JPS615779A - 転移ベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は転移ベクター、特に１組み換えＤＮＡベクター
、それを保持し複製する細菌株および普遍性転写ベクタ
ーの構築方法に関する。

（発明の要旨） ＤＮＡ分子の塩基配列は、中間体メンセンジャー　（ｍ
ＲＮＡ）へと転写され、蛋白質へと翻訳され得る情報暗
号を有している。そういう蛋白質は。

生体内で触媒あるいは構造的な機能を持つことができる
。いくつかの場合には、塩基配列はＲＮＡ分子へと転写
され、このＲＮＡ分子は機能を持つ実体であることがあ
る。自然の例はりボゾームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）、転
移ＲＮＡ分子＜ｔ、ＲＮＡ）そして小分子核ＲＮＡ分子
（ｓｎＲＮＡ）である。いくつかのウィルス（例えば、
レトロウィルス）は逆転写され、そのＤＮＡ産物は宿主
のゲノムに取り込まれるが、そこからウィルスＲＮＡへ
ともう一度転写され得る。人為的な状態で役に立つのは
、有用なＲＮＡ分子と全く同じ配列のＤＮＡ断片を単離
し、そのような断片をベクタープラスミドに挿入された
強力なプロモーター配列の下流の転写開始点に正確に挿
入することであろう。

その場合、所望の多量のＲＮＡ分子はインビトロ転写で
生産できるであろう。従来のベクタ−系はプロモーター
の下流に挿入部位を供してきた゛が。

そこより転写されるＲＮＡは５゛末端に外来の配列を含
む。多くのＲＮＡの機能は５′末端の塩基配列により影
響を受けるので、生じるＲＮＡの機能は望まれない、あ
るいは制御されない態様で修飾されうる。この従来技術
の困難さは、挿入したＤＮＡ区分の転写が正確に開始さ
れるように用意されている転写ベクターにより克服でき
るであろう。このように野性型ウィルスＲＮＡ配列、変
異したウィルスＲＮＡ配列、いくつかの不必要な塩基配
列を有用な外来遺伝子により置き換えたウィルスＲＮＡ
配列、および野性型あるいは変異したｒＲＮＡ、ｔＲＮ
Ａ、’あるいは５ｎＲＮＡ分子を産み出すことが可能で
ある。変異したウィルスのＲＮＡ配列は、過剰な感染を
防ぐことにより植物細胞を感染させるのに使いうるか、
あるいは外来遺伝子に部分的に置き換えたウィルスＲＮ
Ａの配列は植物細胞にそれらの遺伝子を導入するための
媒介物として使える。いずれにしろ、微生物集団の代謝
作用が、変異したｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、あるいは５ｎＲ
ＮＡを有する組み換えプラスミドの集団を形質転換する
ことにより乱されるがもじれない。

ベクター、強力なプロモーター、そして転写開始点の制
限酵素部位を持つ組み換えプラスミドを構築する方法が
望まれている。この制限酵素部位は。

所望のＤＮＡ断片を挿入するのに用いられる。

（発明の概要） 組み換えＤＮＡの技術は、ＤＮＡ配列内の様々なオープ
ンリーディングフレームを転写したり。

翻訳したりすることを可能にした。そういう転写や翻訳
の効率は多（の因子１例えばプロモーター領域の強さ、
転写開始部位より上流のＤＮＡ配列の構造、そしである
場合では終止信号の３゛側のＤＮＡの構造に依る。ある
場合では、正確な開始点および終止点を持っＲＮＡ転写
物を生産すること１例えばウィルスのＲＮＡ分子、小分
子核ＲＮＡ分子そしＴ、ｒＲＮＡ分子のインビトロテノ
生産に有用である。この発明は、様々なりＮＡ配列の転
写がそこから正確に開始できるような強力なラムダウィ
ルスプロモーター（ＰＲ）の下流の点に制限酵素部位を
含む組み換えプラスミドを、−進んだ遺伝子操作技術を
用いた作成について述べている。加えて、　Ｅｃｏ　Ｒ
Ｔ制限酵素部位が転写開始部位のすぐ後ろに在るので、
インビトロでの転写を行う直前−Ｅｃｏ　Ｒ１を用いる
と初めの制限酵素部位に挿入されたどんなりＮＡ断片も
（７ヌクレオチド内に）終止点を正確に位置させること
もある。

本発明の細菌株は、以下のものを含む組み換えＤＮＡベ
クターを保持しそこで複製する：（ａ）複製開始点と選
択マーカー、（ｂ）プロモーターと、転写開始ヌクレオ
チドが一番目の転写物のヌクレオチドである転写開始部
位とを含むヌクレオチド配列。

（Ｃ１切断部位が該プロモーターの下流の転写開始ヌク
レオチドの３゛側にある。制限エンドヌクレアーゼ認識
配列、および＋ｄｌ該切断部位に挿入されたＤＮＡの断
片。

本発明の組み換えＤＮＡベクターは以下のものをもつ：
（ａ）複製開始点と選択マーカー、■）プロモーターと
、転写開始ヌクレオチドが一番目の転写物のヌクレオチ
ドである転写開始部位とを含むヌクレオチド配列、（Ｃ
）切断部位が該プロモーターの下流の転写開始ヌクレオ
チドの３′側にある。制限エンドヌクレアーゼ認識配列
、および（ｄｌ該切断部位に挿入されたＤＮＡの断片。

本発明の普遍性転写ベクターを構築する方法は以下の工
程を含む：（ａ）プロモーターを含むＤＮＡ断片を単離
すること、（ｂ）組み換え線状１本鎖ファージを生ずる
ような線状１本鎖ファージ株の複製型へ該ＤＮＡ断片を
挿入すること、（Ｃ）該組み換−えファージを用いて細
菌株を形質転換すること、（ｄ）該細菌株から分泌され
る該組み換えファージのｓｓＤＮＡを単離すること、（
ｅ）該プロモーターに部分的に相補的なオリゴヌクレオ
チドプライマーを合成すること、このオリゴヌクレオチ
ドプライマーの５゛末端が転写開始部位に相当しそして
この５”末端が平滑末端制限エンドヌクレアーゼ部位の
一方の配列を有する。（ｆ）該オリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて該ｓｓＤＮＡを複製し１、修飾プロモー
ターを含む修飾相補Ｉ）ＮＡ鎖を生産すること。

該修飾プロモーターは該オリゴヌクレオチドプライマー
に相補的な配列を含むプロモーターである。

（ｇ）前記該修飾相補ＤＮＡ鎖を複製して該修飾プロモ
ーターを含む修飾２本鎖ＤＮＡ断片を生産すること、お
よびｆｈｌ該修飾２本鎖ＤＮＡ断片をベクタ−プラスミ
ドヘクローニングし普遍的転写ベクターを生産すること
。

（発明の背景） 過去数年間に、植物へ外来遺伝子を転移させるための遺
伝子操作の分野では非常に多くの可能性が発展してきた
。そういう転移を達成するため。

適当なベクターを見出すことが必須である。植物ゲノム
に遺伝子を転移させるということで最も進歩した仕事は
、アグロバクテリウム・ヂューメファシエンス（＾ｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅ（ａｃｉｅｎｓ）と、
より狭い範囲でアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用
いることにより達成された（Ｌｅｅｍａｎｓ、　Ｊ、、
　ｅｔ　ａｌ　（１９８２）　Ｉｎ　Ｋａｈｌ。

Ｇ、およびＪ、　Ｓ、　５ｃｈｅｌｌ　（１９８２）　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔＴ
ｕｍｏｒｓＣｈ、２１：５３７−５４５＋Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｙ　Ｙｏｒｋ　）　ａ最近の研
究（Ｍｕｒａｌ＋　Ｎ、＋ｅｔ、　ａｌ、　（１９８３
）　５ｃｉｅｎｃｅ　　２２２　：　４７６−４８２　
）は。

豆の種子の蛋白質ファセオリンをコードしている配列が
腫瘍誘導プラスミドの転移したＤ’ＮＡ領域によりヒマ
ワリゲノムに挿入されたことを示した。

ある例では、ファセオリンをコードしている配列はオク
トピンシンターゼプロモーターにより制御されており、
他の例ではファセオリンプロモニター領域により制御さ
れていた。両側とも、ファセオリン遺伝子は正確に転写
され、プロセシングを受け、翻訳されており、このよう
に分類学的に別の植物学上の科に転移後、植物遺伝子は
発現することを表している。

さらに、植物の根に感染させたり、瘤を形成したりする
より以前にリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）株のふつ
うのプラスミドを遺伝的に操作する可能性がある。多く
の仕事がすでにニトロゲナーゼ遺伝子に関してなされて
きた（Ｓｃｏｔｔ、　Ｋ、　Ｆ１Ｒｏｌｆｅ＋Ｂ、　　
Ｇ、　　ａｎｄ　　Ｊ、　　５ｈｉｎｅ　　（１９８３
）　　ＤＮＡ　　２　　：　　１４１−１４８　　；５
ｃｏｔｔ、　Ｋ、　ｐ、ｌ　Ｒｏｌｆｅ、　Ｂ、　Ｇ、
　ａｎｄ　Ｊ、　５ｈｉｎｅ（１９８３）　ＤＮＡ　２
　：　１４９−１５６）。これらの生物のニトロゲナー
ゼ遺伝子、のプロモーター領域は、このプロモーター領
域の支配下にあるようにリゾビウムの共生プラスミドに
挿入された様々な外来遺伝子の転写や翻訳を制御するよ
うに用いられてきた（Ｕ、　　Ｓ、　　Ｐａｔｅｎｔ　
　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　　５ｅｒｉａｌ　　Ｎｏ、
５０６，６７６゜ｆｉｌｅｄ　Ｊｕｎｅ　２２．１９８
３）。両型のベクター、即ちアグロバクテリウムｓｐｐ
、のＴ−ＤＮＡおよびリゾビウムｓｐｐ、の共生プラス
ミドは、Ｄ、ＮＡとして外来遺伝子の転移を含む。

植物細胞への外来遺伝子を転移させるためのもう一つの
可能性は、ＲＮＡあるいはＤＮＡウィルスを用いること
である。ＲＮＡウィルスの場合。

ＲＮＡ分子を扱うことの技術的な歎しさとＲＮＡに活性
のある制限酵素がないために、それらをｃＤＮＡ分子に
逆転写することが必須であろう。

二次的な感染周期による増幅が可能であるような場合２
例えば、ポリオウィルス（Ｒａｃａｎｉｅｌ　Ｉｏ＋Ｖ
、　ａｎｄ　Ｄ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、（１９８１）
　５ｃｉｅｎ’ｃｅ　２１４　：　９１６−９１９）と
ジャガイモスピンドルチューバーウィルス（Ｃｒｅｓｓ
、　Ｄ、、　Ｋｉｅｆｅｒ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｒ，Ａ、
　Ｏｗ？ｎ５（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、旦：　６８２１−６８３５）では、その方
法は有効そうであるが、多くの例ではウィルスのｃＤＮ
Ａの感染性は低い、あるいは存在しないし、またこのア
プローチでは結果を産み出していない。何故このような
負の結果が生じるのかを理解するため、直接接種したウ
ィルスｃＤＮＡの感染に必要だと考えられるものを以下
に挙げることは有益である。

（１）細胞へのｃＤＮＡの取込み；（２）核へのｃＤＮ
Ａの転送；（３１（少なくとも）全長のウィルスのＲＮ
Ａ　（ｖＲＮＡ）の転写、　（４１Ｖ　ＲＮ　Ａのスプ
ライシングの欠除；（５）感染型へのｖＲＮＡの末端の
プロセッシング；（６）細胞質へのＶＲＮＡの転送；（
７）（少なくとも複数個の）ウィルス蛋白質の翻訳；そ
して（８）複製の最初の段階でのウィルスおよび細胞の
蛋白質とのｖＲＮＡの効果的な相互作用。

効果的な翻訳は最も重要なこととしばしば考えられてい
るが、ウィルスｃＤＮＡの感染性はさらに多くの必要条
件を含んでいる。例えば５強力な植物のプロモーターへ
ウィルスｃＤＮＡを連結させることはより有効な手段と
なり得るであろうが。

もしウィルスＲＮＡが不感染型へと効果的なプロセッシ
ングを辱くような臨界のスプライング部位を含むならば
感染は起こらないであろう。また。

いくつかの段階２例えば上記の（４）から（６）まで、
はほとんど理解されていない細胞質の過程を含んでいる
。結果として、直接接種されたｃＤＮＡの感染性は、い
くつかの段階１例えば細胞質へのｖＲＮＡの転送、で厳
密に制限され得るのであろう。

こういう感染性の欠点は究極的に同定することは困難で
あるので、様々な欠点は基礎的な分子生物学および細胞
生物学における重要な進歩なしでは改良していくことは
非常に困難であろう。

いくつかの点が核酸の断片を植物ベクターに組み入れる
ために必要である：（１）有効量を回収できるために、
核酸はクローン化されることができなければならない；
（２）核酸は植物細胞内で複製できなければならず、望
ましくは選択方法により確認できなければならない；（
３）病原性であってはならない；（４）核酸は、他の核
酸配列をその構造に取り込むことができ、その取り込ん
だ核酸を発現できなければならない；そして（５）形質
転換した植物の遺伝的な変化が望まれるならば、ベクタ
ーあるいはベクターの誘導体はある世代から次の代まで
安定に維持されなければならない。さらに、Ｔ−ＤＮＡ
の場合、ある段階では形質転換された植物細胞はクロー
ニングにより純化され、植物へと再生されなければなら
ない。これらの点をＲＮＡ植物ウィルスに関して考える
と、多くの困難が明らかとなる？　（１１ＲＮ　Ａの遺
伝子操作や組み換えといった技術は、、ＤＮＡの遺伝子
操作や組み換えの技術以上にずっと困難である；（２）
はとんどのウィルス粒子は蛋白質のカプシドに包みこま
れるので、限定量以上の“外来の”核酸を収容する際に
困難があるかもしれないｉ　（３１ＲＮ　Ａウィルスは
植物細胞内で複製される必要があるが、遺伝子操作した
ＲＮＡの回収時に困難があろう；（４）植物細胞を感染
させるのに用いられるＲＮＡウィルスの株によっては、
最小限の病原性効果を引き起こすだろう。

（発明の構成） 以下に本発明の詳細な説明する。

本発明の鍵となる特徴は２強いプロモーター成分と転写
開始がいつも決まったヌクレオチドで起こるように、当
校プロモーターから下流に位置する制限酵素部位を保持
する組み換え発現ベクターの構築である。本発明の独特
な特徴は、逆転写酵素の使用によるウィルスＲＮＡ分子
のｃＤＮＡへの変換に続いて、これらのｃＤＮＡ分子を
インビトロでＲＮＡへ転写することが可能であるという
発見である。さらに、ｃＤＮＡ分子からインビトロで転
写される。そのようなウィルスＲＮＡ分子は、感染能力
があり、転写開始と転写終結が２本質的に正しいヌクレ
オチドに起こることを開示する。

外来遺伝子の植物への伝達に役立つためにＤＮＡ断片は
当校ｃＤＮＡ分子上の適切な位置へ取りこまれる。例え
ば、３部に分かれたゲノム（ずなわち、ＲＮＡＩ、ＲＮ
Ａ２．ＲＮＡ３）を持つブロムモザイクウィルスを用い
ると、ＲＮＡａ中のコート蛋白質をコードしている核酸
配列を欠失させ、それを外来遺伝子をコードしている配
列で置き換えることが可能かもしれない。そのような欠
失と置換がｃＤＮＡ分子の使用によって最も簡単に行う
ことができた。

この計画は、いくつかの魅力がある。（ａｌ遺伝子３ａ
はＲＮＡ３の２つのオープンリーディングフレームのひ
とつとして存在し、この遺伝子が植物細胞内でのウィル
スＲＮＡの複製のために存在することが必須である。遺
伝子３ａの機能に対する必要性は、ウィルス中で操作さ
れた成分を維持することに役立つのであろう。（ｂ）外
来蛋白質は、多分、正常な感染で強いコート蛋白質生産
を導くのと同じ機構によって強く発現するであろう、（
ｃ）挿入配列の大きさは、カブジッド形成の束縛によっ
ても制限されないであろう。（ｄｌウィルスコート蛋白
質の欠除は、故意に植菌された植物からの操作されたウ
ィルスの脱出を制限するであろう。もし。

（ＲＮＡ３によってコードされた）３ａとコート遺伝子
が感染にとって必要であれば、それらは。

それらのひとつか、あるいは両者が外来の遺伝情報を運
ぶこともできるような、２つの異なった成分に分けるこ
とができるであろう。２キロヘースの大きさの外来配列
までは、単一のそのような成分中にパンケージングの束
縛を妨害することもなく、挿入可能である。

多くの他のウィルスがクローン化されたｃＤＮＡからの
転写による感染可能なＲＮＡ分子のインビトロでの生産
にとって有効であり、これには種々の他の植物ウィルス
（例えば、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ））　、ポ
リオウィルス、インフルエンザウィルス、フットマウス
病ウィルス等が含まれる。

ｃＤＮＡからのウィルスｍＲＮＡ分子のインビトロでの
転写から得られるもう一つの利点がある。

ウィルスｍＲＮＡ分子中に、病原性株を病原性のないも
のに変える突然変異を作ることが可能である。そのよう
な病原性をなくした株は、遺伝学的に外来遺伝子を含む
ように操作されたウィルスｍＲＮＡのインビトロの合成
に使用される。そのような病原性をなくしたウィルス株
による植物の感染は、病原性ウィルス株による。これら
の植物の後の重感染を防ぐこともできる。

強いプロモーターと、転写の開始点に正確に位置する制
限酵素部位を保持する組み換えベクターの他の使用は、
細菌の感染に反抗するように突然変異をかけたｒＲＮＡ
分子の使用である。ｒＲＮ八分子分子ｒＤＮＡから転写
されている。したがって、ｒＲＮＡをリボゾーム中のそ
の位置に着かせ、ｍＲＮＡ分子の転写を仲介できないよ
うに細菌の１６３　　ｒＲＮＡ分子の３′末端を突然変
異させることが可能である。そのような変異を受けたｒ
ＲＮＡを含む組み換えベクターによる細菌の多重形質転
換は細菌の感染をきびしく妨害するか゛あるいは減少さ
す。同様に、ｔＤＮＡから転写される。変異を受けたｔ
ＲＮＡは、細菌集団の多重形質転換に使用することがで
きる。そのような変異を受けたｔＲＮＡは細菌の必要な
蛋白質へのｍＲＮＡの翻訳能力を、きびしく破壊させる
ことができる。

ここで記述される転移ベクターのいまひとつの効果は形
質転換された細菌中で真核生物の遺伝子から転写された
ｍＲＮＡの翻訳の増強である。細菌のｔＲＮＡ集団が、
真核生物のｔＲ’ＮＡ集団と比較して異なる比率で存在
し、コドン使用が原核生物と真核生物のｍＲＮＡで相違
があるということは、当業者には良く知られている。形
質転換された細菌中で真核生物の遺伝子から転写された
ｍＲＮＡの翻訳は、形質転換された細菌へのプロモー２
−の正確な制御下で様々なｔＤＮＡをさらに形質転換す
ることによって、最適化することができる。

正確に、開始され終結される転写物が要求される。

これら種々のＤＮＡ分子をクローン化するためには、転
写されるべきＤＮＡが１強い細菌かウィルスのプロモー
ターの調節信号の下流の正しい距離に挿入されるような
組み換えプラスミドの構築が必要である。バクテリオフ
ァージのプロモーターは、しばしば強い開始信号を与え
る。なぜなら。

感染しているウィルスは、宿主の細胞代謝を自分の目的
の方へ仕向けなければならないからである。

ラムダＰＲプロモーターは、Ｌ！Ｌやハ［のような細菌
のプロモニターより頻繁に何度も転写を開始することが
示された（口ｕｅｅｎ＋　ｃ、　ａｎｄ　Ｍ、　Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ（１９８１）ＣｅｌＬ２５　　：　　２４
１−２４９）　　。

蛋白質の生産を増加させる以前の研究（（ｌｕｅｅｎ。

Ｃ，（１９８３）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、　２　：　１−１０）で・発現ベクターはプラ
スミド上にＰＲプロモーターと」匹遺伝子リポゾーム結
合部位を、　　ＰＲのりプレソサー遺伝子と共に」リボ
ゾーム結合部位が容易に外来遺伝子につながることがで
きるように配置することにより創造された。このベクタ
ーの有効性は、β−ガラクトシダーゼとＳＶ　−４０ス
モールを一抗原の２つの蛋白質の大腸菌の全蛋白質の５
〜１０％のレベルの生産によって示された。ｔ−抗原が
達したレベル（４Ｘ１０５分子／細胞）はハ（システム
で得られたもの（Ｔｈｕｍｍｅｌ、　Ｓ−＋　Ｂｕｒｇ
ｅｓｓ。

Ｔ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｔｉｊｉａｎ　（１９８１）
　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３７　：　６８３−６９７）あ
るいは化学的に合成したりボゾーム結合部位で得られた
もの（Ｊａｙ、　Ｇ、１Ｋｈｏｕｒｙ＋　ｃ、Ｉ　５ｅ
ｔｈ。

＾、ａｎｃｌ　Ｊａｙ、Ｅ、（１９８１）Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ、Ａｒ、ａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、ユ８　：　５５４３−５５４８）より約１
０倍高く、３重にプロモーターを用いて得られたインタ
ーフェロンのレベル（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、　Ｖ−＋
　５ｈｅｐａｒｄ、　Ｉｌ、　Ｍ、＋Ｙｅｌｖｅｒｔｏ
ｎ＋　Ｌ、　Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｃｒｅ
ａ　（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、　８　：　４０５７−４０７３）より２０倍高い。

このＰ＋＋ファージラムダプロモーターを保持する発現
ベクター（Ｑｕｅｅｎ、　Ｃ，’　（１９８３）　Ｊ、
　Ｍｏｌ。

八ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｔ、　２　：　１−１０）は、ま
ったく新しいベクター、すなわち２強いプロモーターの
調節配列から下流の正確な転写開始点で制限酵素部位を
持ち。

強いプロモーターを保持するベクターの創造に対する出
発点であった。この制限酵素部位を外来ＤＮＡの挿入に
用いることができるので、このことは、どんな外来ＤＮ
Ａの転写開始も正確に配置できることを意味する。

これらの転写開始ベクターの構築においてＰ。

ラムダファージプロモーターの使用のみに限定されない
。他にも適切なプロモーターが使用されるかもしれない
。そのようなプロモーターは強いかあるいは弱いか、そ
して活性化因子とリプレフサー、あるいはどちらか一方
によって調節を受ける。

そのようなプロモーターの表示リストは２次のようなリ
ストを含むであろう（制限はされないが）（ａ）且ＦＰ
１　（Ｆｌｕｓｓｏ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　（１９７７
）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。

八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、八、　７４　：　１０
６−１１０）あるいは、　ｔｒｐ（Ｂｅｎｎｅｔｔ、　
Ｇ、　Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７８）　Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ。

肛：　１１３−１３７）のような細菌のプロモーターｆ
ｂｌ　Ｔ　７ＡＩ（ＳｉｅｂｅｎＨｓｔ、　Ｕ、　（１
９７９）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

６　：　１８９５−１９０７）あるいは、ファージＳＰ
　６　　（Ｇｒｅｅｎ＋Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８
３）　Ｃｅ１ｌ　３２　：　６８１−６９４）のような
他のファージプロモーター（Ｃ）ｐＢＲ３２２ｂｌａ　
（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ。

Ｊ、　　Ｇ、　　（１９７９）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ
ｔ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、八、　７
５　：３７３７−３７４１）とＴｎ５ｎｅｏ　（Ｒｏｔ
ｈｓｔｅｉｎ、　Ｓ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ（１９８１）　
Ｃｅ１ｌ　２３　：　１９１−１９９）のようなプラス
ミドとトランスボゾンプロモーターとＩａｃＰ１１５　
（Ｊｏｈｎｓｏｎ＋　　Ｒ，Ｃ，ｅｔ　　ａｌ、　　（
１９８１）　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、
　９　：　１８７３−１８８３）とＩＳ２　ｌ−１１（
Ｈｉｎｔｏｎ、　Ｄ。

Ｍ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｅ、　Ｍｕｓｓｏ　（１９８２）　
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１０　：　５０１５−５０３１）のような融合あるいは
突然変異によって造られたプロモーター。加えて、完全
な合成プロモーター、あるいは、細菌の他の生物源から
のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター
が使用できる。

本発明で２発現ベクターｐＣＱＶ２　（第１図）からの
」憇旧−Ｃ１ａｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片の挿入、伝達、操作
のために使用したベクターは、　Ｍ１３ｎ＋ｐ９　（Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ。

Ｊ、　ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、　（１９８２）　
Ｇｅｎｅ　１９　：　２６９−２７６＞であった。この
実施中の当校Ｍ１３ｍｐ９は、容易さ、　　−便利さの
ため選ばれた。この株の使用は、他の綿状１本鎖ファー
ジ（たとえばｆｌあるいはｆｄ　）が使用できないとい
う意味ではない。他の線状。

１本鎖ファージも同様にこれらの実験で、うまく利用で
きるだろう。（Ｔｈｅ　Ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒＡｎｄｅ
ｄ　ＤＮＡｐｈａｇｅｓ　（１９７Ｂ）　（Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ、　Ｄ、　Ｔ、、　Ｄｒｅｓｓｌａｒ＋’Ｄ。

ａｎｄ　Ｄ、　Ｓ、　Ｒａｙ、　ｅｄｓ、）　ＣｏＩｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ＋
　Ｎｅｎ　Ｙｏｒｋ）　ａ　Ｍ１３ｍｐ９は他のＭ１３
の操作されたファージ、すなわちＭ１３ｍｐ７に由来し
た。

Ｍ１３の複製型（ＩＩＦ）へのＤＮＡのクローニングは
Ｍ１３ｍｐ７クローニングベクターを生み出す一連の改
良によって減少してきている（Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、
　Ｂ。

ａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９７８）　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　Ｌｏｎｄ、　２７２　：　３７５−各ヱ７　
　；　　Ｍｅｓｓｉｎｇ＋　　Ｊ、　　（１’１７９）
　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ＯＮ＾Ｔｅｃｈｎｉｃ
ａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、　ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎ　Ｎｏ、７９−９９＋２、　Ｎｏ、２４３−４８　
；　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　（：ｒｅａ、　Ｒ，ａｎ
ｄＰ、　Ｈ。

Ｓｅｅｂｕｒｇ　（１９８１）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：　３０９−３２１）。

エセリシア・コリーのＩａｃオペロンの断片（β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子のプロモーターとＮ末端）はＭ１３
ゲノムへ挿入された。ある細胞系列（例えば、エセリシ
ア・コリーに１２　ＪＭ１０１およびＪＭ１０３）の感
染中、この情報はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の欠失突
然変異とβ−ガラクトシダーゼ活性を相補するであろう
（α−相補）。これらの細胞は」赳゛表現型を示し、　
ＩＰＴＧとＸ−ｇａｌを含む培地上で青色のプラークに
よって同定できる（Ｍａｌａｍｙ。

Ｍ、　ｌ（、、Ｆｉａｎｄｔ、　Ｍ、　ａｎｄ　５ｚｙ
ｂａＸｓｋｉ、　Ｉｉｌ、　（１９Ｔ２）Ｍｏ１．　Ｇ
ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１１９　：　２０７ｆｆ）　ａ
さらに、インビトロで合成され、制限酵素切断部位（複
数のクローニング部位（ＭＣ５）　）の配列を含む小さ
いＤＮＡ断片がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の構造
遺伝子領域へ挿入された。これらの挿入にもかかわらず
、　Ｍ１３ｍｐ７　ＤＮＡはまだ、感染性があり、修飾
サレタＩａｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａは機能的なβ−ガラクトシ
ダーゼ　α−ペプチドの合成をコードすることができる
。　（Ｌａｎｇｌｅｙ、　Ｋ、　Ｅ、＋　Ｖｉｌｌａｒ
ｅｊｏ、　−Ｍ、　Ｒ，。

Ｆｏｗｌｅｒ、　　Ａ、　　ν、、　　Ｚａｍｅｎｈｏ
ｆ、　　Ｐ、　　Ｊ、　　ａｎｄ　　Ｌ　　Ｚａｂｉｎ
（１９７５）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　八ｃａｄ
、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、八、　　７２　　：　　１
２５４−１２５７）　、このＭ１３ｍｐ７中の合成され
たＤＮＡ断片は、中央に置かれたＰｓｔ１部位に関して
対称的に配列された一即タＲ１，勿旧、Σ１−■、占Ｉ
と一旧ｎｃｌｌ制限酵素に対してそれぞれ、２つの部位
を含む。

偶然にクローン化された制限酵素断片のどちらの鎖も、
ウィルス（＋）鎖の一部となることができる。これは連
結後Ｍ１３ゲノムに関連した断片の方向による。これら
の制限酵素部位のひとつへのＤＮＡ断片の挿入は、たや
すく監視できる。なぜなら、その挿入は機能しないα−
ペプチドとβ−ガラクトシダーゼ活性の減少という結果
をもたらすからである。適切な条件下では１例えば、エ
セリシア・コリーに１２　ＪＭ１０１あるいはＪｌ’１
１０３がＭ１３ｍｐ７に感染すると１機能するα−ペプ
チドが、青いプラークという結果をもたらす。機能しな
いα−ペプチドは無色のプラークをつくる。（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ、　、ｒ。

ａｎｄ　Ｂ、　Ｂｒｏｎｅｎｂｏｒｎ　（１９７８）　
−ｒｎ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ、　Ｄ、　Ｔ、。

Ｄｒｅｓｓｌｅｒ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｄ、　Ｓ、　Ｒａ
ｙ　（ｅｄｓ、）　ＴｈｅＳｉｎｇｌｅＳｔｒａｎｃｌ
ｅｄ　　ＤＮＡ　　Ｐｈａｇｅｓ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ。

ｐｐ４４９−４５３）。Ｍ１３ｍｐＴはダイデオキシ核
酸配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅ
ｎ、　ｓ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｒ，Ｃｏｕｌｓｅｎ（１９
７７）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　Ａｃａ、ｄ、　
　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、八、　　７４　　：　　５４６
３−５４６７）に広い応用が見出された。

Ｍ１３ｎ＋ｐ７の欠点は複数クローニング部位（ＭＣ５
）が制限酵素部位のそれぞれを２つ含むということから
ＤＮＡ制限酵素断片が、どちらの方向への挿入されると
いうことである。したがって、２つの新しいｓｓＤ’Ｎ
Ａバクテリオファージベクター。

Ｍ１３ｍｐ８とＭ１３ｍＰ９が、構築された。　（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ、　Ｊ。

ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、　（１９８２）　Ｇｅｎ
ｅ　１９　：　２６９−２７６）複数の制限酵素部位を
含むＭ１３ｍｐ７の核酸配列は、それぞれ−の制限酵素
部位の１コピーのみを持つように修飾され、一つずつの
Ｈ４ｎｄｌｌｌ、　Ｓｍａ　Ｉ、　Ｘｍａ　１部位が加
えられた。したがって、その末端がこれらの制限酵素部
位の２つに相当するＤＮＡ断片は。

これらの新しいＭ１３クローニングビークルのひとつに
連結することにより“強制的にクローン化”でき、同し
制限酵素の組で“切り出す”こともできる。Ｍ１３ｍρ
８とＭ１３ｍｐ９はＭ１３ゲノムに関して反対の方向に
並ぶ修飾された複数の制限酵素部位領域を持ち、ある制
限酵素断片は２強制クローニングによって直接に方向づ
けができる。旧３ｍｐ８とＭ１３ｍｐ９の両方のベクタ
ーの使用は、クローン化される断片のどちらの鎖も、ク
ローンの一方または他方で（＋）鎖となり、かくしてフ
ァージ粒子中にｓｓＤＮＡとして押し出されることを保
証する。

最初に、　ｐＵＣ９のポリリンカーとラムダファージの
Ｐ、ｌプロモーターの融合は、２１塩基のラムダの配列
および数個のｐＵＣ９の塩基が合成ブロムモザイクウィ
ルス（ｂｒｏｍｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ）　　ｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａ　３転写産物の５゛末端に出現する結果を
もたらした（第２図および第３図）。正しい５”末端を
持つ合成ＲＮＡ転写産物（ウィルスＲＮＡ転写産物を含
む）を産生させるために、“ユニヴアーサル”転写ベク
ター（現在ｐＰＭ１と呼ばれている）を作製した。この
転写ベクター（ｐｐＭｌ　）　　は、　　Ｐ、ｌプロモ
ーターの大部分を保持していたが、唯一の平滑末端制限
部位（第３図す中のＳｍａ　Ｉ部位）の切断部位と一致
する転写開始部位は保持しなかった。

そのような転写ベクターは、多数のプロモーター配列の
実験から、プロモーターの強さを変化させることなく特
異的部位指向変異により、転写開始の位置に、平滑末端
であるＳｍａ−１部位を産み出すことができるかもしれ
ないことが明らかになった時に可能になった。このＳｍ
ａ　ｒ部位に平滑末端連結したＤＮＡ断片の転写産物は
、後はど、挿入断片の第一塩基からであることが示され
た。特に。

ウィルスｃＤＮＡは、末端に相補するオリゴヌクレオチ
ドにより始まるが、この部位に平滑末端連結すると正し
い５゛末端から転写された。さらに。

このベクターの最初の形（第３図ｂ）は、　Ｓｍａ　１
部位のすく下流に、唯一のＥｃｏＲＩ部位を有しており
、そこで、転写産物はランオフ終了が可能であり、３”
末端に７個までの塩基が付加した転写産物を与える。

９２Ｍ１ベクタ−を構築するためニ、　ｐＣＱＶ２　　
（第２図）由来のラムダＣＴ−Ｐ＋＋、ｌ−Ｐ＋＋カー
１リッジをＭ１３ｍｐ９にサブクローニングした。生じ
たｓｓＤＮＡは、この開始部位をＳｍａ　ｒ認識配列の
左半分と融合させるように示されたミスマツチを生ずる
オリゴヌクレオチドからのＤＮＡ合成の鋳型として用い
られた。そのミスマツチを生ずるオリゴヌクレオチドは
手頃な（“１ｎ−ｈｏｕｓｅ”）容易さで合成された。

このミスマツチプライマーから複製したＤＮＡを２本鎖
にし、単離し、　Ｍ１３ｍｐ９へ連結した。修飾された
Ｐ、ｌプロモーター（すなわち、Ｐ、４プロモーター）
の配列を確認した後、この新しいｃＩ−Ｐｇ□ＰＭカー
トリッジをｐＵＣ９ヘサブクローニングし。

最終的に所望のベクターｐＰＭ　１を得た。いくつかの
些細ではない技術的困難はミスマツチプライマーを用い
ることにより解決した。・第一に、そのプライマーはＰ
、プロモーターから９６残基上流の塩基配列と相補性が
あり９期待したＰ、ｌプロモーター開始部位から３塩基
上流での好結果のプライミングは達成できなかった。

この予期しなかった結果に対する解答は、最終的には、
他の可能性を排除し、最初のクローニングの手順がオリ
ゴマー結合の段階で失敗したことを示した後に、得られ
た。所望の部位にオリゴマーを結合することができなか
ったことに関する考えうる機構の考察と可能な相補的ベ
アリングのコンピューター分析とにより、鋳型中の二次
構造が主な問題点であると結論した（第５図）。この発
見により２分子内相互作用からの競争にもかかわらず、
所望の部位に結合させる新しい方策が得られた。この新
しい方策ではＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片（第４
１１）の代わりに、逆転写酵素が用いられた。また、鋳
型を完全変性後高い効果的濃度のミスマツチプライマー
存在下で徐々に再生した。最後に、プライマーの要求さ
れるレベル。

を決定する広い範囲のプライマー濃度を用いるこの新し
く開発された方策の直接試験により、所望の位置（すな
わち、　　Ｐ＋ｔプロモーター開始部位から３塩基上流
）でのＤＮＡ合成の効果的開始が分かった。

Ｓｍａｌ制限エンドヌク、レアーゼの認識配列は下記の
通りである。

Σ懸Ｉ プロモーター　　５’−ＣＣＣＧＧＧ−３”転写開始塩
基 □　読み取り鎖 ３’−ＧＧＧ　ＣＣＣ−５’ “上流”′下流” 切断部位 この切断部位は、ＣとＧの間の中央に存在する。

読み取り鎖は３’−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−５”であ
る。その、、ＳｍａＩ制限エンドヌクレアーゼの切断部
位は、このように読みとり鎖に関して、転写開始塩基の
３゛側に位置す°る。再び、読みとり鎖について、“上
流”は５１−−一＞３１そして“下流”は３”−−−＞
　５１と定義する。

一般に、転写開始ベクターの構築における重大な特徴は
、プロモーター配列と制限エンドヌクレアーゼの平滑末
端切断部位との間の距離である。

制限エンドヌクレアーゼの切断部位は読みとり鎖上で転
写開始に用いられる塩基の３′側に位置しなければなら
ない。そして、切断部位により転写される塩基と転写さ
れない塩基がわけられる。ここで用いられている“転写
開始塩基”という用語は最初に転写される塩基、すなわ
ち、ＲＮＡ転写産物の５′末端リボヌクレオチドに相当
する（あるいは、ＤＮＡ鎖により相補な）塩基を意味す
る。

次の工程は９種々のＲＮＡ分子の正確なｃＤＮＡコピー
をクローニングすることである。種々のＲＮＡ分子とは
、すなわち、ブロムモザイクウィルスあるいは他のウィ
ルス（同上）、さまざまなバクテリアの１６ＳＲＮＡお
よび真核細胞由来の５ｎＲＮＡなどである。これらの工
程は第一および第二鎖ｃＤＮＡプライマーとして用いる
ためのそれぞれのＲＮＡ末端と相補性のあるオリゴヌク
レオチドを合成することにより完成された。一度。

ｃＤＮＡを合成し、新しいｐＰＭ　１ベクタ−プラスミ
ドの唯一のΣｍａＩ部位にクローン化するとＲＮＡは既
知天然のＲＮＡとは３”末端に最高の７塩基が付加した
という違いを持つものが合成され得た。

（以下余白） （実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

実施例１：ファージ組換体Ｍ１３／ＰＲＩ−９の構築お
主グ選択 プラスミドｐＣＱＶ２　　（Ｑｕｅｅｎ　　（１９８３
）　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　２　：　１−１０　）を、
制限エンドヌクレアーゼ　Ｃ１ａｌおよび旦鮒旧により
切断し、λファージのｃｌ”−ｐＨ，ｌ−Ｐ＋＋−ＡＴ
Ｇ配列を有する断片を。

低融点アガロースゲル（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　
（１９８０）Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１４３　　：　１６１−１７８　
）から分離し、子牛腸ホスファターゼ処理済のへｃｅｌ
プラスＢａｍＨＩ切断Ｍ１３ｍｐ　９　ＲＦＤ　Ｎ　Ａ
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。このＤＮＡ
を、コンビテントエセリシアコリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）　
ＪＭ１０１の形質転換に用い。

プレートした。ｄｄＡＴＰシークエンシング技術（Ｓａ
ｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　ＪＭＢ　１６
２　：　７２９−７７３）により９個の白色プラークの
選別と選択を行った。オートラジオグラフ法を行った結
果、９個のファージクローン中８個が予期されたλフア
ージＤＮＡの挿入を有し、残りの１クローンはＭ１３ｍ
ｐ９の欠失突然変異体であることが確認された。Ｍ１３
／λ組換体の一つをＭ１３／ＰＲＩと名付け、これから
の実験用に選んだ。

５　’−ＯＨ−ｄ　（ＧＧＧＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣ
）　−３°−０１１という１５量体ミスマツチオリゴヌ
クレオチドを、これからＰＲ−オリゴヌクレオチドまた
はＰＲ−プライマーと呼ぶことにするが、ホスファイト
・トリエステル法により合成した。このＰ、−プライマ
ーは、λファージのＰ、ｌ−プロモーターを正確に改造
できるように設計され′た。ＰＲＤＮＡにおけるこのＰ
、！−プライマーのプライミングを調べるために、いく
つかの方法を用いた。ここでとりあげるヌクレオチド配
列中に相補的なステムおよびループ構造が存在するので
（上記を参照）、大過剰のＰ、ｌ−プライマーを加えた
Ｍ　１３ｍｐ　９　／　ｐＰＲＩ　Ｄ　Ｎ　Ａテンプレ
ートの完全な変性がλＰＲプロモーターから始まって遂
行され得るｐかどうか、およびこの部位でアニーリング
したようなプライマーは１．上流のＣＴ　Ｌ　ｓ部位に
結合するＰＲ−プライマーの伸長なしで逆転写酵素によ
って伸長され得るかどうか、ということを調べるために
次に述べる実験を計画した。上流のｃＩｔｓ部位に結合
している場合には、ＰＲ−プロモーターは３”側の一番
末端で対をつくることができない、ということが後に示
される（第５図）。そのように３°側の一番末端で対合
を形成しないことにより、３゛−エキソヌクレアーゼ活
性を欠く逆転写酵素による伸長が阻止される。それゆえ
２Ｍ１２／ＰＲ１ｓｓＤＮＡを１．１０．１００および
１　、０００倍のモル過剰でＰＲオリゴマーと混合し、
煮沸／暖冷法　（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、
　　　（１９８０）　　Ｎｕｃｌｅ、八ｃｉｄｓ、Ｒｅ
ｓ。

８　：　１７３１ｆｆ）によりアニーリングし、そして
逆転写酵素を用いたｄｄＴＴＰシークエンシング反応（
＾ｈｌｑｕｉｓｔ　ｅｔ　ａｔ、　　（１９８１）　Ｃ
ｅ１ｌ　　２３　：　１８３−１８９　）においてテン
プレート／プライマー複合体として用いた。　最終のゲ
ルのオートラジオグラフ法により、それらの条件下にお
いては、ＤＮＡ合成はｐ、プロモーター配列中の望みの
部位から唯一開始されることがわかった。ＰＲプライマ
ー濃度が最高のプライマｍ：テンプレート比（１，００
０：　１）をとる場合に、ＤＮＡ合成効率は通常の５倍
過剰のＭ１３／Ｉａｃシークエンシングブライマー（Ｄ
ｕｃｋｉｉｏｒ　ｔｈｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌ、八ｃｉ
ｄｓ、Ｒｅｓ、　９　：　１６９１−１７０６　）から
の合成と同程度の効率゛に安定して増加した。

の使用 １．０００倍モル過剰のＰ、ｌオリゴマーを約２μｇの
Ｍ１３／ＰＲ１のｓｓＤＮＡと混合し、煮沸／暖冷法（
Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｎｕ
ｃｌ、＾ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、　８　：１７３１ｆｆ）
によりアニーリングした。　その結果生成したテンプレ
ート／プライマー複合体を４種のｄＮＴＰＯ全ての存在
下で逆転写酵素により伸長させた。生成りＮＡをエタノ
ール沈澱により分離し、そしてＨｏｎｇ　（Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ上：　２４３−２５２（１
９８１）　）により記述されたＭ２Ｓ　１ａｃ“リバー
ス”プライマーによって開始される第二のＤＮＡ合成反
応に用いた。その結果生成したＤＮＡをＰｓｔｌで切断
し、低融点アガロースゲルで電気泳動し。

そして確定されているマーカーＤＮＡ断片の移動度から
検定された８００−１　、０００ｂｐ部分を切取り、そ
して溶出させた（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９
８０）、　Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏ＋、　１４３　　：　１６１−１７８）。このＤ
ＮＡを次にＳｍａｌプラ人ＰｓｔＩにより切断したＭ１
３ｍｐ　９　ＲＦ　Ｄ　Ｎ　Ａと混合し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ処理し、そしてコンビテン）　Ｅ、ｃｏｌ　ｉＪ
Ｍ　１０１細胞の形質転換に用いた。

平板に置いた後に、ｄｄＡＴＰシークエンシング法（Ｓ
ａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　ＪＭＢ’　
１６２　：　７２９−７７３）により３０個の白色プラ
ークを選別および選択した。これらの組換体のうちの１
６個で得られたパターンはλＰＲプロモーター成分の配
列がベクターのＳｍａＩ部位に直接結合しているという
所望の構造と矛盾しなかった。

ＰＭクローンの構築の目的は改造された特別のプロモー
ター配列（すなわち、五はり制限エンドおよびＭ２Ｓ　
ＰＨ８７と名付けるが）を２’、３’−ジデオキシヌク
レオシド　トリホスフェート法（Ｓａｎｇｅｒ。

Ｆ、　　ｅｔ　　ａｌ、　　　（１９７７）　　Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　１１
．ｓ、八。

７４　：　５４６３−５４６７）により配列決定した。

両方の株における改造されたｐＨプロモーター付近のヌ
クレオチド配列は、まさに望み通りのものであった。

すなわち： Σ匣■ 、、、、ＴＧＣＧＴＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴ
ＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＧＴＣＣＣＧＧＧＡＡ
ＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣ，、、。

ＰＲ匡ｏＲＩ λ配列　　　　　　　Ｍ１３ｍｐ９配列ＳｍａＩ部位に
造られたヌクレオチド配列の変換は。

上の配列とＰＩ３３　ＰＩｉ１３の配列（第２図）とを
比較することにより理解される。Ｍ２Ｓ　ＰＨ１０の配
列は上に示した配列の上流にさらに２１０塩基が読まれ
た。

これはそれからｐＣ（ＩＶ　２の配列（Ｑｕｅｅｎ、Ｃ
，（１９８３）Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　
　２　：　１−１０）とコンピューターにより矛盾なく
対合した。オートラジオグラフ法の精密な視覚実験によ
り、　Ｍ２Ｓ　ＰＨ１０とＭ２Ｓ　ＰＨ８７との間には
配列の相違がないことが明らかとなった。

二つのクローンＭ１３　ＰＨ８６およびＭ１３　ＰＨ１
０のそれぞれにおいて、ＲＦＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼハ（■およびＥｃｏ　ＲＩにより分解し、そして
所望の修飾ＰＲプロモーターを含むＥｃｏ　Ｒ１−Ｐｓ
ｔ　Ｉ断片を、低融点アガロースによる電気泳動の後回
収した。適当なりＮＡバンド（大きさにより判断）を切
取り、前に記述したように上記ＤＮＡを抽出し、　Ｅｃ
ｏ　ＲＴプラスＰｓｔ　Ｉで切断したｐＵＣ９　（Ｖｉ
ｅｉｒａａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ　（１９Ｂ２）　Ｇｅｎ
ｅ　　１９　：　２５９−２６８　）に結合した。この
ＤＮＡをコンピテントＥ、ｃｏｌｉ　ＭＪ１０１細胞の
形質転換に用い、その細胞をアンピシリン。

Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含む培地上に置いた。各々
の結合混合物により生じた６個の白色コロニーからのミ
ニライセードＤＮＡ試料（Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚお
よびＢｕｒｋｅ　　（１９８１）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ
ｓ、Ｒｅｓ、　　９　：２９８９ｆｆ）のＥｃｏ　ＲＩ
およびＥｃｏ　ＲＩプラスハ（Ｉ分解、物をアガロース
ゲル電気泳動により調べた。各々の場合において９分解
物は挿入断片が所望の大きさであること、おらびそのよ
うな断片がただ一つだけ挿入されていることを確証した
。これらのクローンの一つ、　　ｐＰＭｌと名付けられ
たＭ１３’／ＰＭ８６由来のものを、これからの実験用
に選んだ。ｐＰＭｌの転写物を標準的方法により得た。

これらの転写物のランオフの逆転写により＋　　ＰＲプ
ロモーター上の転写開始が計画通り正確にΣｍａｒ部位
より起こることが分かった（下に示す）。

転写開始 ＴＧＡＴ八八ＴへへＴＣＣＣＧＧＧ＾＾ＴＴＣＡＣＴＧ
ＧＣ旦匣Ｉ ＢＭＶＲ，ＮＡ３のヌクレオチド配列はすでに知られて
いる（Ａｈｌｑｕｉｓｔ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８
１）　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　１５３　　：２３−２８　）　、この情報
をもとに、　ＢＭＷＲＮＡ３のｃＤＮＡの第１および第
２鎖の合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計１合成
し、そしてＢＭＶＲＮＡ３のｄｓｃＤＮＡの最初の生成
に用いた゛（Ｆｉｅｌｄｓおよび一１ｎｔｅｒ　（１９
８２）　Ｃｅ１ｌ　２８　　：３０３−３１３　）　、
全長をもつｄｓｃＤＮＡをアガロースゲルより分離しく
同上）、そしてｐＰＭ　１のΣｍａ１部位に挿入した。

（＋）鎖を転写させるように方向づけられたクローン（
すなわち、カプシドで包含されたウィルスＲＮＡと方向
性において呼応した転写）を、制限分解による選択の後
に選別した。

これらの選別されたクローンのプラスミドＤＮＡヲＥｃ
ｏ　Ｒ１により切断し、標準的方法によるインビトロで
転写した。転写のランオフ逆転写を用いることにより得
られた結果により、　　ｐＰＭ１転写ベクターのＳｍａ
Ｉ切断部位から下流の一番目のヌクレオチドから転写開
始が起こることが分かった。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｃｆｌＶ　２の構造を示すマツプ、第２図は
Ｅｃｏ　ＲＩで線状化したｐ８３ＰＲ１３のマツプ、第
３図はｐＰＲｌ　（ｐＢ３ＰＲ１３の元のプラスミド）
におけるＰｒプロモーター／ポリリンカー融合物の構造
（ａ）、およびｐＰＭ　１におけるＰ１プロモーター／
ポリリンカー融合物の構造ｆｂｌを示すマツプ、第４図
は転写ベクターｐＰＭ　１の作成手順を示す工程図、第
５図は転写ベクターｐＰＭ　１の作成の問題点を示す説
朋図である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下のものを含む組み換えＤＮＡベクタ−を保持し
   、そこで複製する細菌株： （ａ）複製開始点と選択マーカー、 （ｂ）プロモーターと、転写開始ヌクレオチドが一番目
   の転写物のヌクレオチドである転写開始部位とを含むヌ
   クレオチド配列、 （ｃ）切断部位が該プロモーターの下流の転写開始ヌク
   レオチドの３′側にある、制限エンドヌクレアーゼ認識
   配列、および （ｄ）該切断部位に挿入されたＤＮＡの断片。 ２、前記プロモーターヌクレオチド配列が制限エンドヌ
   クレアーゼ認識配列を含むように修飾されている特許請
   求の範囲第１項に記載の細菌株。 ３、前記株がエセリシア・コリーＫ１２ＪＭ１０１また
   はエセリシア・コリーＫ１２ＪＭ１０３である特許請求
   の範囲第１項に記載の細菌株。 ４、前記複製開始点および選択マーカーがｐＵＣ９また
   はＭ１３ｍｐ９である特許請求の範囲第１項に記載の細
   菌株。 ５、プロモーターを含む前記ヌクレオチド配列がｐＰＭ
   １である特許請求の範囲第１項に記載の細菌株。 ６、前記制限エンドヌクレアーゼ認識配列が平滑末端制
   限ヌクレアーゼ部位である特許請求の範囲第１項に記載
   の細菌株。 ７、前記制限エンドヌクレアーゼ認識配列がＳｍａ I
   部位である特許請求の範囲第１項に記載の細菌株。 ８、ＤＮＡの前記断片がウィルスＲＮＡ分子からの逆転
   写により由来するｃＤＮＡ分子である特許請求の範囲第
   １項に記載の細菌株。 ９、ＤＮＡの前記断片がｒＤＮＡ、ｔＤＮＡまたはｓｎ
   ＤＮＡをコードする特許請求の範囲第１項に記載の細菌
   株。 １０、以下のものを含む組み換えＤＮＡベクタ（ａ）複
   製開始点と選択マーカー、 （ｂ）プロモーターと、転写開始ヌクレオチドが一番目
   の転写物のヌクレオチドである転写開始部位とを含むヌ
   クレオチド配列、 （ｃ）切断部位が該プロモーターの下流の転写開始ヌク
   レオチドの３′側にある、制限エンドヌクレアーゼ認識
   配列、および （ｄ）該切断部位に挿入されたＤＮＡの断片。 １１、前記プロモーターヌクレオチド配列が制限エンド
   ヌクレアーゼ認識配列を含むように修飾されている特許
   請求の範囲第１０項に記載の組み換えＤＮＡベクター。 １２、前記複製開始点および選択マーカーがｐＵＣ９ま
   たはＭ１３ｍｐ９である特許請求の範囲第１０項に記載
   の組み換えＤＮＡベクター。 １３、プロモーターを含む前記ヌクレオチド配列がｐＰ
   Ｍ１である特許請求の範囲第１０項に記載の組み換えＤ
   ＮＡベクター。 １４、前記制限エンドヌクレアーゼ認識配列が平滑末端
   制限エンドヌクレアーゼ部位である特許請求の範囲第１
   ０項に記載の組み換えＤＮＡベクタ１５、前記制限エン
   ドヌクレアーゼ認識配列が￥Ｓｍａ￥ I 部位である特
   許請求の範囲第１０項に記載の組み換えＤＮＡベクター
   。 １６、ＤＮＡの前記断片がウィルスＲＮＡ分子からの逆
   転写により由来するｃＤＮＡ分子である特許請求の範囲
   第１０項に記載の組み換えＤＮＡベクター。 １７、ＤＮＡの前記断片がｒＤＮＡ、ｔＤＮＡまたはｓ
   ｎＤＮＡをコードする特許請求の範囲第１０項に記載の
   組み換えＤＮＡベクター。 １８、以下の工程を包含する普遍性転写ベクターを構築
   する方法： （ａ）プロモーターを含むＤＮＡ断片を単離すること、 （ｂ）組み換え線状１本鎖ファージを生ずるような線状
   １本鎖ファージ株の複製型へ該ＤＮＡ断片を挿入するこ
   と、 （ｃ）該組み換えファージを用いて細菌株を形質転換す
   ること、 （ｄ）該細菌株から分泌される該組み換えファージのｓ
   ｓＤＮＡを単離すること、 （ｅ）該プロモーターに部分的に相補的なオリゴヌクレ
   オチドプライマーを合成すること、このオリゴヌクレオ
   チドプライマーの５′末端が転写開始部位に相当しそし
   てこの５′末端が平滑末端制限エンドヌクレアーゼ部位
   の一方の配列を有する、（ｆ）該オリゴヌクレオチドプ
   ライマーを用いて該ｓｓＤＮＡを複製し、修飾プロモー
   ターを含む修飾相補ＤＮＡ鎖を生産すること、該修飾プ
   ロモーターは該オリゴヌクレオチドプライマーに相補的
   な配列を含むプロモーターである、 （ｇ）前記該修飾相補ＤＮＡ鎖を複製して該修飾プロモ
   ーターを含む修飾２本鎖ＤＮＡ断片を生産すること、お
   よび （ｈ）該修飾２本鎖ＤＮＡ断片をベクタープラスミドへ
   クローニングし普遍的転写ベクターを生産すること。 １９、プロモーターを含む前記ＤＮＡ断片がラムダファ
   ージ由来のｃＩ−Ｐ＿Ｒ＿Ｍ−Ｐ＿Ｒ断片である特許請
   求の範囲第１８項に記載のプロセス。 ２０、前記１本鎖ファージ株がｐＵＣ９またはＭ１３ｍ
   ｐ９である特許請求の範囲第１８項に記載のプロセス。 ２１、前記細菌株がエセリシア・コリーＫ１２ＪＭ１０
   １またはエセリシア・コリーＫ１２ＪＭ１０２である特
   許請求の範囲第１８項に記載のプロセス。 ２２、前記オリゴヌクレオチドプライマーが５′−ＯＨ
   −ｄ（ＧＧＧＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣ）−３′−ＯＨ
   である特許請求の範囲第１８項に記載のプロセス。 ２３、前記平滑末端制限エンドヌクレアーゼ部位が￥Ｓ
   ｍａ￥ I 部位である特許請求の範囲第１８項に記載の
   プロセス。 ２４、前記ベクタープラスミドがｐＵＣ９である特許請
   求の範囲第１８項に記載のプロセス。