JPS6181800A - 核酸の再結合をより速く生起させる方法 - Google Patents
核酸の再結合をより速く生起させる方法Info
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- JPS6181800A JPS6181800A JP60146443A JP14644385A JPS6181800A JP S6181800 A JPS6181800 A JP S6181800A JP 60146443 A JP60146443 A JP 60146443A JP 14644385 A JP14644385 A JP 14644385A JP S6181800 A JPS6181800 A JP S6181800A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は１本鎖核酸分子を再生、再結合又はハイブリッ
ド形成反応させて２本鎖核酸分子を得る方法に係る。本
発明の方法は６０℃の０．１２Ｍリン酸緩衝液という標
準参考条件下での反応速度より遥かに速い速度で反応を
生起せしめる。より特定的には本発明はＤＮＡ−ＤＮＡ
、ｐ、ＮＡ−ＤＮＡ・及びＲＮＡ−ＲＮＡ反応を含み
、反応速度が標準参考栄件Ｚ （５ｔｘｎｄａｒｄ ｒ
ｅｔｅｒｅｎｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ）下での速度
の５０からｉｏｏ倍に及び且つ数千倍にも達し得るよう
な核酸の再生、再結合又はハイブリッド形成に係る。こ
のよ５な反応速度の大幅な上昇は核酸沈降剤（ｎｕｃｌ
ａｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔ −１ｎｇ
ａｇｅｎｔｓ ）含π反応溶液の使用によって実現され
る。
ド形成反応させて２本鎖核酸分子を得る方法に係る。本
発明の方法は６０℃の０．１２Ｍリン酸緩衝液という標
準参考条件下での反応速度より遥かに速い速度で反応を
生起せしめる。より特定的には本発明はＤＮＡ−ＤＮＡ
、ｐ、ＮＡ−ＤＮＡ・及びＲＮＡ−ＲＮＡ反応を含み
、反応速度が標準参考栄件Ｚ （５ｔｘｎｄａｒｄ ｒ
ｅｔｅｒｅｎｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ）下での速度
の５０からｉｏｏ倍に及び且つ数千倍にも達し得るよう
な核酸の再生、再結合又はハイブリッド形成に係る。こ
のよ５な反応速度の大幅な上昇は核酸沈降剤（ｎｕｃｌ
ａｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔ −１ｎｇ
ａｇｅｎｔｓ ）含π反応溶液の使用によって実現され
る。
先行技術の説明
当分野では１本鎖核酸分子を互に密集
（ｎｕｃｌｓａｔｉｏｎ ）させて２本鎖核酸分子を形
成する方法シエ多数知られており、広範囲に亘る生体の
遺伝物質を分析する上で有用な手段であると認められて
いる。一般的には、これら密集反応（ｎｕｃｌｅａｔｉ
ｏｎ ） ｓ再生、再結合及び７％イブリッド形成は、
相補的塩基配列ブロック又はセグメントをもつ１本−核
酸分子かこれら相補的配列間で塩基対合構造を形成し且
つ巻き戻し二重螺旋を構成する性向をもつという事実に
基礎をおく。１本鎖核酸分子相互間の相補的配列の程度
が大きい程所与の分子対が密集し℃２２本鎖子又は二重
分子を形成する性向が増大する。
成する方法シエ多数知られており、広範囲に亘る生体の
遺伝物質を分析する上で有用な手段であると認められて
いる。一般的には、これら密集反応（ｎｕｃｌｅａｔｉ
ｏｎ ） ｓ再生、再結合及び７％イブリッド形成は、
相補的塩基配列ブロック又はセグメントをもつ１本−核
酸分子かこれら相補的配列間で塩基対合構造を形成し且
つ巻き戻し二重螺旋を構成する性向をもつという事実に
基礎をおく。１本鎖核酸分子相互間の相補的配列の程度
が大きい程所与の分子対が密集し℃２２本鎖子又は二重
分子を形成する性向が増大する。
再生、再結合及びハイブリッド形成ＳＳ １本鎖核酸分
子相互間における反応であって本質的には互に同等であ
る。従って本明細書ではこれらの反応を互換的なものと
して説明する。但し、次のような区別を念頭に置くこと
は関連技術を理解する上で一助になるであろう。再生（
ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ）なる語は通常、本来互に
塩基対合していたものが変性プロセスを通して分離した
ために生じる２つの１本鎖分子から１つの２本鎖核酸分
子を形成する場合に使用される。再結合（ｒｓａ５ｓｏ
ｃｌａｔｉｏｎ ）は通常異なる元の分子からの２つの
１本鎖分子の間で２本鎖核酸分子を形成するような方法
を指す。
子相互間における反応であって本質的には互に同等であ
る。従って本明細書ではこれらの反応を互換的なものと
して説明する。但し、次のような区別を念頭に置くこと
は関連技術を理解する上で一助になるであろう。再生（
ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ）なる語は通常、本来互に
塩基対合していたものが変性プロセスを通して分離した
ために生じる２つの１本鎖分子から１つの２本鎖核酸分
子を形成する場合に使用される。再結合（ｒｓａ５ｓｏ
ｃｌａｔｉｏｎ ）は通常異なる元の分子からの２つの
１本鎖分子の間で２本鎖核酸分子を形成するような方法
を指す。
ハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ）は
互に別個の起源をもつ１本鎖核酸分子からの２本鎖核酸
分子の形成を意味する。但しこれらは明確に区別される
わけではなく、互に重なり合う部分がかなりある・例え
はＤＮＡ、−ＤＮＡ反応は通常再結合ともハイブリッド
形成とも呼ばれる。一方、ＲＮＡ−ＲＮＡＺ本鎖分核酸
形成は一般にハイブリッド形成と称される。
互に別個の起源をもつ１本鎖核酸分子からの２本鎖核酸
分子の形成を意味する。但しこれらは明確に区別される
わけではなく、互に重なり合う部分がかなりある・例え
はＤＮＡ、−ＤＮＡ反応は通常再結合ともハイブリッド
形成とも呼ばれる。一方、ＲＮＡ−ＲＮＡＺ本鎖分核酸
形成は一般にハイブリッド形成と称される。
これらの反応の速度論（ｋｉｎｅｔｉｃｓ ）は当業者
には次の如き二次反応速度論として艮（理解されている
。即ち１本鎖核酸分子の濃度が増大すると反応速度も増
大する。逆に１本鎖核酸反応体の濃度を低減させると反
応速度が低下し、従って２本鎖核酸分子の形成を生起さ
せるに必要な時間が増大する。
には次の如き二次反応速度論として艮（理解されている
。即ち１本鎖核酸分子の濃度が増大すると反応速度も増
大する。逆に１本鎖核酸反応体の濃度を低減させると反
応速度が低下し、従って２本鎖核酸分子の形成を生起さ
せるに必要な時間が増大する。
反応速度に対する温度の影響も当業者には良く知られて
いる。反応の温度がＴｍ（５０％の２本鎖分子が変性す
る時の温度であって「融解温度」とも称する）を下回る
と、その反応はでｍより約１５°Ｃ〜３００（、低い温
度で最大速度を示す。温度を更に工げると速度シエこの
最大速度より退くなることが知られている。
いる。反応の温度がＴｍ（５０％の２本鎖分子が変性す
る時の温度であって「融解温度」とも称する）を下回る
と、その反応はでｍより約１５°Ｃ〜３００（、低い温
度で最大速度を示す。温度を更に工げると速度シエこの
最大速度より退くなることが知られている。
これら反応の速度論に関しては更に、反応速度がＮ ａ
Ｃｇの如き電解質の場合に０．４Ｍより低いイオン強
度には大きく依存し、このイオン強度を越える塩ｎ度に
は殆んど左右されないことも知られている。
Ｃｇの如き電解質の場合に０．４Ｍより低いイオン強
度には大きく依存し、このイオン強度を越える塩ｎ度に
は殆んど左右されないことも知られている。
これら核酸結合反応の速度論及び反応速度に関する詳細
な情報については下記の文献を参照されたい。
な情報については下記の文献を参照されたい。
アール・ウエト？ −（Ｗｅｔｍｕｒ 、 Ｒ，）及び
エヌ・デイビドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｌ Ｎ、 ）
１モルフ・バイ３４９： アール・フェトマー、バイオポリマー（Ｂ１０−ｐｏＬ
ｙｍｅｒｓ ） １４ （１！１７５年）、２５１７：
アール・ジエー・プリラテン（Ｂｒ１ｔｔｓｎ Ｆ、
ＩＪ、）ディー・グレイアム（Ｏｒαｈａｍ、Ｄ、）及
びピー・＝ニーフェルト（Ｎｅｕｆｅｌｄ ｒ Ｂ、
） 、酵素学的方法（ＭｅｔｈｏｄＳＥｎｚｙｍｏｌ、
） ２９ （１９７４年）。
エヌ・デイビドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｌ Ｎ、 ）
１モルフ・バイ３４９： アール・フェトマー、バイオポリマー（Ｂ１０−ｐｏＬ
ｙｍｅｒｓ ） １４ （１！１７５年）、２５１７：
アール・ジエー・プリラテン（Ｂｒ１ｔｔｓｎ Ｆ、
ＩＪ、）ディー・グレイアム（Ｏｒαｈａｍ、Ｄ、）及
びピー・＝ニーフェルト（Ｎｅｕｆｅｌｄ ｒ Ｂ、
） 、酵素学的方法（ＭｅｔｈｏｄＳＥｎｚｙｍｏｌ、
） ２９ （１９７４年）。
３６３；
ディー・イー・コーン（ＫＯｈｎｅ ｌ Ｄ、Ｅ、 ）
、ニス自ニー・リーバイソｙ （Ｌｅｖｉｓｏｎ 、
８．Ａ、 ）及びエム営ジエーーバイヤーズ（Ｂｙｓｒ
ｓ ＋ Ｍ、Ｊ、 ）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｏｍｉｓｔｒ １６（１９７７年）、５３２９； ジエー嗜工Ａ−オロツ（０ｒｏｓｚ ＊ Ｊ、Ｍ、 ）
及びジエー・ジー・ウエトマ−（ｗ＠ｔｍｕｒ ｌ Ｊ
、Ｇ 、）、バイオポリ−ｙ −（Ｂｉｏｐｏｌｙｍ
ｅｒ） １６ （１９７７年）、１１８ａｌｌ 当業界で蚤工かなり以前からこれら公知の核酸結合技術
の有用性の主な限界が反応の基本速度（ｂａｓｉｃ ｒ
ａｔｅ ）にあることが認識されていた。
、ニス自ニー・リーバイソｙ （Ｌｅｖｉｓｏｎ 、
８．Ａ、 ）及びエム営ジエーーバイヤーズ（Ｂｙｓｒ
ｓ ＋ Ｍ、Ｊ、 ）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｏｍｉｓｔｒ １６（１９７７年）、５３２９； ジエー嗜工Ａ−オロツ（０ｒｏｓｚ ＊ Ｊ、Ｍ、 ）
及びジエー・ジー・ウエトマ−（ｗ＠ｔｍｕｒ ｌ Ｊ
、Ｇ 、）、バイオポリ−ｙ −（Ｂｉｏｐｏｌｙｍ
ｅｒ） １６ （１９７７年）、１１８ａｌｌ 当業界で蚤工かなり以前からこれら公知の核酸結合技術
の有用性の主な限界が反応の基本速度（ｂａｓｉｃ ｒ
ａｔｅ ）にあることが認識されていた。
数時間から数十時間、更にを工数日間にさえ及ぶ反応時
間は普通のことなのである。反応に使用する１本鎖核酸
分子を増量することによって（二次反応速度論に基づき
）反応速度を促進させることは、以下の３つの理由から
この問題の解決法としては望ましくない。第１に、反応
における標的１本鎖核酸は通常生理学的試料から抽出さ
れ、七のため前記核酸の使用可能量がこれら試料の細胞
に含まれている量で必然的に限定される。第２に、核酸
反応体の使用はかなりのコスト高につながり、そのため
反応体を増量することの実質的有用性が制限される。第
３に、１本鎖核酸分子を増１）するとパックグラウンド
ノイズ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｎｏｉｓｅ ）が増加
するため反応の感度が低下する。それでも尚、これら反
応の基本速度を５〜５０倍又はそれ以上に増大させるべ
く多（の技術が開発されてきた。基本速度を１０００倍
又はそれ以上のオーダーで増加させるような適用性の限
られた技術も開発された。しかしながら後述の如くこれ
ら先行技術にはＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲ
ＮＡ−ＲＮｋ反応に使用し得る単相系で標準参考反応速
度を５０−１００倍又はそれ以上の割合で大幅に上回る
ような反応速度を実現せしめたものは１つもない。
間は普通のことなのである。反応に使用する１本鎖核酸
分子を増量することによって（二次反応速度論に基づき
）反応速度を促進させることは、以下の３つの理由から
この問題の解決法としては望ましくない。第１に、反応
における標的１本鎖核酸は通常生理学的試料から抽出さ
れ、七のため前記核酸の使用可能量がこれら試料の細胞
に含まれている量で必然的に限定される。第２に、核酸
反応体の使用はかなりのコスト高につながり、そのため
反応体を増量することの実質的有用性が制限される。第
３に、１本鎖核酸分子を増１）するとパックグラウンド
ノイズ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｎｏｉｓｅ ）が増加
するため反応の感度が低下する。それでも尚、これら反
応の基本速度を５〜５０倍又はそれ以上に増大させるべ
く多（の技術が開発されてきた。基本速度を１０００倍
又はそれ以上のオーダーで増加させるような適用性の限
られた技術も開発された。しかしながら後述の如くこれ
ら先行技術にはＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲ
ＮＡ−ＲＮｋ反応に使用し得る単相系で標準参考反応速
度を５０−１００倍又はそれ以上の割合で大幅に上回る
ような反応速度を実現せしめたものは１つもない。
反応速度を取り扱うにあたり、これら反応速度の比較に
使用される標準参考条件は６０°Ｃの０．１２Ｍリン酸
緩衝（ｐ Ｂ ）水溶液である。同程度の反応速度が得
られる類似の標準参考条件として６０℃の０．１８ Ｍ
ＮａＣ６もしはしは使用される。
使用される標準参考条件は６０°Ｃの０．１２Ｍリン酸
緩衝（ｐ Ｂ ）水溶液である。同程度の反応速度が得
られる類似の標準参考条件として６０℃の０．１８ Ｍ
ＮａＣ６もしはしは使用される。
反応速度をの準参考条件下での速度より速くするための
極めて一般的な方法は反応溶液の塩濃度をａ＊参考条件
のそれより高くすることであった。
極めて一般的な方法は反応溶液の塩濃度をａ＊参考条件
のそれより高くすることであった。
次表に示すように、多（の研究が反応溶液の塩濃度を標
準参考条件の濃度よりかなり高（することで反応速度を
標準参考条件における速度の１０倍又はそれ以上のオー
ダーで増加させることに成功している。しかしなからこ
の表から明らかなように、これら先行技術方法では塩の
度の増加によって反応速度がかなり増加するものの塩０
度が２Ｍを越えるとその増加率が横ばいになり又は減少
しさえする。
準参考条件の濃度よりかなり高（することで反応速度を
標準参考条件における速度の１０倍又はそれ以上のオー
ダーで増加させることに成功している。しかしなからこ
の表から明らかなように、これら先行技術方法では塩の
度の増加によって反応速度がかなり増加するものの塩０
度が２Ｍを越えるとその増加率が横ばいになり又は減少
しさえする。
（以下余日）
表 Ｉ
２厘（ｔｊ口り乙△
０．７Ｍ ５．３表１のデー
タはＤＮＡ−ＤＮＡ反応に関して観察された速度増加に
係るが、ＲＮＡ−ＤＮＡの場合には反応速度は塩濃度変
化の影響をさほど受げないと報告されている。他の研究
者等は、塩濃度Ｙ：標準参考濃度より高くするとＲＮＡ
−ＤＮＡ反応の相対速度は使用するＲＮＡの二次構造が
比較的少なければＤＮＡ−ＤＮＡ反応の場合の約局まで
の影響を受けることを立証した。二次構造のより多いＲ
ＮＡ反応体の場合は塩濃度増加の影響が更に／ｈさいこ
とか判明した。実際、過剰ＲＮＡ及びＤＮＡ間のハイブ
リッド形成の場合にはかなりの塩の度範囲に亘って反応
速度変化が全（見られない（例ぇはジエーーバンネス（
Ｖａｎ Ｎ＠１６ｓｌＪ、）及びダブル・イー・バーン
（）！ａｈｎ、ＷＪ、）、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａ
ｃ１ｃｉｓ、Ｒｅｓ、） １０ （１９８２年）、８０
６１参照）。ＤＮＡが過剰反応体である場合のＲＮＡ−
ＤＮＡハイブリッド形成に関してはデータが殆んどない
が、当業者は一般にこのような反応系に対する塩濃度増
加の影響１＄ ＲＮ Ａが過剰である時と同８慶であろ
うと考えている。
タはＤＮＡ−ＤＮＡ反応に関して観察された速度増加に
係るが、ＲＮＡ−ＤＮＡの場合には反応速度は塩濃度変
化の影響をさほど受げないと報告されている。他の研究
者等は、塩濃度Ｙ：標準参考濃度より高くするとＲＮＡ
−ＤＮＡ反応の相対速度は使用するＲＮＡの二次構造が
比較的少なければＤＮＡ−ＤＮＡ反応の場合の約局まで
の影響を受けることを立証した。二次構造のより多いＲ
ＮＡ反応体の場合は塩濃度増加の影響が更に／ｈさいこ
とか判明した。実際、過剰ＲＮＡ及びＤＮＡ間のハイブ
リッド形成の場合にはかなりの塩の度範囲に亘って反応
速度変化が全（見られない（例ぇはジエーーバンネス（
Ｖａｎ Ｎ＠１６ｓｌＪ、）及びダブル・イー・バーン
（）！ａｈｎ、ＷＪ、）、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａ
ｃ１ｃｉｓ、Ｒｅｓ、） １０ （１９８２年）、８０
６１参照）。ＤＮＡが過剰反応体である場合のＲＮＡ−
ＤＮＡハイブリッド形成に関してはデータが殆んどない
が、当業者は一般にこのような反応系に対する塩濃度増
加の影響１＄ ＲＮ Ａが過剰である時と同８慶であろ
うと考えている。
これら核酸の結合反応速度を増加させる別の方法として
は、ＤＮＡをＤＮＡと再結合させるために開発された二
相フェノール水溶性乳濁液法が挙げられる（ディー・イ
ー・コーン（ＫＯｈｎｓ 、Ｄ、Ｅ、 ）、ニス・ニー
・レビンンン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ＋Ｓ、Ａ、）及びエム
・シエー・バイヤーズ著バイオケミストＩＪ −（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） １６ （１９７７年）、５
３２９）この二相系では、フェノールと水溶性塩溶液と
で形成した乳？′３液を攪拌すると反応速度が比較の対
象たる標準条件下での速度の１００倍以上に達する程犬
幅に増加した。しかしながらこの二相フェノール水溶性
乳濁液法はＲＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＤＮＡ系の場合
には反応速度をそれ程大幅には増加せしめなかった。Ｒ
ＮＡ−ＲＮＡ及びＦＩＩＪＡ−ＤＮＡ反応に関して観察
される反応速度増加の最大値は標準参考条件下での値の
５０〜１００倍にすぎない＠この方法は更に、乳濁液を
形成して攪拌しない限り且つ反応温度が７５℃以下でな
い限り反応か生起しないという欠点を有する。
は、ＤＮＡをＤＮＡと再結合させるために開発された二
相フェノール水溶性乳濁液法が挙げられる（ディー・イ
ー・コーン（ＫＯｈｎｓ 、Ｄ、Ｅ、 ）、ニス・ニー
・レビンンン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ＋Ｓ、Ａ、）及びエム
・シエー・バイヤーズ著バイオケミストＩＪ −（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） １６ （１９７７年）、５
３２９）この二相系では、フェノールと水溶性塩溶液と
で形成した乳？′３液を攪拌すると反応速度が比較の対
象たる標準条件下での速度の１００倍以上に達する程犬
幅に増加した。しかしながらこの二相フェノール水溶性
乳濁液法はＲＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＤＮＡ系の場合
には反応速度をそれ程大幅には増加せしめなかった。Ｒ
ＮＡ−ＲＮＡ及びＦＩＩＪＡ−ＤＮＡ反応に関して観察
される反応速度増加の最大値は標準参考条件下での値の
５０〜１００倍にすぎない＠この方法は更に、乳濁液を
形成して攪拌しない限り且つ反応温度が７５℃以下でな
い限り反応か生起しないという欠点を有する。
反応速度な標準参考条件下での速度の１０倍のオーダー
に増大させるだめの他の多（の方法では、反応速度増加
促進のために体積排除原理（Ｖｏｌｕｍ＠ｅｘｃｌｕｓ
ｉｏｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌＡ）か使用されてきた。これ
は合成ポリマーポリエチレングリコール、デキストラン
又は硫酸デキストランを用いて核酸反応体に使用し得る
反応溶液の体積を減少させ、それによって前記反応体の
有効濃度を増加させるという方法である。しかしながら
この石の方法では、ＤＮＡ−ＤＮＡ反応の場合には標準
参考条件下での速度の１０〜１５倍に及ぶ反応速度の増
加が報告されているのに対し、ＲＮＡ−ＤＮＡ反応の場
合には速度増加が約３倍でしかない。これらの技術の詳
細については下記の文献を参照されたい。
に増大させるだめの他の多（の方法では、反応速度増加
促進のために体積排除原理（Ｖｏｌｕｍ＠ｅｘｃｌｕｓ
ｉｏｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌＡ）か使用されてきた。これ
は合成ポリマーポリエチレングリコール、デキストラン
又は硫酸デキストランを用いて核酸反応体に使用し得る
反応溶液の体積を減少させ、それによって前記反応体の
有効濃度を増加させるという方法である。しかしながら
この石の方法では、ＤＮＡ−ＤＮＡ反応の場合には標準
参考条件下での速度の１０〜１５倍に及ぶ反応速度の増
加が報告されているのに対し、ＲＮＡ−ＤＮＡ反応の場
合には速度増加が約３倍でしかない。これらの技術の詳
細については下記の文献を参照されたい。
エムｅレンツ（Ｒｅｎｚ、Ｍ、） 及ヒシー・クルッ（
Ｋｕｒｚ、ｃ、 ）、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１
ｄａ Ｆｌｅｓ、）１２（１９８４年）、３４３５； ジー・エム−ワール（ｗａｈｌｇＧ、Ｍ、）、工Ａ−、
Ｘターン（５ｔｓｒｎ、Ｍ、）及びジー・アール・スタ
ークＵＳＡ）７６（１９７９年）、３６８３゜以上の理
由から本発明は、標準参考条件下での速度の１００倍又
はそれ以上のオーダーの大幅に増大した反応速度を実現
せしめ且つＤＮＡ−ＤＮＡ。
Ｋｕｒｚ、ｃ、 ）、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１
ｄａ Ｆｌｅｓ、）１２（１９８４年）、３４３５； ジー・エム−ワール（ｗａｈｌｇＧ、Ｍ、）、工Ａ−、
Ｘターン（５ｔｓｒｎ、Ｍ、）及びジー・アール・スタ
ークＵＳＡ）７６（１９７９年）、３６８３゜以上の理
由から本発明は、標準参考条件下での速度の１００倍又
はそれ以上のオーダーの大幅に増大した反応速度を実現
せしめ且つＤＮＡ−ＤＮＡ。
ＲＮＡ−ＤＮＡ及びＲＮＡ−ＢＮＡ反応系に使用し得る
ような核酸の再生、再結合又はハイブリッド形成方法を
提供することを主目的とする。本発明にまた、二相系の
使用又は乳濁液の形成な必要とセずに反応速度を激増さ
せるような方法を提供することも目的とづ−る。１本鎖
核酸反応体のの度ケ高めな（ても反応速度を激増させ得
るような方法を提供することも本発明の目的である。最
後に１本発明は更に、広範囲に亘る反応混合物体積及び
ハイブリッド形成温度に適応し得るような核酸再結合反
応速度増加法を提供することも目的とする。
ような核酸の再生、再結合又はハイブリッド形成方法を
提供することを主目的とする。本発明にまた、二相系の
使用又は乳濁液の形成な必要とセずに反応速度を激増さ
せるような方法を提供することも目的とづ−る。１本鎖
核酸反応体のの度ケ高めな（ても反応速度を激増させ得
るような方法を提供することも本発明の目的である。最
後に１本発明は更に、広範囲に亘る反応混合物体積及び
ハイブリッド形成温度に適応し得るような核酸再結合反
応速度増加法を提供することも目的とする。
発明の概要
一般的に言えば、本発明は少なくとも−穂の核酸沈降剤
を既知濃度で含む単相反応溶液を使用して反応速度を標
準参考条件下での反応速度より大幅に反応速度を速める
こと１０徴とする分離状１本鎖核酸分子からの２本鎖核
酸分子の形成法を実現することにより前述の諸目的を達
成する。本発明の改良された方法は広範囲の反応溶液量
及び核酸濃度に広（適用し得、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ
−ＤＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡ反応において反応速度を標
準参考条件下での反応速度の１００から１０００倍のオ
ーダーで増加させる。
を既知濃度で含む単相反応溶液を使用して反応速度を標
準参考条件下での反応速度より大幅に反応速度を速める
こと１０徴とする分離状１本鎖核酸分子からの２本鎖核
酸分子の形成法を実現することにより前述の諸目的を達
成する。本発明の改良された方法は広範囲の反応溶液量
及び核酸濃度に広（適用し得、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ
−ＤＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡ反応において反応速度を標
準参考条件下での反応速度の１００から１０００倍のオ
ーダーで増加させる。
より特定的には、本発明の方法は互に相補し合う１本鎖
核酸と既知濃度の少なくとも１８ｉの核酸沈降剤とを含
む反応水溶液なり４製するステップを含む。好ましくは
前記１本鎖核酸のうち少なくとも一方が検出可能マーカ
ーを有する。このようにして調整した反応水溶液はハイ
ブリッド形成が生起し得る温度でインキュベートし、次
いで２本鎖核酸分子の存在を確認すぺ（アッセイにかけ
る。
核酸と既知濃度の少なくとも１８ｉの核酸沈降剤とを含
む反応水溶液なり４製するステップを含む。好ましくは
前記１本鎖核酸のうち少なくとも一方が検出可能マーカ
ーを有する。このようにして調整した反応水溶液はハイ
ブリッド形成が生起し得る温度でインキュベートし、次
いで２本鎖核酸分子の存在を確認すぺ（アッセイにかけ
る。
本発明の方法にはその他１反応水溶液に既知濃度の核酸
変性剤をも含有せしめ、且つ核酸沈降剤を第２溶液に含
有させて、この第２溶液をインキュベーションステップ
の前に前記反応水溶液に加えるような方法もある。
変性剤をも含有せしめ、且つ核酸沈降剤を第２溶液に含
有させて、この第２溶液をインキュベーションステップ
の前に前記反応水溶液に加えるような方法もある。
本発明のね々の方法を実施するために使用する核酸沈降
剤は洗浄剤、ジヒドロキシベンゼン、サルコシル（５ａ
ｒｋｏｓｙｌ ）並びにＳ０４１ＰＯ４＋Ｃ６及ＵＨＣ
ＯＯｆ）アルカリ金属塩及びアンモニウム塩の中から通
訳するのが好ましい。塩の度は約ＬＭから約１０Ｍの範
囲が好ましい。また、反応水溶液はｐＨが約４〜１１と
なるようにｖ４整するのが好ましく、存機化合物強力核
酸沈降剤の０度は好ましくは約５容量％〜９５答計％で
あり且つ核酸変性剤の濃度が約５容量％〜９５容量％と
なるのが好ましい。
剤は洗浄剤、ジヒドロキシベンゼン、サルコシル（５ａ
ｒｋｏｓｙｌ ）並びにＳ０４１ＰＯ４＋Ｃ６及ＵＨＣ
ＯＯｆ）アルカリ金属塩及びアンモニウム塩の中から通
訳するのが好ましい。塩の度は約ＬＭから約１０Ｍの範
囲が好ましい。また、反応水溶液はｐＨが約４〜１１と
なるようにｖ４整するのが好ましく、存機化合物強力核
酸沈降剤の０度は好ましくは約５容量％〜９５答計％で
あり且つ核酸変性剤の濃度が約５容量％〜９５容量％と
なるのが好ましい。
（以下余白）
インキュベーション百度は２本鎖核酸結合生成物のＴｍ
より僅かに下の値から約２２℃の室温に近い値までの範
囲で選択するのが好ましい。反応水溶液に核ｒａ変性剤
を加えればハイブリッド形成の生起する温度が低下する
ことは明らかであろう。
より僅かに下の値から約２２℃の室温に近い値までの範
囲で選択するのが好ましい。反応水溶液に核ｒａ変性剤
を加えればハイブリッド形成の生起する温度が低下する
ことは明らかであろう。
本発明の方法を使用する反応操作では通常このハイブリ
ッド形成温度を室温に近い温度から９０℃までの範囲で
選択する。
ッド形成温度を室温に近い温度から９０℃までの範囲で
選択する。
インキュベーション後は反応溶液を種々の公知アッセイ
法によって分析し、２本鎖核酸生成物の存在を検出する
。好ましいアッセイ法ではこの検出のためにヒドロキシ
アノタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）を使用す
る。
法によって分析し、２本鎖核酸生成物の存在を検出する
。好ましいアッセイ法ではこの検出のためにヒドロキシ
アノタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）を使用す
る。
本発明の方法の別の目的、特徴及び利点は当業者には以
下の説明の要点から明らかであろう。
下の説明の要点から明らかであろう。
広義には、本発明の方法は次の如き驚くべき発見に基硫
をおく。即ち核酸沈降剤（塩及び有機化合物の両方）の
濃度を比較的高くすると、相補的塩基配列部分をもつ１
本鎖核酸分子が互に結合して塩基対になった２本鎖核酸
分子を形成する速度が大幅に増加する。この反応速度は
標準参考条件下での速度と比較してＤＮＡ −ＤＮＡ反
応の場合にはＳＯＯ倍、ＲＮＡ −ＤＮＡ反応の場合は
３０００倍、ＲＮＡ −ＲＮＡ反応の場合は１０００倍
速い。
をおく。即ち核酸沈降剤（塩及び有機化合物の両方）の
濃度を比較的高くすると、相補的塩基配列部分をもつ１
本鎖核酸分子が互に結合して塩基対になった２本鎖核酸
分子を形成する速度が大幅に増加する。この反応速度は
標準参考条件下での速度と比較してＤＮＡ −ＤＮＡ反
応の場合にはＳＯＯ倍、ＲＮＡ −ＤＮＡ反応の場合は
３０００倍、ＲＮＡ −ＲＮＡ反応の場合は１０００倍
速い。
更に留意すべきことは、このような大幅に増加した速度
が単相系で得られ、乳濁液も攪拌も必要としないことで
ある。
が単相系で得られ、乳濁液も攪拌も必要としないことで
ある。
これら反応のこのような著しい速度上昇は先行技術での
教示とは全く異なるものである。例えば、しばしば用い
られる反応促進条件は約ＬＭ ＮａＣ６（又はこれと等
価のもの）でちるが、この条件下では反応速度が標準参
考条件下の場合の約８〜２５倍にすぎない。この程度の
増加は本発明により開示される大幅に増加した速度とは
異なる。前掲の先行技術に関する表に示されているよう
に、ＮａＣ４０度を４．７５Ｍに高めても反応速度はほ
んの僅かしか増加しない。また、７．５ＭまでのＣａｃ
ｔ（これも反応速度増加用に一般的に使用されている）
０度でも速度増加は標準参考条件下での速度の約１５倍
である。ＬＭ （Ｎ１（４）、ＳＱ４及ヒ１Ｍ Ｌｉｃ
ｔの場合も標準参考条件下での速度に対する反応速度増
加は同心度であり、各基による増加は約１３倍から１８
倍でちる。この値はＬＭ ＮａＣ４又はＣ５ＣＬの場合
にほぼ比肩する。しかしながら、これら既知の結果とは
対照的に、（ＮＨａ ） ２ ＳＯＡ ｍ度を２Ｍに上
げると反応速度が更に３３倍増加し標準参考条件下での
速度に対し約６００倍と著しく増加することが判明した
。更に研究を続けた結果。
教示とは全く異なるものである。例えば、しばしば用い
られる反応促進条件は約ＬＭ ＮａＣ６（又はこれと等
価のもの）でちるが、この条件下では反応速度が標準参
考条件下の場合の約８〜２５倍にすぎない。この程度の
増加は本発明により開示される大幅に増加した速度とは
異なる。前掲の先行技術に関する表に示されているよう
に、ＮａＣ４０度を４．７５Ｍに高めても反応速度はほ
んの僅かしか増加しない。また、７．５ＭまでのＣａｃ
ｔ（これも反応速度増加用に一般的に使用されている）
０度でも速度増加は標準参考条件下での速度の約１５倍
である。ＬＭ （Ｎ１（４）、ＳＱ４及ヒ１Ｍ Ｌｉｃ
ｔの場合も標準参考条件下での速度に対する反応速度増
加は同心度であり、各基による増加は約１３倍から１８
倍でちる。この値はＬＭ ＮａＣ４又はＣ５ＣＬの場合
にほぼ比肩する。しかしながら、これら既知の結果とは
対照的に、（ＮＨａ ） ２ ＳＯＡ ｍ度を２Ｍに上
げると反応速度が更に３３倍増加し標準参考条件下での
速度に対し約６００倍と著しく増加することが判明した
。更に研究を続けた結果。
ＬｉＣＬｉ：速度を４Ｍに高めても前記と同程度の速度
増加がイ：）られることか判明した。この場合は更に３
０倍の増加が見られ、反応速度はり準参考条件下での速
度の４６７倍に達した。ギ酸アンモニウム、硫酸リチウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、リン散ナトリウム
、並びに数４重の洗浄剤及び■１々重合化に関しても同
様の大幅な増加ノ♀ターンが観察された。
増加がイ：）られることか判明した。この場合は更に３
０倍の増加が見られ、反応速度はり準参考条件下での速
度の４６７倍に達した。ギ酸アンモニウム、硫酸リチウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、リン散ナトリウム
、並びに数４重の洗浄剤及び■１々重合化に関しても同
様の大幅な増加ノ♀ターンが観察された。
ここで留意すべきことは、同様の塩濃度を使用しながら
前述の如き大幅な速度増加を知見できなかった研究者が
いることである。これらの研究者が本発明で開示される
ような著しい反応速度増加を検出し得なかった理由は、
先行技術が通常反応速度の測定に光学的手段を用いてい
たことＫあると考えられる。これらの光学的手段は１不
鎖核酸の方が２本鎖核酸より多（のＵＶ光を吸収すると
いう事実に依存する。従ってアッセイは１本鎖核酸から
２本鎖核酸への変換に伴なう光学口度（ｏｐｔｉｃａｌ
ｄｅｎｓ ｉ ｔｙ ）の減少に基づいて行なわれる。
前述の如き大幅な速度増加を知見できなかった研究者が
いることである。これらの研究者が本発明で開示される
ような著しい反応速度増加を検出し得なかった理由は、
先行技術が通常反応速度の測定に光学的手段を用いてい
たことＫあると考えられる。これらの光学的手段は１不
鎖核酸の方が２本鎖核酸より多（のＵＶ光を吸収すると
いう事実に依存する。従ってアッセイは１本鎖核酸から
２本鎖核酸への変換に伴なう光学口度（ｏｐｔｉｃａｌ
ｄｅｎｓ ｉ ｔｙ ）の減少に基づいて行なわれる。
しかしながら多数の人為結果が生起してこのような光学
的測定を妨害することもある。核酸がこれら核酸の沈降
剤の存在下におかれた時のように凝集又は沈降する性向
を示す系においては正に前記現象が生じる。
的測定を妨害することもある。核酸がこれら核酸の沈降
剤の存在下におかれた時のように凝集又は沈降する性向
を示す系においては正に前記現象が生じる。
先行技術の研究において本発明の如き方法の発見を阻止
したこれら同一の要因（凝集又は沈降）は、同時に本発
明の方法の極めて速い反応速度の原因でもあると考えら
れる。核酸沈降剤は１本鎖核酸分子を凝集させ、それに
よって反応を促進するものと想定される。前述の如く、
所与の相補的１本鎖核酸対が２本鎖核酸分子を形成する
速度は反応Ｇ液中での１本鎖核酸の濃度に直接関連する
。
したこれら同一の要因（凝集又は沈降）は、同時に本発
明の方法の極めて速い反応速度の原因でもあると考えら
れる。核酸沈降剤は１本鎖核酸分子を凝集させ、それに
よって反応を促進するものと想定される。前述の如く、
所与の相補的１本鎖核酸対が２本鎖核酸分子を形成する
速度は反応Ｇ液中での１本鎖核酸の濃度に直接関連する
。
この核酸０度が高い程反応速度は速い。核酸沈降剤を存
在させると１本鎖核酸分子が溶液中で互に凝集又は結合
する。このような凝集又は半沈降は反応溶液の核酸濃度
を局部的に高める。この凝集がハイブリッド形成又は再
結合の生起し得る温度で生じれば反応速度は大幅に増加
する。
在させると１本鎖核酸分子が溶液中で互に凝集又は結合
する。このような凝集又は半沈降は反応溶液の核酸濃度
を局部的に高める。この凝集がハイブリッド形成又は再
結合の生起し得る温度で生じれば反応速度は大幅に増加
する。
相補的１本鎖核酸分子が核酸沈降剤含有反応溶液中で互
に再結合し又はハイブリッドを形成するようにするため
には温度を反応を生起する程十分に高くしなければなら
ない。丹生、再結合又はノ・イブリッド形成は通常関連
２本鎖核酸分子のＴｍよシ約１０℃から３０℃低い温度
でゴよ適速度で生起する。本発明の反応溶液では大部分
の２本鎖核酸分子のＴ は８５℃から１００℃である。
に再結合し又はハイブリッドを形成するようにするため
には温度を反応を生起する程十分に高くしなければなら
ない。丹生、再結合又はノ・イブリッド形成は通常関連
２本鎖核酸分子のＴｍよシ約１０℃から３０℃低い温度
でゴよ適速度で生起する。本発明の反応溶液では大部分
の２本鎖核酸分子のＴ は８５℃から１００℃である。
木兄明の反応溶液が１種以上の核ａ＝性剤を含む場合は
Ｔ が大幅に低下するため室温程度の低温で最適反応速
度に達し得る。従って反応温度を約２０℃〜９０℃にす
れば最適反応速度が得られる筈でちる。
Ｔ が大幅に低下するため室温程度の低温で最適反応速
度に達し得る。従って反応温度を約２０℃〜９０℃にす
れば最適反応速度が得られる筈でちる。
前述の如く、十分高い濃度で使用すると種々の核酸沈降
無機塩が反応速度を火偏に増加きせることか判明した。
無機塩が反応速度を火偏に増加きせることか判明した。
一般に１本発明の方法に有効であった塩はよシ強い塩析
（ｓａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ）作用をもつ陰イオン又は陽
イオン群（特に８０４ ＊ ＰＯ４＋ Ｌｌｌ ＋正、
）の少なくとも一種を含む塩である。更に、反応溶液と
混和し得且つ沈降又は塩析作用をもつ有イ）化合物も反
応速度を大幅に増加させる上で有効である。このような
化合物の一例としては洗浄剤、ジヒドロキシペンゼ／及
びサルコシルが挙げられる。
（ｓａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ）作用をもつ陰イオン又は陽
イオン群（特に８０４ ＊ ＰＯ４＋ Ｌｌｌ ＋正、
）の少なくとも一種を含む塩である。更に、反応溶液と
混和し得且つ沈降又は塩析作用をもつ有イ）化合物も反
応速度を大幅に増加させる上で有効である。このような
化合物の一例としては洗浄剤、ジヒドロキシペンゼ／及
びサルコシルが挙げられる。
いずれの塩又は池の化合物が本発明の方法を実施するの
に必要な核酸沈降作用を有しているかを調べるためには
、先ずその化合物が１本鎖核酸分子を沈降させるか否か
を調べ５次いで形成された沈降物（沈殿物）が反応溶液
を反応の生起し得る温度に加熱した時に消滅するか否か
を調べるべく、当該化合物を一次スクリーニングにかけ
る必要がある。その後当該核酸沈降剤のアッセイを行な
って最適反応速度増加を実現するための好ましい良度及
びインキュベーション温度を決定する。このスクリーニ
ング処理では反応速度を大幅に増加させるのに必要な核
酸沈降剤の有効Ｃ度を調べることもで５゛る。
に必要な核酸沈降作用を有しているかを調べるためには
、先ずその化合物が１本鎖核酸分子を沈降させるか否か
を調べ５次いで形成された沈降物（沈殿物）が反応溶液
を反応の生起し得る温度に加熱した時に消滅するか否か
を調べるべく、当該化合物を一次スクリーニングにかけ
る必要がある。その後当該核酸沈降剤のアッセイを行な
って最適反応速度増加を実現するための好ましい良度及
びインキュベーション温度を決定する。このスクリーニ
ング処理では反応速度を大幅に増加させるのに必要な核
酸沈降剤の有効Ｃ度を調べることもで５゛る。
。−例として、サルコシル（Ｎ−２ウロイルサルコシン
ナトリウム塩）をその核酸再結合速度増加能力を調べる
べ（次の方法でスクリーニングにかけた。先ず既知量の
精製肝臓ＲＮＡ（最終良度４ ｍｙ ／ｒｎｌ ）と１
重々の量のサルコシル約９容量−〜２４容量％）とを含
む一連の溶液を調製した。この溶液を十分に混合し、直
接目視観測か又はサルコシルもしくは核酸のいずれも吸
収しないような波長を用いる分光光度計によって沈降物
の存在を調べた。溶液中に沈降物が検出された場合は、
その溶液を約４０℃〜９０℃の温度に加熱して沈降度が
変化するか否かを確かめた。１０％〜１４襲のサルコシ
ルでは核酸の沈降は殆んど又は全く見られなかった。し
かしながら濃度を上げるとサルコシルによる核酸の沈降
が生じた。次いで更に多くの実験を行なって最適反応速
度増加を建成するための好ましい濃度及びインキュペー
ンヨン温度を決定した。
ナトリウム塩）をその核酸再結合速度増加能力を調べる
べ（次の方法でスクリーニングにかけた。先ず既知量の
精製肝臓ＲＮＡ（最終良度４ ｍｙ ／ｒｎｌ ）と１
重々の量のサルコシル約９容量−〜２４容量％）とを含
む一連の溶液を調製した。この溶液を十分に混合し、直
接目視観測か又はサルコシルもしくは核酸のいずれも吸
収しないような波長を用いる分光光度計によって沈降物
の存在を調べた。溶液中に沈降物が検出された場合は、
その溶液を約４０℃〜９０℃の温度に加熱して沈降度が
変化するか否かを確かめた。１０％〜１４襲のサルコシ
ルでは核酸の沈降は殆んど又は全く見られなかった。し
かしながら濃度を上げるとサルコシルによる核酸の沈降
が生じた。次いで更に多くの実験を行なって最適反応速
度増加を建成するための好ましい濃度及びインキュペー
ンヨン温度を決定した。
種々の温度の好ましいブ７玉機塩核酸沈降剤によつて得
られる反応速度の増加を次表２及び３に示した。
られる反応速度の増加を次表２及び３に示した。
表 ２
高娘度の特定塩がＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドＡ、硫酸
アンモニウム Ｉ Ｐ、１ １７．５
２Ｍ ６００２．１Ｍ
６００２．５Ｍ
４６７３．１Ｍ
７０Ｂ、塩化リチウム １Ｍ １３ ３．５Δ１ ６６４Ｍ
４６７５１〜１
２８０６Ｍ １９
Ｃ１他の塩 ２Ｍ（ｌｉｉｊ酸セシウム ２８０１．
９Ｍ硫酸ナトリウム ６００２ Ｉｖ１ｉｔ
酸リチウム ４２０６Ｍギ【２アンモニ
ウム ２１０２．４Ｍ リン酸ナトリウ
ム ８００表 ３ ０．１８Ｍ 塩化ナトリウム １
０．７２Ｍ 塩化ナトリウム ３
．６２Ｍ 硫酸アンそニウム １５００
２．４Ｍ リン酸ナトリウム ３０００
４Ｍ塩化リチウム ６００２Ｍ 硫酸ナ
トリウム ３４６０硫酸アンモニウム １Ｍ ９０ ２Ｍ １５００ ３Ｍ ６００ このようにして核酸沈降剤の性質を理解した上で、本発
明の方法を次の如〈実施する。好ましい実施法の第１ス
テツプは一定量の第一１本鎖核酸分子と、好ましくは検
出可能マーカーを含み且つ第一１本鎖核酸分子の対応塩
基配列セグメントに対して相補的な少なくとも１つの塩
基配列セグメントを有する一定量の第二１本鎖核酸分子
とを含む反応水溶液の調製からなる。この反応水溶液に
は既知餞度の少なくとも一種の前述の核酸沈降剤をも加
える。この旋度は反応速度を標準参考条件下での反応速
度の少なくとも５０倍から１００倍に増加せしめるに足
る濃度である。１本鎖核酸反応体の俗解限度の如く実際
面で考慮すべき事柄以外には５本発明の方法を実施する
ために使用し得る反応水溶液の量又は１本鎖核酸分子反
応体の量についても同様に制限はない。また１反応速度
を大幅に増加させるのに必要なものは核酸沈降剤だけで
ちるということは言うまでもないことであるが、緩菌液
ＥＥＤＴＡ 、ＳＤＳ、ＳＫ、ＰＫ又はＥＴＯＨの如き
添加剤も前記反応水溶液に加え得る。更に、少なくとも
一方の１本鎖核酸分子は検出可能マーカーを有するのが
好ましいが、このマーカーは反応速度を激増させる上で
必要不可欠というわけではないことにも留意されたい。
アンモニウム Ｉ Ｐ、１ １７．５
２Ｍ ６００２．１Ｍ
６００２．５Ｍ
４６７３．１Ｍ
７０Ｂ、塩化リチウム １Ｍ １３ ３．５Δ１ ６６４Ｍ
４６７５１〜１
２８０６Ｍ １９
Ｃ１他の塩 ２Ｍ（ｌｉｉｊ酸セシウム ２８０１．
９Ｍ硫酸ナトリウム ６００２ Ｉｖ１ｉｔ
酸リチウム ４２０６Ｍギ【２アンモニ
ウム ２１０２．４Ｍ リン酸ナトリウ
ム ８００表 ３ ０．１８Ｍ 塩化ナトリウム １
０．７２Ｍ 塩化ナトリウム ３
．６２Ｍ 硫酸アンそニウム １５００
２．４Ｍ リン酸ナトリウム ３０００
４Ｍ塩化リチウム ６００２Ｍ 硫酸ナ
トリウム ３４６０硫酸アンモニウム １Ｍ ９０ ２Ｍ １５００ ３Ｍ ６００ このようにして核酸沈降剤の性質を理解した上で、本発
明の方法を次の如〈実施する。好ましい実施法の第１ス
テツプは一定量の第一１本鎖核酸分子と、好ましくは検
出可能マーカーを含み且つ第一１本鎖核酸分子の対応塩
基配列セグメントに対して相補的な少なくとも１つの塩
基配列セグメントを有する一定量の第二１本鎖核酸分子
とを含む反応水溶液の調製からなる。この反応水溶液に
は既知餞度の少なくとも一種の前述の核酸沈降剤をも加
える。この旋度は反応速度を標準参考条件下での反応速
度の少なくとも５０倍から１００倍に増加せしめるに足
る濃度である。１本鎖核酸反応体の俗解限度の如く実際
面で考慮すべき事柄以外には５本発明の方法を実施する
ために使用し得る反応水溶液の量又は１本鎖核酸分子反
応体の量についても同様に制限はない。また１反応速度
を大幅に増加させるのに必要なものは核酸沈降剤だけで
ちるということは言うまでもないことであるが、緩菌液
ＥＥＤＴＡ 、ＳＤＳ、ＳＫ、ＰＫ又はＥＴＯＨの如き
添加剤も前記反応水溶液に加え得る。更に、少なくとも
一方の１本鎖核酸分子は検出可能マーカーを有するのが
好ましいが、このマーカーは反応速度を激増させる上で
必要不可欠というわけではないことにも留意されたい。
本発明の方法の次のステップは前記反応水溶液のインキ
ュベーシヨンからなる。前述の如く、該反応水溶液はＴ
ｍより僅かに低い温度からほぼ室温までの温度で十分に
インキュベートできる。実際に使用される温度は反応体
のぬ反と反応溶液に混入される別の添加剤のａｔ類とに
応じて異なる。
ュベーシヨンからなる。前述の如く、該反応水溶液はＴ
ｍより僅かに低い温度からほぼ室温までの温度で十分に
インキュベートできる。実際に使用される温度は反応体
のぬ反と反応溶液に混入される別の添加剤のａｔ類とに
応じて異なる。
しかしながら通常は大体室温から９０℃程度までのイン
キュベーション温度で反応が生起する。
キュベーション温度で反応が生起する。
（以下余白）
本発明の方法の最終ステップはインキニ−トした反応水
溶液をアッセイにかけて２本鎖核酸分子の存在を調べる
ことにちる。当業界では多岐に亘るアッセイ法が知られ
ているが、本発明ではこれらの方法を全て使用し得る。
溶液をアッセイにかけて２本鎖核酸分子の存在を調べる
ことにちる。当業界では多岐に亘るアッセイ法が知られ
ているが、本発明ではこれらの方法を全て使用し得る。
好ましいアッセイ法の１つでは反応開始後特定の時点で
このインキュベートし九反応溶液から一部（ａｌｉｑｕ
ｏｔ ）を採取する。この一部を１１の０．１４Ｍ Ｐ
Ｒ，０，０２チドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に希
釈する。次いでこの希釈した溶液ｔ６７℃で０．１４Ｍ
ＰＲ。
このインキュベートし九反応溶液から一部（ａｌｉｑｕ
ｏｔ ）を採取する。この一部を１１の０．１４Ｍ Ｐ
Ｒ，０，０２チドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に希
釈する。次いでこの希釈した溶液ｔ６７℃で０．１４Ｍ
ＰＲ。
ｏ、ｏ２僑ｓＤｓに対し予め平衡化したヒドロキシアノ
ｑタイト（ＨＡ）カラム（１ｍに等しいベッド体積）に
通す。１本鎖ＤＮＡ分子社ＨＡに結合しないが、ＲＮＡ
及び２本鎖核酸分子はカラムに吸着される。次いで５ｍ
のカラム緩衝ｆｉ ０．１４Ｍ ＰＨ。
ｑタイト（ＨＡ）カラム（１ｍに等しいベッド体積）に
通す。１本鎖ＤＮＡ分子社ＨＡに結合しないが、ＲＮＡ
及び２本鎖核酸分子はカラムに吸着される。次いで５ｍ
のカラム緩衝ｆｉ ０．１４Ｍ ＰＨ。
０．０２％ＳＤＳをカラムに通すことにより該カラムか
らハイブリッド未形成１本鎖核酸分子を除去する。６７
℃の０．３Ｍ ＰＨでカラムを溶離処理することにより
カラムから吸着核酸を回収する。このようにして得た程
々の溶液画分はその後検出可能マーカー（放射性水素等
）ｔ−検出すべくアッセイにかけ得る。
らハイブリッド未形成１本鎖核酸分子を除去する。６７
℃の０．３Ｍ ＰＨでカラムを溶離処理することにより
カラムから吸着核酸を回収する。このようにして得た程
々の溶液画分はその後検出可能マーカー（放射性水素等
）ｔ−検出すべくアッセイにかけ得る。
本発明の方法の別の実施法では、核酸沈降剤を含む第２
溶液を先Ｋｖ４製した反応水溶液に混入し、その後でこ
の混合物をインキュベートする。即ち、この実施法では
先ず酊述の如き反応水溶液を調製し、該水溶液と混和し
得且つ１本鎖核酸分子を水溶液から沈降させ得るような
少なくとも１種類の核酸沈降剤を既知濃度で含む第２溶
液を前記水溶液顛混入し、得られた混合物を前述の温度
でインキュベートし、最後に２本鎖核酸分子の存在を検
出すべ（インキュベートした混合物のアッセイを行なう
。この方法は反応水溶液中での１本鎖核酸分子反応体の
早過ぎる凝集に伴って生じ得る問題を完全に回避せしめ
る。
溶液を先Ｋｖ４製した反応水溶液に混入し、その後でこ
の混合物をインキュベートする。即ち、この実施法では
先ず酊述の如き反応水溶液を調製し、該水溶液と混和し
得且つ１本鎖核酸分子を水溶液から沈降させ得るような
少なくとも１種類の核酸沈降剤を既知濃度で含む第２溶
液を前記水溶液顛混入し、得られた混合物を前述の温度
でインキュベートし、最後に２本鎖核酸分子の存在を検
出すべ（インキュベートした混合物のアッセイを行なう
。この方法は反応水溶液中での１本鎖核酸分子反応体の
早過ぎる凝集に伴って生じ得る問題を完全に回避せしめ
る。
本発明の反応速度を増加させる方法の前記２つの実施法
は更に、少なくとも１種類の既知濃度の核酸変性剤、例
えばアルコールを前記反応水溶液に添加するステップも
含む。添加する変性剤の濃度は約５容ｉ％から約９５容
ｔ％が好ましい。−例としてエタノールは変性作用をも
ち、且つ反応生起温度を低下させる。エタノールは約２
０％まで２Ｍ （ＮＨ４）ｔｓｏ４に溶解し得る。この
程度の濃度では反応が通常の６０℃〜８０℃ではな（約
４９℃で生起する。
は更に、少なくとも１種類の既知濃度の核酸変性剤、例
えばアルコールを前記反応水溶液に添加するステップも
含む。添加する変性剤の濃度は約５容ｉ％から約９５容
ｔ％が好ましい。−例としてエタノールは変性作用をも
ち、且つ反応生起温度を低下させる。エタノールは約２
０％まで２Ｍ （ＮＨ４）ｔｓｏ４に溶解し得る。この
程度の濃度では反応が通常の６０℃〜８０℃ではな（約
４９℃で生起する。
本発明の方法の実施法如何に拘らず、核酸沈降剤は洗＋
１１１． ジヒドロキシベンゼン、サルコシル並びに８
０４ ＋ Ｐ ０４ ＋ ＣＩ及びＨＣＯＯのアルカリ
金属塩及びアンモニウム塩の中から選択するのが好筐し
い。本発明ではこれら種々の物質ｔ−１つの反応水溶液
で一緒に使用することもできる。更に、本明細書で開示
する有機化合物以外にも種々の洗浄剤を本発明の範囲に
含まれるものとして使用し得る。９０ち不明ＭＢ書で特
に開示され且つ本発明の請求の範囲に記載されている化
合物は、本発明の方法を実施するのに適したものとして
現在知られている化合物である。類似の化合物性従って
本発明の範囲に含まれるものと見なされる。
１１１． ジヒドロキシベンゼン、サルコシル並びに８
０４ ＋ Ｐ ０４ ＋ ＣＩ及びＨＣＯＯのアルカリ
金属塩及びアンモニウム塩の中から選択するのが好筐し
い。本発明ではこれら種々の物質ｔ−１つの反応水溶液
で一緒に使用することもできる。更に、本明細書で開示
する有機化合物以外にも種々の洗浄剤を本発明の範囲に
含まれるものとして使用し得る。９０ち不明ＭＢ書で特
に開示され且つ本発明の請求の範囲に記載されている化
合物は、本発明の方法を実施するのに適したものとして
現在知られている化合物である。類似の化合物性従って
本発明の範囲に含まれるものと見なされる。
本発明の方法を実施するのに必要な核酸沈降剤の有効濃
度は、反応溶液中の核酸の量と、該溶液のｐＨと、他の
化合物の存在とに応じて変化する。
度は、反応溶液中の核酸の量と、該溶液のｐＨと、他の
化合物の存在とに応じて変化する。
即ちこの濃度は無機塩化合物の場合には約１Ｍ〜１０Ｍ
、有機化合物の場合には約５容量チ〜約９５容ｉ％にす
るのが好ましい。また、反応溶液のｐＨは約４〜１１の
間が好ましい。
、有機化合物の場合には約５容量チ〜約９５容ｉ％にす
るのが好ましい。また、反応溶液のｐＨは約４〜１１の
間が好ましい。
最後に、反応水溶液の好ましいインキュベーション温度
は前述の如（はぼ室温から約９０℃までの値が好ましい
＠ 本発明の方法は細菌、バクテリア及び呻乳動物の核酸の
他、化学的に合成された核酸に適用し得る。反応の完全
性は強力核酸沈降剤の濃度と最初の反応浴液中の核酸の
童とに応じて異なる。核酸い度が低ければ優に９０％を
越える１本鎖核酸分子が結合して２本鎖核酸分子を形成
することになる。核酸濃度が高ければ反応速度が大幅に
増加しても反応完成度は約７０％以下にすぎない。核酸
反応体製産が極度に高いと反応速度の増加率が低下する
ことに留意されたい。
は前述の如（はぼ室温から約９０℃までの値が好ましい
＠ 本発明の方法は細菌、バクテリア及び呻乳動物の核酸の
他、化学的に合成された核酸に適用し得る。反応の完全
性は強力核酸沈降剤の濃度と最初の反応浴液中の核酸の
童とに応じて異なる。核酸い度が低ければ優に９０％を
越える１本鎖核酸分子が結合して２本鎖核酸分子を形成
することになる。核酸濃度が高ければ反応速度が大幅に
増加しても反応完成度は約７０％以下にすぎない。核酸
反応体製産が極度に高いと反応速度の増加率が低下する
ことに留意されたい。
反応水溶液中に存在する１本鎖核酸分子反応体の量は核
酸分子の溶解限度に達する上限と１０−’ｍｃｇのオー
ダーの下限との間のｉにし得る。興味深いことに、高濃
度でのＤＮＡ：ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ反応の反応速
度増加は低濃度でのＤＮＡ ： ＤＮＡ及びＲＮＡ：Ｒ
ＮＡ反応の場合より劣る。本発明の方法は反応体濃度が
高い場合にも低い場合にも使用し得る。これらの事情を
勘案すると好ましい反応溶液量は１ｊｔｊ以下のオーダ
ー１μ！の一部分にあたるまでになる。但し、この値は
限定的なものではな（本発明の範囲内で変化させ得ると
理解されたい。尚、少量のタンパク質及び他の細胞成分
が存在しても本発明の方法の反応が著しく妨害されるこ
とはないが、異ｍＲＮＡ又はＤＮＡが過料に存在すると
反応速度が様々な程度低下する。
酸分子の溶解限度に達する上限と１０−’ｍｃｇのオー
ダーの下限との間のｉにし得る。興味深いことに、高濃
度でのＤＮＡ：ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡ反応の反応速
度増加は低濃度でのＤＮＡ ： ＤＮＡ及びＲＮＡ：Ｒ
ＮＡ反応の場合より劣る。本発明の方法は反応体濃度が
高い場合にも低い場合にも使用し得る。これらの事情を
勘案すると好ましい反応溶液量は１ｊｔｊ以下のオーダ
ー１μ！の一部分にあたるまでになる。但し、この値は
限定的なものではな（本発明の範囲内で変化させ得ると
理解されたい。尚、少量のタンパク質及び他の細胞成分
が存在しても本発明の方法の反応が著しく妨害されるこ
とはないが、異ｍＲＮＡ又はＤＮＡが過料に存在すると
反応速度が様々な程度低下する。
大幅な反応速度増加は、塩基約６０個分から塩基１０’
個分のオーダーまでの長さをもつ核酸分子に関して得ら
れた。しかしながら本発明の方法は塩基１０−１５個分
のオーダーの短かい長さをもつ核酸分子から塩基１０’
個分を越えるより長いものまで広範囲に亘って適用し得
る。
個分のオーダーまでの長さをもつ核酸分子に関して得ら
れた。しかしながら本発明の方法は塩基１０−１５個分
のオーダーの短かい長さをもつ核酸分子から塩基１０’
個分を越えるより長いものまで広範囲に亘って適用し得
る。
本発明の方法がより良く理解されるよう、以下に非限定
的実施例を示す。
的実施例を示す。
実施例１
１、塩基約３００〜７００１！Ｉ度の長さの音波処理し
た１本＠３Ｈ−大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１１．） ＤＮＡを
０．００４ｍｃｇ含む０．１７％ＳＤＳ、 ３ＸｌＯ−
３ＭＥＤＴＡ ５０ ｐｌとｐＨ＝６．８の４．８Ｍり
ン酸ナトリウム５０μｌと全十分に混合する。
た１本＠３Ｈ−大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１１．） ＤＮＡを
０．００４ｍｃｇ含む０．１７％ＳＤＳ、 ３ＸｌＯ−
３ＭＥＤＴＡ ５０ ｐｌとｐＨ＝６．８の４．８Ｍり
ン酸ナトリウム５０μｌと全十分に混合する。
２、得られた混合物を７６０でインキュフートし、処理
開始後特定時点でその一部を採取する。この一部ｆｃ０
．１４Ｍ ＰＨ，０，０２％ＳＤＳ Ｋ希釈し、前述
の如くヒドロキシアパタイトを用いてハイブリッド形成
検出アッセイにかける。
開始後特定時点でその一部を採取する。この一部ｆｃ０
．１４Ｍ ＰＨ，０，０２％ＳＤＳ Ｋ希釈し、前述
の如くヒドロキシアパタイトを用いてハイブリッド形成
検出アッセイにかける。
この方法を用いると反応速度が標準参考条件下での速度
の約８００倍に増加する。
の約８００倍に増加する。
このような大幅な速度増加は容量、リン酸ナトリウム公
度、ＤＮＡ９度、 ＥＤＴＡａ度、ＳＤＳ濃度及びイン
キュベーション温Ｊｌｔｉｉ々に変えても得られる。
度、ＤＮＡ９度、 ＥＤＴＡａ度、ＳＤＳ濃度及びイン
キュベーション温Ｊｌｔｉｉ々に変えても得られる。
実施例２
いる方法
１、音波処理した１本鎖３Ｈ−大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１ｔ
）ＤＮＡ（塩基約３００〜７００ ＠Ｉ分の長さ）を
２ｍｃｇ含む水０．１５ ｍｌ と２．２５Ｍ硫酸ナト
リウム０．８５ｍｔと全十分に混合する。
）ＤＮＡ（塩基約３００〜７００ ＠Ｉ分の長さ）を
２ｍｃｇ含む水０．１５ ｍｌ と２．２５Ｍ硫酸ナト
リウム０．８５ｍｔと全十分に混合する。
２、 この混合物ｆ、７７℃でインキュベートし、開始
後の特定時点で一部を採取する。これら一部を１１１１
７の０．１４Ｍ ＰＨ，０，０２％ＳＤＳに希釈し、前
述の如＜ＨＡでアッセイを行なう。
後の特定時点で一部を採取する。これら一部を１１１１
７の０．１４Ｍ ＰＨ，０，０２％ＳＤＳに希釈し、前
述の如＜ＨＡでアッセイを行なう。
この方法では参考条件下での速度の約６００倍の反応速
度が得られる。
度が得られる。
実施例３
１、音波処理した１本鎖３Ｈ−大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１１
）ＤＮＡ（塩基約３００〜７００１！Ｉ分の長さ）を
約ｌＯｍｃｇ含むｐ）ｉ＝７．８の０．１６Ｍ）リス０
．３ ｍｌと１０Ｍ塩化リチウム０．２ｍｌとを十分に
混合する。
）ＤＮＡ（塩基約３００〜７００１！Ｉ分の長さ）を
約ｌＯｍｃｇ含むｐ）ｉ＝７．８の０．１６Ｍ）リス０
．３ ｍｌと１０Ｍ塩化リチウム０．２ｍｌとを十分に
混合する。
２、 この混合物を７６℃でインキュベートし、開始後
特定時点で一部を採取する。これら一部を前述の如（希
釈し、７）イブリッド形成検出アッセイにかける。
特定時点で一部を採取する。これら一部を前述の如（希
釈し、７）イブリッド形成検出アッセイにかける。
この方法では反応速度が参考条件下での速度の約６００
倍に増加する。
倍に増加する。
実施例４
１、音波処理した１本鎖３Ｈ−大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１ｔ
）倣酸アンモニウム５０μｌとを十分に混合する。
）倣酸アンモニウム５０μｌとを十分に混合する。
２、 この混合物ｔ７８℃でインキュベートし、開始後
特定時点で一部を採取する。該一部を前述の如（希釈し
、ハイブリッド形成検出アッセイにかける。
特定時点で一部を採取する。該一部を前述の如（希釈し
、ハイブリッド形成検出アッセイにかける。
この方法では参考条件下の場合の約７００倍の反応速度
が得られる。
が得られる。
実施例５
ハイブリッド形成が生起する温度は反応混合物にエタノ
ールを加えることによって著しく低下し得る。エタノー
ルは２ Ｍ Ｗｉ ｍアンモニウムに約２０％まで溶解
し得る。
ールを加えることによって著しく低下し得る。エタノー
ルは２ Ｍ Ｗｉ ｍアンモニウムに約２０％まで溶解
し得る。
１４ 音波処理した１本鎖３Ｈ−大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ
１ｔ ）ＤＮＡ（塩基３００〜７００１固分の長さ）
ｔ″０．４ｍｃｇ含む３４％エタノール水溶液０．０５
ｉｔと、４Ｍ硫酸アンモニウム、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ
及びｐ Ｈ＝ ６．８の０．１Ｍ ＰＢ ０．０５ｍｊ
とを十分に混合する。
１ｔ ）ＤＮＡ（塩基３００〜７００１固分の長さ）
ｔ″０．４ｍｃｇ含む３４％エタノール水溶液０．０５
ｉｔと、４Ｍ硫酸アンモニウム、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ
及びｐ Ｈ＝ ６．８の０．１Ｍ ＰＢ ０．０５ｍｊ
とを十分に混合する。
２、 この混合物を４９℃で適当時間インキュベートし
、一部を採取する。該一部を前述の如く希釈し、ハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
、一部を採取する。該一部を前述の如く希釈し、ハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
この方法では参考条件下の場合の約１００倍の反応速度
が得られる。
が得られる。
実施例６
１、音波処理した１本鎖３ＨヒトＤＮＡ（塩基約４００
〜８００個分の長さ）を２６ ｎｃｇ含む０．０２ＭＥ
ＤＴＡ ０．１Ｍと４Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ＝６．
８の０．１Ｍ ＰＢ ０．１ｍ／とを十分に混合する。
〜８００個分の長さ）を２６ ｎｃｇ含む０．０２ＭＥ
ＤＴＡ ０．１Ｍと４Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ＝６．
８の０．１Ｍ ＰＢ ０．１ｍ／とを十分に混合する。
２、 この混合物を６８℃でインキュベートし、特定時
点で一部を採取する。各一部を前述の如（希訳し、ハイ
ブリッド形成検出アッセイにかける。
点で一部を採取する。各一部を前述の如（希訳し、ハイ
ブリッド形成検出アッセイにかける。
との方法では参考条件の場合の約２００倍の反応速度が
得られる。
得られる。
実施例７
１、 −ｆｆ−液処理した１本鎖３ＨヒトＤＮＡ（塩基
約４００〜８００個分の長さ）を２６ｍｃｇ含む０．０
１６Ｍ ＥＤＴＡ、４０％エタノール水溶液０．０５ｍ
１と、４Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ＝６．８の０．１Ｍ
ＰＨ０、０５Ｒ１とを十分に混合する。
約４００〜８００個分の長さ）を２６ｍｃｇ含む０．０
１６Ｍ ＥＤＴＡ、４０％エタノール水溶液０．０５ｍ
１と、４Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ＝６．８の０．１Ｍ
ＰＨ０、０５Ｒ１とを十分に混合する。
２、この混合物を４９℃でインキュベートシ、特定時点
で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈し、ハイブ
リッド形成検出用アッセイにかける。
で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈し、ハイブ
リッド形成検出用アッセイにかける。
この方法では参考条件の場合の約１８０倍の反応速度が
得られる。
得られる。
実施例８
Ｅ、呻乳動物ＤＮＡ：高濃度
１、音波処理した１本鎖ヒト”ＨＤＮＡ （塩基約４０
０〜８００個分の長さ）を１３０ｍｃｇ含む０．０４Ｍ
ＥＤＴＡ水溶液０．０２５−と４Ｍ楢、酸アンモニウ
ム及びｐＨ＝６．８の０．１ Ｍ ＰＢ ０．０２５
ｍとを十分く混合する。
０〜８００個分の長さ）を１３０ｍｃｇ含む０．０４Ｍ
ＥＤＴＡ水溶液０．０２５−と４Ｍ楢、酸アンモニウ
ム及びｐＨ＝６．８の０．１ Ｍ ＰＢ ０．０２５
ｍとを十分く混合する。
２、 この混合物を６８Ｃでインキュベートし特定時点
で一部を採取する。
で一部を採取する。
各一部を前述の如（希釈し、ハイブリッド形成検出アッ
セイにかける。
セイにかける。
この方法では参考条件の場合の約９０倍の反応速度が得
られる。
られる。
実施例９
１、 ４０％ＥＴＯＨと音波処理した１本ヱ４ヒト３Ｈ
ＤＮＡ （塩基約４００〜８００飼分の長さ）６５ ｍ
ｃｇと〒含む０．０１６Ｍ ＥＤＴＡ水溶液０．０１２
５−と、４Ｍ硫酸アンモニウム及びｐＨ＝６．８の０．
１ Ｍ ＰＢ ０．０１２５−とを十分に混合する。
ＤＮＡ （塩基約４００〜８００飼分の長さ）６５ ｍ
ｃｇと〒含む０．０１６Ｍ ＥＤＴＡ水溶液０．０１２
５−と、４Ｍ硫酸アンモニウム及びｐＨ＝６．８の０．
１ Ｍ ＰＢ ０．０１２５−とを十分に混合する。
２、 この混合物を４９Ｃでインキュベートし、特定時
点で一部を採取する。
点で一部を採取する。
各一部を前述の如く希釈し、ハイブリッド形成検出アッ
セイにかける。
セイにかける。
この方法では参考条件の場合の約１３０倍の反応速度が
得られる。 ゛ 実施例１０ １、 ２ Ｘ ＩＦ” ｎａｇのポリオＩ （Ｐｏ１ｉ
ｏ Ｉ ）ＲＮＡ七２ Ｘ １０＝ ｒｎｃｇ （１）
”Ｈ−ｅ ＤＮＡ （ｒＨリオＲＮＡに対する相補的’
Ｈ−ＤＮＡ、塩基３ｏｏ〜６ｏ。
得られる。 ゛ 実施例１０ １、 ２ Ｘ ＩＦ” ｎａｇのポリオＩ （Ｐｏ１ｉ
ｏ Ｉ ）ＲＮＡ七２ Ｘ １０＝ ｒｎｃｇ （１）
”Ｈ−ｅ ＤＮＡ （ｒＨリオＲＮＡに対する相補的’
Ｈ−ＤＮＡ、塩基３ｏｏ〜６ｏ。
個分の長さ）とを含む０２チＳＤＳ、１０−”ＭＥＤＴ
Ａ水溶液ｏ、 ｉ ＋ＲｔとｐＨ＝ ６．８の４．８Ｍ
リン酸ナトリウム０．１−とを十分に混合する。
Ａ水溶液ｏ、 ｉ ＋ＲｔとｐＨ＝ ６．８の４．８Ｍ
リン酸ナトリウム０．１−とを十分に混合する。
２、 この混合物を７６Ｃでインキュベートし、特定時
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈し、ハイ
ブリッド形成検出アッセイに７５）ける。
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈し、ハイ
ブリッド形成検出アッセイに７５）ける。
この方法では６０ ｒ、 ０．１８Ｍ Ｎ龜という標準
参考条件下での速度の３３００倍のハイブリッド形成速
度が得られる。
参考条件下での速度の３３００倍のハイブリッド形成速
度が得られる。
実施例１１
Ｂ、過剰ＲＮＡ： １ｍ容量
１、 ２Ｘ１０−”ｒｎｃｇのポリオＩ ＲＮＡと塩基
３００〜６００個分の長さのポリオ’Ｈ−ｃ ＤＮＡ
２ Ｘ １０−’ｍＣｇとを含む１０−”ＭＥＤＴ人、
０．２ ％ ５ＤＳＯ，５−をｐＨ＝ ６．８の４，
８Ｍリン酸ナトリウム０．５−と十分圧混合する。
３００〜６００個分の長さのポリオ’Ｈ−ｃ ＤＮＡ
２ Ｘ １０−’ｍＣｇとを含む１０−”ＭＥＤＴ人、
０．２ ％ ５ＤＳＯ，５−をｐＨ＝ ６．８の４，
８Ｍリン酸ナトリウム０．５−と十分圧混合する。
２、 この混合物を７６０でインキュベートし、特定時
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
この方法では参考条件下での速度の３３００倍のハイブ
リッド形成速度が得られる。
リッド形成速度が得られる。
実施例１２
場合
１、 ２ ｘ １０−” ｍｃｇのポリオニＲＮＡと２
Ｘ １０−４ｍｃｇ（Ｑｒｔ！リオＩ ”Ｈ−ｃ Ｄ
ＮＡ （塩基３０ｏ〜６００個分の長さ）と５ ｍｃｇ
の子牛肝臓ＲＮＡ十分に混合する。
Ｘ １０−４ｍｃｇ（Ｑｒｔ！リオＩ ”Ｈ−ｃ Ｄ
ＮＡ （塩基３０ｏ〜６００個分の長さ）と５ ｍｃｇ
の子牛肝臓ＲＮＡ十分に混合する。
２、 この混合物を７６Ｃでインキュベートし、特定時
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイＫかける。
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイＫかける。
この方法では参考条件の場合の６００倍の反応速度がイ
；Ｆられる。
；Ｆられる。
実施例１３
Ｄ、過ｆ１ＤＮＡ：
Ｌ １．５ Ｘ １０−’ ｍａｇの”Ｈ−ｃＤＮＡ
とレジオネチサルコシル０．０１２−とｐＨ＝６．８の
４．８Ｍリン酸ナトリウム０．０２ｍとを十分に混合す
る。
とレジオネチサルコシル０．０１２−とｐＨ＝６．８の
４．８Ｍリン酸ナトリウム０．０２ｍとを十分に混合す
る。
前記”Ｈｅ ＤＮＡ （塩基１００〜３００個分の長さ
）は前記ＲＮＡの約十に対して相補的であるにすぎない
。この相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ配列の（！ＤＮＡ／ＲＮ
Ａ比は約４／１である。
）は前記ＲＮＡの約十に対して相補的であるにすぎない
。この相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ配列の（！ＤＮＡ／ＲＮ
Ａ比は約４／１である。
２、 この混合物を７６Ｃでインキュベートし、特定時
点で一部を採取する。各一部を前述の如（希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
点で一部を採取する。各一部を前述の如（希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
この方法では参考条件下での速度の３０００倍以上の反
応速度が得られる。
応速度が得られる。
実施例Ｉ４
に対して相補的な１０””’ ｍｃｇの”Ｈ−ｃ ＤＮ
Ａ（塩基１００〜３００個分の長さ）と約６ＸＩＯ−’
Ｍ ＥＤＴＡ、１．４Ｘｌｏ−”Ｍ ＥＧＴＡ、ｏ、７
％ＳＤＳ。
Ａ（塩基１００〜３００個分の長さ）と約６ＸＩＯ−’
Ｍ ＥＤＴＡ、１．４Ｘｌｏ−”Ｍ ＥＧＴＡ、ｏ、７
％ＳＤＳ。
０．３チサルコシル０．０１２１ＲｔをｐＨ＝６．８の
４．８Ｍリン酸ナトリウム０．０２−と十分に混合する
。
４．８Ｍリン酸ナトリウム０．０２−と十分に混合する
。
２、 この混合物ｔ−７６Ｃでインキュベートし、特定
時点で一部を採取する。
時点で一部を採取する。
各一部を前述の如く希釈しハイブリッド形成ｔａ出アッ
セイＫかける。
セイＫかける。
この方法では参考条件での速度の１５０倍以上の反応速
度が得られる。
度が得られる。
実施例１５
Ｆ、過剰ＲＮＡ ：未精製ＲＮＡ
１、大ＰＪ！Ｆａ （Ｅ、 Ｃａ１ｌ ）リポソームＲ
ＮＡに対して相補的なＩ Ｆ” ｍｃｇの”Ｈ−ｃ Ｄ
ＮＡ （塩基１００〜３００個分の長さ）と約７ Ｘ
１０−’ ｍｃｇのリポソームＲＮＡを含む５０００個
の大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１ｔ ）バクテリアとを含む０．
１６％サルコシル０．０１２ｍｇをｐＨ＝６．８０４．
８Ｍリン酸ナトリウム０．０２ｍと十分に混合する。
ＮＡに対して相補的なＩ Ｆ” ｍｃｇの”Ｈ−ｃ Ｄ
ＮＡ （塩基１００〜３００個分の長さ）と約７ Ｘ
１０−’ ｍｃｇのリポソームＲＮＡを含む５０００個
の大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１ｔ ）バクテリアとを含む０．
１６％サルコシル０．０１２ｍｇをｐＨ＝６．８０４．
８Ｍリン酸ナトリウム０．０２ｍと十分に混合する。
２、 この混合物を７６Ｃでインキュベートし、特定時
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
この方法では参考条件での速度の１００倍以上の反応速
度が得られる。
度が得られる。
実施例１６
硫酸ナトリウムによるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成
速度の増加 １、 ２Ｘ１０−”ｍｅｇのポリオＩ ＲＮＡとポリオ
Ｉ ＲＮＡに対して相補的な２×ｌ〇一番ｎｃｇの”Ｈ
−ｃ ＤＮＡ （塩！ ３００〜６００個分の長さ）混
合する。
速度の増加 １、 ２Ｘ１０−”ｍｅｇのポリオＩ ＲＮＡとポリオ
Ｉ ＲＮＡに対して相補的な２×ｌ〇一番ｎｃｇの”Ｈ
−ｃ ＤＮＡ （塩！ ３００〜６００個分の長さ）混
合する。
２、 この混合物を７ＦＣでインキュベートし、特定時
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
この方法では参考条件速度の３０００倍以上の反応速度
が得られる。
が得られる。
実施例１７
１、 ２ Ｘ １０””” ｎｃｇのポリオＩ ＲＮＡ
とポリオ１ＲＮＡに対して相補的な２ Ｘ １０−’
ｍｃｇの３Ｈ−ｃ ＤＮＡ （塩基３００〜６００の長
さ）とを含む０．２％ＳＤ８．１０−”ＭＥＤＴＡｏ、
１−を０．１−の４Ｍｍ酸アンモニウムと十分に混合す
る。
とポリオ１ＲＮＡに対して相補的な２ Ｘ １０−’
ｍｃｇの３Ｈ−ｃ ＤＮＡ （塩基３００〜６００の長
さ）とを含む０．２％ＳＤ８．１０−”ＭＥＤＴＡｏ、
１−を０．１−の４Ｍｍ酸アンモニウムと十分に混合す
る。
２、 この混合物を７７Ｃでインキュベートし、特定時
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
点で一部を採取する。各一部を前述の如く希釈しハイブ
リッド形成検出アッセイにかける。
この方法では参考条件速度の約１５００倍の反応速度が
得られる。
得られる。
実施例１８
形成速度の増加
１、 ４ＸＩＯ−”ｍｅｇのＶｓＶＲＮＡとＶＳＶ Ｒ
ＮＡく対して相補的な２ Ｘ １０” ｍｃｇの””Ｉ
−ｃ ＲＮＡ（塩基３００〜８００）長さ）とを含む
０．２％ＳＤ８゜１０−” Ｍ ＥＤＴＡ ０．１ ｍ
を４．４Ｍ硫酸アンモニウム０．１ｍｇと十分に混合す
る。
ＮＡく対して相補的な２ Ｘ １０” ｍｃｇの””Ｉ
−ｃ ＲＮＡ（塩基３００〜８００）長さ）とを含む
０．２％ＳＤ８゜１０−” Ｍ ＥＤＴＡ ０．１ ｍ
を４．４Ｍ硫酸アンモニウム０．１ｍｇと十分に混合す
る。
２．８７Ｃでインキュベートし、特定時点で一部を採取
する。各一部を希釈し儲準リボヌクレアーゼ法によって
ハイブリッド形成検出アッセイを行なう。
する。各一部を希釈し儲準リボヌクレアーゼ法によって
ハイブリッド形成検出アッセイを行なう。
この方法では０．１８ Ｍ Ｎａでの速度の１０００倍
以上の反応速度が得られる。
以上の反応速度が得られる。
実施例１９
１、 ４Ｘ１０−”ｍｃｇのＶｓＶＲＮＡとＶＳＶ Ｒ
ＮＡに対して相補的な２ Ｘ １０’−’ ｍａｇのＶ
ＳＶｌ！’Ｉ−ｃＲＮＡとを含む０．２ ％ ＳＤＳ
、 １０−’ Ｍ ＥＤＴＡｏ、１ゴを４．８Ｍリン酸
ナトリウム０．１−と十分に混合する。
ＮＡに対して相補的な２ Ｘ １０’−’ ｍａｇのＶ
ＳＶｌ！’Ｉ−ｃＲＮＡとを含む０．２ ％ ＳＤＳ
、 １０−’ Ｍ ＥＤＴＡｏ、１ゴを４．８Ｍリン酸
ナトリウム０．１−と十分に混合する。
２．８３Ｃでインキュベートし、特定時点で一部を採取
する。各一部を希釈し標準リボヌクレアーゼ法によって
ハイブリッド形成検出アッセイを行なう。
する。各一部を希釈し標準リボヌクレアーゼ法によって
ハイブリッド形成検出アッセイを行なう。
この方法では参考条件速度の５００倍以上の反応速度が
イＧられる。
イＧられる。
終りに当って、以上説明してきた本発明の実施法は本発
明の原理を示すための説明にすきず、他の核酸沈降剤又
は核酸変性剤を用いるなど種々の変形が本発明の範囲内
で可能であるとＦｉ！解されたい。従って本明細書に開
示した方法は好ましい方法ではおるが、本発明はまさに
これらの方法には限定されない。
明の原理を示すための説明にすきず、他の核酸沈降剤又
は核酸変性剤を用いるなど種々の変形が本発明の範囲内
で可能であるとＦｉ！解されたい。従って本明細書に開
示した方法は好ましい方法ではおるが、本発明はまさに
これらの方法には限定されない。
Claims (32)
- （１）標準参考条件下での反応速度を大幅に上回る反応
速度で分雌状１本鎖核酸分子から２本鎖核酸分子を形成
せしめる改良された方法であつて、 一定量の第一１本鎖核酸分子と、この第一 １本鎖核酸分子の対応塩基配列セグメントに対する相補
的塩基配列セグメントを少なくとも１つ有する一定量の
第二１本鎖核酸分子と、既知濃度の少なくとも１種類の
核酸沈降剤とを含む反応水溶液を調製し、前記既知濃度
は反応速度を標準参考条件下での反応速度に比べて大幅
に増加させるに十分な濃度であり、前記反応水溶液を再
結合の生起し得る温度 でインキュベートし、且つ ２本鎖核酸分子の存在を検出すべくこのイ ンキュベートした反応水溶液のアツセイを行なう 諸ステップを含む方法。 - （２）前記核酸沈降剤が洗浄剤、ジヒドロキシベンゼン
、サルコシル並びにＳＯ＿４、ＰＯ＿４、Ｃｌ及びＨＣ
ＯＯのアルカリ金属塩及びアンモニウム塩の中から選択
される特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （３）前記既知濃度が約１Ｍから約１０Ｍである特許請
求の範囲第１項に記載の方法。 - （４）前記反応水溶液が既知濃度の核酸変性剤をも含む
特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （５）核酸変性剤の前記既知濃度が約５容量％から約９
５容量％である特許請求の範囲第４項に記載の方法。 - （６）前記核酸変性剤が約１０容量％から２０容量％の
濃度のアルコールであり、前記強力核酸沈降剤が（ＮＨ
＿４）＿２ＳＯ＿４である特許請求の範囲第４項に記載
の方法。 - （７）前記反応水溶液のｐＨが約４から約１１である特
許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （８）前記温度がほぼ室温から約９０℃の値である特許
請求の範囲第１項に記載の方法。 - （９）前記強力核酸沈降剤がリン酸ナトリウムである特
許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （１０）前記核酸沈降剤がＮａＳＯ＿４である特許請求
の範囲第１項に記載の方法。 - （１１）前記核酸沈降剤がＬｉＣｌである特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - （１２）前記核酸沈降剤が（ＮＨ＿４）＿２ＳＯ＿４で
ある特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （１３）前記核酸沈降剤が１３容量％から３０容量％の
サルコシルである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （１４）標準参考条件下での反応速度を大幅に上回る反
応速度で分離状１本鎖核酸分子から２本鎖核酸分子を形
成せしめる改良された方法であつて、 一定量の第一１本鎖核酸分子と、この１本 鎖核酸分子の対応塩基配列セグメントに対する相補的塩
基配列セグメントを少なくとも１つ有する一定量の第二
１本鎖核酸分子と、水溶液に混和し得且つ水溶液から１
本鎖核酸分子を沈降させ得る既知濃度の少なくとも１種
類の核酸沈降剤とを含む反応水溶液を調製し、この反応
水溶液を再結合の生起し得る温度 でインキュベートし、且つ ２本鎖核酸分子の存在を検出すべく前記イ ンキュベートした反応水溶液をアツセイにかける 諸ステップを含む方法。 - （１５）前記核酸沈降剤が洗浄剤、ジヒドロキシベンゼ
ン、サルコシル並びにＳＯ＿４、ＰＯ＿４Ｃｌ及びＨＣ
ＯＯのアルカリ金属塩及びアンモニウム塩の中から選択
される特許請求の範囲第 １４項に記載の方法。 - （１６）前記既知濃度が約１Ｍから約１０Ｍである特許
請求の範囲第１４項に記載の方法。 - （１７）前記反応水溶液が既知濃度の核酸変性剤をも含
む特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 - （１８）核酸変性剤の前記既知濃度が約５容量％から約
９５容量％である特許請求の範囲第１７項に記載の方法
。 - （１９）前記核酸変性剤が約１０容量％から２０容量％
の濃度のアルコールであり、前記強力核酸沈降剤が（Ｎ
Ｈ＿４）＿２ＳＯ＿４である特許請求の範囲第１７項に
記載の方法。 - （２０）前記反応水溶液のｐＨが約４から約１１である
特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 - （２１）前記温度がほぼ室温から約９０℃の値である特
許請求の範囲第１４項に記載の方法。 - （２２）標準参考条件下での反応速度を大幅に上回る反
応速度で分離状１本鎖核酸分子から２本鎖核酸分子を形
成せしめる改良された方法であつて、 一定量の第一１本鎖核酸分子と、この１本 鎖核酸分子の対応塩基配列セグメントに対する相補的塩
基配列セグメントを少なくとも１つ有する一定量の第二
１本鎖核酸分子とを含む反応水溶液を調製し、 前記反応水溶液を既知濃度の少なくとも１ 種類の核酸沈降剤を含む第２溶液と混合し、この核酸沈
降剤は水溶液と混和し得且つ水溶液から１本鎖核酸分子
を沈降させ得る作用をもち、 得られた混合物を再結合の生起し得る温度 でインキュベートし、且つ ２本鎖核酸分子の存在を検出すべく前記の インキュベートした混和物をアツセイにかけ諸ステップ
を含む方法。 - （２３）前記核酸沈降剤が洗浄剤、ジヒドロキシベンゼ
ン、サルコシル並びにＳＯ＿４、ＰＯ＿４Ｃｌ及びＨＣ
ＯＯのアルカリ金属塩及びアンモニウム塩の中から選択
される特許請求の範囲第 ２２項に記載の方法。 - （２４）前記既知濃度が約１Ｍから約１０Ｍである特許
請求の範囲第２２項に記載の方法。 - （２５）前記反応水溶液が既知濃度の核酸変性剤をも含
む特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 - （２６）核酸変性剤の前記既知濃度が約５容量％から約
９５容量％である特許請求の範囲第２５項に記載の方法
。 - （２７）前記核酸変性剤が約１０容量％から２０容量％
の濃度のアルコールであり、前記強力核酸沈降剤が（Ｎ
Ｈ＿４）＿２ＳＯ＿４である特許請求の範囲第２５項に
記載の方法。 - （２８）前記反応水溶液のｐＨが約４から約１１である
特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 - （２９）前記温度がほぼ室温から約９０℃の値である特
許請求の範囲第２２項に記載の方法。 - （３０）標準参考条件下での反応速度を大幅に上回る反
応速度で分離状１本鎖核酸分子から２本鎖核酸分子を形
成せしめる改良された方法であつて、 擬似核酸沈降剤をスクリーニングにかけて、反応速度を
標準参考条件下での速度より大幅に増加させるのに必要
な前記擬似核酸沈降剤の有効濃度と対応インキュベーシ
ョン温度とを求め、 一定量の第一１本鎖核酸分子と、この１本 鎖核酸分子の対応塩基配列セグメントに対する相補的塩
基配列セグメントを少なくとも１つ有する一定量の第二
１本鎖核酸分子と、前記有効濃度の前記核酸沈降剤とを
含む反応水溶液を調製し、 この反応水溶液を前記インキュベーション 温度でインキュベートし、且つ ２本鎖核酸分子の存在を検出すべく前記の インキュベートした反応水溶液をアツセイにかける 諸ステップを含む方法。 - （３１）前記擬似核酸沈降剤のスクリーニングを、各が
既知量の１本鎖核酸と種々の量の前記 擬似核酸沈降剤とを含むような一連の溶液を調製し、 核酸沈降物の存在を検出すべく前記各溶液 を検査し、且つ 沈降物の検出された溶液を加熱して沈降度 が変化するか否かを調べる 諸ステップにより実施する特許請求の範囲 第３０項に記載の方法。 - （３２）反応速度の速い核酸再結合反応に使用するため
の擬似核酸沈降剤のスクリーニング法であつて、 各が既知量の１本鎖核酸と種々の量の前記 擬似核酸沈降剤とを含むような一連の溶液を調整し、 核酸沈降物の存在を検出すべく前記各溶液 を検査し、且つ 沈降物の検出された溶液を加熱して沈降度 が変化するか否かを調べる 諸ステップからなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62779584A | 1984-07-05 | 1984-07-05 | |
| US627795 | 1996-04-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6181800A true JPS6181800A (ja) | 1986-04-25 |
| JPH082319B2 JPH082319B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=24516162
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60146443A Expired - Lifetime JPH082319B2 (ja) | 1984-07-05 | 1985-07-03 | 核酸の再結合をより速く生起させる方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0167366B1 (ja) |
| JP (1) | JPH082319B2 (ja) |
| AT (1) | ATE152116T1 (ja) |
| AU (1) | AU4457385A (ja) |
| CA (1) | CA1337551C (ja) |
| DE (1) | DE3588154T2 (ja) |
| FI (1) | FI852625L (ja) |
| IL (1) | IL75648A0 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2006-07-20 | Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社 | 緩衝剤組成物 |
| JP2008541070A (ja) * | 2005-05-09 | 2008-11-20 | オリオン ダイアグノスティカ オーワイ | 結合物質および被分析物の結合速度の測定 |
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|---|---|---|---|---|
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| US5310650A (en) * | 1986-09-29 | 1994-05-10 | Abbott Laboratoires | Method and device for improved reaction kinetics in nucleic acid hybridizations |
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| US6045996A (en) | 1993-10-26 | 2000-04-04 | Affymetrix, Inc. | Hybridization assays on oligonucleotide arrays |
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| TWI419974B (zh) | 2008-10-27 | 2013-12-21 | Qiagen Gaithersburg Inc | 於自動平台上之快速結果雜交捕捉法 |
| EP2224018B1 (de) * | 2009-02-25 | 2014-04-30 | QIAGEN GmbH | Hybridisierungs- und Detektionspuffer |
| WO2010127228A1 (en) | 2009-05-01 | 2010-11-04 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample |
| JP5826752B2 (ja) | 2009-09-14 | 2015-12-02 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 細胞学用培地に固定された組織サンプルから核酸またはタンパク質を回収するための組成物および方法 |
| CA2787924A1 (en) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
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| EP2572001A2 (en) | 2010-05-19 | 2013-03-27 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
| WO2012116220A2 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Materials and methods for detection of hpv nucleic acid |
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- 1985-06-26 IL IL75648A patent/IL75648A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-06-28 AT AT85304635T patent/ATE152116T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-28 DE DE3588154T patent/DE3588154T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-28 EP EP85304635A patent/EP0167366B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-03 FI FI852625A patent/FI852625L/fi not_active Application Discontinuation
- 1985-07-03 JP JP60146443A patent/JPH082319B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-04 CA CA000486298A patent/CA1337551C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-07-04 AU AU44573/85A patent/AU4457385A/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|
| AU4457385A (en) | 1986-01-09 |
| IL75648A0 (en) | 1985-10-31 |
| EP0167366B1 (en) | 1997-04-23 |
| FI852625A0 (fi) | 1985-07-03 |
| JPH082319B2 (ja) | 1996-01-17 |
| EP0167366A3 (en) | 1987-06-03 |
| FI852625A7 (fi) | 1986-01-06 |
| ATE152116T1 (de) | 1997-05-15 |
| DE3588154D1 (de) | 1997-05-28 |
| DE3588154T2 (de) | 1997-08-07 |
| EP0167366A2 (en) | 1986-01-08 |
| FI852625L (fi) | 1986-01-06 |
| CA1337551C (en) | 1995-11-14 |
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