JPS6181791A - 組み込みベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は所望の性質、例えば、所望化合物を生産する能
力を有する遺伝子工学的に製造さｎた細胞に関する。

遺伝子工学的に付与された性質を有する生物の製造にあ
たっては、細胞の染色体に遺伝子工学的に製造された遺
伝子全組み込むことが望ましい。

染色体外要素（プラスミド）に存在する遺伝子の変更コ
ピーは、細胞の増殖中に突然変異したりまたは細胞中か
ら消失したりして、生産物の収ｆｉｆ減少させる傾向が
ある。これに比べて、染色体ＤＮＡは複製の間に確実に
保持される傾向があり、そのため染色体に存在する遺伝
子の遺伝子工学的・ｉじ飾は遺伝子工学で処理した細胞
の子孫に安定して保持される。

遺伝子工学的に処理されたＤＮＡは一般にクローニング
　ベヒクルがその細胞中で自己複製可能であるときは、
宿生細胞の染色体中に組み込まれないから、遺伝子工学
的遺伝子の究極宿主はその中でベヒクルが複製出来ない
ものでなければならない。従って、染色体に存在する遺
伝子の変更方法は一般に二つの宿主全使用して行われる
。遺伝子工学的に製造された遺伝子を有するクローニン
グ　ベヒクル？それが複製できろ第一のタイプの宿主細
胞中に得る。次いで細胞染色藻中への組み込みのため、
これを第二のタイツ−の宿主に移しかえる。

通常、第二宿主中に導入さｎたＤＮＡは、適当な複製開
始点金本米欠如するため又は第二宿主がプラスミドの複
製音引き起こし得ないため、複製ができない。そのよう
な状況の一つに、ツーラスミド操作のための都合よい光
分特性の知られた宿主である大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１　
）中で処理され、大腸菌プラスミドの複製音引き起こし
得ない異なるタイプの微生物（例えば、酵′ｅ−または
枯草菌（Ｂａｃｉ−１ｈｂｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　
）の染色体中にｉ且み込もうとされるプラスミドが挙げ
られる。例えば、ハルデンパンク（Ｈａｌｄｅｎｗａｎ
ｇ　）らＣ１９８０）Ｊ、Ｂａｃｔ−ｅｒｉｏｌｏｇｙ
ｌ　４２　（１）　：　９０−９８シエーラ−（５ｃｈ
ｅｒｅｒ　）ら（１９７９）　Ｐｒｏｃ、　Ｈａｔ’　
ｌ　、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６（ｔｏ）：４９５１−４９５５ｋ
＞照。

遺伝子工学的に処理した遺伝子全第一宿主として使用し
たものと同じタイプの１萌胞の染色体中に組み込ませる
場合には、他の工夫が必要であり、例えば、第二宿主を
突然変異させて、その埋填ではプラスミドＤ　Ｎ　Ａの
複Ｈｋ不可能とする必要がある（例えば、ガツターソン
およびコシュラ／ド（Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｋ
ｏｓｈｌａｎｄ　）　　「インビトロで変更された配ダ
リによるバクテリア遺伝子の置き換えおよび増幅」、Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ　（１，Ａｃａｄ、　５ｃｉ１Ｖｏ１
．８０　、　ｐｐ、　４８９４−４８９８．１９８３年
８月参照。

一般に、本発明はバクテリア染色体中に組み込まんとす
る遺伝子工学的に処理した遺伝子のためのクローニング
ベクターとして使用されるベクターに関する。本発明の
ベクターは複製−特異的配列、即ち自己複製全可能とし
バクテリア宿主細胞中で安定に維持しうる配列全音む。

本ベクターは複製−特異的配列を挟む制限工／ドヌクレ
アーゼ開裂部位も含み、そのため該複製−特異的配列は
都合よく切り離すことができる。さらに本発明のベクタ
ーは、バクテリア宿主染色体に組み込ませる遺伝子工学
的に処理したＤＮＡ配列も有する。

複製−特異的配列上句り離すことにより、遺伝子工学的
に処理したＤＮＡ配列は、自己複製に使用された宿主細
胞と同じタイプのバクテリア宿主細胞の染色体に組み込
むことが可１１巳であり、また安定な維持も可能であり
、従って遺伝子工学的に処理した配列がバクテリア染色
体の一部として複製することを可能とする。このベクタ
ーはさらに、染色体上に遺伝子工学的に処理した配列を
有するバクテリア細胞全検出できる手段を提供するＤＮ
Ａ配列を含む。

本発明の第二の観点は、前記ベクターの前駆体である。

該前駆体は、遺伝子工学的に処理した配列全欠如し、複
製−特異的配列會挟むどの部位も認Ｒしない制限エンド
ヌクレアーゼによって認識される開裂部位を有する。

第三の観点において本発叫は、遺伝子的に製造したＤＮ
Ａ配列を一つのタイプのバクテリア宿主細胞の染色体外
で複製し、次いで同じタイプのバクテリア細胞の染色体
に組み込むことが可ＮＱ’１方法ヲ目的とする。この方
法の工程は、バクテリア宿主細胞中に前記ベクターを用
意し、この遺伝子工学的に処理した構成物から複製−特
異的配列全切り論し、そして残りのＤＮＡを再環化させ
ることよりなる。該残りのＤＮＡによってバクテリアＪ
胞宿主金形質転換し、そして、遺伝子工学的に処理した
構成物全組換えによって細胞の染色体に組み込み、染色
体ＤＮＡ配列を置き換える。

好ましい態様においては、複製−特異的配列はプラスミ
ドに由来する複製開始点であり；宿主Δｄｊ泡は例えば
、大腸菌であり、複製−特異的配列はｐＢＲ３２２の複
製開始点である。遺伝子工学的に処理した配列を運ぶバ
クテリア細胞全検出する手段を提供するＤＮＡ配列は抗
生物質への耐性を付与する配列である。また、好ましい
態様として、ＤＮＡ配列の遺伝子工学的処理に言上れる
少なくとも一部の工程はベクターが宿主バクテリア細胞
中に維持されている間にベクター上でおこされることも
好ましい。遺伝子工学的に処理さｎたＤＮＡは両末端に
側位配列を有し、この側位配列は置ぎ決えられるべき染
色体ＤＮＡの両末端の各測位配列と１゛目同である。

さらにまた、好ましい態様として、本発明のベクターは
第一および第二制限酵素開裂部恒の間に選別マーカー全
含み、複製−特異的配列の存在を示すことができ、この
ため組み込み体上複製能力のある染色体外プラスミドを
持つ細胞から識別することを可能にする。単独または上
記選別マーカーとの組み合わせにより、複製−特異的配
列および切り離すべき他のＤＮＡは、一つの選別マーカ
ーをコードする遺伝子を二つの非−機能性断片に分割す
るように位置し、これら非機能性断片は、前記断片の切
り離しにより機能性になる。このようにして、複製能力
のないＤＮＡが宿主染色体に組み込まれると、第二選別
マーカーが発現される。

従って、第二選別マーカーの存在で選別することによっ
て所望の組み込みをうげた細胞ヲ遠別することができる
。最も好ましくは、組み込まれるべきＤＮＡは、テトラ
サイクリン耐性のような、選別可能で前記第二選別マー
カーと同じマーカーを有し、そのため該性質を発揮する
コロニーが確文されたのち、その性質を逆に選別してマ
ーカー遺伝子が切り離された微生物を単離することが出
来る。これによって、最終目的細胞を識別する方法が単
純化される；なぜなら、識別を所望細胞金高いパーセン
トで含む集団によって行うことになるからである。

本発明の方法は特に染色体に所望蛋白質をコードする遺
伝子工学的に処理した遺伝子を組み込み、第二宿主に所
望蛋白質を生産させるために使用し；またはバクテリア
細胞から染色体に存在する遺伝子を除去するため、正し
い配置の二つの別々のＤＮＡ配列（その一方は除去すべ
き遺伝子の置ぐ５′に自然に存在し、他方は遺伝子の３
′に自然に存在する）よりなる雑種ＤＮＡを構成するた
めに使用することも出来る。ＤＮＡ分子をベクター中に
挿入し、そこから複製開始点全都合よく切り廉すことが
できる。遺伝子工学的に調造した構成物から複製開始点
を切り離した後、残部ＤＮＡ’ｚ再び環状化し、新たに
得た（蒋造物全組み込みによりバクテリアの細胞の染色
体の中の、前記構造物中の遺伝子工学的に処理したコピ
ーが目標とする遺伝子ローカス部分またはその付近に組
み込むことが出来る。

染色体に存在する遺伝子の変更は、遺伝子工学的に製造
した細胞の子孫に、該変更物が安定に維持されることを
保証する。染色体に存在する変更物を最終的に有するべ
き宿主細胞と同じタイプの宿主細胞内で調製され安定に
維持されつるベクターの使用は、二つの異なるタイプの
宿主を使用する系に固有の問題、例えば、異種（ヘテロ
ロガス）細胞タイプの間の制限修飾システム障害（ｒｅ
ｓｔ−ｒｉｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓ
ｙｓｔｅｍ　ｂａｒｒｉｅｒ　）　ｆ克服する。本発明
のベクターおよびその使用方法は染色体に存在する遺伝
子の変更を単純化し、そのような方法の適用範囲を拡大
するものである。

一般に、本発明のベクターは、両側を制限エンドヌクレ
アーゼ部位で挟まれた複製開始点を含む前１１妃体（例
えば、第２図のｐＫＢ７０１または４４図に示すｐＫＢ
８４３）から構成される。こｎら二つの制限エンドヌク
レアーゼ部位は同一または異なる酵素によって認識され
る部位であってよい。複製−特異的配列の外側には遺伝
子工学的処理をすべきＤＮＡ配列の挿入のだめの開裂部
位が存在する。好ましい態様においてはこの制限エンド
ヌクレアーゼ開裂部位は最初の二つの部位のいずれをも
認識しない酵素により認識される。このベクターはまた
ＤＮＡ配列または複数の配列セグメントを有し、これら
は−緒になると抗生物質にたいする耐性の性質をコード
し、これによって染色体に遺伝子工学的に処理した配列
を有するバクテリア細胞を検出する手段が与えられる。

そのような前駆体の二つの具体例Ｃ’１）ＫＢ７０１お
よびｐＫＢＦ３４３）の構造を、それらの製造の記載に
より以下に説明する。

前駆体の製造 ｐＫＢ７０１およびｐＫＢ８４３の構成に関する以下の
説明はベクターの製造方法を説明するものである；ここ
に具体的に記載されていない範囲にかんしては、例えば
、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）、Ｍｏ１ｅｃｕＬ
ａｒ　ＣＬｏｎｉｎｇＣコールド　スプリング　ハーバ
−ラボラ）　ＩＪ−ズ　１９８２）に記載されている標
準的組換えＤＮＡＭｌ術を使用した。

ベクターｐＫＢ７０１ｃ第２図参照）を製造するため、
複製開始点に隣接してこｎを挾む部位に−Ｋｐｎ（リン
カ−を挿入したｐＢＲ３２２誘導体を製造した。これは
ベータ　ラクタマーゼ遺伝子に隣接する複製開始点の側
においては３ｉｙ、ｕ３Ａによる部分消化により行われ
た。先ずベータ　ラクタマーゼ遺伝子と開始点の間にＨ
ｉｎｄ　［［ＩＪ　／カーを挿入した。次に、このＨｉ
ｎｄ　ＩＩＩ部位をＪ（ｐｎｌ’）ンカーを使用してＫ
ｐｎ　Ｉ　ＶＡ位に変換した。同様にして、ｐＢＲ３２
２のＴｔ屓ｔｔ　１部筐をＫｐｎ　ＩＩＪ　：／カーを
もちいてＫｐｎｉ部位に変換した。この製造の処方によ
ってＮｃｏｉ部位（Ｋｐｎ　ｌリンカ−とＴｔｈｌｌｌ
　１部位との接合部に）およびＮｄｅ　１部位（構造中
に現われる二つのとなりあうＫｐｎＩＩ）ンカーの間に
）が生じる。二つのリンカ−挿入物は一つのプラスミド
上に組み込まれ、ＮｄｅｌおよびＥｃｏＲＩを含む構成
物とされた。その結果、ｐＢＲ３２２のＮｄｅｌおよび
Ｔｔｈｌｌｌ　Ｉ部位の間の少量の成分は最終ベクタ〜
から失われた。Ｈｉｎｄ　ｍ　！７ノカーの元の挿入物
も少量の成分の損失に含まれる軒、こ九ら少量物の削除
はいずれもベクターの有用性に影響を及ぼさない。

第二の前駆体ベクターｐＫＢ８４３は第４図に示す要素
から製造され、その使用をより効果的にする成る種の改
良を含んでいる。ｐＫＢ８４３の要素の詳細は下記の構
造に関する記載から明らかにされる。簡単に言えば、ｐ
ＫＢ８４３は所望の組み込みを受けた細胞の選別を助け
る二つの選別マーカーを含む。ｐＫＢ７０１を使用する
時は複製開始点は完全に削除する必要がある；さもない
と、組み込みが生じたコロニーとマーカーが染色体外要
素上に存在するコロニーを識別するだめの選別マーカー
を使用することは不可能であろう。

プラスミドｐＫＢ８４３は下記の如く、この問題を解消
するものである。

プラスミドｐＫＢ８４３は、襟製開始点とともに削除さ
れるセグメント上に選別ｏＴ症表現型をコードする遺伝
子を■する。第４図に示すとおり２、ｐＫＢ８４３はピ
ースＢＶＣｐＢＲ３２２からの複製開始点、およびαｒ
ｒｔｐＲを含んでいる。従って、アンピシリン耐性の存
在は染色体外プラスミドｐＫＢ８４３がその複製開始点
とともに存在することを示唆する。

プラスミドｐＫＢ８４３は、第二の選別ＯｆＥ表現型（
テトラサイクリン耐性）をコードする遺伝子も含む。こ
の遺伝子はピースＢＫより二つの不活性なフラグメント
に分割されている。複製開始点が削除され、生じたベク
ターが組み込まれると、二つのフラグメントは接合して
機能性ｔｅｔ　　遺伝子を生じ、こｎを用いて組み込み
体を複製開始点を保持するプラスミドを有する細胞と区
別することができる。後述する如く、切り離しを受けた
細胞を単離するためにｔｅｌ　　にたいして逆の選別を
するためにも１更用できる。

プラスミドｐＫＢ８４３は宿主染色体に組み込むべき配
列の挿入のため、適当な制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位をも有する；例えば、第４図のＥｃｏＲ（である。

ｐＫＢ８４３を製造するには、第４図に示す三つの別々
のセグメントを用６意し、前記７２アチスらの組換えＤ
ＮＡ操作技術を用いて、−緒に連結する。

ピースＡはｔｅｔ　　凍伝子の５′部分を含むセグメン
ト、例えば、ｐＢＥ３２２をＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ
Ｉで消化して得られる３　７５　ｂｐのフラグメントで
ある。

ピースＥｖ′１ｐＥＲ３２２の２．１．４ｋｂセグメン
トであり、Ｔｔｈｌｌｌ　（からＥｃｏＲｒまでの領域
を含み、そして復製開始点々らびにアンピンリ７耐注遺
伝子また；よ類似の機能を有するＤＮＡ’セグメントを
有する。このセグメントはＥｃｏＲｌおよびＴｔｈｌｌ
ｌ　Ｉで消化することによって得られ、セグメントの末
端はリンカ−により、まずＫｐｎｌ末端に、次いでｆ３
ａｍＨＩ末端へと変換される。

ピースＣはｔｅｌ　　遺伝子の３′部分に隣接するＢａ
ｍＨ（部位を■する任意の適当な領域であり、ピースＡ
の５′部位を補って機能的ｔｅｔＲ遺伝子を生じる。ｐ
ＢＲ３２２の適当なフラグメントまたは前駆体例えば、
リンカ−によりＨ７）α「部位をＥｃｏＲＩＶＣＫ換し
たｐＭＥ９　ＣＡＴＣＣ３７０１９］のＢａｍＨ［カら
ＨｐａＩのフラグメントが使用できる。

プラスミドｐＫＢ７０１およびｐＫＢ８４　、ｌｊ：大
腸菌ＹＭＣ９中でアメリカン　ティシュ−タイプ　カル
チャー・　コレクショ／にそれぞれ寄託番号３９７７２
および５３１８１として寄託されている。これらの寄託
期間は３７　　ＣＦＲｌ、１４の下に寄託機関に認めら
れた者に分譲が許され、特許の取得と同時に公衆の入手
〇Ｔ詣注に対する寄託微生物の全ての制限は最終的に除
去される。出願人および承継者は寄託をブタペスト条約
の要求に適合するよう移管する。

発明の効果 一般に前、躯体ベクターは次のようにして使用される；
第１図１αおよび１ｂにおいて、ＤＮＡ配列Ａを、複製
開始点ＲＯおよび抗生物質耐性を与えベクターを有する
細胞を識別するためのマーカーＭを有する前、実体ベク
ターに挿入する。前、駆体ヘの配列Ａの挿入は、前駆体
上に複製開始点を挾むいずれの部位も認識しない酵素に
よって認識される開裂部位が存在することにより可能と
なる。

配列Ａは染色体への組み込みのための配列Ａ′へと遺伝
子工学的に加工しつる任意の配列であってよく、例えば
、本来必要な蛋白質または所望生産物への経路内の反応
を触媒する酵素をコードする構造遺伝子とその遺伝子の
発現の適当な調節配列が一緒になったものでよい。配列
Ａはその各末端に側位領域を有し、配列Ａ′での置き換
えを目指す宿主染色体配列Ａｃの相当領域と相同であり
且つおなじ方向である。これら側位領域は組換え現象に
より配列Ａ′の染色体への組み込みを可能ならしめるに
充分長いことが必要である。具体的には、染色体への構
造Ａ′の導入の効率は相同側位傾頭のサイズが増力口す
るとともに高まる。

第１ｃ図において、ＤＮＡ配列は配列Ａの所望の変化を
あたえる遺伝子工学的加工によって配列Ａが変更配列Ａ
′に変わるよう遺伝子工学的に加工される。第Ｌｃ図に
おいて、変更配列Ａ′を含むベクターは、該ベクター上
に複製開始点ＲＯが存在することから、宿主細胞中で自
己複製でき、また安定に維持される。全ての段階におい
て、遺伝子工学的に処理されるベクター及び遺伝子は、
最終的にその染色体に変更を目指すものと同一のタイプ
の；細胞中に維持できる。

変更配列の宿主細胞の染色体への組み込みを達成するた
め、プラスミドを単離する。次いで複製開始点ＲＯを制
限エンドヌクレアーゼ消化により切り離しく第１ｄ図〕
、ＤＮＡの残部から分離し、残部をＤＮＡリガーゼで処
理して再び環状化する。

ベクターを宿主細胞に取り込ませてその甲でベクター／
′ｉ＋Ｉａ胞染色体の配列Ａｃ　　（こｎのためにベク
ターは遺伝子工学的に処理したコピーＡ′を有する）の
部分またはその近辺に組み込まｎる（第１ｅ図）。複＃
開始点を失った構造物のみが庸胞染色体に組み込まれる
。組み込みの結果生産された変更（Ａつ染色体と野性種
（Ａｃ）染色体の比率は、側位領域のサイズが全体的に
互いに等しいとぎに最大となる；なぜなら、この場合に
変更の各サイドでの組換え率を等しくすることに都合が
よいからである。

第１ｆ図において、交叉組換え現象が生じるときは変更
配列Ａ′は細胞染色体に存在し、天然配列Ａｃはベクタ
ーに存在する（第１ｇ図）。

特定ベクター（ｐＫＢ７１９）の構成および使用により
、染色体に存在する遺伝子の削除のための上記方法の使
用を説明する。第３図において、ｐｈｅＡ構造遺伝子を
含む全染色体配列を削除した大腸菌を得るため、大腸菌
ｐｈｅ　Ａ遺伝子をクローニングして使用した。ｐｈｅ
Ａ遺伝子の両サイドからの成分をＭするＤＮＡの小片を
構成した。一方のサイドとしてＥｃｏＲｉからＨｉｎｃ
ＩＩ　　までの領域を使用し、他方のサイドとしてＢａ
ｎ　ｌからＸｍｎ　■までの領域を使用した。これらの
領域を結合して、ｐｌ（Ｂ２Ｏ２のＥｃｏＲＩとＰｖｕ
１１部位の間にクローニングしてｐＫＢ７１９を得た。

ｐＫＢ７１９ｆＫｐｎｌで消化し、得られたフラグメン
トをポリアクリルアミド　ゲル電気泳動で分離した。遺
伝子工学的に処理したｐｈｅ　Ａ削除物を有する大きい
フラグメントをＤＮＡリガーゼを用いて環状化し、大腸
菌ストンＹＭＣ９ＣＡＴＣＣ３３９２７）に形質転換し
た。アンピシリン耐性形質転換体を選別した。こｎはｐ
ＢＲ３２２によるＹＭＣ９の形質転換よりも１００ない
し１０００倍低い１ｉｔｊ率で起こった。形質転換体に
ついてプラスミドＤＮＡの存在を分析した。調製された
ＤＮＡフラグメ／トにもとのフラグメントまたは不完全
に消化されたｐＫＢ７１９が混在するときは、形質転換
体の成るものはｐＫＢ７１９と同一のプラスミドを有す
るであろう。ｐＫＥ７１９形ｐＪ　Ｉｒ換体の回収の頻
度は、環状化ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｄｅｌ
（これｔｆｉ複製開始点フラグメ／トを有するＤＮＡ分
子を直線化する）で処理すると急激に減少する。プラス
ミドの存在が検出されなかった数種のアンピシリン耐性
単離物が同定され、これらの単離物のカルチャーについ
てサイクロセリン増強によりフェニルアラニン　オート
トロフ（変異体）を増やした。このようなフェニルアラ
ニンオートトロフは同時にアンピンリン耐性を消失して
おり、これらがａＬｆ図Ｋｍ説した機構により発生した
ことを示唆している。

ｐＫＢ７１９と同じプラスミドを有する形質転換体また
は複製ＯＴ能染色体外要素の上にαｍｐＲ選別マーカー
を有する他のプラスミドを有する形質転換体の存在に関
する上記問題は、ｐＫＢ８４３由来のプラスミドを使用
することにより、所望現象を受けた微生物の選別機構の
改善のため、解消される。ｐＫＥ８４３に所望の染色体
−挿入フラグメントを挿入したのち、そして上記のよう
にして復′＃、開始点が削除されたのち、生じたプラス
ミドを宿主微生物に挿入し、テトラサイクリ／耐性形質
転換体を選別する。ｔｅｔ　　のシフグル　コピーを有
する。訓胞のために適当なテトラサイクリンの量を便用
するが、最も好ましくは約３μｍμである。

ｃＬｒｒＬｐ　　マーカーの使用は、選別された形質転
換体が組み込みｔｅｌ　　遺伝子により特徴ずけられ、
復製能力のあるプラスミド上のｔｅｔ　　遺伝子により
特徴ずけられるものでないことを確実にするためである
（元のフラグメントが複製不活性フラグメントの二つに
結合して、ｌｅｔ　　遺伝子を有する複製能力のあるプ
ラスミドを生じることが稀にありうる）。

最後にテトラサイタリン耐性クローンから、サブクロー
ンとして、テトラサイクリン遺伝子の切り離しを受けそ
のため元の染色体の相同部分（第５図のＡｃ）の所望の
切り離しもまた生じているもの、或いは例えば、ｐＫＢ
８４３に由来する相同セグメントＡ′の不所望な切り離
しを受けているものを選別することができる。ｔｅｔ　
　にだいする選別は例えば、ボフナー（Ｂｏｃｈｎｅｒ
）ら（１９８０）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ’ｌ　　
１４３　：　９２６−９３３に開示されている一般的方
法により行いつる。

所望の切り離しをうけた細胞に非常に富む集団を選別す
ることにより、そのような細胞の同定が非常に容易にな
り、例えば、切り離しの結果出現した表現型性質をスク
リーニングまたは選別することができ、或いは全細胞Ｄ
ＮＡの制限工／ドヌクレアーゼ消化の後サザン　プロッ
ト分析のような正確なきめう構造を示す単純なスクリー
ニングによることもできる。

第５図はｐＫＢ８４３のような前１−ｇ体をペースとし
切り離し可能な復製決定ＤＮＡセグメント（第５図のＲ
Ｏ）によって二つの部分（第５図の夫々ＭＬおよびＭＲ
）に分断されている第一マーカー遺伝子を有するベクタ
ーの使用を一般的に説明するものである。複製−決定セ
グメントは第二マーカー遺伝子、Ｍ２　　も有する。他
の観点において、ラベルは第５図の第１図について上記
したものと同様である。工程は同様であるが、但し、ｐ
ＫＥ８４３について前記した選択操作は例えば、工程５
ｆにおいてＭ２　の不存在およびＭＬＲの存在の決定の
ためにおこなわれ、工程５んでＭＬＨにたいして選別を
行なった。

更なる態様は特許請求の範囲に記載する。例えば、本発
明方法は任意蛋白質の生産をコードする遺伝子工学的遺
伝子の挿入に使用出来る。

【図面の簡単な説明】

第１α図ないし第１ｈ図は、遺伝子工学的に処理した遺
伝子をバクテリア細胞の染色体ＤＮＡ中に導入する方法
の工程の流れ図であり、ベクターＤＮＡと染色体ＤＮＡ
上の′訓限工／ドヌクレアーゼ部位を示しており、 第２図はベクターｐＫＥ７０１の模式図であり、その制
限工／ドヌクレアーゼ部位を示しており、第３図ば′ｐ
ＫＢ７１９の構造を示す模式図であり、 第４図はｐＫＢ８４３の構造を示す模式図であり、 第５α図ないし第５ｈ図は、遺伝子工学的に処理した遺
伝子をバクテリア細胞の染色体中に導入する別法の工程
の流れ図である。 １丁丁 代　　理　　人　　弁理士　　　湯　　浅　　恭　　三
“、−：ｆ（外５名） 図面の浄吉（内容に変更なし） Ａ１ ＩＧ　４ 手　　続　　補　　正　　書 昭和６ρ年／ρ月　２日 特許庁斗官　宇　賀　道　部数　　　　　い１事件の表
示 昭和６θ年特許願第１り０２６７　号 ２、発明の名称 ８立ケニ５六べ２／− ６補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 ２　喜　　ｌ：’＋λテフ？−ｐ・イン７一−ｒシ７丁
、し・イ、コーポし−フ７Ｆ゛４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）複製−特異的配列； 前記複製−特異的配列の一末端に隣接し、制限エンドヌ
   クレアーゼにより認識される第一開裂部位； 前記複製−特異的配列の他の末端に隣接し、制限エンド
   ヌクレアーゼにより認識される第二開裂部位； 前記第一及び第二部位は前記ベクター上において前記第
   一もしくは第二開裂部位を認識する制限エンドヌクレア
   ーゼにより認識される唯一の部位であり； バクテリア細胞の染色体に組み込ませる遺伝子工学的に
   処理したＤＮＡ配列；および 前記遺伝子工学的に処理した配列を有するバクテリア細
   胞を検出する手段； よりなり、前記ベクターはバクテリア細胞中で前記遺伝
   子工学的に処理した配列の安定な維持および自己複製が
   可能であり、そして前記複製−特異的配列の切断によつ
   て、前記ベクターが安定に維持されうる細胞とおなじタ
   イプのバクテリア細胞の染色体中に、前記遺伝子工学的
   に処理した配列は組み込まれ、そして該遺伝子工学的に
   処理した配列は次いで前記染色体の一部として複製可能
   である； ことを特徴とするベクター。 （２）前記第一開裂部位を認識する制限エンドヌクレア
   ーゼが前記第二開裂部位を認識する制限エンドヌクレア
   ーゼと同じものである特許請求の範囲第１項記載のベク
   ター。 （３）前記検出手段が、抗生物質にたいする耐性を付与
   する遺伝子である特許請求の範囲第１項記載のベクター
   。 （４）ベクターが複製可能なバクテリア細胞が大腸菌で
   ある特許請求の範囲第１項記載のベクター。 （５）複製−特異的配列がｐＢＲ３２２の複製開始部で
   ある特許請求の範囲第４項記載のベクター。 （６）前記遺伝子工学的に処理した配列がその一方の末
   端に第一側位ＤＮＡ配列および他方の末端に第二側位Ｄ
   ＮＡ配列を有し、前記バクテリア染色体が置き換えられ
   るべきＤＮＡ配列を含み、該置き換えられるべきＤＮＡ
   配列は、その一方の末端に前記第一側位ＤＮＡ配列と相
   同の配列を有しその他方の末端に前記第二側位ＤＮＡ配
   列と相同であるＤＮＡ配列を有する、特許請求の範囲第
   １項記載のベクター。 （７）置き換えられるべき染色体配列が蛋白質の発現を
   コードする遺伝子を含み、遺伝子工学的に処理した配列
   が前記染色体遺伝子から遺伝子工学的に処理した遺伝子
   を含む、特許請求の範囲第６項記載のベクター。 （８）置き換えられるべき染色体配列が一部の側に相同
   染色体配列が側位し他方の側に第二相同染色体配列が側
   位した遺伝子を含み、遺伝子工学的に処理した遺伝子が
   実質的に前記第一および第二側位配列よりなる特許請求
   の範囲第６項記載のベクター。 （９）遺伝子工学的に処理した配列が製造目的蛋白質を
   コードする構造遺伝子を含む特許請求の範囲第１項記載
   のベクター。 （１０）ベクターが、第一制限開裂部位と第二制限開裂
   部位との間に複製−特異的配列の存在をマークするため
   の選別可能表現特性をコードするマーカーを有する、特
   許請求の範囲第１項記載のベクタ（１１）ベクターが選
   別可能な表現特性をコードするマーカー遺伝子を含み、
   該遺伝子は第一及び第二制限開裂部位の間のベクターの
   部分によつて二つの非機能性フラグメントに分割されて
   おり、該遺伝子は前記部分が切り離されたとき発現され
   る特許請求の範囲第１項記載のベクター。 （１２）表現特性が、その存在または不存在に関して選
   別される特許請求の範囲第１０項または第１１項記載の
   ベクター。 （１３）表現特性がテトラサイクリン耐性である特許請
   求の範囲第１２項記載のベクター。 （１４）表現特性がアンピシリン耐性である特許請求の
   範囲第１０項または第１１項記載のベクター。 （１５）ベクターがｐＫＢ７０１、ＡＴＣＣ寄託番号Ｎ
   ｏ．３９７７２、またはｐＫＢ８４３、ＡＴＣＣ寄託番
   号Ｎｏ．５３１８１、に由来する特許請求の範囲第１項
   記載のベクター。 （１６）［１］第一バクテリア細胞中で、特許請求の範
   囲第１項記載のベクタ−上に遺伝子工学的に処理したＤ
   ＮＡを維持し、 ［２］該ベクターを制限エンドヌクレアーゼにさらし、
   そして複製−特異的配列を含むＤＮＡセグメントを除去
   し、 ［３］残存ＤＮＡを再環化し、 ［４］前記第一細胞と同タイプの第二バクテリア細胞を
   前記再環化した残存ＤＮＡで形質転換し、組換えにより
   前記遺伝子工学的に処理したＤＮＡを該細胞の染色体中
   に導入し、染色体ＤＮＡの目的セグメントを置き換え、
   そして ［５］遺伝子工学的に処理したＤＮＡが染色体中に組み
   込まれた形質転換細胞の子孫を同定する、ことよりなる
   人工的に遺伝子工学的に処理したＤＮＡをバクテリア細
   胞の染色体中に導入し、染色体ＤＮＡのセグメントを置
   き換える方法。 （１７）遺伝子工学的に処理されたＤＮＡの人工的遺伝
   子工学的処理の少なくとも一部は第一バクテリア細胞中
   で行われる特許請求の範囲第１６項記載の方法。 （１８）形質転換バクテリア細胞子孫が、ベクターの存
   在により与えられた抗生物質耐性により同定される特許
   請求の範囲第１６項記載の方法。 （１９）バクテリア細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種の
   ものである特許請求の範囲第１６項記載の方法。 （２０）［１］自然状態では一部が削除すべき遺伝子の
   直ぐ５′側に存在し、他方が通常該遺伝子の３′側に存
   在する二つに分離したＤＮＡ配列を正しい順序に連結し
   て雑種ＤＮＡ分子を形成することにより、遺伝子工学的
   に処理したＤＮＡを形成し、 ［２］前記雑種ＤＮＡ分子を、複製に必要なＤＮＡ配列
   を容易に切り離しうるベクター中へ挿入し、［３］前記
   複製に必要な配列をベクターから切り離して残存ＤＮＡ
   を再環化させ、 ［４］バクテリア細胞を前記環化残存ＤＮＡで形質転換
   し、該雑種ＤＮＡ分子を該細胞の染色体中に組み込みに
   より導入し、これにより前記染色体に存在する遺伝子を
   置き換え、そして ［５］置き換えられた遺伝子の代わりに、細胞染色体中
   に前記雑種ＤＮＡ分子が組み込まれた前記細胞の子孫を
   同定する、 ことにより、バクテリア細胞から染色体上に存在する遺
   伝子を特異的に削除する特許請求の範囲第１６項記載の
   方法。 （２１）ベクター上の遺伝子工学的に処理した配列が蛋
   白質をコードする構造配列を有し、そして該蛋白質を得
   るため第二バクテリア細胞またはその子孫を培養するこ
   とにより、所望蛋白質を製造するための特許請求の範囲
   第１６項記載の方法。 （２２）複製−特異的配列； 前記複製−特異的配列の一つの末端に隣接し、制限エン
   ドヌクレアーゼにより認識される第一開裂部位； 前記複製−特異的配列の他の末端に隣接し、制限エンド
   ヌクレアーゼにより認識される第二開裂部位；および 前記複製−特異的配列の外側に存在し前記第一または第
   二開裂部位を認識しない第三の制限エンドヌクレアーゼ
   により認識される少なくとも一つの開裂部位；よりなり
   、 前記第一および第二開裂部位はベクター上において該第
   一または第二開裂部位を認識する制限エンドヌクレアー
   ゼにより認識される唯一の部位である； ことよりなる特許請求の範囲第１項記載のベクターのた
   めの前駆体ベクター。 （２３）ｐＫＢ７０１、ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．３９７
   ７２、ｐＫＢ８４３、ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．５３１８
   １またはそれらの誘導体である特許請求の範囲第２２項
   記載のベクター。