JPS6188896A - 白血球弁別用組成物および弁別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液学の分野に関し、さらに詳しくは白血球の
サブクラスの弁別１！Ｅ！する。

人の白血球はリンパ球、単球および多形核細、胞（ＰＭ
Ｎ）に分類される。ＰＭＮはその細胞質顆粒の染色特性
によって好中球、好酸球または好塩基球のサブクラスに
分類される。

白血球の弁別は通常種々の染色法によって行なわれてき
た。数種のフタロ／アニン化合物をこのような用途に使
用することが知られている。これらのうち最初に発見さ
れたものはアルシアンブルーと呼ばれる。アルシアンブ
ルーは好塩基球の弁別的染色に使用されてきた。銅フタ
ロノアニンカチオン染料は、ポリヌクレオチド例えばＤ
ＮＡおよびＲＮＡを有する他の細胞をも染色するため、
単独で使用の場合好塩基球を選択的ンこ染色し得る程十
分には特異的でない。しかも、好塩基球が染色されるの
は、その中に硫酸化された多糖であるヘパリンが存在す
るとい５独特の性質のためである。所望の選択性を確医
する一つの方法は、ポリヌクレオチドのリン酸基を遮蔽
してフタロンアニン陰イオンとの結合を防止する塩化ラ
ノタ／をこれと組合わせることである。

アルシアンブルーを使用するには精密に調節された高い
Ｕ性ｐｌＩが必要であり、またこのものは熱に不安定で
ある。アルカリ性のｐｕで加ｆキされるとアルシアンブ
ルーは粒状物（不溶性染料）を生ずる。この沈殿する傾
向はアルンアノブルー含何試薬において水い間問題とな
ってきた。自動分析り器にはこれらの沈殿を集める部品
例えばＩｔｊ過器が含まれている。これは１．ｌ１ｉｌ
定の信頼性を損うばかりでなくこの方法を使用する分析
機器の運・云：ζまで支障を来たす恐れがある。それに
もかＸｂらずこの染料はその特異性と１ｉつきりした色
とから優れた染料と考えられてきた。アルシアンブルー
テ関するさらに詳しい予備知識については、Ｇ１１ｂｅ
ｒｔらの「アルシアンブルーを１史用する新染色、・去
７こよる好塩基球以外」、（Ｂｌｏｏｄ　、　４６　：
　２７９　２Ｂ６（１９７５）　］をつ照のこと。

以後その他のフタロンアニノ染料も開発された。

例えばＢｌｏｏｍら（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ　、　２
　：　４８−５７（１９６０））は誘導体化きれていな
いアストラフルー（遊離塩基）をｆ史用してムコ多糖を
含有する生物学的阻織特にｔｉ［！！満細弛を染色する
ことを報告している。アストラブルー遊離塩基は、これ
に正の１荷を与える０、５ＮＨＣ４中で］重用される。

この低いｐＨによって選択性が得られるのは、ｐＨ０，
３でイオン化される硫酸誘導体、例えばヘパリンの固有
の強さのためで、これは低ｐＨでイオン化されないリノ
Ｉ夕誘導体ｆｌｌえげＤＮＡが弱いのと対照的である。

稲垣［Ａｃｔａ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ　Ｊａｐｏ
ｎｉｃａ、　３２　第４１　：６４２−６４７　（１９
６９））は、０．５　Ｍ　ＮａＣ４を含有するメタノー
ル中のアクリジンオレンジの固定液とアストラブルー遊
離塩基と？！−１史用する好塩基球および肥満ｍ胞顆粒
の染色方法を報告している。稲垣ニーｔセチルピリジニ
ウムクロリドの無水メタノール飽和溶液とアクリン／の
無水メタノール飽和溶液とｔζよる末梢血液および骨Ｕ
ｌ塗抹標本の固定を検討した。セチルピリジニウムクロ
リドは好塩基球顆粒および肥満細胞顆粒を確ｌ；に保ａ
したかアストラブルー染色は妨害される＋Ｌ＋′ｉ向が
あった。アクリジノ（は上１己の１葦１乍においてこれ
らのｌ−１ｌｌ　ｌｉ’ｆｆｌ　ｉ′［Ｉ　４立を十分
に保存し得なかった。

総括すれば、アル／アノブルーとアストラブルー遊離塩
におよびその第四級誘褥体が好塩基球をそれ以外の白血
球から弁別することが知られているこの種の唯一の化合
物群であった。アル／アノブルー試薬の不安定性は永い
間の問題であった。

従ってこの分野の研究者（ｉ、好塩基球のみをそれ以外
の白血球と区別して選択的に染色する化合物の探索を続
けてきた。さらに、染料の染音度Ｈ，−１１点々の使用
者の染色技術によって異なる。

細胞の成熱は連続的な過程であるので、その過程におけ
る逐次段階を弁別するのｉ−を困ｔ（ｔである、しかし
、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ　）またはジームサ（Ｇｉｅｍ
ｓａ）の染色法（’Ｃよって染色された全血塗抹標本に
おいては個別Ｏ段階を認識することができる。、この分
類は各細胞の細、地質的および核的特性と顆粒の存在、
その性質および数に基いている。白血球のこれらの分類
およびその弁別の技術は公知である。

例えばＡｎｓｌｅｙ　　ら米国特戸第３，７４１，８７
５号参照。

しかし、染色された無鵠の、細胞の罰■、地質的および
核的知見に基いての分Ｘ？Ｎま試験担当層の主観的判定
番で著しく左右さ几る。

Ｋｉｍの米国特許第４，０９９，９１７号には未染色白
血球の腫頓とその細胞の太きさおよび頃粒的特注によっ
て識別するだめの血液試料の調製法が開示されている。

血液試料を、赤血球は溶解するが白血球）は溶解しない
界面活性剤で処理し、固定剤を加え、この液をインキュ
ベートする。得られた細胞ｙ濁ｉｔシにより、低角およ
び高角光散乱特注を有する光学系全使用して未染料の同
定された無湯の出血Ｆ、Ｐ、を弁別することができると
云われる。しかしこれに・は大型複雑な訓厄器が必９で
あり、従って睨覚蜆祭では実相できない。

１ｃｄｉｓらのＣ（；国特許ｇ　４，２８６，９６３号
：・ては、赤血球を溶解して白血球のリンパ注および骨
１１■１団の識別を可能とするための、ｆａｌ少くとも
一陣の長如アルキルトリメチル・ル四俵アンモニウム塩
、圀えはヘキサデンルトリメチルアンモニウムブロミド
と＋ｂ＋ｍフェニル基またはフェノキン基で４模された
短鎖アルカノール例えば２−フェノキ／エタノールおよ
び叩ポリヒドロキン化合物１７１１え：ずソルビトール
から選ばれる少くとも一陣の添加剤とだ・ら成る組成物
が開示されている。

以上の通り、この弁別のための公知の技術９つ多くは染
色試薬の調製および使用を必些とするも１つであったり
、赤血球の溶解のみの手段を与えるものである。またあ
るものは複雑な磯？＝Ｓが必要でちる。またさもなけれ
ば、全血球の識別で報告さτ］５る結果は、染色された
ものにせよされてないものにせよ、主観的を同定に箸し
く左右てれる。Ｉ６］じ処哩皿液試ト１シこおいて染色
を行わずに、好ち１ｈ入１；Ｅｌｉの正確な数と莫犬注
指数とを同時：ζ４１１１定し得る確実な方法について
の文献記載は全くない１゜ＱｒｏｎｅｒらＣＢｌｏｏｄ
　Ｃｅ１ｌｓ、　ｆｉ　：　１４１−１５７（１９８１
）））は光学的散乱、染色ｔｉｋそのＩ＋！２Ｆ’）枝
うトｉを１すΣ第１１する白血球サブクラスの識別：こ
ついて５．１１している、好Ｉｉ）球集団における、よ
り来軌なすなわちより葉４’Ｓ　ｉとされていない形妙
の方向への順向をルフトンフ１−　（１ｅｆｔ　５ｈｉ
ｆｔ　）　　と呼んでこれについて論じている。全面状
ｆ４と強力な陽イオン界面活性剤とマレイン酸とで処理
すると核の境胃において屈折率の著しい変化が生じた。

その結果、赤血球は溶解され、白血球のｉａｌ　、’ｌ
ｉ！２質の大部分Ｖ１浸出され、核は若干収縮した。こ
の文献の論議からすると、白血球の細胞膜：ｄ（赤血球
について述べたようには）破壊ないし溶解されず、白血
球細胞質は大部分は取除かれるが完全には除かれずに、
核の外形をゆが１せる人為構造を残すと思われ、さらに
この処理１の影Ｉオが白血球のあるサブクラスとその他
のザブクラスとの間で差異があるか否かについては全く
述べられていない。

従４ｉ１技術７′ｃよる方法とは対照的に本発明によれ
ば、Ｐ　ｉＶＩ　ＮのあるサブクラスのＩＩＢ％ｌ質は
取除くが他Ｄサブクラスのものは除かないということに
基いてＰＭＨのサブクラスを弁別し、核の形態（葉状囲
）を正確に特注づけることが可能となる。本発明の組成
物は白血球中のある分類のもののみの細胞質を選択的に
除く。さらに詳しく云えば、本組成物はり７バ球　、Ｃ
１１球、好酸球お・よび好中球から細胞質を除去するが
、好塩基球からは除去しない。従って、好塩基球はその
顆粒および１甜胞質膜を保持することにより他のＰ　Ｍ
　Ｎサブクラスから弁別される。さらに、有核の赤血球
が検出されるので、本発明によりその定量も可能となる
。

円胞質人為構造が好塩基球以外のすべての血り尺の核に
附着して核の外形を変化させることにより誤差を生ずる
という危険は、本発明の組成物によって細胞質をそれら
の核から完全にはき取ることにより防止することができ
る。従って、芽細胞、有核赤血球と種々の成熟段１着の
好中球とをそれらの核の形態学に基いて確実に弁別する
ことができる。重要な利点として、本発明の組成物およ
び方法は、染料調製の必要が全くなく、また従って染色
技術による不確実性？避は得ることが挙げられる。本組
成物は手動的測定にも殻器）てよる測定：こもｆ更用し
得る。

試料中の白血球弁別用の本発明の組成物は、白血球の選
ばれたサブクラスからのみ細胞・莫および１１ｊｌ胞質
を取除くのに有効な少くとも一種の希薄酸ち−よび少く
とも−１，ｌｊの水溶性界面活性剤を含有してなり、か
つｐｌ＋が約１．８ないし約２．３である。界面活性剤
の例としては、ポリアルキレングリコールのｃ６＋　Ｃ
１６脂肪奴アルコールエーテル、Ｃ６−Ｃ１６アルキル
茫を有する第四級アンモニウム化合物、またはアルキル
ベンゼンスルホネートを挙げることができる。酸は好ま
しくは、スルホン酸、カルボン酸また１は塩酸である。

本発明）まさらに、白血球のサブクラスの弁別方法を提
供するものである。血液試料を処理して、選侭されたサ
ブクラスの白血球から細：ＩｉＱ　ｌ摸および細胞７１
を除いた仮、核の形態に基いてサブクラスの弁別を行な
う。さらに詳しくいえば、白血球のうちＬｊｆ塩基球口
、外のすべてのサブクラスのものから細目１己膜および
１ｔ（Ｉｆ　！Ｏｆｊ　ｆ完全に月７除く。

Ｌ）、ドの記述において特定の態様について使用する特
定の用語は、特記しない限り油のすべての態（工にも」
凶用されるものである。

先に記した通り、本発明の組成物Ｉは白血球のある分類
のもの、細胞質のみを選択的に除く。リンパ球、単球、
好酸球および好中球は細ｔｌｌ　’ｔ’［を；−１き取
られる。すなわち、それらの細弛暎およびキ４ト弛質は
その核から完全に除かれ、核は彰Ｉｎを受けずにそのま
＼、かつ随伴細胞質の無い伏態であと（こ残る。従って
その核の形１きをはっきりと識別できる。以上の細胞員
除去と対伴的９こ、好塩基球はその顆粒および細胞質膜
を保持する。

本発明の＠ｆ規組成物は仲々の型ＩＤ血球の手ｌ・ｂお
よび流動血球ヨ１数糸Ｏこよる検出に適用し得る。こ５
に開示した組成物は水浴性界面活性剤とイ）坂とを含有
して成り、Ｉ）１１　？屯囲は約１．８ないし約２．３
である。この組成物はまた必安に応じ酸化防止剤を含有
することができる。検定実施のためには界面活性剤成分
と希醸成汁とが存在し“ダければならず、どちらの成分
を欠いても有効な組成物）よ（４）もれない。連鎖停止
性酸化防止１？：１は界面活性剤・、つ自動ｒ愛［ヒ的
５＋解と防止し、それによる削泡１′ｆ除去浅；；巨、
し低下を防ぐ。酸化防止剤が存在しない揚台、ま１、打
：吸物の２５　Ｃにおける貯蔵可能期間・−ｉ２ケ月で
あるが、酸化防止剤が存在すると２５　’Ｃで少くとも
１年となる。酸１ヒ防止剤は本組成物の正常な作用を妨
害しない。

水溶性界面活性剤としては血球に対する下記の所要の作
用を与える任砒の界面活性剤であってよい：すなわち赤
血球と血小板との完全な溶解、好中球、好６１２球、リ
ンパ球および単球の細胞質および細胞質膜の除去、およ
び好塩基球のｌ預杓と細胞嗅との保持である。例として
、（１）ポリアルキレングリコールのＣ６−Ｃ１６脂肪
族アルコールエーテル、好ましくはポリオキンエチレン
またはポリオキノプロピレノ、例えばブリッジ（Ｂｒ１
ｊ　）　−３５（ＩＣＩ　。

アメリカ社、ウイルミントン、プラウエア州）、＋ＩＩ
＋　Ｃ６−ｃ、６脂肪族Ｎ、Ｎ−ジアルキルＮ−オキシ
ド、例えばドデンル−Ｎ　、Ｎ−ジメチルアミノＮ−オ
キシド、１ｌｌｌｌ　Ｃ６−Ｃ１６脂肪族アンモニウム
塩、例えばテトラデシルアンモニウムプロミド、ＯＶＩ
　Ｃ６−Ｃ１６アルキル基を有する第四級アンモニウム
化合物、列上ばセチルトリメチルアンモニウムブロミド
またはセチルピリジニウムクロリド、（■）アルキルヘ
７ゼンスルホ不−ト、例えばドブノルへ７ゼンスルホン
酸ナトリウム、およびＶＩｌこれらの混合物が挙げられ
る。

本発明１℃は、さらに少くとも一種の希酸の存削が必要
である。希酸の例としては、（１）有機スルホ／酸例え
ばメタンスルホン酸またはエタンスルホノｍ、ｔｉｉ＋
カルボン酸例えばマレイン酸、フタル酸、／ユウ酸、マ
ロン酸、グリシン、ジクロロ酢酸および乳酸、および＋
＋ｉ１＋これらの混合物が挙げられる。

少くとも一種の希薄無機酸を使用することも有利でちる
。例として塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸が挙げ
られる。本発明つ目的に７１しては「希薄」とは約３０
　ｒｎＭ　以下の濃度を指す。特に有用なのは鉱酸とカ
ルボ／酸との組合せ例えばフタル酸−）（Ｃ４である。

本試薬組成物は試ず４と接触してその分析に使１４され
る場合のρ１１が約１．８ないし約２．３の範囲内（こ
ある必要がある。このｐｌ＋範囲は狭いが本発明の一つ
の重要な面である。このｐＨは希ｉｖ酸の存在のみによ
って確保することも、追加の酸をυ口えてこのｐｌ＋を
得ることもできる。

本組成物；−ｉ１だ必要に応じ、界面活性剤の自動酸化
による分解？遅延させて貯蔵寿命を増大させる連鎖停止
性酸化防止剤を含有し得る。酸化防止剤は、防止剤がな
い場合ンこ連鎖反応に関与するであろう過酸化ラジカル
を破壊する。レリとしてジ第三級ブチル〜４−メチルフ
エノール（ＢＨＴ）　、ｐ−メトキノフェノール（ＭＥ
ＨＱ）またはジ第三級ブチルー４−メトキ／フェノール
（ＢＨＡ　）が挙げられる。

本組成物ｖｉまた、必要に応じ、混入生物例えばかびの
生長を遅らせまたは防止する抗微生物防腐剤１を含有す
ることができる。

本発明の好−４しい態様においては、使用する成分の割
合は次の範囲でちる： ａ）界面活性剤　　　　　　１０−２０り／Ｌｂ）希薄
酸　　　　　　　　０．０２０−０．０２４　ＷｔＣ）
連鎖停止性酸化防止剤　０．１−０．２　？／ｌｄ）抗
微生物防腐剤４剤　　　　０．２−０．６９／を本方法
が手動式、自動式のいずれにも最適化しく尋るように、
反応速度を調節し得ることが望ましい。この点に関し、
ブリッジ−３５、マレイン酸およびＢＩＴを含有して成
る組成物は特に興味がちる。

マレイン酸は帆０２５％−１％（０，００２２−０，０
８６Ｍ　）の製置にわたって使用することができる。マ
レ・ｆン酸濃変を変化させることにより速度を約１０培
も増加させることができる。

マレイン酸の低い範囲の濃度は手動式誼ｔＢ境的作業に
特て有用である。反応速度は操作全２分以内に完了し得
る程度に十分に緩徐でちる。これ；こχ１し濃度範囲り
うち高い方の端においては反応、ｉ本質的シ・ζ瞬間的
で、自動式機器測定法に＋ｉｌ当である。

本発明の方法を実施する場ば、全血試ト１をＨｔ７−　
＋ｉ＋ｉ活性剤および希薄酸の浴液と混合すると、尤ず
あとに赤血球の１ｇ造分全く残さない赤血球溶４ｊイか
り始まり、次にやは！ｌｌあとに構造を残さない血小内
溶解、さらに、好塩基ＥＦ以り１のすべての白面上）゛
・２）球の核を残し好塩基球のみがα理イ÷の血イｉ試
！、Ｖ中唯−の蜆祭司能な完全細胞として実質的に無傷
で残る白面Ｅ）細：Ｉｆ！２質除去といった一連のｌｌ
（ｌＩ胞ａ位および帷宿質鼓壊が生ずる。白血球の核と
、π＋ｉｌ胞質膜およびＩ！Ｑ粒曲を保持する好塩基球
とは、視覚的表４またばｔ幾器検出系によって弁別する
ことができる。

流（の人血！、ｘ　ｉＩ数計中の導管ないし分析流路内
を流れている流体流中に細胞試ｆ−１を導入することが
好ましい。これは好ましくは、導管ないし分析流路内９
Ｃ鞘液のｇすれをつくり、次で試料を流れている鞘流中
に導入することによって行われる。この萌五は通常、廁
胞試料附゛濁媒体と実質的に同じ屈折率と持つ流体から
なる。鞘流キャリヤー成体をｉ重用するこの種流動式血
球以外計の一つがテクニコノ（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ　）
ヘマログ（Ｈｅｍａｌｏｇ　）　ＤおよびＨ−６０００
糸に゛（重用されており、　この系はあらゆる日常的な
血液学的試験を行うことができる。ヘマログＤおよびＨ
−６０００糸の詳細な情報はテクニコ／インスツルメン
ト社（クリタウン、ニューヨーク州）から入手すること
ができる。

以下の実施例は本発明を完成するに当って走：６した実
験を記述するものである。総括すればこれら実施し１ｊ
の、清栄は本発明の組成物ち・よび方法によってＩａｌ
好塩基塩凸球確に以外すること、ｆｂｌ与えられた任意
の試料に存在するレフトソフトの程度および平均ローブ
（葉状体）以外または量の指漂を与えること、Ｉｃｌ芽
細胞を他の皓核細兜と正確に弁別すること、（ｄ）有核
赤血球を定量、同定すること、およびｔｅｌ全白血球の
以外を得ることが可能であることを大証している。可能
な場合は常に標準の市販試薬級薬品を使用した。

例　　ｌ 白血球の手動式弁別的以外 白血球（■℃）の弁別的以外は（ｊ々の病態、特に感染
性または免疫的疾患関係の病態の弁別的診断における最
も重要な識別パラメータである。本実施例に報告の実験
においては、好塩基球をそれ以外のすべての血球と、ま
た単核白血球を多形杉白血球と弁別するために本発明組
成物を調製し使用した。

本発明の組成物は蒸留水９７ｍ１中にマレイン酸０．２
０？、ブリッジ−３５３ｍｇ（蒸留水中３０　％　ｗ／
ｖ（重ｈ１／８債）としたもの）を加えて調製した。

新鮮なヒト全面試料８．０μｔを上記の通り調製したｉ
Ｈ成酸物００μｔと混合した。　１分後反応した全面試
料のアリコートをピペットで清浄な顕微鏡スライドガラ
ス上；てと９、ニコ／顕微鏡で４０倍で観品した。

このアリコートを顕微鏡で調べたところ、赤血球および
面小坂は破壊され、好塩基球以外の白血球は完全に細胞
質を除かれていることが認められた。基塩好性ＰＭＮ　
の細胞質膜および顆粒は影響を受けずそのま＼であった
。

またマレイアｊ股を含まぬ以りｔは上記と同す丘な組成
物も調製した。この組成換金上記と同ｔｊ）ｌに血液試
料の試験１・ζ１史用したがｍｉ液成分の溶解ｊま認め
られなかった。さらに、マレイン酸な含有するが界面ｌ
古住斉りのブリッジ−３５を古いたシ且ｆ戊！ｌ勿も６
（１ｒ製した。細１把凝東が生ずることが認められ、こ
れ（は基塩４．１３球のｕ　、にち・よび出血月；の騒
状■の認識を不明瞭（こする、すなわちどちらの組成物
も、セ発明の組成物で行い得るような弁別を可能とする
力が、ｊ、！Ｉｉかった。

例　２ 白血球の自動式弁別的以外 本実崩例に報告する実験は本発明の組成物を゛重用する
好塩基球の正確な以外を示すものである。

好塩基球、単核細＠（未成熟１１ｒ１粒球、リンパ球お
よび単球）およびＰＭＮ　　（好中球および好２　Ｅ４
＋　）を測定した。これらを、Ｈ−６０００測定機屋系
（テクニコ／、上山）において使用される既存技術によ
る同じ測定と比較した。未成熟顆粒球の存在０」り定を
例示する。また本発明のｍ５ｙ、物を使ノイ（してレフ
ト／７ト、例えば平均好中球葉状体駐数のイシ少をｄｌ
り定した。

本発明に従って、フタルａ３６ｙ、ブリッジ−３５１０
９、ＨＨＴ　Ｏ，１ｆ　、　　Ｉ　Ｎ　Ｉ−ＩＣｊ　１
．Ｏｍｌを蒸留ｋ（ｐＨ２，０）で１４として試・桑！
′Ｉ！成づのを調製した。

多勢の患者１４シ団のそれぞれからの血孜試ｔ＋をそれ
ぞれ同一試験法によってｄ８べた。谷血液試１）８μｔ
　を別々の試験管に上記試薬１組成物５ｏ１〕μｔ　ど
共に加えた。混合５０秒後、反応混合物を拭動ポンプに
よって鞘流流動セル中を流速０．１ｍ／／分で通過させ
た。

細胞ごとの光散乱信号の二次元分布を得るのに使用した
光学系はテクニコンＨ−６０００流動式血球以外系（テ
クニコン、上山）の改造ＲＢＣ／ＰＬＴチャンネルであ
る。この系で得られる出力の横・袖に沿って高角散乱を
、縦軸に沿って低角散乱を測定した。血球の独々の型を
識別するためにクラスター分析（ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎ
ａｌｙｓｉｓ　）　　を使用してコンピューターにより
分界閾値線を設定し、細胞残片等：こよる信号はすべて
無視するように系をプログラムした。使用した光学系の
完全な記述はテクニコン社（上山）から入手し得る。光
学系からの出力信号は増幅し二次元分布図に変換した。

各点は単一の細胞についての測定座漂肺を表わす。

、の者０四団からとった各試料は本発明に従ってｔ？ｆ
ｌ記の組成物および操作を使用して分析した。第１Ａ図
から第１Ｅ図までは、正常な試料提供者からのか＼る試
料の一つに対し上記分析操作によって得た、反応開始か
ら神々の時間後（（おける反応１段階を示す。第１Ａス
（１５秒）は破壊されたＩｔＢＣおよびＰＬＴ　（Ｒ）
ならびに膨潤したＷＢＣ（Ｗ）を示ｒ、第１Ｂ図（２０
〜２５秒）は、細ｊ泡質を失゛ハ始めＹ軸に４って原点
方向へ動き始めたリンパ球（Ｌ）を示す。第１Ｃ図（３
０〜３５秒）においては顆粒球（Ｇ）のあるものは細胞
質を失い始め、すべてのリンパ球（Ｌ）は完全に細＠質
を除かれている。

第１Ｄ図（４０−４５秒）においては顆粒球（Ｇ）の大
部分とリンパ球全部が完全に細、砲’ｔｒｉを除去され
、従ってその最終的のＸ−Ｙ位ｉｌに移動してしまって
いる。少数のＷＢＣ（Ｗ）は、大部分は単球であるが、
無傷で残っている。第１Ｅ図（８０秒）は好塩基球以外
のすべての白血球が＠泡質を取除がれて裸の核のみを残
し、その最終的なＸ−Ｙ位・４にあることを示す。ＰＭ
Ｎ（Ｐ）、　単核甜、ｔｉ！！（ＭＮ　）、好塩基球（
Ｂ）および細胞残片（Ｒ）の明瞭な集団が示されている
。

患者の集団から採取した試料はまた、Ｊｒ、！１７にの
市販テクニコンｌ（−６０００系を使用しメーカーの取
扱い説明丼（・Ｃ従って試・険した。好塩基球、単核細
胞（：Ｖ［Ｎ）、およびＰＭＮ　集団のそれぞれについ
て結果の相関とそれぞれ第２〜第４図に示す。

ＷＪ２図！＋ま正常分よび異常の９８試料からのデータ
についてのＲｕｍｐｋｅ　　の卵形を示し、好塩基球の
百分率について本発明の方法とテクニコンＨ−６０００
好塩基球測定法とを比較するものである。

′＄図は両結果が矩めてよく一致すること、また９５％
以上の点が卵形内に来ることを示している。相関係数は
帆８１であった。

第３図は本発明の分析法を使用した場合の竿核刑′ｉｉ
！１（ＭＮ）と、　テクニコン）（−６０００ベルオキ
ンターセ法と使用した場合の単核細胞〔リンパ球（Ｌ）
、卓球（Ｍ）および大型非染色細胞（ＬＵＣ）を含む〕
とに村する優れた精度と相関性とを示す。

本発明の方法が正常試料について如何によく一致するか
を示すために試料数を減らして異常な（白血病性）試料
を除いた。相関係数は帆９６　　であった。

第４図は同一試料のＰＭＮについて本発明の方法（Ｐ）
と、ＰＭＮを好中球（Ｎ　）　オ、１：　ｅ）−ｂ［１
２５Ｐ（Ｅ）として報告するＨ　−６０００系シζよる
方２去とを使用したときの優れた精度と相関性とを示す
ものである。相関係数ｄ　０．９７であった。

第５Ａ図、および第５Ｂ図は本発明の方法と？＋ｆ来の
［（−６０００系ベルオキングーゼ法をそれぞれ使用し
た、未、吸熟頌粒球全含有することが既知の異常試料の
二次元分布図である。第５Ａ図１（おいては、ベルオキ
／ラーゼ法シ（よるリンパ球、単球プラス大型非染色細
胞から予想されるよりもより密集した単核細胞集団が認
められる。上記二つの方法のそれぞれを使用して得らｉ
Ｌる谷！ｔｌ　ｉ説ｉす、７）百テナ比および手動式に
観測して得られるその１直を第１表に示す。

第１表 本発明法　　３９．６％　　５７．９係　　ｍら扛ずＨ
−６０００３１，６チ　　６７．７係　　？４）もｔｔ
ず手動　　　　３３．５％　　５９．０係　　７．５係
、４・足間の方、去と１ｌ−６ｏ００　　ｒ去とでｆ！
ＩらＩ′Ｌる単核細胞数のかなり大きな差は、手動式〇
去で観測される末成：Ｉζｌ’（＋粒Ｅドの数に対むし
ている。従って、相当数の未成執（′ｌ′ｉ粒球を含有
する試料を正常試料から識別することができる。

ド定明の方法が好中球の咳のみを温存することによる今
一つの利１点は、レフトレフト（すなわち、より多数り
術状核細胞数が存在することによる平均基中球核ローブ
以外の減少）の存在を指示し得ることである。これｊｄ
平均ローブ以外の減少に伴ってＰ　Ｍ　Ｎ　、％団（Ｐ
）の最頻１直が減少する事実によって実証される。第６
図〜第６Ｃ図は帯状核細胞計Ｕが・・Ｉ欠瑠加し平均ロ
ーブ以外が１１１次減少する３種の試料てついてのＨ−
６０００法の結果を示す。

この３試料にはどの試料がレフトシフトを有スるかを示
唆するような弁別的特畝は存在しないことがわかる。第
６Ｄ図〜第６Ｆ図は同じ試料につき本発明の方法を使用
した場合の結果を示す。平均ローブ以外が減少するにつ
れて、２ＭＮ集団（Ｐ）の最頓値が対応して減少するこ
とがわかる。ＰｉＶＩＮ集団最頻値のこの左方への移動
から、本発明のツノ去ではレフトシフトの存在を予測す
ることができる。

第２表はこれら試料に対する手動式の帯状核細胞以外お
よび手動式の平均好中球ローブ以外と２ＭＮ集団（Ｐ）
最ｙＪ４値とを帯状核細、＠０〜２０、平均ローブ以外
３．３８〜２．３１　　の範囲で対比して示すものであ
る。

第　　　　２　　　　図 手動式帯状核細胞以外　手動式平均ローブ以外　ＰＭＮ
最Ｉ填血０％（第６Ｄ図）　　　　　３．３８　　　　
　３０．５５％（第６Ｅ図）　　　　　　３．０６　　
　　　２７．０２０チ（第６Ｆ図）　　　　　２．３１
　　　　　２４．５例　　３ 本例に報告する実験は、芽細胞を池の単核１抱から弁別
するために例２に記したのと同じ本発明の組成物および
分析方法と使用する例を示ｔものである。Ｈ−６０００
系ベルオキシグーゼ法を使用して観測される大型非染色
細胞のうち相当の部分は異常単核細胞の存在に帰せられ
ていた。か＼る方法ではこれらの細胞が芽細砲でちるか
非定型リンパ球であるかを同定することはできなかった
。

全面試料を急性骨髄芽球性白血病の供血者（試料Ａ）、
正常供血者（試ＭＢ）および慣性リンパ原注白血病の供
血者（試ＭＣ）から得た。本発明のギ且酸物を使用して
それぞれの試料を分析した場合の、別、泡集団のバタン
をそれぞれ第７Ａ図〜第７Ｃ図に示す。

上記と同じ３（重の試料のそれぞれから別のアリコート
をとってベルオキシターゼ活は用に染色し、Ｈ−６００
０系（ＩＣより通常のベルオキ／ダーゼ試薬およびチャ
ンネルを使用して分析した。得られた結果は　第７Ｄ図
〜篇７Ｆ図にそれぞれ示す。

第７Ａ図分よび第７Ｃ図には共に、大型非染色に４１１
　！＋包（ＬＵＣ）のかなりの集団が与られる。これら
はそれ自体、異常車し、Ｉ（ＩＩ胞の存在を示し、正常
な集団汁布を示す第７Ｂ図と弁別することができる。

しかし第７Ａ図、第７Ｃ図は実質的に外見が同一で、従
ってこのＬＵＣ集団の増加が角性芽球註出血ｊ’３　ｋ
　７１：す芽球（ｌｉｔ胞の増ＩＪＯによるものか漫ひ
リッパ球ｊ％白皿白金示す非〕１１型リンパ球によるも
のかを決定する手段となり得ない。

第７Ｄ図と第７Ｆ図とで）は、単核（ＭＮ　）　ＩＡ団
が現れる位置がＸ＠上で相当異なっている。原点方向に
左側に移動している第７Ｄ図のＭＮ隼団は芽ＥＪ！！胞
を含んでいる。これに対し、ＷＪ７Ｆ図のＮＩＮ集団は
正常供血者からの試料である第７Ｅ図ＤＭＮ集団と同じ
位置に留っている。一定の垂直な芽球閾値線（ＢＴ）を
設けることによってその正ζ１ｒな割合を求めることが
できる。

手動式方法および本発明の方法を使用した観１ｌＩｌ＋
した芽球細胞の百分率、およびＨ−６０００分析法？使
用した大型非染色細胞の百分率を第３表に示す。

第３表 ２２．０係　２３．１８チ（第７Ｄ図）　　　３１．４
係（第７Ａｌλ）０％　０．６４％　（第７Ｅ図）２．
：う！ｌ）（第７Ｂ図）０％　０，１７チ（第７Ｆ図）
　　　４１．２チ（第７　Ｃｔｌ　）以上の通り、本発
明のＹｌｉ　Ｉｎｘ物を１吏用することにより芽球細胞
と非定型り／バ球との識別が可能となったことが実証さ
れた。これは重要な意義のある白血病の異る鍾類を識別
するための方法を提供するものである。

１クリ　　４ 本実施列に報告の実１＠ＩＣは列２に記したと固守の組
成物および分析方法を使用した。有核赤血球（ＮＲＢＣ
）の走化的」す定のためには、循環血液中の未成熟有核
赤血球の存在は重大な異常所見であるが従来これは機器
分析によっては測定できなかった。

有核赤血球を含有する全血試料を本発明の組成物と混合
し分析した。結果を第８Ａ図に示す。細、ｌＩ！Ｉの富
集集団がＰ　Ｍ　Ｎ　領域（Ｐ）に現れてい乙。同じ試
料の別のアリコートをベルオキンダニゼ活性用に染色し
、Ｈ−６０００系により通常のベルオキンターゼ試桑お
よびチャンネルを使用して分析した。

結％！Ｌ″１ｉ８Ｂ図に示す通りである。好中球（Ｎ）
ち−よび好酸球（Ｅ）が通常現れる領域に、まばらに細
胞が現れたのみである。

すなわち、従来のベルオキシダーゼ法ではＰＭＮはほと
んど検出されないのにＩ’Ｊ　Ｌ、木兄・月の方法では
かなりのＰ１νＩＮ集団が検出され、これは視覚検査に
よるＥ（１＋　４１ｔこより有核赤血球であることが’
ｔｌｉ　））ｌした。これは従来のＨ−６０００系測雇
法を便用しりｃＰＭＮ以外と本発明の方法を使用したＰ
　ＭＮ計孜との（団のラムダ（０，００１ａ＋＋’）　
　当り細胞絶対数の相ｉｆ［であることがわかった。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図〜第１Ｅ図（ま本発明の組成物を１史用し流動
式血球以外計で血球百濁液を分析した場合の個々の白血
球の分散バタンの二次元分布図である。 各白血球は黒点で示される。各々の図は実施例２の実験
において行った反応の各逐次段階において観ｉｉ］ｌｌ
されたバタンを示す。 第２図；ま実施例２で試験した試料中の芽球そ■泡以外
（個々の細胞ではない）の分布を示す二次元分布図であ
る。 第３図は実施例２で試験した試料における単形細胞以外
（個々の細胞ではない）の分布を示す二次元分布図であ
る。 第４図は実画例２で試験した試料における多形核細胞以
外（個々の細胞ではない）の分布を示す二次元分布図で
ある。 、ル５へ図〜第５Ｂ図は本発明の組成物および従来の方
法全それぞれ使用して得た、未成熟顆粒球を含むことが
既知である異常全面試料の二次元分布図である。 第６Ａ１４〜第６Ｆ図は本発明の方法がレフトンフトを
示す能力を従来法と比較して示す二次元分布図である。 ｇ７Ａ７Ａ第７Ｃ図は、流動式血球以外計において本発
明の組成物を使用して分析した１固々の血液状ｑの二次
元分布図である。これらは実施例３の、＠、性刊髄芽球
性白血病の供血者、正常供血音および漫ｎ　１７ンパ球
性白血崗の供血者からの試料についての実験でイ４’ｔ
られた結果をそれぞれ示す。 ｅｎ　７０図〜第７Ｆ図は従来法を使用して実施例３で
行った実験の二次元分布図である。 ・ｇｓＡ図〜第８８図（ｒｉ実価例４に記載の通り、本
発明の、ｔ１１成物ｔ・よびｂｔ来のベルオキシターゼ
試薬を使用し流動式血球言１数泪を通過させた血球ど濁
液中の個々の白血球の分散バタンの二次元号ｍ図である
。 ＦＩＧ、１Ａ ＦＩＧ、旧 ＦＩＧ、ＩＣ ＦＩＧ、１Ｄ ＦＩＧ、旧 ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ｌＧ４ ８６０００　Ｎ−Ｅ

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. （１）白血球の選ばれたサブクラスからのみ細胞膜およ
   び細胞質を取除くのに有効な、少くとも一種の希薄酸お
   よび少くとも一種の水溶性界面活性剤を含有して成りか
   つｐＨが約１．８ないし約２．３であることを特徴とす
   る、試料中の白血球の弁別用組成物。
2. （２）界面活性剤がポリアルキレングリコールのＣ＿６
   −Ｃ＿１＿６脂肪族アルコールエーテルである前項（１
   ）に記載の組成物。
3. （３）ポリアルキレングリコールがポリオキシエチレン
   またはポリオキシプロピレングリコールから選ばれる前
   項（１）に記載の組成物。
4. （４）界面活性剤がＣ＿６−Ｃ＿１＿６脂肪族Ｎ，Ｎ−
   ジアルキルＮ−オキシドを含む前項（１）に記載の組成
   物。
5. （５）Ｃ＿６−Ｃ＿１＿６脂肪族Ｎ，Ｎ−ジアルキルＮ
   −オキシドがドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンＮ−オ
   キシドである前項（４）に記載の組成物。
6. （６）界面活性剤がＣ＿６−Ｃ＿１＿６脂肪族アンモニ
   ウム塩を含む前項（１）に記載の組成物。
7. （７）Ｃ＿６−Ｃ＿１＿６脂肪族アンモニウム塩がテト
   ラデシルアンモニウムブロミドである前項（６）に記載
   の組成物。
8. （８）界面活性剤がＣ＿６−Ｃ＿１＿６アルキル基を有
   する第四級アンモニウム化合物を含む前項（１）に記載
   の組成物。
9. （９）第四級アンモニウム化合物がセチルトリメチルア
   ンモニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド
   から選ばれる前項（８）に記載の組成物。
10. （１０）界面活性剤がアルキルベンゼンスルホネートを
    含む前項（１）に記載の組成物。
11. （１１）アルキルベンゼンスルホネートがドデシルベン
    ゼンスルホン酸ナトリウムである前項（１０）に記載の
    組成。
12. （１２）希薄酸がスルホン酸と含む前項（１）に記載の
    組成物。
13. （１３）スルホン酸がメタンスルホン酸およびエタンス
    ルホン酸から選ばれる前項（１２）に記載の組成物。
14. （１４）少くとも一種の希薄酸がカルボン酸を含む前項
    （１）に記載の組成物。
15. （１５）カルボン酸がマレイン酸、フタル酸、シユウ酸
    、マロン酸、ジクロ・酢酸および乳酸およびグリシンか
    ら選ばれる前項（１４）に記載の組成物。
16. （１６）希薄酸が塩酸である前項（１）に記載の組成物
    。
17. （１７）少くとも一種の希薄酸がジカルボン酸および鉱
    酸を含む前項（１）に記載の組成物。
18. （１８）ジカルボン酸がフタル酸であり鉱酸が塩酸であ
    る前項（１７）に記載の組成物。
19. （１９）さらに連鎖停止性酸化防止剤を含有して成る前
    項（１）に記載の組成物。
20. （２０）連鎖停止性酸化防止剤がジ−第三級ブチル−４
    −メチルフエノールおよびジ−第三級ブチル−４−メト
    キシフエノールから選ばれる前項（１９）に記載の組成
    物。
21. （２１）血液試料を処理して白血球中の選ばれたサブク
    ラスから細胞膜および細胞質を取除く工程と、その後白
    血球の前記サブクラスをその細胞核の形態に基いて弁別
    する工程とから成ることを特徴とする、白血球のサブク
    ラスの弁別方法。
22. （２２）試料を処理して白血球中の選ばれたサブクラス
    から細胞膜および細胞質を取除く工程が、好塩基球以外
    の白血球から細胞膜および細胞質を除去することである
    、前項（２０）に記載の方法。
23. （２３）前記試料の処理が、白血球の選ばれたサブクラ
    スからのみ細胞膜および細胞質を取除くのに有効な少く
    とも一種の希薄酸を含有して成りｐＨが約１．８ないし
    約２．３である組成物によって試料を処理することであ
    る前項（２２）に記載の方法。
24. （２４）前記試料の処理が、ポリアルキレングリコール
    のＣ＿６−Ｃ＿１＿６脂肪酸アルコールエーテルによっ
    て試料を処理することである前項（２３）に記載の方法
    。
25. （２５）前記試料の処理が、Ｃ＿６−Ｃ＿１＿６アルキ
    ル基を有する第四級アンモニウム化合物によつて試料を
    処理することである前項（２３）に記載の方法。
26. （２６）前記試料の処理が、アルキルベンゼンスルフオ
    ネートにより試料を処理することである前項（２３）に
    記載の方法。