JPS6184559A - 免疫原抱合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃα２４−、ヤンネル・ブロッカ−（ｃｈａｎｎｅｌｂ
Ｌｏｃｋｅｒｓ　）は種々な心臓血管障害の処置に対し
て広く用いられている。ニフェジピン（Ｎｉｆｅｄｉ−
ｐｉｎｅ　）、ニトレンジピン（ｎ１ｔｒｅｆＬｄｉｐ
ｉｘｅ　）、ニソルジピン（ｎ１ａｏｌｄｉｐｉｎｅ　
）、ニモジピン（ｎｉｍ、ｏｄｉｐｉｎｓ　）及び関連
した１、４−ジヒドロピリジン類（以下にまたＤｉｐｓ
として示す）はＣα２＋　チャンネル・ブロッカ−の最
も効力のある群である。放射受容器及び高速液体クロマ
トグラフィー分析がヒト血清中のこれらの試薬の測定に
有効であるが、しかしながら、かかる方法は扱いにくく
且つ高価であり、そして大規模な使用に対しては容易に
受は入れられない。

本発明は免疫原性担体物質と結合したＤＨＰ誘導体及び
免疫原抱合体に対して調製した抗体からなる免疫原抱合
体を提供する。かかる抗体は生体液中のＤＨｐｓを測定
する際の免疫測定法（１ｒｒｒｒｒｎｂ−ｎｏα８８α
１１８）に有用であり、かくして、大規模な使用に対し
７て迅速且つ敏感な検定に対する要求を満たすものであ
る。

ジャニス（Ｊａｎｉｓ　）等〔ジエイ・タリノ・ファー
　マコ／ｌ／　（Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｐんａｒｍａｃｏｌ、
）　２３　、２６６〜２７３　（１９８３））は血清試
料中のカルシウム・チャンネル拮抗剤ニトレンジピンに
対する放射受容器及び高速液体クロマトグラフィー分析
の開発を述べている。クロール（Ｋｒｏｌ　）　等バジ
ャーナル・オプ・クロマトグラフィー（Ｊ、Ｃｈγｏｍ
α−ｔｏｇｒａｐんｙ）、１９８３（印刷中）において
、血液、血漿及び脳を髄液中のカルシウム・チャンネル
拮抗剤ニモジピンのガス及び液体クロマトグラフ分析を
示唆している。

上記の文献は、本発明において開示される免疫原抱合体
またはこれに起因する抗体、或いは１゜４−ジヒドロピ
リジン類に対する免疫測定法における該抗体の用途を記
述または示唆していない。

本発明は１．４−ジヒドロピリジン誘導体に結合した免
疫原性担体物質の１．４−ジヒドロピリジン免疫原抱合
体を開示する。開示される免疫原抱合体は次の一般式の
ものである： 式中、Ｒは蛋白質またはポリペプチドである。

また本発明は式■の免疫原抱合体に対して調製された抗
体及び免疫測定法におけるその用途を示す。

また抗血清から１．４−ジヒドロピリジン類に対して特
異的な抗体の精製に有用なアフィニティー・カラム（ａ
ｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｏｌｕｍｎ　）を開示する。

該アフィニティー・カラムは一般式 式中、Ｘは遊離の有効なアミノ官能基を有する不溶性の
支持マトリックスである、によって表わされる１、４−
ジヒドロピリジン含有免疫吸着剤抱合体（ｓｖａｒｍｎ
ｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｃｏｎ−ｊｘｇａｔｇｓ　）か
らなる。

この免疫吸着剤抱合体は、１．４−ジヒドロピリジン類
に対して特異的抗体を含む抗血清から該抗体を精製する
際に用いられる。この精製法には、（ａ）１，４−ジヒ
ドロピリジン類に対して特異的抗体を含む抗血清と１．
４−ジヒドロピリジン含有免疫吸着剤抱合体との混合物
を培養し、これによって該抗体を該抱合体に結合させ：
（ｂ）工程・（ａ）の混合物を洗浄して非特異的に結合
した物質を除去し；そして（Ｃ）工程（ａ）の混合物を
約Ｏ℃〜約ｌＯ°Ｃで解離剤と共に培養して、該抱合体
から該抗体を解離させ、これによって官能性抗体の回収
率を高め、そしてこのものから該抗体を単離する工程が
含まれる。

免疫原抱合体を調製する際に用いるＤＨＰ誘導体はニフ
ェジピンの関連同族体であり、化学的には１．４−ジヒ
ドロ−２，６−シメチルー４−（２−インチオ７アナト
フエニル）−３，５−ビリジ／カルボン酸ジメチルエス
テル（以下にニフエジピン−イソチオシアネートとして
示す）であり、そして式 によって表わされる。ニフエジピン−イソチオシアネー
トは二ニー・イングランド・ニュークリア社（Ｎｅｗ　
Ｅｎｄｌａｎｄ　Ｎ１Ｌｃｌｅａｒ　Ｃａｒｐ、）から
市販されているか、或いはペンタ−（Ｖｅｎｔｅｒ　）
等によりザ・ジャーナル・オプ・ビオロジカル・ケミス
ト　リ−（Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ　）　、第
２５８（１５）巻、９３４４〜９３４８　（１９８３）
に記載された如くして製造され、この文献を本明細書に
参照例として加える。

ニフエジピン−イソチオシアネートは、後記の如く、免
疫原性担体物質に共有結合する。免疫面性担体物質は、
ニフエジピン−イソチオシアネート誘導体に結合するた
めに利用できるアミン官能基を有する蛋白質またはポリ
ペプチドであることができる。免疫原性担体が蛋白質性
物質である場合、該担体を、ニフエジピン−イソチオシ
アネート対担体の比が少なくとも約１：１を有する免疫
原抱合体を生成させるために、十分な高儂度で存在する
ニフエジピン−イソチオシアネートと共に培養する。ニ
フエジピン−イソチオシアネートの十分な高濃度は、培
養中にニフェジピン−インチオファネートの溶解度を保
持するだめに十分な量のエタノールを含ませることによ
って、保持することができる。

免疫原性蛋白質及びポリペプチドは大部分は分子量４，
０００乃至１０，０００，０００間、好ましくは１５．
０００よυ大、そして更に通常５へ０００より犬を有す
るであろう。一般に、１動物種から採った蛋白質は、他
種動物の血清に導入した際、免疫原性であろう。殊に有
用な蛋白質はアルブミン、グロブリン、酵素、ヘモシア
ニン、グルテリン、顕著な非蛋白質性成分を有する蛋白
質、例えば糖蛋白質、等である。更に、普通の免疫原性
担体物質及びこれにハプテンを結合させる方法に関連す
る当該分野の現状での文献は次のものを挙げるべきであ
る（各々これらの文献を本明細書に参照例として加える
）：・ぐ−カ−（Ｐａｒｋｅｒ　）、生物学的活性化合
物のラジオイムノアッセイ（Ｒａ−ｄｉｏｉｍｒｎｂｎ
ｏａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　Ａｃ
ｔｉｖｅＣｏｍｐｏｌＬｎｄｓ　）、プＶ７テイスーホ
ール（ｐｒｅｎ−ｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ　）（Ｅｎｇｌｅ
ｗｏｏｄ　Ｃ１１ｆｆｓ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒ−ｓｅｙ　Ｕ
、Ｓ、Ａ、、　　１９７６　）　　；パトラ−（Ｂｕｔ
ｌｅｒ）、ジエイ・イムツル・メス（Ｊ　、　Ｉｍｍ、
ｗｎｏ　ｌ　、ｈｌｅ　ｔん、）、７：１−２４（１９
７４）；ウエインリ（Ｗｅｉｎ−ｒｙｂ　）　及びシュ
ｏ　７　（５ｈｒｏｆｆ　）、ドラッグ・メタブーｖブ
（Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂ、Ｒｔｔｖ、）、１０：２７１
−２８３　（１９７５）；ブロード７　（ＢｒｏｌＬｇ
ｈｔｏｎ）及びストロング（Ｓｔｒｏｎｇ　）　、リジ
ン・ケム（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、）、　２２ニア２６−
７３２　（１０７６）；並びにプレイ７ｘ−７（ｐｌａ
ｙｆａｉｒ　）等、プル・メト・プル（Ｂデ、Ｍｔｔｄ
、Ｂｕｌｌ、　）　、　３０　：　２４−ａｌ（１９７
４）。免疫原性担体物質として用いるために好ましい蛋
白質はウシ血清アルブミン、カゼイン、オバルプミン及
びアオガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニ
ンである。殊にアオガイヘモシアニンが最も好ましい。

本免疫原抱合体を用いる特定の抗体の調製は全て普通の
方法に従うことができる。抗体産生を銹発する基本的見
解を述べた多くの文献が利用できる。例えば上記の・セ
ーカー、生物学的活性化合物のラジオイムノアッセイ参
照、この文献を本明細書に参照例として加える。通常の
場合、宿主動物、側光ばウサギ、ヤギ、マウス、モルモ
ット、ヒツジまたはウマに種々な部位の１個所またはそ
れ以上に、通常補助剤との混合物として免疫原抱合体を
注射する。更に、規則正しいまだは不規則な間隔で同一
部位または異なる部位に注射を行い、その後、採血し、
最適力価に達したことが測定されるまで、抗体力価を査
定する。特異的抗血清の適当な容量を得るために、宿主
動物から採血を行う。

この抗血清自体を実際の評価分析を行う際に用いること
ができるか、或いは精製工程を経て望ましくない物質、
例えば非特異的抗体等を除去することができる。かかる
精製法には、硫酸アンモニウムを用いて、或いは、例え
ば後記の如く、ニフエジピン−イソチオシアネート及び
ＡＨ−セフアロース（ＡＨ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　
４　Ｂまたはニフエジピン−イソチオシアネート及びリ
ジン−セフアロース４Ｂから調製した不溶性１，４−ジ
ヒドロピリジン含有免疫吸着剤抱合体からアフィニティ
ー精製によって、抗血清からＩｇＧフラクションの調製
が含まれる。次に１．４−ジヒドロピリジン含有免疫吸
着剤抱合体を用いで、抗体を含む抗血清から抗体を精製
する。抗血清を所望の免疫吸着剤抱合体（好ましくはニ
フエジピ／−インチオシアネート及びＡＨ−セフアロー
ス４Ｂまたはニフエジピン−イソチオシアネート及びリ
ジン−セフアロース４Ｂから調製した抱合体）と共に培
養し、この培養は１．４−ジヒドロピリジン−特異的抗
体を抱合体に結合させるための役割を果たす。次にこの
混合物を、例えばリン酸塩緩衝された塩水または塩化す
）　ＩＪウム溶液で洗浄して、非特異的に結合した物質
を除去する。洗浄に続いて、この混合物を抱合体から結
合した抗体を解離させ得る溶液と共に培養する。この溶
液は、かかる解離に影響を及ぼし、一方官能性抗体の回
収率を高めるために役立ち得る全ての溶液である。塩化
ナトＩＪウム及びジオキサンを含むアルカリ性溶液がか
がる解離に対して好ましい。殊に好ましくは塩化ナトリ
ウム約ＩＪ　ジエチルアミン約５０ｍＭ及びジオキサン
約１０％を含むｐＨ値約１１の溶液である。この培養を
約０℃〜１０℃、好ましくは約０℃〜４℃で行うことが
できる。次に解離した抗体の単離は普通の方法で行われ
る。

ＤＨｐ−特異的抗体の存在に対する最初の試験は次の如
く、免疫原抱合体の間接的免疫−過酸化酵素染色法を用
いて行うことができる。対照（非標識）及びニフェジピ
ン−蛋白質免疫原抱合体（免疫化に用いた担体二フェジ
ぎンー蛋白質抱合体とは異なる）をニトロセルロース紙
上に点在させるか、ＳＤＳグル電気泳動法に従って、ニ
トロセ／ｌ／ロースｍ上に８ｆ。このニトロセルロース
ノじみを試験抗血清と、次に過酸化酵素に抱合された第
二の抗体と共に培養し、次に過酸化酵素基質によって展
開させる。正の抗血清はニフェジピン−蛋白質抱合体と
反応するが、しかし非標識蛋白質とは反応しない。

免疫原抱合体に対して調製した抗体はすぐれた特異性を
与えることが見出された。ニトレンジピンの不活性代謝
産物並びに構造的に関連せぬカルシュラム・チャンネル
・ブロッカ−・ヘラ／ソミル（ｖｅｒａｐａｔｎｉｌ　
）及びジル−１−７セム（ｄｉｌｔｉａｚｅｍ　）は該
抗体と交す反応しない。更に、当該分野に精通せる者に
とっては、特異的１．４−ジヒドロピリジン類に対する
モノクロナール抗体は次の如き標準法によって調製され
得ることが容易に理解されよう。雌ＢＡＬＥ／Ｃ’マウ
スをニフェジピンインチオシアネート−アカガイヘモシ
アニン免疫原抱合体で免疫にし、次に４週間後、同一抱
合体で３回増強する。血清試料をラジオイムノアッセイ
（ｒ（ｘｄｉｏｉｔｒａｎｒｂｎｏａａｓａｙ　）及び
間接免疫点測定法を用いて試験し、抗−１，４−ジヒド
ロピリジン抗体の高力価を確実にする。ポリエチレング
リコールを用いて、免疫したマタス及び骨髄腫細胞（Ｎ
Ｓ−１）から牌細胞の等数によって融合を行う。

各々融合による細胞を２０個の９６−ウェル・マイクロ
タイター・プレート（９６−ｗｅｌｌ　ｍ１ｃｒｏ−ｔ
ｉｔｔｔｒ　ｐｌａｔｅｓ　）に塗布する。抗−１，４
−ジヒドロピリジン抗体を産生ずるハイプリドーマ（ｌ
ｌｙｂデｉｄｏｍα）集落を、間接免疫過酸化酵素斑点
測定法を用いて、二７エジビ／ウシ血清アルブミンに対
して選定する。

好ましくは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において
、生物試料中に存在するＤＨＰの量を決定する際に、免
疫原抱合体から誘導された抗体を用いるべきである。し
かしながら、またかかる抗体が種々な他の測定法におい
て必要であることはよく知られている。下記のラジオイ
ムノアッセイと同等と考えられる測定法には不均質及び
均質酵素標識結合測定法、ケイ光標識結合測定法並びに
化学ルミネッセンス結合測定法が含まｎる。かかる測定
法は生物試料中の全てのジヒドロピリジン、例えばニト
レ／ジビ／、ニアニジビン、ニソルジピン、ニモジピン
等における濃度を決定するために用いることができる。

１．４−ジヒドロピリジン類に対するＲＩＡは、生物試
料中の１．４−ジヒドロピリジン類並びに１．４−ジヒ
ドロピリジン類に対して高度の特異性及び親和性を有す
る抗体に対して放射性標識１゜４−ジヒドロピリジン、
例えば放射性標龍二トレンシヒン（即ち、２．６−シメ
チルー３−ｔｊルボエトキシ−５−カルボメトキシ−４
−（３−ニトロフェニル）〜１．４−ジヒドロヒＩＪ　
、）ン）Ｏ一定量間の競合に基ずくものである。放射性
標識ニトレンジピンは当該分野においてよく知られた方
法において、適当な放射性核種によって標識することが
できる。試薬に使用する際に普通の且つ本発明に使用し
得る放射性核種のリストは、二ニー・イアｐ”ランド・
ニュークリア社（Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｃｉ　Ｎｕｃ
ｌｅａｒ、　１９７７　）のカタログの１９７８年版の
８１頁に見出される放射性核種の索引に示されており、
このリストを本明細誉に参照例として加える。利用し得
る放射性核りには次のものが含まれる：水素−３（トリ
チウム）及びヨウ素の放射性同位元素（＋２３１゜１２
４Ｉ、　１２３１．１１６Ｉ、１２ａＩ、ｌ！ｔ＋ｒ　
、　＋３１１及び　＋３２７）。

有効性、半減期及び特異的活性、セして／または普通の
液体シンチレーション計数器を用いて容易に検出し得る
能力を省慮して、３Ｈが好ましい。

ＲＩ　Ａは当該分野において公知の方法によって行うこ
とができる。例えば免疫原抱合体に対して調製した抗体
を含む抗血清（または硫酸アンモニウム精製によって得
られるＩＱフラクションもしくはアフィニティー精製し
た抗体）を放射性標識ニトレンジピン（または他の放射
性標識１．４−ジヒドロピリジン）を含む緩衝剤で適当
な濃度に希釈し、そして適当な条件下で、測定する生物
試料または標準曲線を作成するために用いる標準溶液が
平衡になるまで培養する。遊離１．４−ジヒドロピリジ
ンから、抗体に見出される１、４−ジヒドロピリジンの
分離はよく知られた方法、例えばデキストラン−被覆し
た木炭、プロティン・エイ・セファｏ−ス（ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）ビーズ二重抗体法等
を用いて行われる。好ましくは、この分離はデキストラ
／−被覆した木炭を用いて行われる。分離された物質の
１つの放射能を例えばウニルータイブ（ｗｅｌｌ−ｔｙ
ｐｅ　）シンチレーション計数器で計数し、同一方法で
測定した標準溶液に対して得られた値に基ずいて標準曲
線を作図する。次に試験する生物試料中のＤＨｐレベル
をこの標準曲線に基すいて決定する。

以下の実施例は本発明を説明するために示したものであ
シ、本発明を限定するものと解釈すべきではない。

実施例１ 免疫原抱合体の調製 二ニー・イングランド・ニュークリア社製ニフエジピン
−イソチオシアネート（１，４−ジヒドロ−２，６−シ
メチルー４−（２−インチオシアナトフェニル）−３，
５−ピリジンジカルボン酸ジメチルエステル）を次の如
くしてウシ血清アルブミンに結合させた。ウシ血清アル
プミ／（１０■）をｔｏｏｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ
値９．０）１０−に溶解し、次にニフエジピン−イソチ
オシアネート（エタノールに溶解し、培養媒質中のエタ
ノールの最終濃度を０．６５％にしたもの）０．６可と
共に暗所にて室温で振盪しながら２４時間培養し、かく
して所望のニフエジピン−イソチオシアネートウシ血清
アルブミン免疫原抱合体を産生させた。該抱合体の産生
を、ウシ血清アルブミンー二フエジビン抱合体の調製物
中に〔３Ｈ〕ニフエジピン−イソチオシアネートを含ま
せて監視した。

ウシ血清アルブミン−Ｃ”Ｈ〕ニフェジピン抱合体（４
ｏ〜４０μｇ）を５ＤＳ−ポリアクリルアミドケ゛ル電
気泳動法によって遊離ニフェジピンから分離し、〔３Ｈ
：１ｌ−７工ジビン合体をフルオログラフィー（ｆｌｗ
ｏｒｏｇｒａｐｈｙ　）またはグル薄片分析法によって
検出した。グル薄片（１５ｍ　）を３０チ過酸化水素０
．８コ中にて４５℃で一夜消化させ、次に液体シンチレ
ーション液を加えた。放射能をベックマン（Ｂｅｃｋｔ
ｎａｎ）ＬＳ８１００計数器を用いて測定した。

また上記の方法を用いて、ニフェジピン−イソチオシア
坏−トをカゼイン、オバルプミン及びアカガイヘモシア
ニンに結合させた。種々な蛋白質（即ち、ウシ血清アル
ブミン、オバルブミン、カゼイン及びアカガイヘモシア
ニン）にニフェジピン−イスチオシアネートを結合させ
る別法は、該蛋白質（２０■）を１００ｍＭ重炭酸ナト
リウム（ｐ＃値９．ｏ　）　２ｍｇに溶解し、次にニフ
エジピン−イソチオシアネート（エタノールに溶解し、
培養媒質中のエタノールの最終濃度３８チにしたもの）
０．８■と共に暗所にて３７℃で振盪しながら２４時間
培養することである。この別法は高蛋白質濃度でニフェ
ジピン抱合体を産生ずる際に有用でおる。

実施例２ 抗体の産生及び単離 １．４−ジヒドロピリジン類に対する抗体を産生ずるた
めに、ウシ血清アルプミン一二フエジビンイノシアネー
トを直接免疫化に用いるか、或いはウサギの免疫化前に
、室温で８時間０．０４％グルタルアルデヒドと交す結
合させた。いずれの場合にも、免疫原抱合体を７０イン
ド責Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）完全補助液の等容量で乳化した
。

ニューシーラント（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　）白色ラ
ビットから、前免疫性血清を得るために採血し、次に背
及び足に沿って多数の部位に筋肉内及び皮肉的に免疫に
した。ウサギにフロイント完全補助液中のウシ血清アル
ブミン一二フェジビンインチオシアネート免疫原抱合体
０．５■を０６に、次にフロイント完全補助液中のイン
サルツ（１ｎｓｕｔｔｓ）０．５ηを２〜３週間毎に与
えた。２週間毎の第３回目の免疫化後、ウサギから採血
を行った。血液を耳静脈から引き出し、４℃で一夜凝固
させ、血清を遠心分離によって単離した。ウシ血清アル
ブミンに産生された抗体を減少させるために、続いてア
カガイヘモシアニン−ニフェジピンインチオシアネート
免疫原抱合体を用いて免疫化を行った。

上記の方法を用いて、またウサギを免疫にし、そして抱
合体に対して産生された特異的抗体を単離するために、
カゼイン一二フエジピンインチオクプレート、オバルブ
ミンーニフエジピンインチオシアネート及びアカガイヘ
モシアニン−ニアニジビンインチオシアネート免疫原抱
合体を用いた。

アカガイヘモシアニンー二フエジビンインチオシアネー
ト免疫原抱合体を水酸化アルミニウム及びリン酸塩緩衝
された塩水の等容量と混合し、４°Ｃで１時間攪拌し、
次に免疫化に用いる前にフロイント完全補助液中で乳化
した。

上記の全ての方法は、ウサギにおける高親和性１．４−
ジヒドロピリジン−特異的抗体を得る際に有利であった
。アカガイヘモシアニ／は最も短い時間（４週間）で１
．４−ジヒドロピリジン−特異的抗体の応答を産生じ、
そして最も高い力価の抗血清を産生じた。また抗−１，
４−ジヒドロピリジン抗体を産生ずるためにヒツジの免
疫化において、ウシ血清アルプミ／−ニアニジビンイン
チオシアネート免疫原抱合体及びアカガイヘモシアニン
ーニフエジピフインチオシアネート免疫原抱合体を用い
た。

１．４−ジヒドロピリジン−特異的抗体（実施例２に述
べた如くして得られたもの）を、冷時２４時間、５０％
硫酸アンモニウム沈降によって、抗血清から部分的に精
製した。次に沈降したＩＱＧフラクションをリン酸塩緩
衝された塩水に懸濁させ、冷時２４時間、リン酸塩緩衝
された塩水に対して透析した。

実施例３ ニフェジピン−セフアロースアフィニティーカラムの調
製 二ニー・イングランド・ニュークリア社製ニフエジピン
−イソチオシアネートを次の如くして、薬局から得られ
たＡＨ−セフアロース４Ｂに結合させた。ＡＲ−セフｌ
ａ−，ｘ、４Ｂ　（ｓｌ　）を２０ｍＭ重炭酸ナトリウ
ム（ｐＨ値９．０）８０−に３回再懸濁させて洗浄し、
次に重炭酸す）　ＩＪウム（ｐＨ値＆０）１００−に再
懸濁させた。ニフェジピ／−イソチオシアネート（１０
■）を９５チェタノール１０ｒｎ！、に溶解し、トレー
サーとしテＣ”Ｈ”にフエジビンーインチオシアネ　）
（８３（：’ｚ／ミリモル）５μｌを加えた。次にＡＨ
−セフアロース４Ｂビーズ（２５ｒｎｌ）、ニフェジピ
ンーイソチオシアネー）　（０，１〜８　ｍｌ　）及び
少なくともエタ／−ル１０％を３７°Ｃで一夜培養した
。次にこノビーズを次の緩衝剤４ｏ−で洗浄した：　０
．１５Ｍ　　ＮａＣｌ　、１０ｍ、Ｍトリス（ＴＲＩＳ
）、７）Ｈ値７．４；１＃ｌリス、ｐＢ値７．５；０．
０５％ツウイー：ｙ−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）による
リン酸塩緩衝された塩水、そして最後に、０．１５Ｍ　
　ＮａＣ２゜１０ｍＭトリス、ｐＨ値４．７、で４回洗
浄した。

次にニフェジピン−セフアロース４Ｂ免疫吸着剤抱合体
を０．１５１ＶＮｔＬＣＬ、　　１０ｔｎＭ　トリスｐ
Ｈ値７．４の２０ｍ１に再懸濁させた。Ａｌ１−セフア
ロースに結合したニアニジピン−インチオシアネートの
百分率をＬＳ８１００液体シンチレー７ヨン計数器でニ
フェジピン−セフアロース４Ｂ免ｆ１着剤抱合体の試料
を計数することによって測足した。

実施例４ ニフェジピン−特異的抗体のアフィニティー精製 実施例３に述べた如くして、ニフェジピン−セフアロー
ス４Ｂアフイニテイーカラム（１，Ｏｔｎｌ充填カラム
）を調製し、ヒツジ抗−ニフェジピン皿清１００−と共
に、静かに振謔しながら室温で２４時間培養した。次に
アフィニティーカラムをり／酸塩緩衝された塩水、次い
で１ｋｆＮａＣ１で広範囲に洗浄した。次にニフエジピ
／−特異的抗体を約θ〜４℃でＩＭＮａＣｌ、５０ｍＡ
ｌジェチル７ミン（ｐＨ（ｉｔｌ、ｓ）及び１０％ジオ
キサンと共に培養して俗離させた。俗離した抗体を、脱
塩するだめに、（ｙ　−２５ｉＳｆセフアロースカラム
に速かに入れ、リン酸塩緩衝された塩水で回収し、これ
によって、抗体を中性ｐＢ値にもどした。

実施ψ１５ ｆＭＪ’Ｊした抗体の免疫斑点特性指摘非標識及びニフ
ェジピン標識蛋白質をニトロセルロース紙上に塗布する
か、或いはニトロセルロース紙上に移し、続いてＳＤＳ
ポリアクリルアミドケ゛ル電気電気泳動性した。ニトロ
セルロース斑点をリン酸塩緩衝された塩水中の０．０５
　％ツウイーノー２０または３チウシ血清アルブミンに
よって室温で１時間ブロッキングした。次に斑点をブロ
ッキング剤の存在下において試肢抗皿清の１：１０〜ｔ
：ｔｏｏｏ８釈によって室温で１時間培養した。洗浄に
ついて１、この斑点をヤギ抗つサギＩｇＧ過酸化酵素抱
合体のｔ：１ｏｏｏ希釈によって１時間培養した。次に
斑点を４−クロロ−１−ナフトールで展開し、続いて洗
浄した。斑点に対する特性は、対照としての非標識蛋白
質を用いて及び／または試験抗血清による最初の培養中
１０７Ｍニトレンジピンを含ませることによって示され
る。

実験データは、調製した抗体が炭酸脱水素酵素に結合し
たニフェジピンを認識するが、一方、非標識炭酸脱水素
酵素と反応しないことを示した。

実施例６ １．４−ジヒドロピリジンラジオイムノアッセイ １．４−ジヒドロピリジンの未知量を含む試料のラジオ
イムノアッセイをＬ　５　ｔｎｔエツペンドルフ（Ｅｐ
ｐｇｎｄｏｒｆ　）管を用イテ暗所で行った。ｌ。

４−ジヒドロピリジン標準試料を塩水中の０．１チウシ
血清アルブミンの一連の希釈によって調製し、４℃で暗
所に保存した。１，４−ジヒドロピリジン−特異的抗体
を実施例２に述べた如くして調製するか、或いは実施例
４に述べた如くしてアフィニティー精製した。次に力価
試験を、〔８Ｈ〕ニトレンジピンにュー・イングランド
・ニューフレア社製）の一定量（例えば２ｏｐＭ）を用
いて、１．４−ジヒドロピリジン−特異的抗体によって
行い、加工た〔３Ｈ〕ニトレンジピ／の５０チを結合す
るために必要な希釈を決定した。

各測定管には試料または標準試料の０．１一部分標本及
び次の検定媒質を含ませた：１５０＊ｔＭＮａＣ１，１
０ｍＭトリ、＜（ｐＨ値７．０）、０．１饅ゼラチン、
２０ｐＭＣ＆Ｈ〕ニトレンジピン及び上記の力価試験に
よって決定される如き抗体の適量。暗所にて室温で１時
間培養した後、測定管を水浴中に１０分間入れた。遊離
及びＣｓＢ〕ニドレンジぎン結合した抗体の分離をデキ
ストラン被覆した木炭０．２−の添加によって行った。

水浴中で更に１２分後、測定管をエラ槓ンドルフ遠心分
離機中で１５分間遠心分離した。次に透明な上澄液の試
料０．６５−を液体シンチレーション液１０ｍに加え、
ベックマンＬｓｓ１６ｏ液体シンチレー７ヨ／計数器で
計数した。標準曲線を、ｐ　ｇ／　ｍｌにおける標準試
料の濃度関数として片対数グラフ用紙の線形座標軸上に
、各徐準試料の３重値の平均％Ｂ／ＢＯ（但し、Ｂは非
標識１．４−ジヒドロピリジンの未知量の存在下におい
て結合した〔３　ｇ　〕ニトレンジピンであり、そして
Ｂｏは非標識１．４−ジヒドロピリジンの不存在下にお
いて結合した〔３Ｈ〕ニトレンジビ／である）をグロッ
トすることによって作図した。各試料及び対照の３重値
の平均％Ｂ　／　Ｂ　ｏを測定し、そしてまた標準曲線
による試料または対照％Ｂ　／　Ｂ　ｏから１，４−ジ
ヒドロビリジン濃度を測定した。ニトレンジピンの純総
数／分（ｃｐｖｌ及び％Ｈ／　Ｂ　ｏ値を第１宍に示し
た。同様な標準曲線を他の１，４−ジヒドロピリジン類
に対して作図した。

第１表 ０．０　　　１？４７　　１００．０ １８．０　　　１４９２　　　８５．４３６．０　　　
１４０６　　　Ｂｏ、５７２０　　　１０２４　　５８
．６ １８０．０　　　６７３　　３＆５ ３６０．０　　　　　　　　４８２　　　　　２７．６
７２０．０　　　　　　　　３４６　　　　　１９．８
１８００．０　　　　　　　　２２５　　　　　１２−
９α　最終検定混合物中のニトレンジピン標準試料濃度
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒは蛋白質またはポリペプチドである、 の１，４−ジヒドロピリジン免疫原抱合体。 ２、Ｒが蛋白質である特許請求の範囲第１項記載の免疫
   原抱合体。 ３、蛋白質がウシ血清アルブミン、カゼイン、オバルブ
   ミンまたはアオガイヘモシアニンである特許請求の範囲
   第２項記載の免疫原抱合体。 ４、蛋白質がアオガイヘモシアニンである特許請求の範
   囲第３項記載の免疫原抱合体。 ５、特許請求の範囲第１項記載の免疫原抱合体に対して
   調製した抗体。 ６、特許請求の範囲第２項記載の免疫原抱合体に対して
   調製した抗体。 ７、特許請求の範囲第３項記載の免疫原抱合体に対して
   調製した抗体。 ８、特許請求の範囲第４項記載の免疫原抱合体に対して
   調製した抗体。 ９、１，４−ジヒドロピリジンの未知量、放射性標識１
   ，４−ジヒドロピリジンの一定量及び該１，４−ジヒド
   ロピリジンに対して高度の特異性を有する特許請求の範
   囲第５項記載の抗体の前もつて決められた量を含有する
   生物試料を反応させ、その後、生ずる抗原−抗体結合物
   を未結合抗原から分離し、そして結合物または未結合抗
   原の放射能含有量を測定することを特徴とする該生物試
   料中の１，４−ジヒドロピリジン類の存在の検出方法。 １０、放射性標識１，４−ジヒドロピリジンが〔＾３Ｈ
   〕ニトレンジピンである特許請求の範囲第９項記載の方
   法。 １１、使用する抗体が特許請求の範囲第６項記載の抗体
   である特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、使用する抗体が特許請求の範囲第７項記載の抗体
   である特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３、使用する抗体が特許請求の範囲第８項記載の抗体
   である特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １４、１，４−ジヒドロピリジンに特異的抗体を含む抗
   血清から該抗体を精製する際に有用な、１，４−ジヒド
   ロピリジン含有免疫吸着剤抱合体を含有してなる、￥ア
   フイニテイーカラム￥。 １５、ニフエジピン−イソチオシアネート及びＡＨ−セ
   フアロース４Ｂから調製した特許請求の範囲第１４項記
   載のアフイニテイーカラム。 １６、ニフエジピン−イソチオシアネート及びリジン−
   セフアロース４Ｂから調製した特許請求の範囲第１４項
   記載のアフイニテイーカラム。 １７、ａ）１，４−ジヒドロピリジン類に対して特異的
   抗体を含む抗血清と１，４−ジヒドロピリジン含有免疫
   吸着剤抱合体との混合物を培養し、これによつて該抗体
   を該抱合体に結合させ；ｂ）工程（ａ）の混合物を洗浄
   して非特異的に結合した物質を除去し；そして Ｃ）工程（ａ）の混合物を約０℃〜約１０℃で解離剤と
   共に培養して該抱合体から該抗体を解離させ、これによ
   つて官能性抗体の回収率を高めそしてこのものから該抗
   体を単離することを特徴とする１，４−ジヒドロピリジ
   ン類に対して特異的抗体を含む抗血清から該抗体を精製
   する方法。 １８、該洗浄をリン酸塩緩衝された塩水及び塩化ナトリ
   ウム溶液で行い、そして該解離剤が塩化ナトリウム約１
   モル、ジエチルアミン約５０ミリモル及びジオキサン約
   １０重量％を含有する特許請求の範囲第１７項記載の方
   法。 １９、該１，４−ジヒドロピリジン含有免疫吸着剤抱合
   体をニフエジピン−イソチオシアネート及びＡＨ−セフ
   アロース４Ｂから調製される特許請求の範囲第１８項記
   載の方法。 ２０、該１，４−ジヒドロピリジン含有免疫吸着剤抱合
   体をニフエジピン−イソチオシアネート及びリジン−セ
   フアロース４Ｂから調製する特許請求の範囲第１８項記
   載の方法。