の投与量は、数マイクログラムから数ミリグラム（例えば約、 ５０−２００μｇ　から約１−５η〕の範囲内で十分である。適当な投与量の決 定は当業者により容易になしイオタイブ抗体含有製剤を投与して、腫瘍、例えば 固形腫瘍（すなわち、白血病のような分散性循環性悪性細胞ではなく、がん、肉 腫、メラノーマ等によって生ずる悪性細胞の固形塊）に対する免疫応答を起すこ とを意図している。好ましい実施態様では、腫瘍は胃腸の腫瘍である。

上記のように抗イデイオタイプ抗体のサブクラスは、抗腫瘍、抗体のパロトープ （イディオタイプ抗体）と選択的に結合（すなわち同定］する。抗イデイオタイ プ抗体を含む製剤は、抗イデイオタイプ抗体のバロトープがウィルス抗原の内部 イメージである宿主に投与することができる。このような抗体は、対応するイデ ィオタイプ抗体のパロトープであるエピトープを認識する。腫瘍またはウィルス 抗体の内部イメージを現す抗イデオタイプ抗体は、数種の方法のうち任意のもの によってイディオタイプ抗体の可変領域におけるフレームワーク決定基を認識す る抗イデイオタイプ抗体と識別することができる。希望する抗イデイオタイプ抗 体を同定する方法の１つには、腫瘍またはウィルス抗原（また入手可能であれば 、ハプテンン、イディオタイプ抗体、および抗イデイオタイプ抗体との間の競合 結合分析がある。もし抗原がイディオタイプ抗体に対する抗イデイオタイプ抗体 の結合を妨害するなら、抗イデイオタイプ抗体で同定されるエピトープは、イデ ィオタイプ抗体のパロトープと近い関係１こある。別の試験方法は、抗イデイオ タイプ抗体に対する抗血清が抗腫瘍またはウィルス抗体でもあるかどうかを決定 するものである。適当な抗イデオタイプ抗体を同定する上記および他の方法は、 当業者に公知の範囲内にある。

宿主に投与する製剤は、フレームワーク決定基に対する抗−イディオタイプ抗体 と共に、イディオタイプ抗体のパロトープに対するサブクラスを包含することが できる。製剤が、イディオタイプ抗体のパロトープに対するサブクラスを包含す ることだけが必要である。

用いられた抗イデイオタイプ抗体は、宿主に対し同種または異種抗体であってよ い。しかしながら、ひとにとって好ましい抗体は、抗体分子のＣ領域に対する免 疫反応が最小であるひと抗体である。しかし、この発明においては比較的少量の 抗イデイオタイプ抗体しか必要としないので、異種抗体（例えば、マウス、ラッ ト、やぎ、家兎など〕を用いてよい。また、異種抗イデイオタイプ抗体に対して 重要な反応がない場合には、このような抗体は製造の容易さおよびコストの点か ら好ましい場合がある。さらに、モノクローナル抗イデイオタイプ抗体と同様に 、ポリクローナル抗イデイオタイプ抗体を用いることができる。

ポリクローナル抗イデイオタイプ抗体は、当業界で知られた従来法によって製造 できる、例えば、ポリクローナル抗１ｄ　Ａｂは、動物をモノクローナル抗腫瘍 またはウィルス抗体（例えば、Ｉｄ　Ａｂ）で免疫することによって産生できる 。免疫した動物は、抗ＬｄＡｂを産生ずる。この抗血清中の抗イデイオタイプ抗 体のサブクラスは、抗腫瘍またはウィルス抗体のバロトープであるエピトープを 同定する。例えば、動物から採取した抗血清は、（ｉ）抗血清から抗アイソタイ プ抗体を除去するための、モノクローナルＩｄ　Ａｂとしては同じアイソタイプ であるが、別のイディオタイプの固定化抗体、および、Ｃ）そのサブクラスが腫 瘍およびウィルス抗原の内部イメージを現す抗Ｉｄ　Ａｂを除去するための、固 定化モノクローナルＩｄ　Ａｂ、を用いた、系列吸収によって精製できる。次い で、抗Ｉｄ　Ａｂを結合モノクローナル抗腫瘍およびウィルス抗体から溶離して 抗アイソタイプ抗体を実質的に含まない溶液を得る。この溶液は、Ｉｄ　Ａｂの パロトープを同定する抗Ｉｄ　Ａｂの存否を分析することができる。

実質的に他の抗体を含まないモノクローナル抗イデイオタイプ抗体は、イモータ ルＢリンパ球を実質的にンバ球」の語は、ハイブリドーマ（体細胞が、正常およ び悪性りンバ球と交雑したもの〕、および、ウィルス（例えば、エプスタイン・ バール・ウィルス）または発癌性ＤＮＡによって形質転換された正常リンノ寸球 のような、数ケ月間（好ましくは無限に）培養物中に維持されうる比較的安定し た連続抗体産生細胞を包含する。抗イデイオタイプ抗体を産生ずる正常Ｂリッツ ｆ球からイモータルＢりンパ球を産生ずる技術は当業界で公知である。　「モノ クローナル・アンテイボディーズ」（アール・エイチ・ケネット、ティ・ジエイ ・マクリーンおよびケイ・ビー・ピートル編、１９８０年〕；エム・シュライヤ ーら著、「ノ翫イブリドーマ・テクニック」（コールド・スプリング・）翫−／ イー・ラドラトリー、１９８０年】；「モノクローナル・アンテイボデーズ・ア ンド・ティーセル・ハイブリドーマズ（ジー・ジエイ９ハーマーりング、ニー・ ／１−マーリングおよびジエイ・エフ・キーネイ、１９８１年）；コズパーら著 、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（アメ リカ、１９８２年）７９巻６６５１−６６５５頁；ジョナら著、「ハイプリード ーマＪ（１９８３年）２巻１２４頁：「モノクローナル・′アンテイボデイズ・ アンド・ファンクショナル・セル・ライング」（アール・エッチ・ケネット、ケ ー・ビー・ビートル、およびティ・ジエイ・マッキーン編、１９８３年）：コズ パーら著、「イムノロジー・ツデイＪ（１９８３年）４巻７２−７９頁を参照。

抗Ｉｄ　Ａｂを産生じ、イモータルＢ　ＩＪンバ球の産生に適している正常ＢＩ Ｊンバ球は、当業界で公知な方法の変法で提供される。例えば、ラットまたはマ ウスのような動物をモノクローナル抗腫瘍または抗ウイルス抗体で免疫し、抗Ｉ ｄ　Ａｂを産生するＢ　１３ンパ球を動物の胛臓から採取することができる。抗 ＩｄＡｂを産生ずるひと３９７８球は、モノクローナル抗腫瘍またはウィルス抗 体を用いて患者を免疫することによって得られる。患者から末梢血リンパ球を採 取し、モノクローナル抗腫瘍またはウィルス抗体によって培養物を刺激して抗− Ｉｄ　Ａｂを産生ずる３９７８球のインビトロでの生育を誘導する。デフレイテ スら著、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス （アメリカ、１９８２年〕７９巻。

６６４６−６６５０頁参照。従って、抗Ｉｄ　Ａｂを産生ずる、動物またはひと の３９７８球は、当業界で公知の方法により採取し固定することができる。もち ろん、腫瘍細胞またはウィルス抗原の内部イメージを現出する抗Ｉｄ　Ａｂを産 生ずるこれらのリンパ球は、イディオタイプ領域上のフレームワーク、決定基に 対する抗１ｄ　Ａｂを産生するＢ　＋Ｊンバ球と区別されることが必要である。

腫瘍に適用するこの発明の方法はまた。アメリカ特許第４１０８９８３号に記述 されるウィルス性腫瘍細胞破壊ワクチンの様な、腫瘍に対する免疫反応を誘発す る他の方法と共に実施することができる。ウィルスに関しては、ウィルスの場合 、所望により、宿主哺乳類でおこる免疫応答は上述と同様に抗Ｉｄ　Ａｂを投与 することｆこ加えて公知のウィルスワクチンで免疫することによっていっそうさ かんになる。抗（抗ＩｄＡｂ）の産生が抗Ｉｄ　Ａｂを投与することによって宿 主哺乳類に誘発された後（例えば投与後約２週間）、宿主に当業界で公知の従来 技術を用いてウィルス・ワクチンの１回接種を行う（例えば　ＨＤＣ狂犬病ワク チンのような不活性化ウィルスワクチン）、ブロッキンら著、アメリカン・ジャ ーナル・オブ・エビデミオロジー（１９７６年）１０３巻、７５−８０頁：ウィ クターラ著、ラビーズ・ワクジン・フォー・ヒユーマン・ユース、４０号３−９ 頁（１９７８年〕参照。投与におけるワクチンの型および実験方法はこの分野の 技術で公知である。次に示す例は１本発明の説明であり、発明の範囲を限定する ものではない。

実施例１　腫瘍抗体 （モノクローナルイディオタイプ抗体ン次に示す実験では、ひと消化器系癌細胞 と結合しているマウス・モノクローナル抗体１７−　Ｉ　Ａ、Ｃ４２０３２およ びＣ４１４７２を使用した。これらは、バーリンら著、プロシーディング・オブ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（アメリカ、１９７９年）　７６ ７１４３８−１４４２頁およびコブロフスキー著、モノクローナル・アンティボ ディ・イン・キャンサーの中で「生体内でのモノクローナル抗体」として：プロ シー・ラングマン、アイ・ドロウブリッジおよびダルベツコ編、１９８３年〕に 記述されている。モノクローナル抗体（ＭＡ　ｂ　）　、　Ｃ４２０３２ハＭｒ 　１８０．１６０゜５０および４０にの結腸直腸癌腫（ＣＲ（：Ｊ結合抗体に対 する特異性を有している。Ｍ　Ａ　ｂ　（：４１４７２　（Ｉ　ｇＧ２すは、Ｃ ＲＣ結合抗原Ｍｒ　５　Ｑ　Ｋ　に対する特異性を有している。肝炎ウィルスに 対するＭＡｂ　Ａ３Ｃ５も用いられるが、これについてはバンズら著、プロシー ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（アメリカ、１９ ８１年）７８巻、１２１４−１２１８頁で記述されている。ＭＡｂ１７−１Δ（ ＩｇＧ２Ａ、ルＬ鎖）およびＣ４２０Ｃ４２０３２（Ｉ、　ＸＬ鎖）は、アイら 著、イムノケミストリー（１９７８年）１５巻、４２９−４３６頁で記述されて いるようにプロティンＡ・セファロース・カラム（ファルマシア、ビスカドアウ ェイ、ニュージャーシーツでアフィニティークロマトグラフィーにかけることに よって、ハイブリドーマ担持マウスから得た腹水から精製される。

（患者〕 患者は全て転移性で再発性の結腸直腸腺癌を持っていて、シアーズら著、ランセ ット（１９８２年）７６２−７６５頁で発表されている方法を用いて、Ｂａ１ｂ 、／Ｃマウスの腹水から濃縮したＭＡｂ　１７−ＩＡの精製された発熱性物質不 含の滅菌製品を１回の投与で全身的に注射した。Ｍａｂｌ？−ＩＡ　１９２”’ ９以下ヲ注入した９患者のうち７患者は抗マウスグロブリン抗体を発生した。モ ノクローナル抗体２００−１０００１９を受けた２０患者のうち、３患者が抗マ ウスグロブリン抗体を発生した。抗マウスグロブリン抗体を発生した最初のグル ープの３患者（患者番号０７．０８および０９）の血清および２番目のグループ の２患者（番号１４および２３）の血清を、抗イデイオタイプ抗体を単離するた めに選択または処理した。患者番号０７．０８および２３から抗イデイオタイプ 抗体を単離するために用いた血清は、３患者すべてが高濃度の抗マウスグロブリ ン抗体を示した時に得られた。患者番号０８は、最初の注射の後２０ケ月目にモ ノクローナル抗体１３０ηの２回目の注射を受け２回目の注射の後得られた血清 を抗イデイオタイプ抗体の存否を調べるスクリーニングテストに用いた。

（ポリクローナル抗イデイタイプ抗体の製造）精製したＭＡｂ　１７−ＩＡ３０ ０μｆをフロイント混合アジュバントで乳化したものを、ニュージランド白うさ ぎの多部位に皮下注射し、３０日後面ノクローナル抗体１００μｍを筋肉注射で 増強した。二度目の反応の１０日後面清を採取した。

抗血清を固定化Ｍ　Ａ　ｂ　Ｃ４２０３２およびＭＡｂ１７−ＩＡで吸収させた 。精製モノクローナル抗体（各々３０岬）を、アフイ・ゲル１０〔パイオーラッ ド・ラボラトリーズ、リッチモンド、カリフォルニア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌ＠ｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ　）　）　２　ａｔと結合させた 。ついで、抗血清を、抗アイソタイプおよび抗イデイオタイプ抗体をそれぞれ取 り除くために免疫吸着剤ＭＡｂ　Ｃ４２０３２およびＭＡｂ　１７−ＩＡに連続 吸収させた。吸収した抗体を、０．１　Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２，８）で溶出 し、直ちに燐酸緩衝液で中和し、燐酸緩衝生理食塩水で透析し、蛋白質を２９　 Ｑ　ｎｍ　（Ｅ”％　−１４）の吸光度で定量した。

ＭＡｂ　１７−１Ａを１回注射した後患者から得られた抗血清も、上で述べたと 同様にして精製した。それぞれＭＡｂ　１７−ＩＡを７５０岬を投与した患者番 号２３゜およびＭＡｂ　１？−ＩＡを１３３および１２５Ｗｉ投与した患者番号 ０８および＆０７由来の血清は、抗体を最初に注射した後、種々の時期に採取し た。

ラジオイムノアッセイ法によって抗ムリンＩｇＧ抗体を含有していることが°分 かった試料を、それぞれ上述と同様に抗アイソタイプおよび抗イデイオタイプ抗 体を除去するために、免疫吸着剤ＭＡｂ　Ｃ４２０３２およびＭＡｂ　１７−Ｉ Ａで十分に吸収させた。血清から分離した抗イデイオタイプ抗体は、■でラベル した抗ひとＦ　（ａｂ’　）、、フラグメントに結合することにより免疫グロブ リンであることを示した。血清試料から得た抗イデイオタイプ蛋白の収量はそれ ぞれ異なって、＆０８より１３μダ／ａｔ　、　Ｆａ　Ｏ７より８．９μｆ／ｍ ｅ、および黒２３より４３μｆ／ｊＥｔであった。最も高い水準の抗マウス免疫 グロブリン抗体を示した血清黒２３から最も多くの量が得られた。

（抗イデイオタイプ抗体の存否を調べるための血清スクリーニング法） 血清試料について抗イデイオタイプ抗体の存否を調べるために、競合分析を、ｌ 　でラベルしたＭＡｂ１７−ＩＡと予備インキュベートした４種のひと血清と家 兎抗イデイオタイプ抗体を用いて行なった。

４分の１インチ（６，３５ｙ）粒径のポリスチレン・ビーズ〔プレシジョン・プ ラスチック・ボール・コーポレイション、シカゴ、イリノイ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏ ｎ　ＰｌａｓｔｉｃＢａｌｌ　Ｃｏ、、　Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ〕〕　を９５チ エタノールで３回洗浄した。風乾したビーズを、０．０２Ｍテトラはう酸ナトリ ウム（Ｐ２Ｏ，２）で希釈した家兎またはひとの抗イデイオタイプ抗体と共にイ ンキュベートした。

緩やかに振とうしながら４℃で一夜培養した後、ビーズを燐酸緩衝生理食塩水で ３回洗浄し、２チうし血清アルブミンおよび０．０４％Ｎ　＠Ｎ　ａを含有する 燐酸緩衝生理食塩水を用いて、室温で少なくとも３時間インキュベートした。つ いで、ビーズをひと抗イデイオタイプ抗体源と予備インキュベートしたイディオ タイプの基準として１２５Ｉ　でラベルしたＭＡｂ　１７−ＬＡに露した。すな わち、ひと血清をＣａＺ＋およびＭｇ２＋を含まない燐酸緩衝生理食塩水で２５ チの濃度に希釈し、２％うし血清アルブミンおよびｏ、０４チＮ　ａ　Ｎ　３　 を補った。さらに−夜培養を続けた後、ビーズを洗浄し、ガンマ−線測定器で結 合放射能を測定した。

モノクローナル抗体（番号２３．０９または１４，１１回注射後に得られた血清 中３つは、モノクローナル抗体注射前より高いＭＡｂ　１７−ＩＡに対する結合 阻害を示した。患者番号１４のモノクローナル抗体注射後血清が得た結合阻害値 は、他の２種の血清に比べて低いが、同じ患者の血清が示すモノクローナル抗体 投与前の値よりも高力；つた。モノクローナル抗体を２回目に注射して７日後の 患者番号０８から得た血清の阻害値は、既に高かった。

（抗イデイオタイプ検出の競合分析ノ モノクローナル抗体Ｃ４２０３２、Ｃ４１４７２およびＡ３Ｃ５に対してと同様 にＭＡｂ　１７−ＩＡに対して、分離した抗イデイオタイプ抗体の結合を測定す るために上述と同様な方法で競合分析を行った。

結果は、３種の血清（番号０８．０７お上び２３）由来の抗イデイオタイプ抗体 のＭＡｂ　１？−ＩＡに対する結合性は、他の３種のモノクローナル抗体に対す るより顕著に高いことを示し、他の２種のモノクローナル抗体（Ｃ４２０３２お よびＣ４１４７２）も、結腸直腸の癌腫細胞上の抗原部位を検出した。しかし、 これらの部位はＮＡｂ　１７−ＩＡ認諏部位と異なっていた。ＭＡｂ１７−１八 にさらす前に３人の患者すべての血清から分離した免疫グロブリンを約２．５μ ｆ　／ｄに濃縮し、ポリスチレン・ビーズに結合した。しかしながら、上記製品 は試験したどのモノクローナル抗体とも結合せず、処理前の血清中に抗イデイオ タイプ抗体が存在しないことを示した。

（ひと抗イデイオタイプ抗体同志の交叉反応性］ひと抗イデイオタイプ抗体同志 の交叉反応があるが否かを決定するために競合分析を行った。

競合分析の結果は、下に示すように、患者番号０７および２３の抗イデイオタイ プ血清間で顕著な交叉反応を示し、患者番号０８および２３の抗イデイオタイプ 抗体間の交叉反応は少し弱い（しかし、それでも重要である〕。同様の交叉反応 が、患者番号０８から得たモノクローナル抗体処理前血清と患者番号０７の抗イ デイオタイプ血清との間に見られた（結果は示さない）。上述の結果は、他の患 者が産生じた抗イデイオタイプ抗体が、同じ抗原部位に向けらることを示してい る。

なし　４２９７ 抗−１ｄ２３　０７　前　４５９５　０後　１２３１　７１ ０８前　４０９７　５ 後　２５８５　４０ （抗イデイオタイプ抗体によって検出されたエピトープ） ＭＡｂ　１７−ＩＡに対するひと抗イデイオタイプ抗体の結合のバブテン阻害は 、抗イデイオタイプ抗体がイディオタイプ抗体のパロトープに対するものである ことを示すために行なった。

結腸直腸の癌から得た細胞株、ＳＷ　１２２２の３ＭＫＣ［抽出物を、バーリン ら著、〔ジャーナル・オブ・クリニカル−イムノロジー（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、　）　２巻１３５−１４０頁〕で述べられているのと同様に調製 した。この製剤はＭＡｂ　１７−Ｌ　Ａに結合し、この材料が可溶性の抗原を含 有することを示した。１２５にでラベルしたＭＡｂ１７−ＩＡをＣＲＣ細胞抽出 物およびＭＡｂ　１７−ＩＡに結合しないメラノーマの３ＭＫＣｌ抽出物とイン キュベートした。それから、抗体抗原混合物を、患者番号２３から得た抗イデイ オタイプ抗体で被覆したビーズに加え、その結合を放射性同位元素で標識したモ ノクローナル抗体のみの結合と比較した。これらの実験は、少量の競合ハプテン による結合の変化を検出するために、非飽和量のよう化モノクローナルを用いて 行った。対照として、よう化ＭＡｂ　１７−ＩＡをＭＡｂ　１７−ＩＡとは結合 しないことが知られている〆う／−マ由来の抽出物と混合した。濃度０，１また は０．５η／−のＣＲＣ細胞抽出物は、それぞれ３９％および６８哄で、患者番 号２３由来の抗イデイオタイプ抗体がよう化ＭＡｂ１７−ＩＡと結合するのを阻 害することが分かった。メラノーマ由来の抽出物は、０．５■／　ｍｅ以下の濃 度では、顕著にはモノクローナル抗体結合に効果を表わさない。

この結合反応のハプテン阻害は、抗イデイオタイプ抗体上のＣＲＣエピトープの 「内部イメージ」の現出を示す。このことは、ＣＲＣ細胞抽出物が抗イデイオタ イプ抗体と結合しないが、予想したようにＭＡｂ　１？−ＩＡに結合することに よっても確認された。

（ひと８９７３球による抗イデイオタイプおよび抗（抗イデイオタイプ）抗体の 産生） ＭＡｂ　１７−ＩＡを注射後、各々１２および６か月日の患者番号０８および２ ３から軟膜細胞を得た。デフレイタスら著、プロシーディング・オブ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンス（アメリカ、１９８２年）７９巻６６４６− ６６５０頁に述べられているように１７−ＩＡ　の１００ｇ／ｄＦ（ａｂ′）２ フラクメントテ細胞ヲ刺激した。続く７日間、細胞の一定量を２−アミノエチル イソウロニウムブロミドで処理したひつじ赤血球でロゼツト化することによって ＴおよびＢ細胞ポピユレーションに分離した。〔ペロリーノら著、クリニカル・ イムノロジー・アンド・イムノパスオロジ−（１９７５年〕３巻３２４−３３３ 　頁を参照。〕どちらの〕細胞ポピュレーションモ１７−ＩＡのＦ　（ａｂ’　 ）２フラグメントマタは抗−インフルエンザ・モノクローナル抗体およびやぎ抗 マウスＩ　ｇ−Ｆ　ＩＴＣで着色された。ついで細胞ポピユレーションをシトフ ルオログラフで分析した。さらに、同一患者由来の末梢血単核細胞を１７−ＩＡ 　のＦ（ａｂ′）２フラグメントまたは抗インフルエンザ・モノクローナル抗体 でデクレイタスら著（上述の文献）に述べられている特異的ひとＩｇを産生修飾 ミッシエルーダットン培養基中で９日間刺激した。これらの培養物から得た上清 を特異的ひとＩｇＧに対する固相酵素結合免疫吸収分析で分析した。〔ケイ・ピ ー・エル・ラボラトリーズ、ゲテルスブルグ、エム・ディ（ＫＰＬＬａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ　、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ　）　）患者番号０８の １７−ＩＡ　Ｆ（ａｂ’）ｚに初めに結合するリンパ球の比率は１．２％であり 患者番号２３のリンパ球は０．２％であった。ＭＡｂ　１７−ＩＡとインキュベ ートした７日間で１７−ＩＡ　のＦ　（ａ　ｂ’　）２と特異的に結合する患者 番号２３のリンパ球の比率は、０，２％から１３％に増加した。１７−ＩＡ　と 結合する細胞すべては、Ｂ細胞ポピユレーション中に存在した。さらに９日後、 ひと抗−ＭＡｂ　１７−ＩＡ　ＩｇＧ　が検出された。同条件下で抗インフルエ ンザ・モノクローナル抗体を用いて同じ患者由来のリンパ球をインキュベートし てもＭＡｂ　１７−ＩＡ４たは抗インフルエンザ・モノクローナル抗体に対する 検出可能なひとＩｇを全く産生じなかった。

別の実験で、抗（抗イデイオタイプ）抗体を産生ずるためにひとＢりンバ球を刺 激した。８９７８球を集め、イディオタイプ抗体ではな（自家性抗イデイオタイ プ抗体で刺激した点を除いて、上述の方法を用いてインビトロで刺激した。刺激 した８９７８球によって抗（抗イデイオタイプ）抗体を産生じ、これらの抗（抗 １ｄ）Ａｂ　はＣＲＣ細胞抽出物および全細胞上にあるエピトープを同定するこ とが示された。こうして、ひと免疫系は抗イデイオタイプ抗体で刺激するのに応 答して抗腫瘍抗体を産生ずる。

（抗イデイオタイプ抗体を産生ずるイモータル３９７８球） モノクローナル抗体を分泌するイモータルＢリンノぐ球を産生ずる多くの方法は 既知技術である。コズバーラ著、〔イムノロシー−７デイ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ　Ｔｏｄａｙ　）４巻７２−７９頁〕を参照。したがって、上述のように末梢 血リンパ球から得た抗（抗イデイオタイプ）抗体を分泌するひと８９７８球は、 既知技術の１つによりイモータル化することができる。

谷筋に使用できる方法の１つは、ＥＢウィルス（ＥＢＶ）を用いてイモータル化 することである。この方法によると、上述の正常リンパ球をインビトロでＥＢＶ に感染させ、イモータル細胞株が、例えば栄養層上で限界希釈することによって 確立される。コシバーら著、〔上述の文献（１９８３年）〕を参照、およびその 中で引用された参照文５１−６０頁を参照。

別の方策としては、ひとプラズマサイトーマまたはリンポプラストイド融合パー トナ−と、上述の抗−１ｄＡｂ　分泌リンパ球またはＥＢＶ形質転換リンパ球の どちらかを融合するものがある。例えば、抗−ＩｄＡｂを分泌するＥＢＶ−形質 転換１３１Ｊコシバは、ひとリンボブラストイドセルラインＫＲ−４などと融合 できる。ついで目的とするハイブリドーマが親の細胞を除外するウアバイン含有 ハイポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地中で選択される。ハイブリド ーマの特異的抗体産生を試験する。そして陽性ハイブリドーマを免疫抑制した哺 乳動物（例えば、ヌード・マウス）の腹腔または大量の培地中でクローン化、再 クローン化および増殖する。コツバーら著、プロシーディング・オブ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンス（１９８２年）７９巻６６５１−６６５５頁 を参照。

実施例２ウィルス抗体 （抗イデイオタイプ抗体の製造） 狂犬病ウィルスグリコプロティン（Ｇ）のエピトープを再構成するために種々の モノクロナール抗体（ｍＡｂ）に対応して作られた抗イデイオタイプ抗体（抗− Ｉｄ（ＶＮＡ）　を誘発することを含めて、多数の狂犬病ウイルスの重要な生物 学的特性に応答する。Ｇのどの部分が上記の機能に応答するかということについ ては現在では正確には知られていない。シーフンら、ジャーナル・オブ・ゼネラ ル・パイラロジー（１９８３年）６４巻８４３−８５１　頁は、タイプ特異性Ｖ ＮＡに対し少なくとも３つの主な抗原部位の存在を示唆する、狂犬病ウィルスＧ のチャレンジ・ウィルス・スタンダード（ＣＶＳ）株に対する機能性エピトープ マットを記載している。

機能的エピトープマットにより定義される狂犬病ウィルス上の結合部位およびア イソタイプ（プロティンＡ・セファロース・クロマトグラフィによって精製可能 ）に基づいて大パネルのハイブリドーマの中から５つの抗ＧｍＡｂを選び出した 。抗狂犬病ウィルスＧ　ｍＡｂの５０９−６．１０１−１．５０７−１および７ １９−３はすでに記載されている。シーフンら著；〔上述の文献〕、およびライ クターら著〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイシン（１９８０年 ）１５２巻：　９９−１１２頁参照。狂犬病ウィルスの感染を強力に中和するこ れらのｍＡｂは、以下に示す性質を有している。：５０９−６（エピトープマツ プ部位１　；　ＩｇＧ２ａ）、１０１−１（エピトープマツプ部位［ｂ；ＩｇＧ ；！ａ）。５０７−１（エピトープマツプ部位１［ｂｉｌｇＧｌ）および７１９ −３（エピトープマツプ部位［ｃ；ＩｇＧ２ａ）抗ＧｍＡｂ　１１ａ４−２（Ｉ ｇＧ１）はＰ３ｘ５３Ａｇ８マウスミエローマ細胞の変異株６５３と狂犬病ウィ ルスで免疫したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス由来の膵臓細胞を付加的に融合し て得られた。ライクターら著；〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンス（アメリカ、１９７８年）７５巻３９３Ｂ−３９４２頁 によるカーネイら著；〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（１９７９年〕１２３ 巻：　１５４８−１５５０頁〕。抗Ｇ分泌ハイブリドーマ細胞を選択し、限界希 釈およびライクターら著；（上述の文献）（１９７８年）にすでに記述されてい る様に調製り、　ｔ：　腹水テ９　ａ　−：／化する。１１０４−２　ｍＡｂ゛ は、ＥＲＡウィルスと非常によい結合性を示すが中和性に乏しいので選ばれた抗 狂犬病ウィルスのヌクレオカプシドｍＡｂ　５１５−３　（ＩｇＣ，２ａ）およ び３８９−１　（ＩｇＧ１）を、同様の技術でケルブのウィルスで免疫したＢＡ ＬＢ／ｃマウスから分離した。

用いた狂犬病ウィルスのＥＲＡまたは０７５株のストックは標準方法によりＢＨ Ｋ−２１中で増殖させた。

ライクターら著、ラボラトリ−・テクノロジー・イン・ラビーズ１０１−１２３ 　頁（エム・キャブラン・アンド・エイチ・コブロスキー（第３版編集、１９７ ３年）を参照。狂犬病抗原変異株であるＥＩＩＬＡ　ＲＶ１９４−２およびＲＶ ５０９−６はそれぞれ抗−〇ｍＡｂ１９４−２および５０９−６による中和に耐 性であるウィルスを表わすものとして報告されている。ディーツスコルドら著、 プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（アメリ カ、１９８３年）８０巻７０・−７４頁を参照。狂犬病グリコプロティン（Ｇｓ 　）は、ディーツスコルドらがバイオロジー（１９８３年）１２４巻３３０−３ ３７　頁に記載しているように免疫吸収クロマトグラフィを用いてウィルス粒子 涸渇培地から精製した。

抗Ｇ　ｍＡｂは全て腹水から精製した。アイソタイプＩｇＧ２ａの抗体はブリト ンーロビンンン緩衝液（ｐＨ，８，０）で約３０分の１に希釈した。ゲルハード ら著、モノクローナル・アンティボディ３１７−３３３頁、（アール。

ケネット・ティ、マツキーン・アンド・ケイ、ベツチトル編（１９８０年）を参 照。ＢＲＢ中のｍ　Ａ　ｂはチェイルジン０．４５μ１紙を通し、プロティンＡ セファロース４Ｂ吸着カラム〔ファルマシア・ビスカドアウェイ。

ニューシャーシー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、 　３　Ｉｎかけた。抗体をｐＨａ、ｏでＢ　ＲＢ　７こ溶出する前にＢＲＢ（ｐ Ｈ８，０）　３０　ｘｌでカラムを洗浄した。最初にアイソタイプＩｇＧ１の抗 ＧｍＡｂを最終濃度１８饅（重量比）になるまで硫酸で・沈殿させた。Ｉｇ分画 を溶解し、ＢＲＢ（ｐＨ８，０）で透析し、前と同様にプロティンＡセファロー ス・カラムに通した。カラムから溶出したＩｇを、抗原としてＥＲＡウィルスを 使うラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって検出した。ディラスコールドら著 〔ジャーナル・オブ・パイラロジー（１９８２年）４４巻５９５−６０２頁〕を 参照。抗体を燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、（ＰＨ７，４）で真空透析して濃 縮した。蛋白濃縮物は基準としてうし血清アルブミンを用いて定量した。プラム ホールら著、アナリテイカル・バイオケミストリ（１９６９年）３１巻１４６− １４８頁参照。

抗１ｄＡｂは、スタウトら著、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイ シン（１９８３年）１５７巻６８７−７０４頁で述べられている様に調製した。

簡単に言えば、雌ニューシーラント白兎を、フロイントの完全アジュバント（Ｆ ＣＡ）で乳化させたプロティンＡセファロース精製ｍＡｂ　３００μｙで、乳房 鎖にそって多数の部位に皮下注射した。ＰＢＳ中の抗体１００μｙで２回の追加 抗原を７および３０日筋肉内投与し、血清はその１０日後面取した。抗アイソタ イプＡｂを除去するためニｍＡｂ　５１５−３　（ＩｇＧ２ａ　）　または３８ ９−１（ＩｇＧ１）のいずれかと結合させたセファロース４Ｂカラムにかけて、 各々の抗イデイオタイプ抗血清をイディオタイプ領域に対して特異的にさせた。

上記カラムから得た溶出物はイディオタイプ決定基に対し反応性のある抗体を含 有していた。一定領域に対する抗体を、０．１Ｍジエチルアミ７　（ｐＨ１１， ５）でｍＡｂ’　５１５−３および３８９−１免疫吸収カラムから溶出した。各 々の抗ＩｄＡｂ　由来のＩｇＧを上述と同じ様にプロティンＡセファロース・ク ロマトグラフィーによって分離した。カラム流出液の非イディオタイプ決定基に 対する反応性は無視できるものであった。

（抗イデイオタイプ抗体の確認） 上で調製した抗１ｄ　Ａｂ　の特異性および種々の抗ＧｍＡｂの中でのイディオ タイプ交叉反応の存在は、ＲＩＡで各抗１ｄ　Ａｂ　製品について測定した。

固相ＲＩＡを固定ＭＡｂに対する抗１ｄＡｂの結合を測定するために使用した。

個々のｍＡｂを次に示すように炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（ｐ８８．９　）中で 腹水濃度に応じて希釈した。５０９−６（１：３０００）、１０１−１（１：６ ０００）、７１９−３（１：６０００）、５０７−１（１ニー６０００）、１１ ０４−２（１：１６０００）。ついで、各２５μｌずつポリビニル微量滴定平板 （ダイナチク・ラボラトリーズ製）のウェルに加えた。これらの抗体は３７℃で 一夜インキュベートしウェルに乾かした。ウェル上の遊離結合部位は少なくとも １時間０，０８％アジ化ナトリウムを添加した燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＮ） 中で１０％無ガンマ・うま血清（ギブコ・ラボラトリーズ製）でブロックした。

抗ｉｄ　Ａｂ　の希釈液２５μｌを加え、室温で１時間後プレートを充分洗浄し た。結合した抗Ｉｄ　Ａｂ　は、よう素化法で標識した１２５１やぎ抗家兎１ｇ Ｇ（カッベル・ラボラトリーズ製）を２５μ、９（３００００カウント／分）加 えることによって検出し、室温でさらに１時間インキュベートした。Ｍａｒｋｗ ｅｌｌら著、〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９７８　 ）　１７巻＝４８００−４８１７頁参照。抗１ｄＡｂ　希釈液または放射能標識 したプローベの全てをＰＢＳＮ中に１０％無ガンマ・うま血清で作った。非結合 プローベがなくなるまでプレートを洗い、それぞれのウェルに結合した放射能を ガンマ線カウンターで測定した。

同種および異種ｍＡｂで各々の抗１ｄ　Ａｂ　製品を滴定した結果各抗１ｄＡｂ が同種１ｄｍＡｂに対して特異的であることがわかった。

（イディオタイプ抗体のパロトープに対する抗イデイオタイプ抗体の定量） 競合ＲＩＡ法を、ＩｄＡｂおよび抗ＩｄＡｂ間の相互作用に対する狂犬病ウィル スＧの阻害能を試験するために考案した。Ｃｈａｆｌｉｎ　ら著、ジャーナル・ オブ・イムノロジー（Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１９７４年）１１２巻：１ ７４７−１７５６　頁〕、および、５ｈｅｒら著、ジャーナル・オブ・イムノロ ジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ６．１９７２年）１０９巻：１７６−１７８頁参照。

狂犬病Ｇｓ　を競合抗原として用いた。標準抗１ｄＡｂ希釈液を添加する前に、 Ｇｓの２倍系列希釈液と共に予備滴定レベルのｍＡｂを１時間インキュベートし た。結合抗血清の量を１２５１で標識したやぎ抗家兎抗体を結合させることによ って定量した。対応する抗ＧｍＡｂ（５０９−６，５０７−１、および１１０４ −２）に対する５種中３種の抗１ｄＡｂの結合をＧｓ　が阻害した。最大阻害は 、６μ！Ｚ／ｍＧｓ　の量で２０〜５０哄に変化するが、僅か０．７５μｉ／ｍ ｌ　Ｇ　ｓ程度でも少なくとも１５哄の減少が観察された。抗ＩｄＡｂの結合を 全面的に阻害するのが不可能なことは、フレームワークとバロトープ部位の両持 異性が３種のポリクローナル抗１ｄ血清に存在することを示す。このことは、還 元または非還元状態でドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離したｍＡｂと抗ＩｄＡｂ　の反応性を測る ウェスタン・プロット測定法によって確認された。抗原結合部位はｒｎＡｂの還 元によって除去されるので、還元ｍＡｂに対する抗ＩｄＡｂの反応性はフレーム ワーク決定基に対する特異性を示したことになる。Ｇ、による抗１ｄ１０１−Ｉ Ａｂまたは抗１ｄ　７１９−３Ａｂの有意な結合阻害が存在しないことは、上記 血清におけるバロトープ特異性ポピユレーションが微弱あるいは欠如しているこ とを示唆している。

（抗（抗イデイオタイプ）抗体の製造）次に示す例は、抗Ｇ　ｍＡｂの抗原結合 部位に対して反応性を有する抗１ｄＡｂが上述の抗Ｇ　ｍＡｂに認識されたウィ ルスのエピトープをまねたサブポピユレーションを含有し、Ｇに対する免疫応答 を誘発しうろことを示している。

４つのグループに分けたＩＣλマウスの皮下にＦＣＡで乳化したプロティンＡセ ファロース精製抗１ｄ　ＩｇＧを１匹当り４０μＩずつ接種した。追加抗原刺激 皮下接種は７日月と３２日日目にそれぞれフロイント完全アジュバント中に４０ μｙの抗ＩｄＩｇＧを入れて行った。

最後の追加抗原刺激接種に続く５日間眼窩後方叢より採血し、集めた血清につい て狂犬病ウィルス中和抗体（ＶＮＡ）を調べた。対照として別のグループのマウ スには、プロティンＡ・セファロースで精製した正常家兎夏ｇＧで免疫した。

免疫したマウスにおけるＶＮＡの濃度を迅速螢光フォーカス阻害試験法の変法に よって測定した。スミスら著ラボラトリ−・テクエックス・イン・ラビース（Ｌ ａｂｏｒａｃｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｒａｂｉｅｓ　Ｍ、カブラ ンおよびＨ，コブロフスキ、ら編、第３版、１９７３年）：３５４−３５７頁参 照。マウス血清を二倍系列希釈物をマイクロタイター■平板（ファルコン・プラ スチックス製）（５０μｌ／　ウェル）で作り、１０’　Ｐ　ＦＵ１５０μｌを 含有する、同量のウィルスを用いて３７℃で１時間インキュベートした。インキ ュベーション後、新たにトリズシン処理したＢＨＫ−２１細胞（２Ｘ　１０６個 ／Ｉ−１　”）５０μｌをそれぞれのウェルに加え、混合した。そして血清・ウ ィルス・細胞混合物の１０μｌづつをテラサキ平板（ファルコン・プラスチック ス製）のウェルに（２回に分けて）移した。２０時間インキュベーション後平板 を最初、ＰＢＳで次いで蒸留水中８０％（容量比）アセトンで洗い、室温におい て８０−アセトン中で３０分間固定処理した。平板を乾燥し、螢光コンジュゲー ト家兎由来抗狂犬病ヌクレオカプシド抗体５μｌ／ウェルと３７℃で３０分間細 胞を染色した。ライクトル著シンポジウム・オン・シリーズ・イムノバイオロジ カル・スタンダード（Ｓｙｍｐ、　５ｅｒｉｅｓ　Ｉｍｍｕｎａｌｂｉｏｌ。

５ｔａｎｄａｒｄ　）　２１巻１０２−１１８頁を参照。対照ウェル（ウィルス を含むが抗体を含まない）は狂犬病ウィルス特異性内容物を包含する細胞をほぼ ４０％示した。

ウィルス中和の終点は、狂犬病ウィルスに感染した細胞数を５０％減少しうる最 大血清希釈レシプロカルとして定義した。

迅速螢光フォーカス阻害試験の結果は以下の表、に示す。抗１ｄ５０９−６Ａｂ および抗Ｉｄ　１１０４−２Ａｂで免疫したマウスにＥλＡ株狂犬病ウィルスに 対する顕著なＶＮＡ力価を生じた。他の３種の抗（抗１ｄ）ＡｂはＥＲＡウィル スを中和しなかった。対照の実験は、免疫するのに用いた抗１ｄＡｂと同様にマ ウス抗（正常家兎１ｇＣ，）Ａｂが狂犬病ウィルス中和活性を持っていないこと を示した。さらに、抗１ｄ　５０９−６Ａｂと共に抗（抗ｌａ　５０９−６）　 血清を予備インキュベートすると中和活性を失った。しかし正常家兎血清で予備 インキュベートしても活性を失わなかった。

生じたＶＮＡの特異性を試験するために、他の狂犬病ウィルスを中和測定に用い た。狂犬病のＣｖＳ株はｍＡｂ　５０９−６　および１１０４−２の両方と結合 した（ここではデータは示さない）、そして表は、ＣｖＳが抗（抗Ｉｄ　５０９ −６　）血清および抗（抗１ｄ　１１０４−２）血清の両方によって中和される ことを示している。

他方、ＥＲＡウィルスの変異株であるＲＶ５０９−６は、５０９−６エピトープ が変異した結果ｍＡｂ　５０９−６　による結合および中和活性を失っているが （ラドンら著ジャーナル・オン・ゼネラル・パイロロジー（Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、１９８３）　６４巻：　８４３−８５１頁参照）、そノウイルスは 抗（抗Ｉｃ１５０９−６）血清によって中和されなかった。別の中和耐性変異株 ＲＶ−１９４−２は、抗（抗Ｉｄ　５０９−６）血清によって中和された。先の 結果は、抗ＧｍＡｂ　５０９−６および１９４−２に認識される抗原部位が完全 に独立していることを示す。ラドン等、前掲参照。このデータは、抗（抗Ｉｄ　 ５０９−６　）血清が抗ＧｍＡｂ　５０ｇ−６に認識されたエピトープとのみ反 応し、したがって上記エピトープは抗１ｄ　５０９−５　Ａｂ　にまねられたの であることを示す。

抗（抗Ｉｄ）血清による 狂犬病ウィルスの中和士 マウス抗血清の相手　ＥＲＡ　ＣＶＳ 親株　ＲＶ５０’ｌ−６ＲＶ１９４−２　親株正常　家兎１ｇＧ　４　４　４　 ４ 抗−Ｉｄ５０９−６　３２　４　６４　６４抗−Ｉｄｌｏｌ−１４ＮＤ来　ＮＤ 　ＮＤ抗−１ｄ１７９−３　４　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ抗−１ｄ５０７−１　４　Ｎ Ｄ　ＮＤ　ＮＤ抗−１ｄｌ１０４−２　１２８　４　１２８　６４ＲＩＧ＊４　 １６　１６　３２　３２ 寸　感染細胞数を５０哄減少させつる最高血清希釈レシプロカル 来　実施せず 料　ヒト抗狂犬病！ｇを０．２国際軍位／ｌｄに希釈し２倍系列希釈物を狂犬病 ウィルスと共にインキ−已ご：」二凱丸工一一一一−−一一一−一−一−一一− 上記実験は説明の目的のみで表わされたのであってこの発明を限定するものでは なく、この発明は請求の範囲のみによって定義されるものである。

国際調査報告 −１，−八−””＃Ｉ””？ＣＴ／Ｚ？　８４１０Ｑｖ１ａＡｌ−ｎ−ｉＥＸＴ ｏＴｈｅ：ＩＮＴＥＲＮｉ一つ？：０ＮＡｒ−５ＥＡＲＣＨＲＥ？ＯＲτ０ＮＩ ＮＴＥＲＮＡＴ、ｌ０ＮＡＬ　Ａ、ＰＰ乙ＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／Ｅ Ｐ　８４１００３３４　（ＳＡ　８２５１）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗腫瘍または抗ウイルス抗体のパロトープであるエピトープを同定する抗 イデイオタイプ抗体を含む、腫瘍またはウイルスに対して免疫応答を誘発する組 成物。
2. （２）抗イデイオタイプ抗体がモノクローナルである請求の範囲第１項記載の組 成物。
3. （３）抗イデイオタイプ抗体がポリクローナルである請求の範囲第１項記載の組 成物。
4. （４）抗腫瘍または抗ウイルス抗体のパロトープであるエピトープを同定する抗 イデイオタイプ抗体を産生するイモータルＢリンパ球。
5. （５）ハイブリドーマである請求の範囲第４項記載のイモータルＢリンパ球。
6. （６）請求の範囲第４または５項記載のイモータルＢリンパ球から得られ、他の 抗体を実質的に含まないモノクローナル抗体。
7. （７）抗腫瘍または抗ウイルス抗体のパロトープであるエピトープを同定し、抗 アインタイプ抗体を実質的に含まないポリクローナル抗イデイオタイプ抗体。
8. （８）異種宿主に対して抗腫瘍または抗ウイルス抗体を投与し、上記宿主の血清 から目的とする抗イデイオタイプ抗体を分離・精製することからなる、抗腫瘍ま たは抗ウイルス抗体のパロトープであるエビトープを同定する抗イデイオタイプ 抗体の製法。