JPS6184560A - 補体結合性抗体の測定法 - Google Patents
補体結合性抗体の測定法Info
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- JPS6184560A JPS6184560A JP59205686A JP20568684A JPS6184560A JP S6184560 A JPS6184560 A JP S6184560A JP 59205686 A JP59205686 A JP 59205686A JP 20568684 A JP20568684 A JP 20568684A JP S6184560 A JPS6184560 A JP S6184560A
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- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、細菌、ウィルス等の微細生物によって起る感
染症、腫瘍、糸球体腎炎等のヒトの諸疾患、および動物
、植物にまで及ぶ広い範囲の宿主における疾病の診断及
び感染の判断に利用できる神体結合性抗体の測定法に関
するものである。
染症、腫瘍、糸球体腎炎等のヒトの諸疾患、および動物
、植物にまで及ぶ広い範囲の宿主における疾病の診断及
び感染の判断に利用できる神体結合性抗体の測定法に関
するものである。
（発明が解決しようとする問題点）
感染症、呻瘍、糸球体腎炎等の臨床検査では、これらの
疾患に特異的な抗体が血Ｃａ中に存在しているか否かを
検査対象としている。抗体の測定には種々の測定法があ
るが、その中で補体結合反応は重要なものの一つである
。しかし補体結合反応は有用性のある抗体の検査方法で
あるにもかかわらず、測定操作が繁雑であゆ、きわめて
熟練した技術を必要とするため、その重要性に反してあ
まり利用されていない。
疾患に特異的な抗体が血Ｃａ中に存在しているか否かを
検査対象としている。抗体の測定には種々の測定法があ
るが、その中で補体結合反応は重要なものの一つである
。しかし補体結合反応は有用性のある抗体の検査方法で
あるにもかかわらず、測定操作が繁雑であゆ、きわめて
熟練した技術を必要とするため、その重要性に反してあ
まり利用されていない。
したがってこの測定法が簡易、迅速化され、感度が高く
再現性のある測定値が得られるようになれば、産業界に
おいて太き・く貢献するものである。
再現性のある測定値が得られるようになれば、産業界に
おいて太き・く貢献するものである。
（従来技術）
従来性なわれている補体結合反応は、抗原に特異的に結
合した抗体に補体の１から９成分が連続して結合する反
応を利用したものである。すなわち生成させた抗原抗体
複合体に補体を過剰に加え、それに結合されなかった残
存の補体量を溶血法で測定し、希釈法により溶血度合か
ら結合に供した補体蝋を泳め、それにより補体結合性抗
体量を推測するものである。なお溶血法とは、ヒツジ赤
血球からなる感作赤血球に対する補体の溶血反応を利用
するものであるが、測定操作が複雑であり熟練した技術
と知識が必要で、そのうえ感度は低く、測定に要する時
間も２日間も必要とするという欠点がある。
合した抗体に補体の１から９成分が連続して結合する反
応を利用したものである。すなわち生成させた抗原抗体
複合体に補体を過剰に加え、それに結合されなかった残
存の補体量を溶血法で測定し、希釈法により溶血度合か
ら結合に供した補体蝋を泳め、それにより補体結合性抗
体量を推測するものである。なお溶血法とは、ヒツジ赤
血球からなる感作赤血球に対する補体の溶血反応を利用
するものであるが、測定操作が複雑であり熟練した技術
と知識が必要で、そのうえ感度は低く、測定に要する時
間も２日間も必要とするという欠点がある。
そこで上記欠点を解消するため、種々の方法が見出され
ている。例えば特開昭５５−４５４９８が挙げられる。
ている。例えば特開昭５５−４５４９８が挙げられる。
この発明は補体成分に対する抗体を酵素で標識し、この
酵素活性から抗体量を測定する、いわゆる酵素抗体法で
ある。しかしこの発明は、補体成分に対する標識抗体を
用いなければならないため、反応が２段階となり、各反
応ごとに洗＃操作が必要で、測定に数時間を要するとい
う欠点かある。
酵素活性から抗体量を測定する、いわゆる酵素抗体法で
ある。しかしこの発明は、補体成分に対する標識抗体を
用いなければならないため、反応が２段階となり、各反
応ごとに洗＃操作が必要で、測定に数時間を要するとい
う欠点かある。
、、ｌ：記のこれらの方法を改良すべく鋭意研究を重ね
た栢果、本発明者らは、抗原と抗体が反応して生じた抗
原抗体複合体に補体成分のうち、まず補体Ｃ１成分が結
合し、その後補体Ｃ９成分まで連暁的に結合、活性化す
るという現象に着目し、補体成分を１り接標識し、標識
物をｒ、［ｌｌｌ定することにより補体結合性抗体価が
知得できることを知った。
た栢果、本発明者らは、抗原と抗体が反応して生じた抗
原抗体複合体に補体成分のうち、まず補体Ｃ１成分が結
合し、その後補体Ｃ９成分まで連暁的に結合、活性化す
るという現象に着目し、補体成分を１り接標識し、標識
物をｒ、［ｌｌｌ定することにより補体結合性抗体価が
知得できることを知った。
そして、補体構成成分中の補体Ｃ１ｑを膿ｄすることに
より、補体結合反応の測定の効率化がＩＮられ、かつ補
体結合性抗体が高精度に測定できることを見出したもの
である。
より、補体結合反応の測定の効率化がＩＮられ、かつ補
体結合性抗体が高精度に測定できることを見出したもの
である。
なお酵素標識補体Ｃ１ｑを用いて、自己免疫疾患、忠孝
等の血清中の抗原抗体複合体を測定する技術がシンプソ
ンらにより開示されているＣ １． Ｊ。
等の血清中の抗原抗体複合体を測定する技術がシンプソ
ンらにより開示されているＣ １． Ｊ。
Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ６７．１６７−１７２．１９８４）。しか
しこの技術は、自己免役疾患等を検査するために抗原抗
体複合体を測定するものであり、特異的抗体を測定し、
感染症等の検査に用いる本発明とは区別されるものであ
る。
ｅｔｈｏｄｓ６７．１６７−１７２．１９８４）。しか
しこの技術は、自己免役疾患等を検査するために抗原抗
体複合体を測定するものであり、特異的抗体を測定し、
感染症等の検査に用いる本発明とは区別されるものであ
る。
（問題点を解決するための手段）
本発明は、抗原を固相に固定せしめた後、この抗原に抗
体及び標識物を結合させた補体構成成分を反応させ、次
いで標識物を定量することを特徴とする補体結合性抗体
のヨ１１定法である。
体及び標識物を結合させた補体構成成分を反応させ、次
いで標識物を定量することを特徴とする補体結合性抗体
のヨ１１定法である。
次に本発明の詳細な説明する。
本発明の抗原は、種々のものが利用できる。例えＩｒｉ
抱疹、麻疹、風疹、インフルエンザ、単純ヘルペス、ウ
ィルス性肝炎、流行性耳下腺炎およびマイコプラズマ肺
炎等のウィルス及び細菌抗原、更にインターフェロン等
の薬物およびＤＮＡ等の自己抗体に対する抗原等が挙げ
られる。まず、これら抗原を固相に固定させる。これに
よって液相と異なり、洗浄等の操作が容易となる。固相
は、吸着した抗原が容易に脱離しないものであれはよく
、例えはポリ塩化ビニルあるいはポリスチレン等のプラ
スチック材料からなる合成高分子、戸紙等の天然高分子
または細胞および組織が利用できる。代表例としては、
マイクロタイターウェルやポリスチレンビーズ等が挙げ
られる。また抗原の固相への固定は、物理的吸着、化学
的共有結合または感染等により固相表面に固定させれば
よい。
抱疹、麻疹、風疹、インフルエンザ、単純ヘルペス、ウ
ィルス性肝炎、流行性耳下腺炎およびマイコプラズマ肺
炎等のウィルス及び細菌抗原、更にインターフェロン等
の薬物およびＤＮＡ等の自己抗体に対する抗原等が挙げ
られる。まず、これら抗原を固相に固定させる。これに
よって液相と異なり、洗浄等の操作が容易となる。固相
は、吸着した抗原が容易に脱離しないものであれはよく
、例えはポリ塩化ビニルあるいはポリスチレン等のプラ
スチック材料からなる合成高分子、戸紙等の天然高分子
または細胞および組織が利用できる。代表例としては、
マイクロタイターウェルやポリスチレンビーズ等が挙げ
られる。また抗原の固相への固定は、物理的吸着、化学
的共有結合または感染等により固相表面に固定させれば
よい。
次にこの抗原に特異的な抗体及び標識物を結合させた補
体構成成分を反応せしめる。抗体は、本発明の測定の対
象となるものであり、血清、髄液、１１＋Ｔ［等の体液
を用いることができるが、抗体は血清中にもつとも多く
含まれているため、一般には血清を利用する。また、本
発明で訓電する抗体は、抗原に特異的に結合するもので
あり、更に補体イ４成成分にも結合可能な抗体でなけれ
ばならない。
体構成成分を反応せしめる。抗体は、本発明の測定の対
象となるものであり、血清、髄液、１１＋Ｔ［等の体液
を用いることができるが、抗体は血清中にもつとも多く
含まれているため、一般には血清を利用する。また、本
発明で訓電する抗体は、抗原に特異的に結合するもので
あり、更に補体イ４成成分にも結合可能な抗体でなけれ
ばならない。
しかし、抗原によって生体内で生成された抗体はほとん
どがこの条件を満足するので、本発明においてはほとん
どの抗体を測定することができる。
どがこの条件を満足するので、本発明においてはほとん
どの抗体を測定することができる。
補体は、動物の新鮮血清に含まれる士数種の蛋白質によ
って構成されておし、生体の感染防１卸、免疫反応、炎
症等に関与する蛋白質朴である。１・銅体は主として抗
原抗体複合体によって活性化され、免疫付着反応、貧食
作用の抗進、膠着反応、殺り′自及び溶１■反応、免疫
複合体の可溶化等の種々の生物活性を示す。補体構成成
分としては補体系のいずれの成分でもよく、例えば補体
Ｃ４，Ｃ２，Ｃ３゜Ｃ１ｑ等を適宜選択することができ
る。特に補体Ｃ１ｑは抗原抗体複合体に最初に結合する
補体系の一成分である。そのため補体Ｃ１ｑは他の補体
構成成分に関係なく単独に抗原抗体複合体に結合できる
ため、補体Ｃ１ｑを標識すれば他の補体成分を使用しな
くても、抗体価の測定が可能となるので、補体Ｃ１ｑを
用いることは測定の簡易化につながり特に好ましい、 補体構成成分の調整法としては、一般的な生理活性をも
つ蛋白質の分離精製法が利用できる。例えば「補体学」
医歯薬出版、昭和５８年、Ｐ１４１〜１５８の調整法を
使用することができるが、この方法に何ら限定されるも
のではない。
って構成されておし、生体の感染防１卸、免疫反応、炎
症等に関与する蛋白質朴である。１・銅体は主として抗
原抗体複合体によって活性化され、免疫付着反応、貧食
作用の抗進、膠着反応、殺り′自及び溶１■反応、免疫
複合体の可溶化等の種々の生物活性を示す。補体構成成
分としては補体系のいずれの成分でもよく、例えば補体
Ｃ４，Ｃ２，Ｃ３゜Ｃ１ｑ等を適宜選択することができ
る。特に補体Ｃ１ｑは抗原抗体複合体に最初に結合する
補体系の一成分である。そのため補体Ｃ１ｑは他の補体
構成成分に関係なく単独に抗原抗体複合体に結合できる
ため、補体Ｃ１ｑを標識すれば他の補体成分を使用しな
くても、抗体価の測定が可能となるので、補体Ｃ１ｑを
用いることは測定の簡易化につながり特に好ましい、 補体構成成分の調整法としては、一般的な生理活性をも
つ蛋白質の分離精製法が利用できる。例えば「補体学」
医歯薬出版、昭和５８年、Ｐ１４１〜１５８の調整法を
使用することができるが、この方法に何ら限定されるも
のではない。
補体構成成分と結合させる標識物としては、一般的な分
析法で容易に測定できる物質であればいかなるものでも
使用できる。例えば酵素、螢光物質、色素、酵素の基質
等を適宜選択できる。特に酵素は触媒として作用するた
め、反応温度、反応時間を変えることにより測定感度を
自由に調整できる、そのため酵素は微量な補体結合性抗
体を増幅して測定できるゆえ、より好ましい標識物であ
る。酵素としては、例えばはルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ等が使用できる。
析法で容易に測定できる物質であればいかなるものでも
使用できる。例えば酵素、螢光物質、色素、酵素の基質
等を適宜選択できる。特に酵素は触媒として作用するた
め、反応温度、反応時間を変えることにより測定感度を
自由に調整できる、そのため酵素は微量な補体結合性抗
体を増幅して測定できるゆえ、より好ましい標識物であ
る。酵素としては、例えばはルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ等が使用できる。
補体構成成分への標識物の結合は、補体の生物活性と標
識物の測定が阻害されなければ、いかなる結合方法を使
用しても何ら差しつかえない。なお結合剤を使用する場
合には、過ヨウ素敵、グルタルアルデヒドあるいはマレ
イミド誘４体を用いることができる。
識物の測定が阻害されなければ、いかなる結合方法を使
用しても何ら差しつかえない。なお結合剤を使用する場
合には、過ヨウ素敵、グルタルアルデヒドあるいはマレ
イミド誘４体を用いることができる。
固相に固定した抗原と抗体及び標識物を結合させた補体
構成成分の反応は、三者を混合すれば目すと反応が完了
し王者が結合する。反応時間や温度は、抗原の種類等に
より相違するが、当業者なら容易に反応条件を設定する
ことは可能である、要は補体等の生物活性が失活しない
条件であれば、適宜選択できるものである。
構成成分の反応は、三者を混合すれば目すと反応が完了
し王者が結合する。反応時間や温度は、抗原の種類等に
より相違するが、当業者なら容易に反応条件を設定する
ことは可能である、要は補体等の生物活性が失活しない
条件であれば、適宜選択できるものである。
抗原、抗体及び標識物音結合させた補体副成成分からな
る結合体は固相に固定されているため、洗浄により未吸
着の補体構成成分や反応阻害物の除去が容易にできる。
る結合体は固相に固定されているため、洗浄により未吸
着の補体構成成分や反応阻害物の除去が容易にできる。
次いで固相に吸着された結合体の標識物を定量する。定
量法としては、肉眼測定をはじめ、可視、紫外線等の吸
光度の測定、けい光強度またはパルスカウント測定等適
宜利用できる、なお標識物の定量としては、結合体の標
識物の盆を直接測定することはもちろん、一定量の標識
物を使用し、次いで結合に供しなかった標識物の量を測
定することもできる。
量法としては、肉眼測定をはじめ、可視、紫外線等の吸
光度の測定、けい光強度またはパルスカウント測定等適
宜利用できる、なお標識物の定量としては、結合体の標
識物の盆を直接測定することはもちろん、一定量の標識
物を使用し、次いで結合に供しなかった標識物の量を測
定することもできる。
標識物の定量により、特定の抗原に対する補体結合性抗
体の量が知得できる。
体の量が知得できる。
（補体構成成分の調整例）
新ＭＡＹなうさぎ直留１００ゴを、０．（３２６Ｍエチ
レングリコール四酢酸（ＥＤＴＡ）水溶液（ｐｉ−１７
、５１５１に１５〜２４時間透析し、生じた沈殿物を返
心分離（２０，０ＯＯＧ、２０分）によシ回収し、これ
を０．０１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．７５ Ｍ塩化ナト
リウム水溶液（１）［（５，０）２０−に溶解させる。
レングリコール四酢酸（ＥＤＴＡ）水溶液（ｐｉ−１７
、５１５１に１５〜２４時間透析し、生じた沈殿物を返
心分離（２０，０ＯＯＧ、２０分）によシ回収し、これ
を０．０１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．７５ Ｍ塩化ナト
リウム水溶液（１）［（５，０）２０−に溶解させる。
不溶性物質は遠心分離＜ ２５．（］ ＯＯｃ、ｓ。
分）で除き、次にこれを０．０６３Ｍ ＥＤＴＡ水ｆ
ｉ＊ （ｐＨ５，０） ５ ｔに対して５℃で４時間透
析し、沈殿物を遠心分離（２０，０ＯＯＧ、２０分）に
より回収する。この操作により約５■の蛋白質が得られ
、このうち９５％以上が補体Ｃ１ｑである。次いで上記
蛋白質を０．０５ Ｍ トリス（ヒドロキンメチル）ア
ミノメタ／、１Ｍ塩化ナトリウム、０．００５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、１０チスクロースを含む水溶液（ｐｉ（７，４
１１ｒｎｔに溶解し、補体Ｃ１ｑとして、本発明に供す
ることができる。更に上記操作をくり返して、補体Ｃ１
ｑをより精製してもよい。
ｉ＊ （ｐＨ５，０） ５ ｔに対して５℃で４時間透
析し、沈殿物を遠心分離（２０，０ＯＯＧ、２０分）に
より回収する。この操作により約５■の蛋白質が得られ
、このうち９５％以上が補体Ｃ１ｑである。次いで上記
蛋白質を０．０５ Ｍ トリス（ヒドロキンメチル）ア
ミノメタ／、１Ｍ塩化ナトリウム、０．００５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、１０チスクロースを含む水溶液（ｐｉ（７，４
１１ｒｎｔに溶解し、補体Ｃ１ｑとして、本発明に供す
ることができる。更に上記操作をくり返して、補体Ｃ１
ｑをより精製してもよい。
（標識物の結合した補体構成成分の調整例１）０．００
５ｍＭ ｇＤＴＡ及び１０％シ二一クロースを含む水
溶液（１）Ｈ７，４１１０−に溶解する。これに０．１
Ｍジテオスレイトール溶ｌ夜０．１ ｍｅを加え、至温
下、１時間放置し、反応させる。次に反応液をセファデ
ィクスＧ−２５カラムに＋ｉａＬ、蛋白ツバ−分を回収
する。この蛋白質画分を限界ろ過で約１０ｍｇまで濃縮
し、還元型補体Ｃ１ｑ３０〜を得る。
５ｍＭ ｇＤＴＡ及び１０％シ二一クロースを含む水
溶液（１）Ｈ７，４１１０−に溶解する。これに０．１
Ｍジテオスレイトール溶ｌ夜０．１ ｍｅを加え、至温
下、１時間放置し、反応させる。次に反応液をセファデ
ィクスＧ−２５カラムに＋ｉａＬ、蛋白ツバ−分を回収
する。この蛋白質画分を限界ろ過で約１０ｍｇまで濃縮
し、還元型補体Ｃ１ｑ３０〜を得る。
次にわさび由来のペルオキシダーゼ２０■を、リン酸緩
衝液（ｐＨ１４１６ゴに溶解し、ジメチルホルムアミド
４ｒｎｌを加える。更に２％４−〔マレイミドメチル」
シクロヘキサ／１−カルボキシリック醒すクシンイミド
エステル（ＣＨＭＩジメチルホルムアミド溶液０．２
、ｎｌを加え、室温で１２群間静置し、反応させる。こ
の反応液をセファデックスＧ−２５カラムに通し、ＣＨ
Ｍ結合ペルオキシダーゼ２０屏７を回収する。
衝液（ｐＨ１４１６ゴに溶解し、ジメチルホルムアミド
４ｒｎｌを加える。更に２％４−〔マレイミドメチル」
シクロヘキサ／１−カルボキシリック醒すクシンイミド
エステル（ＣＨＭＩジメチルホルムアミド溶液０．２
、ｎｌを加え、室温で１２群間静置し、反応させる。こ
の反応液をセファデックスＧ−２５カラムに通し、ＣＨ
Ｍ結合ペルオキシダーゼ２０屏７を回収する。
ゴ磯元型補体Ｃ１ｑ ３０ＷとＣ）［Ｍ結合にルオキシ
ダーゼ２０〃ｌりを混合し、４′Ｃ〜１０′Ｃで１５時
間静置し、セファロース６Ｂカラムにより、分子量４０
万〜８０万画分を回収し、ペルオキシダーゼ標識補体Ｃ
１ｑ４０〜を得る。
ダーゼ２０〃ｌりを混合し、４′Ｃ〜１０′Ｃで１５時
間静置し、セファロース６Ｂカラムにより、分子量４０
万〜８０万画分を回収し、ペルオキシダーゼ標識補体Ｃ
１ｑ４０〜を得る。
（標識物の結合した補体構成成分の調整例２）２ ”？
／ ｍｌ！、補体Ｃ４生理食塩水溶１夜１ｒｎｔに、
０．２〜フルオレツセン イソチオシアネイト（ＦＩＴ
Ｃ）含有炭波緩衝液（ｐＨ９，５） ｏ、１−を加え、
１０℃で４時間ゆっくり攪拌する。この操作で螢光物質
であるＦ’ＩＴＣが補体Ｃ４に結合する。この反応物を
セファディクスＧ−２５カラムに通すことにより、未反
応ＦＩＴＣを分離除去し、ＦＩＴＣ結合補体Ｃ４約１．
８〜を回収する。
／ ｍｌ！、補体Ｃ４生理食塩水溶１夜１ｒｎｔに、
０．２〜フルオレツセン イソチオシアネイト（ＦＩＴ
Ｃ）含有炭波緩衝液（ｐＨ９，５） ｏ、１−を加え、
１０℃で４時間ゆっくり攪拌する。この操作で螢光物質
であるＦ’ＩＴＣが補体Ｃ４に結合する。この反応物を
セファディクスＧ−２５カラムに通すことにより、未反
応ＦＩＴＣを分離除去し、ＦＩＴＣ結合補体Ｃ４約１．
８〜を回収する。
（実施り１１１）
単純ヘルペスウィルスＣＦ抗原を吸着させた９６穴マイ
クロタイターウエルに補体結合１１ｆｊ４以下および１
６の非動化した試料血清５μｔをそれぞれ各別に加えさ
らにそれぞれににルオキシダーゼ標識補体Ｃ１ｑ（ゼラ
チンベロナール緩嘴液で１００倍希釈）９５μｔを加え
、室温で１時間静置した。次に０．０５１ Ｔｗｅｅｎ
−２０を含むｖ４ｔＦ２緩衝液で各ウェルを３回洗浄
し、Ｈ２Ｏ，−Ａ Ｂ Ｔ Ｓ溶液（過酸化水素含有２
，２′−アジノージ−（５−エチルーベンゾケアクリン
サルフェート）溶液）を１００μを加え、１時間室温
で反応させた。１）￥素反応停止液１００μｔを加えた
後、４１４ｎｍの吸光度を測定したところ、補体結合価
４以下の血清では吸光度０．０２９、補体結合価１６の
血清では０．５７９の値を得た。
クロタイターウエルに補体結合１１ｆｊ４以下および１
６の非動化した試料血清５μｔをそれぞれ各別に加えさ
らにそれぞれににルオキシダーゼ標識補体Ｃ１ｑ（ゼラ
チンベロナール緩嘴液で１００倍希釈）９５μｔを加え
、室温で１時間静置した。次に０．０５１ Ｔｗｅｅｎ
−２０を含むｖ４ｔＦ２緩衝液で各ウェルを３回洗浄
し、Ｈ２Ｏ，−Ａ Ｂ Ｔ Ｓ溶液（過酸化水素含有２
，２′−アジノージ−（５−エチルーベンゾケアクリン
サルフェート）溶液）を１００μを加え、１時間室温
で反応させた。１）￥素反応停止液１００μｔを加えた
後、４１４ｎｍの吸光度を測定したところ、補体結合価
４以下の血清では吸光度０．０２９、補体結合価１６の
血清では０．５７９の値を得た。
（実施例２）
肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原を直径６．３５ ｍｍのポリ
スチレンビーズに固定させ、小試飲管に移した。次いで
これに、非動化した被験血清のゼラチン・ベロナール緩
衝液１０倍希釈液０．１ ｍｌ、４光吻質ＦＩＴＣで標
識した補体Ｃ４の同緩衝希釈液０．１ゴ、および抗Ｃ４
抗体処理うさぎ新鮮血清０．１ｄを加え空温で１時間静
置した。次にビーズを取り除き、残存液にベロナール緩
衝ｉ２．７ｄを加え、螢光分光光度計を用い、励起波長
４９０ ｎｍ、螢光波長５２０ ｎｍにて測定した。同
時に正常血清および標準血清を用いて比較試験を行ない
、被験ｌ′ｃ［Ｌ清の抗体価を外挿法にて求めた。
スチレンビーズに固定させ、小試飲管に移した。次いで
これに、非動化した被験血清のゼラチン・ベロナール緩
衝液１０倍希釈液０．１ ｍｌ、４光吻質ＦＩＴＣで標
識した補体Ｃ４の同緩衝希釈液０．１ゴ、および抗Ｃ４
抗体処理うさぎ新鮮血清０．１ｄを加え空温で１時間静
置した。次にビーズを取り除き、残存液にベロナール緩
衝ｉ２．７ｄを加え、螢光分光光度計を用い、励起波長
４９０ ｎｍ、螢光波長５２０ ｎｍにて測定した。同
時に正常血清および標準血清を用いて比較試験を行ない
、被験ｌ′ｃ［Ｌ清の抗体価を外挿法にて求めた。
（実施例６）
ウシ血清アルブミンを２０μｔ／ｍｌのＣ４度で＠酸緩
衝食塩液に溶解し、９６穴マイクロタイタープレートに
分注し、室温で２時間保持しウェルに吸着させた。遊離
のウシ血清アルブミンを除いた後にウサギ抗つシ皿清ア
ルブミン抗血清（ゼラチン・ベロナール緩衝液で８００
〜６４００倍に段階希釈）５０μｔ、およびアルカリホ
スファターゼ標識補体Ｃ１ｑ（ゼラチン・ベロナール緩
衝液で１００倍希釈）５０μＬを加え、室温で３０分静
置した。
衝食塩液に溶解し、９６穴マイクロタイタープレートに
分注し、室温で２時間保持しウェルに吸着させた。遊離
のウシ血清アルブミンを除いた後にウサギ抗つシ皿清ア
ルブミン抗血清（ゼラチン・ベロナール緩衝液で８００
〜６４００倍に段階希釈）５０μｔ、およびアルカリホ
スファターゼ標識補体Ｃ１ｑ（ゼラチン・ベロナール緩
衝液で１００倍希釈）５０μＬを加え、室温で３０分静
置した。
各ウェルを洗浄後、バラニトロフェニル溝酸溶液（トリ
ス緩衝液、Ｉ）［−１８，２） １０ ［３μｔを加え
、室温で６０分静置し、酵素反応を停止させた後にＡ
１０ ｎｍの吸光度を測定したところ、抗血前の用量に
依存 して吸光度０．５６８〜０．０５４を与えた。
ス緩衝液、Ｉ）［−１８，２） １０ ［３μｔを加え
、室温で６０分静置し、酵素反応を停止させた後にＡ
１０ ｎｍの吸光度を測定したところ、抗血前の用量に
依存 して吸光度０．５６８〜０．０５４を与えた。
（実施例４）
精製単純ヘルペスウィルス抗原を６．５５ ｍｍ１７）
：Ｗリスチレンビーズに吸着させ、手拭、１倹管に入れ
、非動化した試験血清（補体結合価４以下および１６）
のゼラチン・ベロナール緩＠液１０倍希釈液０．１ｄと
パーオキシダーゼ標識補体Ｃ１ｑの同緩衝液希釈液０．
１−を同時に入れて室温で１侍間静置した。ビーズを洗
浄後側の手拭１険管に移し、オルトフェニレンジアミン
溶）夜０．３ｒｒＬｔを加え、室温で４５分反応させた
。１Ｎ塩１ｓ１２ ｍｌを添加して反応を止め、４９０
ｎｍの吸光度をｄｉｌｌ定した。補体結合価４以下お
よび１６の試料の吸光度はそれぞれ０．０１８、Ｑ、４
０８であった。
：Ｗリスチレンビーズに吸着させ、手拭、１倹管に入れ
、非動化した試験血清（補体結合価４以下および１６）
のゼラチン・ベロナール緩＠液１０倍希釈液０．１ｄと
パーオキシダーゼ標識補体Ｃ１ｑの同緩衝液希釈液０．
１−を同時に入れて室温で１侍間静置した。ビーズを洗
浄後側の手拭１険管に移し、オルトフェニレンジアミン
溶）夜０．３ｒｒＬｔを加え、室温で４５分反応させた
。１Ｎ塩１ｓ１２ ｍｌを添加して反応を止め、４９０
ｎｍの吸光度をｄｉｌｌ定した。補体結合価４以下お
よび１６の試料の吸光度はそれぞれ０．０１８、Ｑ、４
０８であった。
（発明の効果）
本発明により、補体結合性抗体は１ハ１易に、かつ高精
度で測定することができる。さらに本発明による抗体の
測定により、感染症等の臨床検査結果が迅速に知得でき
ることとなり、適正な治療行為を早期に行なうことも可
能となる。
度で測定することができる。さらに本発明による抗体の
測定により、感染症等の臨床検査結果が迅速に知得でき
ることとなり、適正な治療行為を早期に行なうことも可
能となる。
このように本発明は、産業上きわめて有益な補体結合性
抗体の測定法でちる。
抗体の測定法でちる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、抗原を固相に固定せしめた後、この固定化抗原に抗
体及び標識物を結合させた補体構成成分を反応させ、非
結合物を除去し、次いで結合した標識物を定量すること
を特徴とする補体結合性抗体の測定法。 ２、補体構成成分が補体Ｃ１ｑである特許請求の範囲第
１項の補体結合性抗体の測定法。 ３、標識物が酵素である特許請求の範囲第１項の補体結
合性抗体の測定法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59205686A JPS6184560A (ja) | 1984-10-02 | 1984-10-02 | 補体結合性抗体の測定法 |
| DK445585A DK445585A (da) | 1984-10-02 | 1985-10-01 | Stof-konjugeret komplementkomponent clq |
| CA000491980A CA1276103C (en) | 1984-10-02 | 1985-10-01 | Substance-conjugated complement component c1q |
| EP85112428A EP0177023A3 (en) | 1984-10-02 | 1985-10-01 | Substance-conjugated complement component c1q |
| KR1019850007264A KR890001538B1 (ko) | 1984-10-02 | 1985-10-02 | 세포기능 조절물질 등을 결합시킨 보체성분 Clq의 제조법 및 이 보체성분 Clq을 사용하는 측정법 |
| US07/032,025 US4882423A (en) | 1984-10-02 | 1987-03-30 | Substance-conjugated complement component C1q |
| US07/355,196 US5035995A (en) | 1984-10-02 | 1989-05-22 | Test method involving substance-conjugated complement component C1q |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59205686A JPS6184560A (ja) | 1984-10-02 | 1984-10-02 | 補体結合性抗体の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6184560A true JPS6184560A (ja) | 1986-04-30 |
Family
ID=16511021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59205686A Pending JPS6184560A (ja) | 1984-10-02 | 1984-10-02 | 補体結合性抗体の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6184560A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012510618A (ja) * | 2008-12-01 | 2012-05-10 | ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 補体固定抗体の検出のための方法および組成物 |
| US11796547B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-10-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of detecting donor-specific antibodies and systems for practicing the same |
-
1984
- 1984-10-02 JP JP59205686A patent/JPS6184560A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012510618A (ja) * | 2008-12-01 | 2012-05-10 | ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 補体固定抗体の検出のための方法および組成物 |
| JP2015007651A (ja) * | 2008-12-01 | 2015-01-15 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 補体固定抗体の検出のための方法および組成物 |
| US11796547B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-10-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of detecting donor-specific antibodies and systems for practicing the same |
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