JPS6169724A - ヘパリン誘導体の利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 髪！五Δ机堆立！ 本発明はヘパリン誘導体に関する。

従来技術および間　点 脂肪代謝異常をとらなっている疾患または面漿１１ｔｆ
ｆ！１度が高まっている疾患は、それによって動脈硬化
症の早期発病の危険性を含んでいろ。面漿脂質が正常な
患者では、総コレステロールの約２／３はＬＤＬ（低比
重リポ蛋白）の形で輸送される。

今日までの知見から、ｌ　９０　ｎ／ｄＱより高いしＤ
Ｌ−コレステロール値は動脈硬化症のリスク範囲として
とり扱われる。特に家族性■型の高コレステロール血症
の場合は、遺伝的に生じるＬＤＬ−受容体欠損または脂
質代謝異常がＬＤＬ濃度を上昇させる原因となる。その
ため、β−リポ蛋白または低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）を
選択的に分離することにより直中コレステロール値の低
下をはかるべきである。

゛西独公開特許第３１３５８１４号には、体外循環中の
ヒトのｌｌｕ漿または血清に酸性ｐｔ−を値でヘパリン
を使用し、低比重リポ蛋白を沈澱させる方法が記載され
ている。この方法における欠点は、この治療処置に比較
的高いヘパリン０度が不可欠であるノーめ、出血の危険
性が高いことである。

そのうえ、比較的高価であり、また天然の産物として無
制限に使用できないヘパリンを各処置毎に大量に必要と
する。これらのことから、これに代わる好適なＬ　Ｄ　
Ｌ、沈澱剤に置き換えてこの処置を行うことが要望され
る。

この発明の目的は、酸性ｐＨ区域でＬＤＬを沈澱させる
治療原理をその上ま保持し、天然産のヘパリンを使用せ
ず、その代わり利用容易な合成または゛１−合成的に製
造し得ろ物質または物質群を沈ｉｌ剤として使用するこ
とである。但し、最も本質的に望まれろ要件は、使用さ
れる物質の抗凝固作用がヘパリンと比べて明らかに低い
ことである。

ボリアニオノ性ヘパリン誘導体およびその池の酸性ムコ
多糖類（グリコサミノグリカン類）から成る重合体とポ
リアニオン性糖すルフェート順から成る重合体が、沈澱
のために添加しなければならない。例えば多価カチオン
のような補助剤を加えなくても、酸性ｐＨ区域で特異的
にＬＤＬを沈綬させるのに好適であることが判明した。

問題点を解決するための手森 従ってこの発明は、 （ａ）緩和な反応条件でヘパリンを加水分解することに
より合成されるか、または （１１）Ｉ和な反応条件で加水分解し、次いで遊離した
アミノ基をアンル化することによりヘパリンから合成さ
れるか、または （ｃ）合成または半合成グリコサミノグリカンを硫酸化
することによって製造されるか、または（ｄ）天然産ま
たは合成多糖類を硫酸化することによって製造される、 ヘパリン誘導体の利用に関するものであって、この場合
、血液凝固に関係し、ヘパリンに鋭敏に反応する試験体
系、例えばトロノビン時間、部分トロンボプラスチン時
間または薬局方に記載のベパリン試験法に適用して、ヘ
パリンほど高い活性は示さムいが凝固系に対し、１．０
１（国際学位）・Ｎ９”’　ｌより大きい測定可能な影
響を与えるヘパリン様作１１１を（ｆ４゛ろ該ヘパリン
誘導体を、ｐＨ４，０〜５８のＷ（で、全血清または血
漿から低比重リポ蛋白の選択的な体外沈澱に利用するこ
とから成る。

（ａ）および（ｂ）に）６げたヘパリン誘導体は、［ヘ
パリン誘導体とその製造方／Ｆ：わよび３れらを急白。

する脂肪代謝異常治療用医薬品Ｊと題する同時出願の特
許出願番号下３３２２５１８．８号の明細１１Ｆに詳細
に記載されている。

天然産ヘパリンから加水分解により合成し１する（ａ）
に）トけたヘパリン誘導体は、ヘパリンおよび／上たは
その塩を、酸の０．２〜０３モル水溶液−ζ、４５〜７
０℃およびｐＨ値ｌ　５〜５．０で、９０分〜３０時間
注億深＜コノトロールされた酸性加水分解を１ｆい、次
いてＯ′Ｃ４３０℃に冷却し、アルカリを加えてｐ１１
１４’ｉを６０〜８０にｊ、＋４節ずろごとにＬ−て反
応を終結さＵ、反屹；生成物を水に対して透析し、そイ
１自体既知の方法にＬ−で乾燥することにより製造され
る。

これらの誘導体は、下記に示す諸特性値によ−て特徴付
けられる （ａ）外ｉｌｌ：白色、無定形の吸湿し易い物質（ｂ）
遊離アミノ基有量＝５０〜４００μモル・９−１（ｃ）
ウロン酸／ヘキノサミノ含過比：０９７〜０（ｄ）旋光
度　〔α〕Ｉ）−１＝；３５°〜：　Ｉｉ　Ｏ”（ｅ）
凝固活性二１．０〜２０１Ｅ（国際単位）−Ｒｒ’（「
）メタクロマジー（ｓｅｔａｃｈｒｏｍａＸ変色反応）
性色素効果〔ヘパリン（＝１．Ｏ）との比較〕二０１０
〜０．９０（トルイノノブルーで測定）（ｇ）平均分子
虫：２０００〜３００００Ｄ（ｈ）フラボバクテリウム
・ヘパリナム（Ｆ　ｌａｖｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ　　ｈ
ｅｐａｒｉｎｕｍ）から調製されたヘバリナーゼ（ＥＣ
４，２，２，７）に対４−ろ基質適性（Ｅ　Ｉｇｎｕｎ
ｇ　　ａｌｓ　　Ｓ　ｕｂｓＬｒａＬ）：ＪＪ性質飽和
時３０℃、ｐＨ７、ｏ）の反応速度の九７（科ヘパリン
（＝　１００％）との比較　１０％〜１００％ ＋ｉ）アンチト［ｌンヒン■（、〆＼ｉ’　ｌｌ＋　）
に対ずろ結合性ヒト、γノチトロノヒノ■を結合させた
セファロース（Ｓ　（！ｐｈａ　ｒｏｓｅ商は名）を用
いろアフィニティー・り【ｌマドグラフィーによる分離
で、製ｎ　、１Ｍ　＄１−４として用いたヘパリンと比
較し、高い拮１゛讐視和ヤ１を何４′ろ成分（高親和性
ヘパリン）は全くたく、　−ツノ、親和性の低い側の成
分（低親和性ヘパリン）乙製造に用いたヘパリンより常
にＩｐない （ｋ）Ｉｌｌスペクトル　らとのヘパリンと比べてｌ　
１３０−ｌ　１６０ｃｍ−’の吸収帯の強度を増大 （＋）”ＣＮＭｒｔスペクトル　９７．８１）Ｉ）１１
および５８　、７　ｐｐｍのノブナル強度を減少。ヘパ
リンと比べて、ｐｌ＋依ｑ性の９２１〜９ｙ、ｓｐｐ請
および５５〜５６ｐｐｍの二つのノブナル強度を増大 （ＩＮ）’ｌｌ　−ＮＭＩ（（４ｆｌ　ＯＭｔｌｚ）ヘ
パリンと比べ３１０　ｐｐｍ　（Ａ　−２ａ）のノブナ
ルに比し３２５ｐｐｍ（八−２ｓ）のノブナル強度を減
少（ｂ）に挙げた遊離アミノ基をアシル化したヘパリン
誘導体は、ヘパリンおよび／またはその塩を、酸の０．
２〜０３モル水溶液で、４５〜７０℃およびｐＨ１、５
〜５０の範囲で、９０分〜３０時間注意深くコントロー
ルされた酸性加水分解を行い、次いて３０℃〜θ℃に冷
却し、アルカリを加えてｐＨ６，０〜８０の範囲に調節
することにより反応を終結し、反応生成物を水に対して
透析し、それ自体既知の方法に従って乾燥し、得られた
反応生成物の遊離アミノ基をそれ自体既知の方法に従っ
てアシル化することによって得られる。

これらのアンル化誘導体は、下記に示す特性値によって
特徴付けられる （ａ）外観白色の吸湿し易い物質 （ｂ）遊離アミノ基含有量２〜ＩＯμモル・ｇ−１（ｃ
）ウロン酸／ヘキソサミン含量比・０９７〜０（ｄ）旋
光度：＋３０’〜＋６０″ （ｅ）凝固活性　１０−２０１　Ｅ−ｎ−’（ｒ）メタ
クロマノー性色木効果〔ヘパリン（−１，０）、１１：
力比中り］ｌｔ１、　ｌ　１１−１１．９０（）ルｒツ
ノブルーーζ１ｌｌｌ定） （ｙ、＞・＋を均分Ｆ’１１２０００−３００００ＤＣ
ｈ　）−、ｒう十バクテリウム・ヘバリナム（Ｆ　１ａ
ｖｏｂａｃＬ−ｔ：ｒｉｌＩｍ　　ｈ＋１ｐＸＩｒｉｎ
ｕｉ）から、グ４製されたへぺり→゛−ゼ１＞Ｃ，Ｉ　
、２．２．７）に対する基質適性基′ｔ１飽和時（３０
°Ｃ，ｐ１１７．０）の反応速度の原ｎヘパリン（・１
００％）との比較、１０％〜ｌ　ｔｌ　０％ （１）γノ子ｌ・【ノ／ヒノ１１１（△’ｌ’　ＩＩＩ
　）にχ１ｔろ結合性ヒト、アノヂトし１ノヒノ１１１
を結合さＵたセファ０−ス（Ｓ　＋：ｐｈＸＩｒｎｓｃ
商標名）を用いろアフィニテＣ−・クロマトグラフィー
による分離て、’Ｊ’Ｊ　Ｑ　原１１として用いたヘパ
リンと比べて、高い結合ｔＵ和性を（Ｔ　ｔろ成分（高
親和性ヘパリン）は全くなく、一方、親和性の低い側の
成分（低現０１性ｔ＼バリン）乙原料に使用したヘパリ
ンより畠に少ない （ｋ）’ＩＩ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ）：３
．２５ｐｐｍ、；よび３．４０ｐｐｍに、はぼ回し強度
のノブナル と記の合成または半合成のグリコサミノグリカンを硫酸
化することにより、または天然産または合成多糖類を硫
酸化することによって製造し得るヘパリン誘導体はそれ
自体既知の方法によって製造される。それらは、例えば
下記の物質のようなしのであって、大部分は商業的に人
手し得る。

１、サメの軟骨から得られたコンドロイチン硫酸ナトリ
ウム塩〔購入先、カルビオヒエム・ベージング、コルプ
、う、ノヨラ（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　−Ｂｅｈｒｉｎ
ｇ　　Ｃｏｒｐ、　Ｌａ　　Ｊｏｌｌａ））。

２８ウノの靭帯のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩〔購
入先：セルバ、ハイデルベルク（Ｓｅｒｖａ。

Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）　）。

３、ブタの粘膜のヘパリン硫酸ナトリウム塩〔購入先：
カルビオヒエムーベーリング・コルプ・う・ノヨラ（ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｃｍ−Ｂｃｈｒｉｎｇ　　Ｃｏｒｐ、、
　ＬａＪｏｆ　ｌａ　）　：？Ｊａ方法・カス（ｒ１、
　Ｃａ５ｕ　）ら、フγルマコロノカル・リサーチ・コ
ムニケーノタン（Ｐｈａｒｍａｃｏ１、　Ｉ’ｔｅｓ、
　Ｃｏｍｍｕｉ、　）、１１巻、２７リ頁（１９７９年
）〕。

１．ブタの粘膜から調製されたデルマタノ硫酸ナトリウ
ム塩〔購入先・カルピオヒエム・べ−リ／グ・コルブ・
う・ノヨラ（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−■ｅｌ＋ｒｉｎｇ
　　Ｃｏｒｐ、、　１、ａ　　、Ｉｏｌｌａ）；！ＩＪ
進方法：カス（１１，Ｃａ５ｕ）ら、フ１ルマコロノカ
ル・リサーチーコムニケーノ３ン（Ｐｈａｒａａｃｏ１
、　１ｉｅｓ、　Ｃｏ５５ｕｎ。

）、ｚ６．２７９′ｒ１（１９７９年）〕。

５　ベントサンポリ硫酸ナトリウム、平均分子１約２０
００（５Ｐ５４　　（商標名）、購入先、ベネ・ヒエミ
ー、ミュンヘン（Ｂｅｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｅ。

Ｍ　ｕｎｃｈｃｎ）　）。

６、ムコポリサツカリドポリ硫酸エステル〔アルテパロ
ン（Ａ　ｒｔｅｐａｒｏｎ；商標名）、購入先：ルイト
ボルドーベルク、ミュンヘン（ＬｕｉＬｐｏｌｄ−Ｗｅ
ｒｋ。

Ｍｕｎｃｈｅｎ）　）。

７　ペントザンボリ硫酸ナトリウム、平均分子ｌ１４０
００（トロンボシト（Ｔｈｒｏｇ＋ｂｏｃｉｄ；商標名
）、購入先・ベネ・ヒエミー、ミュンヘン（ＢｅｎｅＣ
ｈｅｍｉｅ、　Ｍｕｎｃｈｅｎ）　）。

８、ヘパリノイド、バイエル５０００１１＋）１３−Ｅ
　ごのヘパリノイドは医薬品バヨリン（Ｈａｙｏｌｉｎ
、商標名）リニメント、パイロファルム（Ｂａｙｒｏ−
１）ｈａｒｓ）およびランニール（Ｌａｓｏｎｉｌ；商
標名）、バイエル−レバークーゼノ（Ｌ３ａｙｃｒ　　
Ｌｃｖｒ＋ｒｋｕｓｃｎ）に含有されている。

９、アテロイト（Ａｔｅｒｏｉｄ；商標名）から得られ
たムコポリサツカリド硫酸エステル〔購入先・ドクトル
・レンチュラー、ラウファイム（Ｄ「。

ＲｅｎＬｓｃｈｌｅｒ、　　Ｌａｕｐｈｅｉｍ））。

１０、キト−サンを用いて製造したヘパリン誘導体〔合
成法、ウォルフロム（Ｍ、　Ｉ、、　Ｗｏｌｒｒｏｓ）
ら、ツヤ−ナル・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ
（Ｊｏｕｒｎａｌ　　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　　　５ｏｃｉｅｔｙ）、８１巻、１７６４
頁以下、（１９５９年）〕。

１２　　キンランを用いて製造したヘパリノイド〔合成
法ヴイ・エム・ドクター（Ｖ、　Ｍ、　Ｄｏｃｔｏｒ）
、ヴイ・サウルズ（Ｖ、　５ａｕｌｓ）、トロンボシト
・リサーチ（Ｔｈｒｏｓｂｏｓ、　Ｒｅｓ、　）、３０
巻、５７３〜５７８頁、（１９８３年））。

１３、デキストランを用いて製造したヘパリノイド（デ
キストラン硫酸）〔合成法・レヶッッ（ｃ、ｒｔ。

１ｔｃｃｋｅＬｔｓ）、バイオケミカル・ジャーナル（
Ｂ　１ｏ−ｃｈｅｓ、　、Ｊ　、　）、５１巻、１２９
〜１３３頁（１９５２年））、 １４、アルギン酸を用いて？Ｊ遺したヘパリノイド〔合
成法、ラーム（０’、　Ｌａｒｓ）ら、カーボハイドレ
ート、リサーチ（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　　Ｒｅ５
ｅａｃｈ）、７３巻、３３２〜３３６頁（１９７９年）
〕。

＋５．セルロースｔｃ酸を用いて製造したヘパリノイド
〔合成法キンドネス（Ｇ　、　Ｋ　１ｎｄｎｅｓｓ）ら
、プリティフノユ・ツヤ−ナル・オブ・ファーマン−（
Ｂｒ、　Ｊ　、　Ｐｈａｒａｃ、　）、６８巻、６４５
〜６４９頁（１９８０年）〕。

１６、スルホン化したＮ−カルボキンメチルキト−サン
を用いて製造したヘパリノイド〔合成法：ムッザレリ（
Ｒ，Ａ、　Ａ、　Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ）、ポリマー・
サイエンス・アンド・チクガロジー（ＰｏｌｙｍｅｒＳ
ｃｉｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、
２３巻、３５９〜３７４頁（１９８３年）〕。または １７、合成ヘパリノイド〔合成法オカダ（ＭＯｋａｄａ
）ら、マクロモレクラ−・ヒエミー（〜１ａｋｒｏｓｏ
１．　Ｃｂｃ饋、）、１８０巻、８１３〜８１７員（１
９７９年）およびコモダ（Ｈ、Ｋ　ｏａｏｄａ）、マク
ロモレクラ−・ヒエミー（ＭＡｋｒｏｓｏｌ　、　Ｇ　
ｈｃｍ、　）、ｌ８１８．２３０５〜２３１４頁（＋　
９８０＜１））、。

例示的に示したヘパリン誘導体は、所望により既知の溶
解補助剤、安定剤および／またはベノノルアルコールの
ような防腐剤を添加し、滅菌した水溶液の形にするかま
たは固体として長年にわたり変化することなく、完全な
活性を保持しつつ貯蔵することができる。これは同様に
、滅菌濾過または、例えば１０５〜１２１℃で３０分間
、蒸気または加ハ滅菌するような既知のＴＸ段によって
滅菌することができる。

これらのヘパリン誘導体は抗凝固活性が低いので、特に
溶液の形で静脈内に適用するのに好適である。これらは
またｐ　Ｈを５０〜８．０とし、浸透圧を調節すること
により、体外沈澱用の医堕品として堤供される。これら
はｐＨｂｉ　４　、０〜５８の範囲でしＤし沈澱能を示
すので、低比重リポ蛋白（ＬＩＪＬ、）を全面または面
柴から選択的に沈澱させるにはｐＨ値４０〜５．８の範
囲で使用ず４ことか好ましい。

これらのヘパリン誘導体をこの発明に掲げる低比重リポ
蛋白の選択的な沈澱用として利Ｉｌｌするには、治療的
領域だけでなく診断用検査の領域にも好適に使用できる
。

全面または面漿からしＤＬを選択的に体外沈澱さける方
法と装置が西独公開特許第３１３５８＋４シ」に示され
ている。ごの方法においては天然産ヘパリンが沈澱剤と
して記載されている。この発明に掲げるヘパリン誘導体
はＬＤＬの沈澱に使用する場合、これらの抗凝固性活性
がヘパリンと比べて著しく低いというに１点を存する。

天然産ヘパリンと同等のしＤＬ沈澱反応を生じる一方で
、その抗凝固性活性が低いことにより、ヘパリン誘導体
を使用して患者を処置する場合に出血の危険を生しるこ
とがない。

以Ｆに実ｍ例を示して、この発明を更に詳細に説明する
。

次表の表−目よ、先に挙げノこヘパリン誘導体υノ１−
１７および天然産ｌ＼バリンナトリウ１２で、西独公開
特許第３１３５８１４号に示された装置を用いる方によ
りしＤＬ沈澱実験を実施して得られた抗凝固性活性とそ
の叶２範囲を示したものである。沈澱実験に際しては、
実施例４Ｃに例示した如く、面記化合物の０．９３９・
Ｉ！−’の量をアセテートバッファー（ｐＩＩ４．８５
）中に加えて行った。

表−夏に示しｋｐＨ値は、少なくとらＬ　Ｄ　Ｌの５０
％を沈澱させるｐＨ範囲を掲げている。

また抗凝固性活性は第ＸＸ版米国薬局方（ＵＳｐ　ｘｘ
）に記載の試験法、または、例えばタイエン（Ｔｅｉｅ
ｎ）ら〔トロンボ−シス・リサーチ（Ｔｈｒｏａｂ。

Ｒｅｓ、）、８巻、４１３頁（１９７６年）およびトロ
ンボ−シス、リサーチ（Ｔｈｒｏａｂ、　Ｒｃｓ、　）
、１０巻、３９９頁（１９７７年）〕により記載されて
いる色素原性基質試験法により測定を行った。

この表から、凝固活性が１．０１Ｅ−ｓ＋９−’または
それ以上のヘパリン誘導体は、化学構造の如何にかかわ
らすＬ　Ｄ　Ｌ沈澱剤として好適であることが判明した
。凝固活性が１．０１Ｅ−ａｙ−’より低い物質、例え
ば！、２．８および９（実施例３参照）は、沈澱剤とし
て好適ではなかった。

」二ｌ　　ＬＤＬ−沈澱反応試験成績 ２　　　　　　　　　　　　　　〈０５３　　　４．２
−５．５　　　　　　５４　　　４．２−５．５　　　
　　１２５　　　４．５−５．８　　　　　１７，６６
　　　４．６−５．８　　　　　２２−３５７　　　４
．４−５．８　　　　　１５．９８　　充分な沈澱物を
得られず　０４３９　　　　　　　　　　　　　　　０
．３７５１０　　５．０−５．８＊５．６ １１　　　４．２−５．８　　　　　５２１２　　　４
．２−５．８　　　　２３１３　　　４．２−５．８　
　　　　１４１４　　　４．２−５．８　　　　　　２
．８１５　　　４．２−５．８　　　　　２０１６　　
　４．２−５．８　　　　　２７１７　　　４．２−５
．８　　　　　　６ヘバリノーＮａ （対　照）４．５−５．８　　　　１５５＊沈澱剤　２
　、０９／Ｑを使用 ！膚ア１に の明細書に提供しノー−・連のヘパリン様物質のヒト血
漿におけろ低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）の沈澱能を検討し
た。これらの物質を、酢酸でｐＨ４，８５にｊ、１１節
した０　２モル酢酸ナトリウム緩衝液に０．９３ｗ／Ｑ
の濃度で溶解した。ヒト［［［Ｌ漿５００μＱを、試験
物質を含有する酢酸ナトリウム緩衝液６５００μＱと混
合した。１０分間、室温または３７　”Ｃで放置後、０
．４７ｚｍのフィルターで濾別士るかまたは庵心分離し
、上ｒａに自まれろコレステ〔ｌ−ル濃度を調べた。ヘ
パリン誘導体によって沈澱したＬ　ｌ）　Ｌ−コレステ
ロール濃度は、予め知られている総コレステロール含量
から上清のコレステロール値を差し引くことによって算
出した。

以ドの図面において、沈澱したし１）シーコレステロー
ルは、いずれら（沈澱したｔ、　ｏ　Ｌ）／（Ｌ　。

１、分析値）の商として表セか、または１−清中のコレ
ステロール含量として直接肩９／ｄＱで縦座標に示し／
二。Ｌ　Ｉ）　Ｌ　　コレステロールの分１ｌｉｔ直は
、ウイーラノト（Ｉ１、　Ｗｉｃｌ＋Ｉｎｄ）、ザイデ
ル（Ｄ　、　Ｓ　ｅｉｄｅｌ）〔ツヤ−ナル・オブ・リ
ビツド・リサーチ（、ＩＬｉｐｉｄ、　Ｒｅｓ、　）２
４巻、９０４−９０９頁（１９８３年）〕によるヘパリ
ン・ノドレート溶液を用いる分析的Ｌ　Ｄ　Ｌ試験法に
よって測定した。

商が１であるということは、オなわらＩ、Ｉ）Ｉ、コレ
ステロールが定量的に沈澱したことを意味する。

酢酸ナトリウム緩衝液中のｌＩ値の調節に要する酢酸所
要量を変化さ０・ることにより、ｐＨ１−１７を４．０
〜５．４の範囲で調節した。ヘパリン誘導体の酢酸ナト
リウム緩衝液溶液（０，９３ｙ／ｆり同量のヒト血漿を
混合してｔｌ１４ＤＩ−たｐｌ−１値を、添付図面のｖ
Ａ座標にとり、第１図では表に挙げた生成物５によるＬ
ＤＬ−沈澱のｐＨによる変化を示した。

第２図は、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８５）中に
溶存している生成物５の量の増加にとらなって上清中の
コレステロールｍが減少することを示している。

実施例２ アルテパロノ（Ａ　ｒＬｅｐａｒｏｎ商標名）を使用し
て実１１桓例１の方法に従い１．　ｌ）　１、沈澱試験
を実施した。

アセテートバブファー中に溶存しているアルテベａノの
：ＩＩにより変化するＬＤＬ沈澱の測定結果を、ヘパリ
ンと比較して第３図に示した。また、第４図にはアルテ
パロンによるＬＤＬ沈澱ｆｆｌのｐＨによる変化を示し
、一方、業５図にはヘパリンによるしＤＬ沈澱量のＩ）
１１による変化を示した。

実施例３ 実施例１および２と同様の方法を用い、ウノの靭シ１７
のコツトロイチン硫酸をしＤＬ沈纜剤として使用した。

；ＩＮ定した結果を、アセテートバブファーにｋ”：　
Ｉ’１−１−ているコツトロイチン硫酸量によるＬ］）
シ沈澱＋１の変化として第６図に示し、同時にヘパリン
による変化を比較として示した。この結果から、コノド
ロイヂノＦｄｔ酸では、血漿中のしＤし金白ｉ’ｉｔを
苔しく低下させないため（約４０％）、コツトロイチン
硫酸はこの条件下てＬＤＬ沈澱剤として（車用し得ない
ことか判明した二 次に小」゛実施例４は、先に（ａ）を乙−て示したヘバ
リン誘稈体の製造方法よｊよびそのしＤＬ沈澱剤として
の応用について記載してい７１．。

実施例４ Ａ　ヘパリン誘導体のＶＪｍ 平均分子量１５０００Ｄのヘパリン３０ｇを発熱性物質
を含まない蒸留水４８０ＩＩＱに溶解し、これを反応容
器中で予め７０℃に加熱したＩＮ−塩酸２４ｆ１＋（と
混合した。反応混合物の温度を７０℃に保った。ｐＨ値
は約Ｉ　Ｏであった。８０分間加水分解したのら、水浴
で冷却して反応を停止し、５Ｎ−苛性ソーダ液３０ｚ（
！を加えてｐｌ−１６，８〜７に調節した。反応生成物
は発熱性物質を含量しない蒸留水で透析し、噴霧乾燥し
た。１．９１Ｅ／Ｑの凝固活性を示す白色吸湿性の生成
物２５ｇをｉ−トた。その活性は第ＸＸ版米国薬局方に
記載の方法で試験し、国際単位で表した。比較のため３
国際車位のヘパリン標早品を対照とした。

Ｂ、Ａによる生成物の特性値測定 生成物のウロノ酸含量はビック−（Ｔ　、　Ｂ　１ｋＬ
ｅｒ）ら〔アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎ
ａ−１ｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅＩＮ、）、４巻、３３
０頁（１９６２年）〕の方法により測定した。グルタロ
ン酸う′７トノを＋ｆＩ４品として使用した。この生成
物は２８２％のウロン酸含量を示した。ヘキソサミノ桔
の含Ｉλは、バースト（Ｒ，Ｅ、　ｌ−１ｕｒｓＬ）ら
〔アナリテでカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ　Ｒｉｏｃｈ＋！ｓ、　）、＋ｓ６．８８頁（
，１９８１年）〕の方法により光学的な方法で測定した
。ウロン酸とへキソサミン基の含量比は０９８であった
。

生成物のＮ−アセチル基金含量は、アルカリ性で加水分
解したのら、遊離したアセテートを滴定４〜ろことによ
り８３％（Ｗ／Ｗ）の値を得た。

遊離アミノ基の相対的含イｆ量は、２．４．６−ドリニ
ト（２ヘンゼン　１　スルホン酸を使用するサタケ（Ｋ
　、　Ｓ　ａＬａｋｅ）ら〔ツヤ−ナル・オブ・バイオ
ケミストリー（，１、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　）、４７巻
、６５４ｒｔ（１９［ｉ　１１　’ｉ））の方法により
測定した。比較物質として、畠にクリ７ノをＩＩいた。

商業的に人手しｉ−ｔろヘパリンの遊離アミノ基な４量
はＩＯ〜５０μモル・９−１の範囲であるのに対し、実
施例４Ａてｉ！られノニ生成物の場合はＩ　２９　Ｉｔ
モル・ｙ−１の値を示した。

ノルバート（Ｓ　ｉ　Ｉ　ｌ＋ｅｒＬ）　（パイＡケミ
カル・バイオフィンカル・リサーチ・コムニケーノヨノ
（Ｂｉｏｃｈｅｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏｍ５ｕｎ、　）第６９Ｓ１第５７０頁（１９７６年）
〕の方法によるメタクロマノー色素効果、すなわち塩基
性色素（例えば、トルイノンブルー）によってＵ　Ｖ　
／　Ｆｉｒ視スペクトルのメタクロマジー変色を生じる
ヘパリンおよびその誘導体の性質を、ヘパリンと実施例
へ４の生成物で検討した。ヘパリンでは最大のメタクロ
マジー効果が測定できたが、加水分解物では明らかに効
果が減少した。両者の直線勾配（メタクロマジー効果の
濃度による変化）の比はｌ（ヘパリン）０．６５であっ
た。

フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆ　１ａｖｏｂａｃ
ｒｅｒｉｕｓ　　ｈｅｐａｒｉｎｕａ）から調製された
ヘパリナーゼ（ＥＣ，４，２，２，７）のヘパリンおよ
びその誘導体を基質とする反応速度は、各基質の構造に
よって鋭敏に変化する。検討すべき誘導体とヘパリンと
の構造的な相ａの程度は、ヘパリンとその誘導体括質に
対するヘバリ＋−ゼ活性の比に逆比例オろ。

該活性はリンカ＝（Ａ　、　Ｌ　ｉｎｋ＋＋ｒ）　（メ
ソーノズ・イ／・エノザ（モ〔１ノー（ＭｃＬｌ＋ｏｄ
ｓ　ｉｎ　ｌ’：ｎｚｙ＊ｏｌｏｇｙ）、２８在、（１
９８２年）およびＰ　Ｃ′Ｉ’特許／ＵＳ８１　０１　
ｆｌ　８１号〕により記載されているＦ配力条件により
測定した。ヘパリナーゼは、ヒドロキノラパタ（トホス
ホセルロースを用いたクロマト々′ラフイーによ−、て
フラボバクテリウム・ヘパ１１ナム（Ｆ　ｌａｖｏｂａ
ｃｔｃｒｉｕｍ　　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）から分離しノ
ー、、ヘヘリン！／二（まヘパリンａＱ体（２５ｍｇ・
７０−’）の２０μＱとヘパリナーゼ溶液２０μＱに０
２５Ｍ−酢酸ナトリウム溶液および００２５Ｍ−酢酸カ
ルノウム溶液から成る緩衝混合液（ｐＨ７，０＞２．５
ａσをＩＮ＋えた。酵素反応は３０℃で行い、２３２ｎ
ｍの吸光度の変化を定期的に記録した。ヘパリンの時間
／反応曲線の勾配を１００％とした。

ｒ・備試験を行い、括質飽和状態で反応が行なわれろご
よを確認した。実施例４Ａの一生成物ては、へペリンの
５・１％の反応速度が得られた。

乙とのヘパリンの比旋光度は５０９°の１こ均値を示し
た。実施例４Ａの生成物では〔α〕Ｄ＝４２５°の比旋
光度が得られた。

実施例４Ａで得られた加水分解物の分子ｒＩｔまたは分
子量分布は、原料に使用しｌニヘパリンと変わらない。

その平均分子！Ｊｋはｌ　５　（＋　００１）てめ−Ｉ
ｆ二。

実施例４Ａの生成物はアノチトロンヒノ１■結合性をも
とのヘパリンと比較した。ヘーク（Ｍ。

Ｈｏｏｃｋ）ら（ＦＥＢＳレター（Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　　
Ｌｅｔｔｅｒ）、６６巻、９０頁（１９７６年）〕の方
法に従い、セファロース４１３　（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ４１３　商標名）にＪ”　ｒＫ結合的に結合している
ヒト、アンチトロンビン■を用いてアフィニティクロマ
トグラフィーを実施した。商業的に入手し得るヘパリン
では、明瞭に区別し得るアンチトロンビン１■に結合し
た３本のヘパリンフラクンヨノ結合帯（非結合性画分、
低結合性画分、高結合性画分）が得られた。これに対し
て実施例４Ａの生成物では、アンチト〔ｌノヒノ■に対
し全く結合しないか、またはわずかに少部分の低結合性
画分があるだけであった。この発明の生成物のアンチト
ロンヒン１１−セファａ−スニ対するアフィニテｆウロ
マトグラフｆ−の溶離図を第７［２１１に、士た製造に
使用したヘパリンのアフイニティクロマトグラフィーの
溶離図を第８図に示し几。（セファロースに結合させた
アンチトロンビン■に吋・１−ろアフイニティクロマト
グラフィーの条件： ＩｔＪｉＭ　Ｉ　：　１１　、１１５モル　トリス・バ
ブファー、００５モルＮａＣＣＭｉｆ＆：（ｌｌＩＩ　
７　、５　）ｆ！′＃液２：０．０５モル　トリス・バ
ブファー、２５モルＮａＣ０溶液（ｐｌ＋　７　、５　
））溶離ａ：（１）Ｗ衝ｉ＆　ｌ　（３０ｍＱ）（２）
緩衝液Ｉ（３０＋σ）（緩衝液２Ｃ３０ＲＱ’）（直線
的製電勾配） 流速：ｌ５ｚｆ！・ｈｌ 試料らｔ：１．０＊（１：３ｘｙ−ｘＱＩ（溶出ｔろ試
料は２ｚ（１４”つ採取した）実施例４Ａの生成物の硫
黄含イイ咀は、製造原料ヘパリンか１１．５％（Ｗ／Ｗ
であるのに対し９８％であっｆこ。

酸による加水分解の進行は、ヘパリンに鋭敏である凝固
試験、活性化部分トロノボプラスチン時間（ａｐ〕”１
’　）によって追跡した。　・定時間海に反応混合液か
ら試料０　、８　ｘＱをとり、５１Ｍ−炭酸水素ナトリ
ウムの０９％ＮａＣＱ溶液で中和し、同し緩衝液を用い
て１００１に昂択した。この原液の１８Ｍ部を、更に０
９％ＮａＣσで４容＋、ｉ　１１；に品択した。この昂
釈溶液５０μｅをヒト・ノドレート血漿９５０μＱと、
昆合し、パトロムヂン（ＰａＬｈｒｏｌｌｔｉｎ；商標
名）試薬〔ベーリングベルケ（ｒ３ｅｈｒｉｎｇｖｅｒ
ｋｅ）、マールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）　）を使用し
て試験した。

測定には球体凝固計ＫＣ４（アメルング旺（Ｆ　ｉｒｍ
ａＡａｅｌｕｎｇ　　ＧｓｂＨ）、レムゴ（１、ｃｍｇ
ｏ）　）を使用した。表−２に、測定した凝固時間（４
回の測定値の平均値：抄）の時間的変化と、４回の測定
値から計算した標準偏差値（Ｓ）および変動係数（Ｖｋ
）を示す。

Ｃ，Ｌｌ）Ｌ・沈澱反応への応用 実施例４Ａで製造した生成物のヒト血常にわけろ低圧用
リポ蛋白（ＬＤＬ）沈澱能を調べｆ為実施例４Ａによる
生成物を、酢酸でｐＨ４，８５に調節した０、２Ｍ−酢
酸ナトリウム緩衝液に０９３９／Ｑの濃度で溶解した。

ヒト血漿５００　Ｂσを実施例４の生成物を食付してい
るアセテ−ドパ１フアー５００μＱと混合した。室温で
１０分放置後、Ｏｌ１μｍのフィルターで濾別４゛るか
、１１二は」仝８分離し、上ｔ＋１中のコレステロール
０度を測定したウヘバリン誘導体で沈澱させたＬ　Ｄ　
Ｌ　コレステロール濃度は、予め得られている総コレス
テロール含量から上清中のコレステロール値を差し引く
ことにより算出した。

以下の図面では、ＬＤＬ・コレステロールの沈ｉＩｉ槍
は（ＬＤＬの沈殿量）／（Ｌ　Ｄ　Ｌ、の分析値）の商
をもって縦座標に表した。ＬＤＬ−コレステロールの分
析値は、ヘパリン・ントレートを用いる分析的ＬＤＬ試
験法を用いて求めた〔ウィーラノト（Ｈ，Ｗｉｅｌａｎ
ｄ）およびザイデル（Ｄ　、　　Ｓ　ｅｉｄｅｌ）　）
、ツヤ−ナル・オブ・リピヅド・リサーチ（Ｊ。

１　ｉ１＋ｉｄ、　　Ｒｅｓ、　）２−１６．　９０４
頁（１９８３年）〕。

商がＩでめろことは、しすし−コレステロールか定量的
に沈澱したことを章味する。

酢酸ナトリウム緩衝液の１ｕｌｌ値調節に要する酢酸所
要量を変化させろことにより、ｐｔｌ値を４．０〜５４
の範囲で：Ａｌ７ｉシた。ヘパリン誘導体の酢酸ナトリ
ウム緩衝液溶液（０，９３ｇ／ｌりと、同容ｔ１のヒト
血漿を混合したのち、そのｐｌＩ値を調節し、以下にこ
れを図面のｔｉｌｌ座標に表した。第９図は実施例４Ａ
で製造した生成物で沈澱させたＬＤＩ、沈澱ＯｐＨ値に
よる変化を示す。第１θ図は、実施例４Ａの生成物の酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４８５）中に溶存する量によ
って、上清中のコレステロールが減少することを示して
いる。

次に示す実施例５および６に、先に（ｂ）に記載したヘ
パリン誘導体の製造およびＬＤＬ沈澱反応におけるその
利用について記載する。

実施例５ 八、ヘパリン誘導体の製造： 実施例４Ａに示す方法により製造したヘパリン加水分解
物を、次の段階で無水醋酸と反応させた。

この処置は、加水分解段階で遊離されたアミノ基を公知
の方法によってアセチル化することを目的としている。

凝固活性５．７１１Ｅ／Ｉｆｇ（ｔＪｓｒ’ＸＸ）のヘ
パリン加水分解物（実施例１）２．５９を水２７９１ρ
に溶解し、これにメタノール３０１１２および炭酸ナト
リウム１．５ｙを加えた。この溶液を水冷しつつ、これ
に無水酢酸６ＩＩＩＱ、を３θ分間かけて滴下した。

この場合、３Ｍ−ＮａｔＣＯ３溶液を用いて９［（値を
７．０〜７．５に維持した。水浴中で更に２時間攪拌を
続けたあと、次いで水に対して２日間透析を行った。得
られた生成物は常法によりエタノールで沈澱させ、真空
乾燥器中で６０℃で一夜乾燥した。白色の吸湿し易い生
成物（収ｔ２．Ｉ？）は！６９１　Ｅ／１９（Ｕ　Ｓ　
Ｐ　Ｘ　Ｘ）（７）凝固活性を示した。

Ｂ、Ａによる生成物の特性値決定。

この生成物の４００　ＭＨｚ　−’Ｈ−ＮＭＲスペクト
ルを第１１図に示す。スペクトル（５０ｎ・ｘＱ　−１
Ｄｙ”＋内部規準：ＨＩ）０．’ｌ″ＭＳに対する化学
ノット　δ−・ｌ　、　Ｈｐｐ−〕はヘパリノと比へて
Ｎ−アセチルングナルの高いピークを示した。この生成
物は、そのスペクトルから明らかなように、なお若干の
エタノールを不純物として含ａしている（１．１８ｐｐ
ｍ、３．５９　ｐｐｇ＋）。遊離アミノ屑の含ａＦ１は
、出発物質の１４５μモル／ｇに対して４．４μモル／
９に低下した。ヘパリナーゼによる分解速度は、出発物
質の５３％（ヘパリン＝Ｉ００％）に対してアセデル化
生成物では４５％に変化した。

比旋光度は〔α〕背＝＋５１’から＋４４５゜に変化し
た。ヘパリンを１００％とするトルイノノブルーで測定
したメタクロマノー効果は、出発物質の８５％に対して
８２％に変化した。

Ｃ，ＬＩ）Ｌ沈澱反応への応用。

実施例４Ｃに記載した方法を用いて、得られた生成物の
ヒト血漿におけるＬＤＬ沈澱能を検討した。７１２図に
、Ｌ　Ｄ　Ｌ沈澱反応のｐＨによる変化を示した。

実施例ｑ 実施例４Ａに示す、方、生りより製造したヘパリン＋１
１水 Ｕた。この処置は、加水分解段階でＪ離されたアミノ括
を公知の方法によってザクノニル化４−ることを目的と
している。

凝固活性５　、　７　１　１　Ｅ／ｚＲ（Ｕ　Ｓ　Ｐ　
Ｘ　Ｘ）ノヘバリン加水分解物（実施例４Ａ）２ｇを水
２４ｘ（ｌに溶解し、室温で無水コハク酸６００ｚｙを
少ｑずつ加えた。５Ｎ−ＮａＯＨを用いてｐｌ−１値を
８　０に４（持した。添加終了後、溶液を叶【７　５に
調節し、２日間水に対して透析した。生成物をエタノー
ルで沈澱させ、分離した沈澱物を真空乾燥器中で一夜６
０℃で乾燥した。

白色の生成物は、１　８．８　１　Ｅ／ｚｙ（ＵＳｐＸ
Ｘ）の凝固活性を示した。

生成物の４　０　０　ＭＨｚ　−　’Ｈ　−　ＮＭＲス
ペクトルを第１３図に示した（５０ａ＋ｙ・ｉ９−’Ｄ
ｔＯ：内部規準：ＨＤＯ：ＴＭＳに対するδ−４　、　
８　ｐｐｍ）。生成物の出発物質およびヘパリンと比較
した諸物性を下記の表−３に示す。しＤし沈澱反応のｐ
ｌ．Ｉによる変化は第１４図に示した経過をたどる。沈
澱反応は実施例・ＩＣに示した条件で実施した。

Ｎ−３Ｎ　　サクノニル化した加水分解物と天然産ヘパ
リンおよびザクンニル化＋ｉｉｉのヘパリン加水分解物
との諸物性の比較 ノンブルー） 発明の効果 本発明はヘパリン誘導体を用いることにより、動脈便化
症の原因となる低比重リポ蛋白を全ａＩ【清上たは血漿
から選択的に体外に沈澱させることができろ。

【図面の簡単な説明】

第［図および第２図は、それぞれ５Ｐ５４によろｌ　Ｉ
）　１．沈澱のｐＨ値による変化およびアセテート・＜
　ノー、１アー中に溶存しているＳＦ’５４の屯によっ
て変化する上ｔ＃中のコレステロール量をＩ＼パリリン
比較して示している。 第３図は、アセテートバッファーに溶ｆｊＬでいるアル
テパロンの…によって変化ずろ上清中のフレステ［１−
ルｑをｌ＼パリリン比較して示している。。 第４図はアルテパロンによる１、　ｌ）　１．沈澱の１
１１１値による変化を示し、第５図はヘパリン・ナトリ
ウムによるしＤし沈殿の９Ｈ値による変化を示す。 第６図は、ウノの靭帯のコンドロイチン硫酸のアセテー
トバッファー中の溶存量によって変化する上滑中のコレ
ステロール量をヘパリンの場合と比較して示している。 第７図および第８図は、それぞれヘパリン加水分解物お
よびヘパリンのヒト、アンチトロンビン■を結合させた
セファロース４Ｂによるアフィニティクロマトグラフィ
ーの溶離図を示す。 第９図および第１Ｏ図は、それぞれヘパリン加水分解物
（実施例４Ａ）によるＬＤし沈澱のｐＨ１による変化と
、アセテート・バッファー中に溶存するヘパリン加水分
解物量によって変化する上清中のコレステロール量の変
化を示す。 第１ｔ図は、ヘパリン加水分解物をアセチル化した反応
生成物（実施例５Ａ）の４００ＭＨｚ−’ＨＮＭＲスペ
クトルを示す。 第１２図は、ヘパリン加水分解物をアセチル化した反応
生成物（実施例５Ａ）のＬ　Ｄ　Ｌ沈澱のｐＨ値による
変化を示す。 第１３図は、ヘパリン加水分解物をサクノニル化した反
応生成物（実施例６Ａ）の４００ＭＨｚ’Ｈ−ＮＭＲを
示す。 第１４図は、ヘパリン加水分解物をサクノニル化した反
応生成物（実施例６Ａ）のしＤＬ沈澱のｐＩ４値による
変化を示す。 特許出願人　インターメデイカット・ゲゼルノヤフト・
ミツト・ヘノユレンクテル ・ハフツノグ 代　理　人　弁理士　青　山　葆　ほか２名第１図 第２図 アセテートバッフｙ− 第３図 アセテートバヮ７ア− 第４図 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）緩和な反応条件でヘパリンを加水分解するこ
   とにより合成されるか、または （ｂ）緩和な反応条件で加水分解し、次いで遊離したア
   ミノ基をアシル化することによりヘパリンから合成され
   るか、または （ｃ）合成または半合成グリコサミノグリカンを硫酸化
   することによって製造されるか、または（ｄ）天然産ま
   たは合成多糖類を硫酸化することによって製造され、 血液凝固に関係し、ヘパリンに鋭敏に反応する試験体系
   、例えばトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間
   または薬局方に記載のヘパリン試験法に適用して、ヘパ
   リンほど高い活性を示さないが、凝固系に対し１．０１
   Ｅ・ｍｇ＾−＾１の測定可能な影響を与えるヘパリン様
   作用を有するヘパリン誘導体を、ｐＨ４．０〜５．８の
   値で、全血清または血漿から低比重リポ蛋白を選択的に
   体外沈殿させるヘパリン誘導体の利用。