JPS6165900A - インシユリン選択性のソマトスタチン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はソマトスタチンに関するペプチド類、ならびに
この種のペプチドを使用する捕乳動物の薬学的処置方法
に関する。より詳細には、本発明は２８個のアミノ酸残
基から成るソマトスタチンペプチド類、該２８−残基ペ
プチド類の１つの１４−残基Ｃ床端類似体、およびこの
種のペプチドをよむ医薬組成物、ならひにこの種のペプ
チドを使用する唾乳動物の治療方法に関する。

従来の技術 、テトラデカペプチドのソマトスタチ／−１４はガイル
ミン（Ｇｕｉ　ｌ　ｌ　ｅｍｉｎ　）らによって注状決
定がなされ、米国特許第３９０４５９４号（１９７５年
９月９日）に記載されている。このテトラデカペプチド
は式： で表わされ、２個のシスティンアミノ駿残基のスルフヒ
ドリル基の間に架橋結合が存在する。線状のテトラデカ
ペプチド（この架橋結合が存在せず、水素によって置換
されて２つ、ジヒドロソマトスタチンと呼ばれる）は実
質的に同じ生物学的活性を有すると思われるので、往々
にして６ソマトスタチン”という定義中に含めて考えら
れる。

ソマトスタチン−１４および多数のソマトスタチン類似
体は、培養・分散したラットの下垂体前葉細胞からの成
長ホルモン（ＧＨ）分泌をインビトロにおいて、そして
またインビボにおいて抑制し、かつラットやその他の補
乳動物のインシュリンおヨヒグルカゴン分泌をインビボ
で抑制する。

さらに、ソマトスタチンは胃や膵臓の分泌部に直接作用
してガストリンやセクレチンの分泌を抑制することが見
出され、こうしてヨーロッパにおいては潰瘍患者の治療
用にソマトスタチンが市販されている。ＧＨばかりでな
くインシュリンやグルカゴンの分泌に対するソマトスタ
チンの強力な抑制作用は、子供の糖尿病の管理または治
療におけるソマトスタチンの可能な役割の研究へと導き
、また人間の代謝に関するこれらのホルモンの生理学的
および病理学的作用の研究に有用であることを立証した
。

Ｌ、プラデイａ　−ル（Ｐｒａｄａ１／ｒｏ　ｌ）らは
ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ　１０９．５５〜５８頁、１９８
０年１月において、ブタの上部小腸からのソマトスタチ
ン−２８＜５Ｓ−２８）の単離ならびに性状決定を報告
した。合成５Ｓ−２８の試験はインビボで投与したとき
にその効力が高まることを示した。５Ｓ−２８は式： ％式％ このようなホルモンの分泌を抑制するソマトスタチンの
能力を考慮すると、ソマトスタチンは先端巨大症、膵臓
のランゲルハンス島細胞腫瘍および糖尿病の治療に臨床
条件下で使用し得る。ソマトスタチンはインビボで投与
した場合明らかにペプチダーゼによって不活化されるた
めに、その作用時間が比較的短かいので、持続性ソマト
スタチン物質、ならびにソマトスタチンよりも効力があ
るかあるいは一層効力があってしかも分離した抑制作用
を示すソマトスタチン類似体を求めて研究が続けられて
いる。

発明の概要 ソマトスタチン−１４と相同である２８−残基ペプチド
がチョウチンアンコウから抽出され、精製され（すなわ
ち関係あるペプチド類２よび断片を含まない〕、そして
性状決定がなされた。このペプチドは膵臓からのインシ
ュリン分泌を抑制するという点でソマトスタチン−１４
またはソマトスタチン−２８よりも効力かめる。この２
８−残基ペプチドは以後α５Ｓ−２８と称することとし
、式： ％式％ を有する。Ｈｙｌは５−ヒドロキシリシンを表わし、よ
り詳、田にはヒドロキノ置換がデルタ炭素原子上Ｑであ
ることを意味してＬ（２）Ｒ−δ−ヒドロキシリシンと
称される。α５Ｓ−２８の生物学的効力に基づくと、あ
る種のアミノ酸残基が悪影響を及ぼすことなく欠失しつ
る。本・発明はさらに（１）式： で表わされるα５Ｓ−２８のより短い１４−残基Ｃ末端
類似体〔以後α５Ｓ−２８（１５−２８）−０Ｈと称す
〕および （２）式； ％式％ で表わされる２８−残基ペプチド〔以後（ｚ、ｙＳ２３
）−α５Ｓ−２８と称す〕り包含する。（Ｌｙｓ”’）
−α５Ｓ−２８はａＳＳ−２８と同様にチョウチンアン
コウの膵臓ランデルタ・ンス島から単離され、その性状
決定がなされた。

本発明による医薬組成物は、薬学的に受容できる液体ま
たは固体の担体中に分散された２８−残基ペプチドおよ
び／または１４−残基ペプチドもしくはその無毒性付加
塩の少なくとも１種を含有する。この種のソマトスタチ
ン類似体または薬学的に受容できるその付加塩の哺乳動
物への投与は、インシユリノーマ（膵臓ランデルタ・ン
ス島細胞腫瘍）を治療すべくインシュリン分泌の調節の
ために行われる。

好適な実施態様の詳細な説明 ソマトスタチン−２８はブタの腸抽出物およびヒツジの
視床下部抽出物から以前に単離された。

ペプチドを定義するために用いる表現法は、ショロダー
（５ｃｈｒｏｃｌｅｒ　）およびリュプケ（Ｌｗｂｋｅ
）の１ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｔｔｓ　）
”アカデミツクプレス（１９６５）によって指定された
ものであり、慣用衣示に従ってアミノ基を左にそしてカ
ルボキシル基を右に記載する。アミノ酸残基が異性体を
有する場合、特に指示がない限りそれは示されるアミノ
酸のＬ体を意味する。

本発明は式： ％式％ （式中Ｒ２３はＨｙｌまたはＬｙｓである）で表わされ
る２８−残基ペプチドを提供する。本発明はさらに式： で表わされる１４−残基ペプチドも提供する。ここには
示さないが、上記式はＣｙｓ残基のスルフヒドリル基の
間の架橋結合が存在せずに水素原子で置換されている線
状ペプチドを包含するものと理解すべきである。

ペプチドは例えば排他的固４目法、部分的固相法、断片
縮合、基本的な浴液付加反応のような適当な方法または
最近開発された組換えＤＮＡ技術の使用によって合成さ
れる。例えば、排他的固ａ合成法はスチュワート（Ｓｔ
ｅｗａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）の６固相ペプ
チド合成（Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ　５
ｙｎｔんｅｓｉｓン”、フリーマン＆Ｃｏ−＋サンフラ
ンシスコ、１９６９年およびベール（Ｖａｌｅ）らの米
国特許第４１０５６０３号（１９７８年８月８日）に記
載されている。断片縮合法は米国特許第３９７２８５９
号（１９７６年８月３日〕に示される。その他の利用可
能な合成法は米国特許第３８４２０６７号（１９７４年
１０月１５日）および同第３８６２９２５号（１９７５
年１月２８日）に例示される。本ペプチドは所望により
Ｌｙｓを使って合成することができ、これはその後Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１．　１　２　２〜ｌ　２９
　（１９７２）およびＪ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、　＋
　２５９．５４０３〜５（１９８４）に記載のりシンヒ
ドロキシラーゼ（水酸化酵素）を用いてＩＩｙｌＫ転化
される。組換えＤＮＡ技術を使う合成ペプチドの生産は
、大規模の商業要件を満たすために使用できるであろう
。

組換えＤＮＡ技術の使用による合成は、本出願シ′こと
って、ａｓｓ−２８および（Ｌｙ　ｓ　２３　）−αｓ
ｓ−２８の前駆体をコードする構造遺伝子の適切な使用
を包含すると理解すべきである。合成α５Ｓ−２８およ
び（Ｌｙｓ２リ−ａＰ；５−２８は、このような構造遺
伝子と共にプロモーターおよびオペレーターを含む発現
ベクターを用いて微生物を形質転換し、そしてこの形質
転換微生物にα５Ｓ−２８または（Ｌ　ｙ　８２３　）
−α５Ｓ−２８を発現させることにより得ることができ
る。まだ、この種の構造遺伝子および米国特許第４２７
６２８２号（１９８１年６月３０日〕に記載の一般技術
を使用するか、あるいは１９８３年５月２６日発行のＷ
Ｏ３３１０１７８３および１９８２年１２月２３日発行
のＴＶＱ８２１０４４４３に記載されるような胚の微量
注射（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を使用して遺伝
子操作することにより、人間以外の動物を利用してα５
Ｓ−２８またはＣＬｙｓ２３）−αＳＳ−２８を生産す
ることもできる。

各種アミノ酸の不安定な側鎖基を適当な保護基（その保
護基が最終的に除去されるまでその部位で化学反応が起
こるのを防ぐ）で保護することは、カンプリング型合成
法にとって一般的である。さらに、アミノ酸または断片
がカルボキシル基のところで反応している間そのα−ア
ミノ基を保護することも普通に行われ、そのα−アミノ
保護基を選択的に除去した後その部位で次の反応を行わ
せる。従って、合成の一段階として、ペプチド鎖中にそ
の意図する順序で位置するアミノ酸残基の各々を含み、
種々のこれらのアミノ酸残基が保護基に結合した中間体
化合物が製造される。

次式で表わされる中間体も本発明の範囲に含まれると考
えられる； Ｘ”−８ｅｔ（Ｘ２）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（Ｘつ−Ｅａｒ
（ＸジーＴｈｒ（Ｘａ）　−Ａｓｎ（Ｘ”）　−Ａｓｎ
（Ｘａ）　−Ｌｅｒｂ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（、￥
’）−ＧｉｒＬ（Ｘ’）　−Ａｒｇ（Ｘ’）−Ｌｙｓ　
（、￥’ノーＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙａ（Ｘ’）　−Ｌｙ
ｓ（Ｘ’）　−Ａｓｎ（Ｘａ）　−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（Ｘ
リ−Ｔｒｐ−ＨｙＬ　（、￥　２）　ＣＸ’）　−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｘ”　）　−Ｓｅｒ’　　（Ｘ２
）−Ｃ’ｙｓ（Ｘ？）−ＸＩｏ；Ｘ”−８ｅｒ（、￥”
ン−Ｖａｔ−Ａｓｐ（Ｘ”）−Ｅａｒ（Ｘ”）−Ｔｈｒ
（Ｘ’）　−Ａｓｎ（Ｘａ）−Ａｓｎ　（Ｘａ）　−Ｌ
ａｗ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　−ＡｒｇＣＸ’）−Ｇ１１ｂＣ
Ｘ’）−Ａｒｇ（Ｘ’ノーＬｙｓ（Ｘ’）−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−ＣｙｓＣＸ７）−Ｌｙｓ（Ｘ６）−Ａｓｎ（Ｘａ
）−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（Ｘ’）−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｘ６）
−Ｇｉｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｘａ）−８ｅｒ（Ｘ２）−
Ｃｙｓ（Ｘ勺−Ｘ１０；およびＸ’−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
Ｃｙｓ　（、Ｙ’）−Ｌｙｓ　（、￥’ノーＡｓｎ（Ｘ
”）−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ＜Ｘ’）−Ｔｒｐ−Ｈｙｌ　（、
￥”）（、￥’ンーＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（、￥’）
−８ｅｒ（、ＹリーＣｙｓ　（、￥’　）　−Ｘ”上記
各式中、Ｘｌは水素原子またはα−アミノ保護基である
。Ｘｌによって意図されるα−アミノ保護基は、ポリペ
プチドの段階合成の分野において有用であることが知ら
れているものである。Ｘｌに包含されるα−アミノ保護
基の種類には以下のものがある＝（１）アシル型保護基
、例えばホルミル、トリフルオルアセチル、フタリル、
ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ベンゼンスルホニ
ル、ニトロフェニルスルフェニル、ｔｌチルスルフェニ
ル、０−ニトロフェノキシアセチル、クロルアセチル、
アセチルおよびγ−クロルブチリル；（２）芳香族ウレ
タン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）
および置換されたＺ（例えばｐ−クロルペ／ジルオキシ
カルボニル、ｐ−ニトロペンンルオキシカルポニル、ｐ
−ブロムベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベン
ジルオキシカルボニル）；（３）脂肪族ウレタン型保護
基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）　、
ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキ
シカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカル
ボニル；（４）シクロアルキルウレタン型保護基、例え
ハシクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキ
シカルボニルおヨヒシクロヘキシルオキシ力ルボニル；
（５）チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカル
ボニル；（６）アルキル型保護基、例えばトリフェニル
メチル（トリチル）、ベンジル（Ｅｚｌ）＊（７）トリ
アルキルシラン基、例えばトリフチルシラン。好適なα
−アミン保護基はＢＯＣである。

Ｘ２およびＸ８はＴｈｒおよびＳｅｒの測鎖ヒドロキシ
ル基のための保護基であり、好ましくはアセチル（Ａｃ
　）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔ−ブチル、トリチル、テ
トラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）、２
．６−ジクロルベンジルおよびＺよりなる群から選択さ
れる。最も好ましい保護基はＢｚｌである。Ｘ２および
／またはＸ８は水素原子でめってもよく、この場合はヒ
ドロキシル基に保護基が存在しないことを意味する。

Ｘ３は水素原子またはＡｓｎのアミド基のための保護基
であり、好ましくはキサンチルＣＸａｎ）である。

Ｘ４はＡｒｇのグアニジノ基のための保護基であって、
好ましくはニトロｓ　ＴＯ８ｚ　Ｚｓ　アダマンチルオ
キシカルボニルおよびＢＯＣよりなる群から選択される
か、あるいは水素原子である。Ｔｏｓが最適である。

ＸＳは水素原子またはＡｓｐまたはＧＥｌＬのカルボキ
シル基のためのエステル形成性保護基であり、好ましく
はＢｚｌ、２．６−ジクロルベンジル（ＤＣＢ）　、Ｃ
Ｂ　Ｚ、メチルおよびエチルよりなる群から選択される
。０Ｂｚｌが最適である。

Ｘ６は水素原子またはＬｙｓの側鎖アミノ基のための保
護基である。適当な側鎖アミノ保護基の例はＺ、２−ク
ロルベンジルオキシカルボニル（２−ＣＩ−Ｚ）、Ｔｏ
ｓ、ｔ−アミルオキシカルボニルおよびＢＱＣである。

側鎖アミノ保護基の選択は限定的でないが、それはペプ
チド合成中α−アミン保護基の除去の間除去されないも
のでなげればならない。それ故、α−アミン保護基と側
鎖アミノ保護基が同一であってはならない。

Ｘ？はＣｙｓのための保護基でるり、好ましくはｐ−メ
トキシベンジル（ＭｅＯＥｚｌ）、ｐ−メチルベンジル
、アセトアミドメチル、トリチルおよびＥｚｌよりなる
群から選択される。最も好ましい保護基はｐ−メトキシ
ベンジルである。Ｘ７は水素原子であることもでき、こ
の場合は硫黄上に保護基が存在しないことを意味する。

Ｘ９はＴ１１ｒのヒドロキシル基のための保護基であり
、好ましくは２，６−ジクロルベンジル（ＤＣＢ）、Ｂ
　ｚ　Ｌｓ　Ｍ　ｇ　ＯＢ　ｚ　Ｌおよび０Ｂｚｌより
なる群から選択される。ＤＣＢが最適である。

ｘ”はＯＫ、ＯＣＲ，、アミド、ヒドラジドおよびエス
テルよりなる群から選択され、エステルにはベンジルエ
ステルｉたは式ニ ー　Ｏ−ＣＨｔ−ポリスチレン樹脂支持体および ＯＣＨ２−ベンジル−ポリスチレン樹脂支持体で表わさ
れる、固体の樹脂支持体への結合のために固相合成法で
使用するヒドロキシメチルエステル定着結合が含まれる
。ポリスチレン重合体は好適にはスチレンと約０．５〜
２％のジビニルベンゼンとの共重合体であり、このジビ
ニルベンゼンはポリスチレン重合体をある種の有機溶剤
に先金に不溶化させる架橋剤として作用する。

中間体の式において、Ｘｌ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８およびＸ９のうち少なくとも１つは保
護基でめる。ペプチド合成において使用する特定の側鎖
保護基を選択する場合は次の規則に従う＝（ａ）側鎖保
護基は合成の各段階でα−アミン保護基を除去するため
に選択した試薬および反応条件に対して安定であるべき
である、（ｂ）側鎖保護基はカップリング条件のもとて
その保護特性を保持し、開裂されてはならない、および
（ｃ）側鎖保護基は、意図するアミノ酸配列を゛含む合
成の完了時点に、ペプチド鎖を変性させない反応条件の
もとて除去できなければならない。

・本ペプチド類は好適にはメリーフィールド（Ｍｔｔｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ）の−Ｊ、　Ａｍ、、Ｃｈｅｍ、　Ｓａ
ｃ、　＋　　８５．２１４９（１９６４）に記載される
ような固相合成法を使って製造されるが、先に述べたよ
うに当分野で刈られた他の同等の化学合成法も使用でき
る。

固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適当な樹脂にカ
ップリングさせることにより、ペプチドのＣ末端から開
始される。このような出発物質はα−アミノ−およびＳ
−保護ｃｖｓ　’ｅジクロルチル化樹脂またはヒドロキ
シメチル樹脂へ結合させることにより製造できる。ヒド
ロキシメチル樹脂の製造はボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓ
ｋｙ　）らの−Ｃｈｅｍ、　Ｉｎｄ。

（ロンドン）３８．１５９７〜９８　（１９６６、ｌに
記載されている。クロルメチル化樹脂はカリフォルニア
州すッチモンドのバイオ・ランド研究所（Ｅｉｏ　Ｅａ
ｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）およびラボ−シ、；
＜　７ム社（Ｌａｂ　、　Ｓｙｓ　ｔ　ｅｒｎｓ　ｒ　
Ｉｎｃ　−）から入手可能である。

この種の樹脂の製造はスチュワー）　（Ｓｔｅｗａｒｔ
）らの６固相ペプチド合成″（フリーマン＆　Ｇ　ｏ　
、＋サンフランシスコ、１９６９）第１軍、１〜６頁に
記載されている。

ＥＯＣおよびｐ−メトキシベンジルで保護すしたＣｙｓ
は、モナハン（Ｎｏｎαｈａｎ）およびギロン（Ｇｉｌ
ｏｎ）のＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒ　１２．２５１３〜１９
ｉ（１９７３）に記載の方法に従ってクロルメチル化ポ
リスチレン樹脂にカップリングされる。樹脂支持体への
ＢＯＣ−（ｐ−メトキシベンジル）（ＣＩ／Ｓ）のカッ
プリング後に、塩化メチレン中のトリフルオル酢酸（Ｔ
ＦＡ）またはＴＦＡ単独またはジオキサン中のＨＣ１ｆ
用いてα−アミン保護基を除去する。好適には塩化メチ
レン中の５０１量％ＴＦＡを０〜５重量％の１．２−エ
タンジチオールと共に使用する。保護基の除去は約Ｏ℃
から室温までの温度で実施する。特定のα−アミノ保護
基を除去するための他の標準的な開裂試薬ならびに条件
は、ショロダーおよびリュプケの“ザ・ペプチド、１，
７２〜７５（アカデミツクプレス１９６５）に記載のご
とく用いられる。

Ｃｙｓのα−アミノ保護基を除去した後、残りのα−ア
ミノ−および側鎖−保護アミノ酸を意図する順序で段階
的にカンプリングさせ、それにより先に定義した中間体
化合物を得る。各アミノ酸を合成中に別々に添加する代
わりに、アミノ酸のいくつかを互いにカップリングさせ
てから固相反応器に添加してもよい。適切なカップリン
グ試薬の選択は当分野の技術の範囲内である。Ｎ　、　
Ｎ’−レジクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）が
カップリング試薬として特に適する。

ペプチドの固相合成において用いられる活性化試薬はペ
プチドの分野で周卸である。適当な活性化試薬の例は（
１）カルボジイミド類、例えば＃、＃’−ジイソプロピ
ルカルボジイミド、Ｎ−エチル−＃’−（３−ジメチル
アミンプロピル）カルボジイミド；（２）シアナミド類
、例えばＮ　、　Ｎ’−ジベンジルシアナミド；（３）
ケテイミ／ａ；＋：４）インキサゾリウム塩、　例、ｔ
ば＃−エチルー５−フェニルインキサゾリウム−３７−
スルホネート；　（５）環中に１〜４個の窒素原子を含
む芳香族性の単環式窒素含有複素環式アミド、例えばイ
ミダゾリド、ピラゾリドおよび１１２　＋　４−　トリ
アゾールであり、有用な特定の複素環式アミドにはＮ　
、　Ｎ’−カルボニルジ１イミダゾール、Ｎ、Ｎ’−カ
ルボニル−ジー１．２゜４−トリアゾールが含まれる；
（６〕アルコキシル化アセチレン、例えばエトキシアセ
チレンｓ　（７）アミノ酸のカルボキシル部分と混合無
水物を形成する試薬、例えばクロル蟻酸エチルおよびク
ロル蟻酸イソブチル；および（８）１個の環窒素原子上
にヒドロキシ基を有する琶素含有複素環式化合物、例え
ばＮ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド２よび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｈ
ＯＢＴ）：である。ペプチドのカップリングにおけるそ
の他の活性化試薬およびそれらの使用については、ショ
ロダーおよびリュプヶの同書、第■章ならびにカブール
（Ｋａｐｏｏｒ）のＪ、、　Ｐｈａｒ、　Ｓｃｉ、＋　
５９．１〜２７頁（１９７０）に記載されている。

保護アミノ酸またはアミノ酸配列はそれぞれ約４陪過剰
で同相反応器内に導入され、そしてジメチルホルム７　
ｉ　）’　ＣＤＭＦ）　：　ＣＨ２Ｃｌ２（１：　１　
）の混合媒体中もしくはＤＭＦまたはＣＨ２Ｃ１３２単
独の媒体中でカップリング反応を行う。カップリング反
応を手動で行う場合には、合成の各段階でのカップリン
グ反応の成就がカイーザー（Ｋａｉｓｅｒ）らのＡｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３４．５９５（１９７０）に
記載されるようなニンヒドリン反応によって監視される
。不先金なカップリング反応が起こった場合には、次の
アミノ酸のカップリングに先立って行われるα−アミン
保護基の除去前にそのカップリング方法を繰り返す。カ
ップリング反応は、例えばペックマン９９０自動合成機
でリビエル（Ｒｉυ−１ｅｒ）らのＢｉｏｐｏｌｙｍｅ
ｒｓｌｌ　９７８．１７．１９２７〜１９３８頁または
グレイ（Ｇｒａｙ　）らのＥｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋
第２３巻、１２．２７９６〜２８０２頁（１９８４）に
報告されるようなプログラムを使って自動的に行うこと
ができる。

意図するアミノ酸配列が完了した後、例えば散状弗化水
素のような試薬で処理することにより樹脂支持体から中
間体ペプチドを切り離しくこの試薬はペプチドを樹脂か
ら切り離すばかりでなく、残存ｊ　ルｉ−（）側鎖保護
基Ｘ　２、Ｘ　３．Ｘ　’、Ｘ　”、Ｘ　’、ｘ　７　
、ｘ　８およびＸ９ならびにα−アミノ保獲基Ｘ１を開
裂する）、それにより線状のペプチドを得る。

Ｌ１２を用いてペプチド合成を行い、セしてｇ１１ｉ衾
有ペプチドをラーゼで処理する。ペプチドの環状形は、
好適にはリビｘル（Ｒｉｖｉｅｒ）らのＢｉｏｐｏ−ｌ
ｙｍｅｒｓ、第１７巻、１９２７〜３８（１９７８）に
記載されるようなフェリシアン化物溶液を使用する酸化
、または空気酸化、もしくはその他の既昶方法により得
られる。

別の経路として、中間体ペプチドをアルコーリシスによ
って樹脂支持体から分離し、その後回収されたＣ末端エ
ステルを加水分解して酸に転化する。その後先に述べた
ようにして、またはＴｒｐ部分をそのままに保持する条
件下での接触還元（例えばＰｄ／Ｂａ５Ｏ＋）のような
他の既昶方法により、側鎖保護基を全て除去する。開裂
用試薬として弗化水素を用いる場合は、スキャベンジャ
−として７＝ソールとメチルエチルスルフィドとを反応
容器に加える。配列中にＭｅｔが存在する場合は、樹脂
からの開裂に先立ってトリフルオル ／エタンージチオールてＢＯＣ保護基を除去してＳ−ア
ルキル化を避け、さらにスキャベンジヤートシてメチル
エチルスルフィドを存在させて樹脂からの開裂を実施す
る。

以下の実施例はα：ＳＳ−　２８およびその類似体の好
適な固相合成法を説明する、 式： ％式％ で表わされるａＳＳ−　２８の合成を、クロルメチル化
樹脂（例えばラボ・システム社から入手可ＮＱなＺ，、
Ｓ’−６０１であり、０．９Ｍ当量Ｃｌｌ／ｇ樹脂を含
む）上で段階的に行った。ホリキ（Ｈｏｒｉｋｉ）らの
Ｃｈｅｍ′Ｌｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（日本化学会
）（１９７８）１６５〜１６８頁に記載の方法を使って
、ＥＯＣ−（ｐ−メトキシベンジル）（４ｓを樹脂にカ
ップリングさせ、これは樹脂１ｓ当たり（４ｓ約０．３
５ミリモルの置換をもたらした。アミノ酸５−ヒドロキ
シリシンはイズミヤ（Ｉｚｗｍｉｙα）らのＢｖ，１１
・に記載の方法で合成した。そのＤ体とＤ体の分離はケ
オナー（Ｋｅｏｎｅｒｓ）らのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
＊第３７巻、１７６３〜１７７１　（１９８１）に記載
の方法を用いて行った。使用した溶剤は全てヘリウムの
ような不活性ガスを流すことによって注意しながらガス
抜きし、Ｍｅｔの硫黄やＴｒｐを酸化する恐れのある酸
素を除去した。

保護基の除去および中和を行った後、ペプチド鎖を樹脂
上に段階的に増成した。一般に、２時間の間．に、樹脂
１１当たり塩化メチレン中のＥＯＣ保獲アミノ酸１〜２
ミリモルおよび塩化メチレン中の２モルＤＣＣＩ　１当
量を使用した。ＥＯＣ−ＴｒｐまたはＥＯＣ−Ａｒｇ（
Ｔｏｓ）またはＢＯＣ’−Ａｓｎ（Ｘａｎ）　　をカッ
プリングさせるときには、１０％ＤＭＦ／塩化メチレン
の混合媒体を使用した。

ＳｅｒおよびＴｈｒのヒドロキシル側鎖保護基として、
またＨｖｌのＯＨ基の保護基としてＥｚｌを用いた。

ＥＯＣ−Ａｓｎは５０％ＤＭＦ／塩化メチレンの混合媒
体中ＨＯＢｔ１当量を使って一晩カンブリングさせた。

２−Ｃｌｌ−ＺはＬｙｓおよびＨｙ，ｔの側鎖アミノ基
の保護基として使用し、ＤＣＢはＴｙｒを保護するため
に使用した。Ａｒｇのグアニジノ基を保護するためにＴ
ｏｓを使用し、グルタミン酸およびアスパラギン酸のカ
ルボキシル基はＯＢｚｌで保護した。Ａ８ｎのアミド基
はＸａｎで保護した。合成の終りに、次の組成： ＢＯＣ−Ｓｅｒ（Ｅｚｌ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ
）−Ｓｅｒ（ＢｚＬ）−Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）−Ａｓｎ（
Ｘａｎ）−Ａｓｎ（Ｘａｎ）−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｇｔｕ（　ＯＥ　ｚ　ｌ　）−Ａ
ｒｇ（Ｔｏｓ　）−Ｌｙｓ（　２−Ｃｌｌ−Ｚ）−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（ＭｅＯＢｚｌ）−ＬｙｓＣ２−Ｃ
ｌｌ−Ｚ）−Ａｓｎ（Ｘａｎ）−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ＤＣ
Ｂ）−Ｔｒｐ−Ｈｙｌ（Ｂｚｌ）（　２−Ｃｌ−Ｚ）−
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔんｒ（Ｅｚｌ）−Ｓｅｔ（ＢｚＬ）
−Ｃｙｓ（ＭｅＯＢｚｌ　）−０−ＣＨ２−ベンゼン−
ポリスチレン樹脂支持体 を有するものが得られた。

得られた保護ペプチド−樹脂を切り離し同時にその保護
基そ除去するために、ペプチド−樹脂ｌｙ当たり弗化水
素（ＨＦ）１５７！およびアニソール１．５−を用いて
最初−２０℃で２０分、その後０℃で３０分処理した。

高真空下にＨＦを除去した後、樹脂−ペプチドを乾燥ジ
エチルエーテルおよびクロロホルムで交互に洗浄し、次
にカス抜きした２’Ｎ酢酸水浴敵でペプチドを抽出して
濾過により樹脂から分離した。

開裂し保護基を除去したペプチドは次に、リビエル（Ｒ
ｉｖｉｅｒ）らのＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ＋第１７巻、
１９２７〜１９３８頁（１９７８）に記載されるように
、フェリシアン化カリウム溶液に滴下して２個のＣｙｓ
残基の間にジスルフィド結合を形成させた。環化後、リ
ビエルらの上記文献に記載される方法を使って、このペ
プチドをアニオン−およびカチオン−交換樹脂のクロマ
トグラフにかけ、その後凍結乾燥した。

次いで、このペプチドはリビエルらのペプチド：１２５
〜１２８頁およびＪ、リビエルらのＪ、　Ｃｈｒ−頁に
記載されるようなゲル透過クロマトグラフィー、その後
の半調段用ＨＰＬＣにより精製した。

クロマトグラフ分画をＨＰＬＣで監視して、実質的純度
を示す分画のみをプールした。

正確な配列が得られたかどうかを調べるために、若干の
精製α５Ｓ−２８は４Ｎメタンスルホン酸および帆２％
トリプタミンを含む排気した密閉試験管中１１０℃で２
４時間加水分解した。ベン２フフ１２１ よるこの加水分解物のアミノ酸分析は、２８−残基ペプ
チド構造が得られたことを示した。

ＣＬｙｓ２３）−ａＳＳ−２８を製造するために、２３
位のアミノ酸残基としてＢＯＣ−１ｈ１ｔ（Ｂｚの（２
−Ｃ６−Ｚ）の代わりにＢＯＣ−Ｌ１２（２−Ｃ１ｌ−
Ｚ）を用いて、実施例■に記載の合成を繰り返し行った
。

最初の１４個の残基を樹脂にカンプリングさせた後、こ
のペプチド−樹脂の一部分を取り出して、１４−残基ペ
プチドを製造すべくこの後で使用した。全２８−残基配
列が完了した後、それを実施例Ｉと同じ方法で樹脂から
開裂し、保護基を除去した。１４−残基ペプチド−樹脂
も同様に処理した。次いで、開裂しかつ保護基を除去し
たペプチドを抽出し、樹脂から分離した。その後実施例
Ｉのようにしてそれらを精製した。２８−残基ペプチド
の一部分は、環化後に生物学的効力に関するその試験を
行うべく取り出しだ。

次に、２８−残基ペプチドの残部をりシンヒドロキシラ
ーゼで処理して（Ｌ１１ｓ２３）−　ａＳＳ　−　２　
８をα５Ｓ−２８へ転化した。ヒヨコの胚をホモジナイ
ズし、その上清から当分野でよく仰られた方法を使って
リシンヒドロキシラーゼを精製した。

その後、この酵素的５　０　ｔｔｇ　、　　０．０　５
　ｍＭＦｅ．’；Ｃｈ、０、　１　ｍＭα−ケトグルタ
レート、０．５ｍＭアスコルビン酸、カタラーゼ（カル
ハイオケム社製）０、１ｒｎｇ、０．１ｍＭジチオトレ
イトール（カル）くイオケム社製）、ウシ血清アルブミ
ン（シグマ社製）２Ｊ７＋９および５　０　ｍＭ　）リ
スーＨＣ１緩衝Ｗ（ｐＨ７、８に調整したもの）を含有
する反応混合物を約２５℃で調製した。精製２８−残基
ペプチドを加え、約３７℃で約８０分間インキュベート
した。

このペプチドは、０．０　１　ｍＭ塩化カルシウム含有
帆０２Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．６）を数回とり
替えて約４℃で約１６時間透析することにより抽出した
。ペプチドを含む溶液を蒸発乾固させ、この残留物を実
施例Ｉのように環化反応とＨＰＬＣ精裂に精製た。試料
を取り出してアミノ酸分析で試験した結果、１個のヒド
ロキシリシン残基と２個のりシン残基の存在を示した。

この酵素はＣ末端がグリシン残基に結合しているりシン
残基を選択的にヒドロキシル化することが知られており
、従って１４立および１８位に存在する他のリシン残基
はヒドロキシル化されない。

１４−残基ペプチドも同様にリシンヒドロキシラーゼで
処理してそれをα．Ｓ’５（１５−２８）に転化した。

インシュリンの放出を抑制する本ペプチドの有効性を調
べるために、ａＳＳ−２８、ＣＬｙｓ２３〕−α５Ｓ−
２８およびα、Ｓ’、Ｓ’（１５−２８）を用いてイン
ビトロでのラジオイムノアツセイヲ夷ｍ　ｔ、、この際
下垂体細胞へのイソブチルメチルキサンチンの適用によ
って誘発される成長ホルモンの放出を抑制することが仰
られているソマトスタチン−１４の等モル濃度と比較す
る。一般にペイル第３７巻、８２頁に記載される方法に
従って、酵素による分解を最小限に抑えた系においてあ
らかじめ４〜５日前に摘出したラットの下垂体細胞を含
む培養物が使用される。比較試験のために、一定の標準
培地の培養物と、ウシ胎児からの血清を２％または１０
％添加した結果成長ホルモン分泌に最適であると考えら
れる培養物との両方を使用する。この比較試験の結果は
、ａＳＳ−２８のＧＨ分泌抑制がＳＳ−１４より実質的
に劣るので、α５Ｓ−２８がインシュリン選択性である
らしいことを示している。α５Ｓ（１５−２８）および
（ｚ、、８２３）−α５Ｓ−２８も効力がやや劣るけれ
ども同様に生物学的活性を有する。

各群のラットへのアルギニンの投与によって刺激された
グルカゴンおよびインシュリンの分泌を抑制するαＳ；
−２８の効力についてソマトスタチン−１４と比較して
調べるために、ブラウン第２５巻、１５０１〜１５０３
頁に記載の方法を使って、インビボ実験ヲ行つ。

α５Ｓ−２８は、ヒトおよびイヌを含めた補乳動物の基
礎インシュリン分泌と刺激されたインシュリン分泌を抑
制する増大した効力を示し、そして膵臓細胞への直接作
用を有してインシュリン放出を選択的に抑制するものと
考えられる。従って、有効量のα５Ｓ−２８＜またはそ
の薬学的に受容できる無毒性の付加塩〕の補乳動物への
投与は、哨乳動物のインシュリン放出を抑制するために
使用でき、医師の指導の下でインシユリノーマの治療に
利用しうる。α５Ｓ−２８はまた胃酸分泌を抑えかつ体
温調節に影響を及ぼすことが期待される。

ａＳＳ−２８はこのような極端なインシュリン選択性を
示すので、特にこのペプチドは大量のインシュリンを分
泌してその結果低血糖をもたらすところのインシユリノ
ーマの治療に利用しうる。

本発明のペプチド類または七の無毒性付加塩を薬学的に
受容できる担体と組合せて調製した医薬組成物は、ヒト
を含めた哺乳動物に対して、静脈内、皮下、筋肉内、鼻
腔内または経口的に投与される。インシュリ〉′の放出
を抑制するために、この投与は医師によって行われる。

必要とされる投与量は治療すべき特定の症状、その症状
の程度および希望する治療期間により変化するであろう
。

上記ペプチド類はしばしば薬学的に受容できる無毒性塩
、例えば酸付加塩または亜鉛、鉄、カルシウム、バリウ
ム、マダイ、シウム、アルミニウムなどとの金属複合体
（本明廁書ではこれも付加塩とみなす）の形で投与され
る。このような酸付加塩の例は塩酸塩、臭化水素酸塩、
硫酸塩、燐酸塩、タンニン酸塩、パモイン酸塩（ｐａｍ
ｏａｔｅ　）、５ｉ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、
アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安
息香酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩な
どである。活性成分が錠剤の形で投与される場合には、
その錠剤はトラ力カント、トウモロコシ澱粉またはゼラ
チンのような結合剤；アルギン酸のような崩壊剤；およ
びステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含有しつ
る。液剤の形での投与が望まれる場合には甘味料および
／または風味料が使用され、セして等張塩水、燐酸緩衝
溶成での静脈内投与も行うことができる。

本ペプチド類は医師の指導の下で投与すべきであり、そ
して医薬組成物は通常薬学的に受容できる慣用担体と共
に少なくとも１種のペプチドを含有するだろう。一般に
、投与量は患者の体重１　ｋｇ当たり約２〜約２００μ
ｓであるだろう。結局、これらのペプチドでの患者の治
療は、ソマトスタチン自体を使用する治療と同じ方法で
行われる。

本発明は発明者が目下のところ最もよいと考えろ好適な
実施態様について述べてきたが、当分野て通常の矢口識
を有する者に明らかであるような種々の変更ならびに修
飾が、添付の特許請求の範囲に説明される本発明の範囲
から逸脱することなくなされうることは理解されるべき
である。例えば、ソマトスタチンペプチド鎖の他の位置
での置換および修飾が、類似体の効力を損うことなく現
在または将来の技術に従ってなされつる。特に、生物学
的効力を実質的に有する短縮されたフラグメントを作る
ために欠失が行われ、このようなペプチドも本発明の範
囲内であると考えられる。先に述べたように、好適な環
状形と同じく線状形も本発明の範囲内に含まれるもので
ある。

（外５名〕

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿２＿３はＨｙｌまたはＬｙｓである）で表わ
   される化合物またはジスルフィド架橋が水素原子で置き
   換えられたその線状化合物、および次式：▲数式、化学
   式、表等があります▼ で表わされる化合物またはジスルフィド架橋が水素原子
   で置き換えられたその線状化合物よりなる群から選択さ
   れる化合物、または前記化合物のいずれかの無毒性付加
   塩。
2. （２）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる特許請求の範囲第１項記載の化合物。
3. （３）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる特許請求の範囲第１項記載の化合物。
4. （４）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる特許請求の範囲第１項記載の化合物。
5. （５）有効量の特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１
   つに記載の化合物、およびそのための薬学的に受容でき
   る液体または固体の担体を含有してなるインシユリノー
   マ治療用医薬組成物。
6. （６）有効量の特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１
   つに記載の化合物を投与することからなるインシユリノ
   ーマの治療方法。