JPS6163280A - 動物細胞の高密度培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、動物細胞を高密度培養方法に関する。

従来の技術 ヒト細胞を培養して、その培養土清液からＭ用な生理活
性物質を得ることが研究されている。しかしながら、細
胞培養土清液から生理活性物質を大量に得、それを精製
して用いるためには大きな技術上問題がおる。その一つ
は、細胞が産生する生理活性物質は、極めて微量である
ことである。

これは、細胞が増殖し、生理活性物質を産生じ得るため
の細胞飽和密度が低いことが第一の原因であると考えら
れる。例えばインターフェロン自発産生細胞株であるＵ
ＭＣＬＭＣ上、細胞増殖性が良好な株の一つではあるけ
れども、その飽和密度は２Ｘ１０〜程度にすぎない。そ
のため、従来は、培養液量を大量にする方法がとられて
きたが、大量の培養液を取扱うためには培養工学的な技
術開発が必要である上、設備投資及び維持管理費が大き
くなるという問題がある。

二つめの大きな問題点は、細胞培養液に牛胎児血清（Ｆ
ＢＳ）などの血清を１０％前後添加する必要°があるこ
とである。これらの血清は非常に高価であり、かつ原因
不明のロフト差があるため大量に細胞を培養するには問
題があった。さらに、これらの血清は多種類の異種蛋白
を含むので、有用活性物質を分離精製する際に不都合が
生じる。

これまでに、血清の代替として、各種の増殖因子や性格
が明らかな蛋白を含む培養液を用いて細胞を培養する方
法が開発されてきた（　Ｄ、Ｂａｒｎｅｉ＋Ｇ−Ｈ−８
ａｔｏ、Ｃｅ１ｌ、　２２巻、６４９頁、１９８０年）
。また、血清アルブミンの代替物としてサイクロデキス
トリンと不飽和脂肪酸を含有する無血清培地（特開昭５
６−８１６００）などが知られている。

しかしながら、これまでに報告されている無血清培地は
、いずれも細胞を低密度（１〜５　Ｘ　Ｉ　Ｑ　”／ｒ
ｎｌから１〜２ｘ１ｏ／ａ）でしか増殖させられなく高
密度細胞培養（Ｉ　Ｘ　１０７ｍ１以上）に適した培養
方法有し、実質的に血清を含まない培地を用いて、Ｂ、
！　７　／４’芽球様細胞株を培養することに１す・０
れ二もの細胞を高密度で培養できることを見出した。

本発明に使用する培地としては、従来知られている血清
を含まない培地のいずれも用いることができる。例えば
ＲＩＴＣ５７−１培地、ＲＩＴＣ５７−８培地イスコフ
培地、ハムＦ−１２とダルベツコＭＥＭ培地の混合培地
に各種増殖因子を添加した無血清培地などがおげられろ
が、一般的にアミノ酸、ビタミン等を含む豊富な無血清
培地が好ましい。

本発明の無血清培養液におけるＬ−グルタミン酸の濃度
範囲は、０．３〜１１／ｌである。この範囲以下では効
果が認められず、これ以上では毒性が　２認められる。

なお、Ｌ−グルタミン酸の代謝に関係するＬ−グルタミ
ンおよびα−ケトグルタ＆。

の添加は効果がない。Ｌ−グルタミン酸は、遊離型でも
よく、ナトリウム塩などの金属塩および塩酸塩などの塩
として添加してもよい。

本発明におけるＢ　ＩＪン／Ｊ芽球様細胞株はＥｐｓｔ
ａｌｎ−１＆が適している。例えば、フラスコ又はシャ
ーレでは容器を１０〜２０回／分の速度でゆっくりと揺
動させる培養や、マイクロキャリヤー用として開発され
た培養槽に酸素ガスを通気させる方法、又は、エアリフ
ト培養方法などがあげられる。

作用 従来の培養方法ではＩ　Ｘ　１０’／ｄで１２時間まで
しかＢＩＪンパ芽球様細胞株が維持し得えなかったのに
対し、本発明の方法によれば従来の方法に比べ３割以上
の高密度でＢリンパ芽球様細胞株を培養できる。

その結果、例えばＵＭＣＬ細胞による自発的インターフ
ェロン産生は、従来の方法に比べ著しく高めることがで
きた。かつ培地交換頻度を半分以下に節減することがで
きた。

実施例１ 培養液は、表１に示したＲＩＴＣ５７−１培地に０．５
チ表　　１ （ｍ９／ｌ） 塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　６，２４０．０
塩化カリウム　　　　　　　　　　　　３９０．０塩化
カルシウム（無水）　　　　　　　　２００．０硫酸マ
グネシウム（無水）　　　　　　　　９７．７リン酸二
水索ナトリウム（二本［）　　　　　　　　１２５．０
硝酸第二鉄（九水塩）０．１ ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　２，０００．
０ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　　１１０．０
Ｌ−アルギニン塩酸塩　　　　　　　　　８４．ＯＬ−
システン塩酸塩　　　　　　　　　６２．６グリシン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　３０．ＯＬ−ヒス
チノン塩酸塩（−水塩）　　　　　　　４２．ＯＬ−イ
ソロイシン　　　　　　　　　　１０４．８Ｌ−ロイシ
ン　　　　　　　　　　　　１０４．８Ｌ−リジン塩酸
塩　　　　　　　　　　１４６２Ｌ−メチオニン　　　
　　　　　　　　　３ｏ、０Ｌ−７エニルアラニン　　
　　　　　　　６６、ＯＬ−セリン　　　　　　　　　
　　　４２．ＯＬ−スレオニン　　　　　　　　　　　
　９５．２Ｌ　　−）　　υ　２′　ト　フ　ァ　ン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６
．０重酒石酸コリン　　　　　　　　　　　　７．２葉
・　　酸　　　　　　　　　　　　　　　４．０７−・
′ 一テコテン酸アミド　　　　　　　　　　　４．０／４
’ントテン酸カルシウム　　　　　　　　　４．０、ビ
１リドキサール塩酸塩　　　　　　　　　　４．０リゴ
フラビン　　　　　　　　　　　　　　０．４°°−゛
チアミン塩酸塩　　　　　　　　　　　　　　４．０１
−イノシトール　　　　　　　　　　　７．２フエノー
ルレツド　　　　　　　　　　　５−ＯＬ−アラニン−
水塩　　　　　　　　　　　２０．０【Ｊ８８ Ｌ−アスパラギン　　　　　　　　　　５６．ＯＬ−ア
スパラギン酸　　　　　　　　　２０．ＯＬ−システィ
ン塩酸−水塩　　　　　　　４０．ＯＬ−グルタミン酸
　　　　　　　　　　　２０．ＯＬ−グロリン　　　　
　　　　　　　　　　２０．０ビチオン　　　　　　　
　　　　　　　　０．２ビタミ：／Ｂ１２　　　　　　
　　　　　　　　　０．１マンノース　　　　　　　　
　　　　　５００．０ガラクトース　　　　　　　　　
　　　５００．０レシチン　　　　　　　　　　　　　
　　　２．５ヒポキサンチン　　　　　　　　　　　　
４．０チミノン　　　　　　　　　　　　　　　０．７
デオキシシチノｙ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０３デ
オキシアデノシン　　　　　　　　　　１．０６．８ゾ
ハイドロオキシプリン　　　　　　　０．３硫酸亜鉛７
水塩　　　　　　　　　　　　０．０２＝硫酸第一鉄７
水塩　　　　　　　　　　　０．８βｒグリセリンａ！
２２ナトリウム　　　　　　１５００’、−ＨＥＰＥＳ
　　　　　　　　　　　　　　　１２００重炭酸ナトリ
ウム　　　　　　　　　１３００硫酸カナマイシン　　
　　　　　　　　　６０結晶インシユリン　　　　　　
　　　　１０ヒト・トランスフェリン　　　　　　　　
５ＲＩＴＣ５７−１＋０．５優ＢＳＡ培地にＵＭＣＬ細
胞を培養し、培地交換（全量）を４日毎に計２回行なっ
て、細胞密度４ｘｌＱ／ｍ／まで増殖させた後、細胞を
低速遠心（１０００Ｒ，Ｐ、Ｍ、、　５分）にて集めた
。直ちに細胞を表２に示した各培地中に２．０Ｘ１０／
ｍｇになるように懸濁し、その５　ｍｌをファルコン社
製３００３シャーレを用い、５チ炭酸ガス濃度のインギ
ーペーター中に設置したベルコ社製ロッキングプレート
にて１５回／分の速度で４０時間揺動培亡した。

培養後、各々の細胞密匠をエオシンＹ染色法と血球計算
盤にて、生細胞密度を計測した。また、培養後の細胞懸
濁液の一部を遠心分離により培養土清液を採取しインタ
ーフェロンカ価を測定した。

表　　２ 実施例２ 培養液として、表１に示したＲＩＴＣ５７−１＋０．５
係ＢＳＡ培地を基礎培地とし、さらに表３に示した成分
を添加した培養液を使用した。ＲＩＴＣ５７−１＋０、
５チＢＳＡ培地でＢＡＬＬ−１細胞を培養し、６　Ｘ　
１０６まで増殖させた後、細胞を低速遠心（１０００Ｒ
，Ｐ、Ｍ、。

と同様に、細胞密度と培養上清液中のＩｇＭ産生量４； を、・測定した。結果を表３に示す。

、−１ ’　ＢＡＬＬ−１細胞が産生する免疫グロブリン−クラ
スニーＹ’　（ＩｇＭ）　ｋ″ｊ、バイオラド社製イム
ノフロービーズを用いる螢光測定法によって測定した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ０．３〜１ｇ／ｌのＬ−グルタミン酸を含有し、血清を
   実質的に含まない培地を用いて、Ｂリンパ芽球様細胞株
   を培養することを特徴とする動物細胞の高密度培養方法