JPS6158582A - 連続還流細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は動物の各種細胞の培養のための連続還流培養装
置〆１に関する。

脳細胞や肝実質細胞等の特殊な細胞は低酸素濃度の培養
条１′１では細胞数の極端な減少及び機能低下がみられ
る。ｊｆｆｌ常の培！ｆ装置ｎの培養液の溶存酸素濃度
は、およそ１〜３ｐｐｍに限られていた。

しめ化前述の動物細胞の培養においては上り高い溶存酸
素濃度で効果の高いことが明らかにされてきている。従
来、溶存酸素濃度を高める方法として常圧下で酸素又は
空気を培養液中にバブリングする方法が提案されていた
。この場合、溶存酸素濃度はかなり；ン 向くなるが、培養液にホーミングが生しる欠点を有して
いた。こいう。前者の泡の原因は培養液の血清中等に含
まれているたんばく質の変性によって生したものである
ため、細胞を培養するときの障害となる。後者の気泡は
バブリングの際、酸素が溶解しきらずに残０？シたもの
で、溶存酸素濃度等をセンサすることが不可能となるた
めデータの把握や濃度等のフントロール等がで外なくな
ってしよう欠点を有していた。従ってバブリングによる
溶存酸素濃度を高める方法は動物細胞を培養するとき、
特に人工臓器としてこのシステムを利用する場合、極め
て重大な欠点を有するものであった。

］１記に鑑み本発明者らは、鋭意研究の結果、溶存酸素
濃度を高めるための加圧室を培養装置に導入し、この加
圧室に酸素を充填して加圧（２〜５ａ１．＋ｎ）するこ
とにより、培養液に酸素は良好に溶解され、またこの高
濃度酸素を含む加圧培養液は、常圧に減圧後も培養液の
溶存酸素濃度を充分高く保てること、さらにこの方法で
はホーミングは培養液中にわずかに気泡を生じるだけで
この気泡もフィルター等で容易に取り除けることを知見
し、本発明に到達したものである。

以下、本発明の第１の実施例を図面第１図を参照して、
詳細に前記培養槽（２）は、被培養細胞の担体として中
空糸及び／又はフ（８）（９）は被培養細胞特に実質細
胞の機能維持状態をだしかめるために、培養液の温度、
ｐｉ−１、溶存酸素濃度、炭酸ガス濃度、グルツース濃
度、等を計測するための各種センサが内設されている。

このセンサユニッ）（８Ｍり）は　コン１０−ルユニツ
）　（１０）に接続され、この培養装置の各機描を制御
するように構成されている。

（５）は酸素タンクである。この酸素タンク（５）は、
加圧室（３）に連絡管（７）により接続さねている。ま
た前記連絡管（７）と加圧室（３）との接続点には電気
的に制御される開閉バルブ（１１）が設けられており、
この開閉バルブ（１１）は前記フン１０−ルユニツト（
１０）に接続されでいる。（１２）はリークバルブ、（
＋：１）（＋４）は電磁弁でそれらの開閉制御は全てコ
ン）・ロールユニッ）（Ｉｎ）に］二１）行われる。。

（１６）はスターラーバーで加圧室（３）の１ζ部に配
置されたスターク−（図示せず）により回転Ｌ−）−：
ｊ　Ｍ液を攪拌するために加圧室１１（而に載置されて
いる。（１５）は気泡除去用フィルターで例えばミリポ
アフィルタ−で構成され、培養液がこのフィルター（１
５）を通過することにより気泡を除去した培養液を培養
槽（２）に供給するために設けられたものである。

次に−１−記のように構成しｒこ本発明連続還流細胞培
養装置の作用の溶存酸素濃度が低くなったと外センサユ
ニッ）（８Ｈ９）が感知り、酸素タンク（５）から加圧
室（３）に酸素が充填され加圧室内は２〜５ａ１．ｍ程
度に加圧される。次にスターラーバー（１６）を回転さ
せる。この動作により培養液の」二面より酸素は培養液
中に溶解する。充分酸素を溶解させた後、開閉バルブ（
１１）を閉塞し、リークバルブ（１２）を開と加圧室内
の圧を常圧に減圧する。減圧後、電磁弁（＋３）（＋４
）を開き再び培養液を培養槽（２）へ連続的に還流させ
る。

このどき加圧室内に発生した気泡はわずかであるため気
泡除去フィルター（１５）によって除去される。

次に本発明連続還流細胞培養装置の第２の実施例を図面
第２図−：（− を参照して詳細に説明するか、前記第１の実施例と同一
部分には同一符号をイ・１し、その説明を省略する。（
＋７）（＋８）はプランツヤ−ポンプである。（１９）
はりサーバータンク、（２０）はプレタンクである。プ
ランジャーポンプ（１７）は加圧室（３）の培養液をリ
ザーバータンク（＋９）へ送るため、ブランン゛ヤーボ
ンブ（１８）ｌ土ブレタンク（２０）の培養液を加圧室
（３）・＼送るために設けられｌこ（代構であり、各々
コン１０−ルユニツ１．（１０）に接続されている。

本実施例の作用はプレタンク（２０）、リザーバータン
ク（＋！１）Ｔｈｑ・にシステムは第１の実施例と同様
であるか、還流ポンプ（４）は常に作動し、電磁弁（１
３）（１４）が閉塞している間はりサーバータンク（１
９）に貯蔵された培養液を培養槽（２）へ供給する。そ
して溶存酸素濃度が所定値となった時、プランジャ−ポ
ンプ（＋７）（１８）は作動を開始し、還流すると共に
リザーバータンク（１９）にも貯蔵用の培養液が供給さ
れる。

次に本発明連続還流細胞培養装置の加圧室の他の実施例
を図面第３図を参照して詳細に説明するが、前記第１の
実施例と同一部分には同一符号をイ・１した。（２１）
は中空糸であり、酸素タンク（５）＝４− に接続された連絡管（７）に連結されている。この中空
糸（２１）の先端は閉塞されている。尚、中空糸の代わ
りにテフロン管やボアテックスチューブ等も使用しうる
。

−１−記加圧室の作用を説明する。培養液の溶存酸素濃
度が低くなりた時、フン１０−ルユニツト（１０）の制
御によりリークバルブ（１２）電磁弁（１３）（＋４）
が閉塞し、開閉バルブ（１１）が間外酸素が中空糸（２
１）を通って加圧室（３）に充填される。その結果、酸
素は中空糸内から溶は出し培養液中に溶解される。同時
に加圧室内も加圧される。そのため培養液の−に面から
も溶解は進行する。この作用中、）スターラーバ−（１
６）も回転する。充分酸素を溶解した後の減圧、◇・ 還流の作用は第１の実施例と同様であるため、その説明
を省略する。

とるように構成するのが好ましい。

また、本発明装置は、各臓器細胞を培養し、代用人工臓
器に応用できる。この際の特徴として培養液の溶存酸素
濃度を高く保つ二と以外に、培養槽内の中空糸の外側に
実質細胞と、コラーゲン。

糖タンパク質等の細胞外マトリックスと、線ｉｔ芽細胞
等の非実質細胞とを共存させ本来の臓器機能を長期間代
用させうる点と、中空糸ユニットの前に血液中の血球成
分と血漿成分を分離するユニ・ントを有する点があげ゛
られる。

以−１〕の説明上り明らかなように、本発明連続還流細
胞培養装置によれば、培養液の溶存酸素濃度の高い被培
養細胞に好適な条件性細胞、腎実質細胞、肝実質細胞等
の実質細胞に適用１７た場合にバータンク（１９）の作
用により常に一定室、の培養液を間断無く培養槽に流す
ことが可能となる。さらに実用的な而からもリザーバー
タンク中へ、血液、血清等を加える５−とかでとるのも
利点である。

また、加圧室の他の実施例においては、酸素と培養液と
の接触する面積が広いすなわち中空糸の全ての表面より
酸素が溶解するため、溶解速度が速く、消費する酸素量
も少■で充分な効果がｊ（１られる。

次に本発明連続還流細胞培養装置を利用した肝実質細胞
の培養における酸素の影響と代用人工臓器への応用の実
験例について説明する。

実験例１− 肝実質細胞培養における酸素の影響 ｉ、ＩＩＦ１Ｍからの実質細胞の分離及び培養ゲナーゼ
　Ｔｙｐｅｌを細胞分散用（和光純薬製）、仔牛血清を
牛胎児血清（ＧＴＢＣＯ製）に変更し、培地をＤＥ（日
永製薬製）、ＲＰＭＴ　　１６４．（１（（響ＩＢＣＯ
製）を追加した以外は通常のコラゲナーゼ還流法で行な
った。（中村ら　別間蛋白質核酸酵素Ｎｏ、２４　１９
Ｉ３１） ２、培養槽中気相成分の違いによる培養肝実質細胞をプ
１／−Ｆにでインキュベーター中で気相成分としてＣ，
０２を５％に固定１７．０２とＮ２比を変化させて、通
常の方法で培養を行なった。（中村ら　別間蛋白質核酸
酵素Ｎｏ、２４１’９８１）　　そして培養後のプレー
トへの肝実質細胞の接着率及び肝実質細胞の培養経過口
数における生存率を求めた。接着　　　　　□率に関し
ては培養後１０経過したプレートをＨｉｒａ！、ａらの
方法（Ｇａｎｎ　　Ｉ　９８４．　）に従いトルイジン
ブルー染色により求めた。

生存率に関しては培養プレートからトリプシン処理によ
り細胞をはがしトリパンブルー処理し染色されない細胞
数から求めた。

その結果を第４図及び第５図に示した。第４図は肝実質
細胞のプレートへの接着率を示したもので縦軸は接着率
（％）、横軸は培養槽中の気相の酸素の濃度（％）であ
る。第５図は生存率を示し、縦軸は肝実質細胞の生存率
（％）横軸は培養後の時間（Ｂ）グラフ１，２，３，４
はそれぞれ培養槽中の気相の酸素の濃度が０．２０，５
０．７０（％）の条件でのグラフである。

３、培養液中溶存酸素濃度の変化に伴う生存率前述１で
分離・培養した肝実質細胞を本発明連続還流細胞装置の
培養槽部分に（１，５−１、ＯＸ、１０”ｃｅｌｌｓ／
ｃｍ２となるように接着させたシャーレを入れ、培養液
中溶存酸素濃度を変化させ生存率を調べた。生存率は前
記２と同様の方法で測定した。

さらにアルブミン量は細胞をソニーケータ−で充分に破
壊してＢＣＧ法で、またＧＯＴ活性は同様の方法で得た
分画と培養液１とをｐｏｐ法で測定した。

その結果を第６図に示した。図中縦軸は生存率（％）、
横軸は培養後の時間（日）でグラフ１，２．３，４．Ｓ
、６は培養液中の溶存酸素濃度が０．１．２，５．’Ｌ
　　１０，１５（ｐｐｍ）の条件下でのグラフである。

＝８− ４、結　果 紹織培養の条件として長い間５％ＣＯ２，９Ｓ％ａｉｒ
が用いられてきたが生体内の＃ｌｌ胞はその存在する環
境に大きな違いがあるのと同時に、細胞によって異なっ
た（幾能を担っている。今までにも全ての細胞が」〕述
の条件を最適とせず、例えば線Ｍｔ芽細胞ではかなり低
い酸素濃度条件下でよく生育することが、また、定性的
な報告が成されている。今回性なった酸素量による結果
は、第４図、第５図に示す」：つに培養槽中気相酸素濃
度が通常の培養条件（２０％０２）より高い５０％０２
でプレートへの接着率及び生存率共に最も高く、７０％
０２以」二ではその効果がやや減少した。一方、肝山米
の線紺芽細胞は低酸素状態でのみ生存する等、酸素に対
する要求性は全ての細胞で画一的でなく組ので培養液中
ヘカタラーゼ、スパーオキシドディスムターゼ、ラジカ
ルスキャベンジャ−あるいは−重項酸素のクエンチャ−
であると考えられるビタミンＥ（Ｃｔ−ｔｏｃｏｐｌ＋
ｅｒｏｌ）＋　Ｎ−ｐｒｏ−ｐｙｌｇａｌ　ｌａｔ、ｅ
（以」Ｉ　Ｓ　ｉ　ｇｒｎａ製）を添加することで高酸
素状態での肝実費細胞と１１１山来綿矧」細胞の生存率
・＼の効果を調べたど、−ろ、特に７０％０２以１−で
その効」５が−４しかった。

第４図及び第５図から、肝実質細胞の培養条ｆｌは通常
の酸素；量では低すぎることか明らかになった。さらに
、第６図に示す１（’　　！ 層ように、本発明連続還流細胞培養装置により溶存酸素
濃度を１）：確にコントロールして行なった実験から肝
実質細胞の培養には培養液中の酸素濃度５〜１５ｐｐｍ
が細胞の生存には必要で７・−・１０　ｐｐｍが最適で
あった。肝機能Ｍ［持にも著しい効果を示し、アルブミ
ン合成量は酸素２　ｐｐｍでは、培養後７日で培養開始
時の５〜１０％に低下するにもかかわらず、７〜１（ｌ
ｐｐｍでは８０％以」二の値を示した。又、細胞のＧ　
ＯＴは７〜１０ｐｌ−１ｍではほぼ１００％に相持され
るが２ρ１１１１＋では１０〜２０％まで低下する。培
養液中のＧ　ＯＴは７−１０　ｐｐｍでは２　ｐｐｍに
比べて著しく低い値を示した。

因子の機能を失うことなく、マイルドに培養液中の溶存
酸素濃度を」１昇させることを可能にした。

寒験例裟 代用人工肝臓システムへの応用 １、肝臓からの実質細胞の分離及び培養実験例１と同様
に行なった。

２、ＩＩＦｌ愚からの線！＋１芽細胞の分離た線維芽細
胞の初代培養細胞を用いた。

３、モデル臓器デルの調製 Ｔｙ＋ｔｅｌコラーゲン（高研、牛皮７由来　アテロコ
ラーゲン）を０．２％となるようにｐｌ＋３の塩酸又は
酢酸溶液に溶解する。

充分攪拌後、高濃度のリン酸ｂｔ＋ｆ　ｆｅｒ（ｐＨ７
、４）又は１０倍濃度の細胞培養用培養液にて中性にす
る。４°Ｃに保ったコラーデン溶液中にＴｙｐｅＪ、■
コラーゲン（ＢＲＬ、ヘキストジ＋ハン）。

フィブロネクチン（Ｓｉｇｔｎａ製）、ラミニン（７ナ
コシ製）等の細胞外７トリツクス成分を０．０１〜０．
０（１０１％になるように加え、ゆっくり攪拌する。又
、細胞外マトリックスを羊膜（ＳＤプラット上り粗抽出
した成分を使用した方が細胞の静着及び機能ｔｆ、持等
の面ですぐれていた。次にこの溶液に肝実質細胞、線維
芽細胞を混合し、全体を均一にする。この液を手早く、
中空糸の外側に満たし、３７℃の恒温水槽中に水溶し、
１０分程度でゲル化させる。次に手早く１０％ＦＢＳを
含むＤＥ培養液を−Ｉ＋− 中空糸中に満たし細胞培養を開始する。

又、もう１つの方法としては中空糸の外側を０，２％Ｔ
ｙｒ＋ｅｌコラーデン、（１，（１１−０，０００１％
Ｔ　ｙｐｅ　ＩＶ　ｔ　Ｖ　：７ラーデン、フィブロネ
クチン、ラミニン溶液を３７℃でゲル化後、凍結乾燥し
て多孔質基質をイ）１てγ線又はＵＶで架橋したフラー
デンスポンジに肝実質細胞及び線紺芽細胞を靜着させた
ゲルで満たして培養を開始する。

４、培養条件 培養には第１図に示す連続還流細胞培養装置を用いる。

この際、培養液の）開度は３７±０．２℃、培養液還流
速度０　、３　ｍＮ／中空糸の外側の細胞特に実質細胞
は高酸素濃度レベルの培養でよく生存した。また、無血
清培地ＤＭ（Ｒ，Ｅｎａｔ、　　ｅｌ、　　ａｔ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１．１．　／＼ｃａｄ、　Ｓ　ｃ、　
ｉ、＼’ｏ１．８１１’ｌｉｌ　　’８４）での増殖は
血清存在の培地に比べ著しくすぐれていた。又、肝槻能
の発現は血清を含む通常の培地にもどした時の）ｊがす
ぐれていた。

さらに全肝臓摘出ラットに１述の中空糸を糾み込んだシ
スチー１２＝ ムを用いたところ数日間生存した。細胞の血清に対する
適応の目的で還流液を１００％血清に近づけるまで２０
％、５０％血清で１日づつ培養したところゲル中の細胞
の生存率及び機能発現は良好で内情濃度変化の適応を考
えに入れれば、充分に代用人工臓器として使用可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１ｌ：本発明の第１の実施例を示す一部断面図第２図
：本発明の第２の実施例を示す一部断面図第３図：本発
明の加圧室の他の実施例を示す要部断面図第４図二本発
明の実験例における肝実質細胞のプレートへの接着率（
％）と培養槽気相中の酸素（％）とのグラフ第５図、第
６Ｎ：本発明の実験例における肝実質細胞の生存率（％
）と培養後の時間（日）とのグラフ（１）・・・連続還
流培養装置、（２）・・・培養槽。 （３）・・・加圧室、　（４）・・・還流ポンプ。 （５）・・・酸素タンク、（６）・・・還流パイプ。 特許出願人　　株式会社アドバンス開発研究所醜育、１
＆ル　（％） １に５図 培養後、　Ｂ％簡　（８） 第６図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）培養槽へ供給される培養液の溶存酸素を常に高濃
   度に保つために、加圧室と、この加圧室に接続された酸
   素タンクと、培養槽と、さらに培養液を培養槽と加圧室
   とに還流させるための還流パイプと、還流ポンプとを備
   えたことを特徴とする連続還流細胞培養装置。