JPS6188900A - 媒質中の所定微生物、特にレギオネラの検出用プロ−ブおよび検出方法 - Google Patents
媒質中の所定微生物、特にレギオネラの検出用プロ−ブおよび検出方法Info
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- JPS6188900A JPS6188900A JP60170994A JP17099485A JPS6188900A JP S6188900 A JPS6188900 A JP S6188900A JP 60170994 A JP60170994 A JP 60170994A JP 17099485 A JP17099485 A JP 17099485A JP S6188900 A JPS6188900 A JP S6188900A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔従来技術〕
在郷軍人病（ｍａｌａｄｉｅ ｄｅｎ １ｅｇｉｏｎｎ
ａ１ｒｅｉ ；Ｍ、Ｌ、）の原因菌であるレイオネラ
ニュー上１９フ６年夏に臨床上個性化されたレイオネロ
ーシス（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｅａ）の主因である。
ａ１ｒｅｉ ；Ｍ、Ｌ、）の原因菌であるレイオネラ
ニュー上１９フ６年夏に臨床上個性化されたレイオネロ
ーシス（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｅａ）の主因である。
「レイオネローシス」という用語はレイオネラセアエ（
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ ）によって引き起こさ
れる感染症を相称するのに使用する。この細菌は全て、
とりわけり、Ｐ、は北米でもヨーロッパでも湖。
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ ）によって引き起こさ
れる感染症を相称するのに使用する。この細菌は全て、
とりわけり、Ｐ、は北米でもヨーロッパでも湖。
河川、空冷塔（ｔｏｕｒｓ ａｅｒｏｒｅｆｒｏｉｄｉ
ｓｓａｎｔｅｓ ）および特に給水網−この最後の２つ
は在郷軍人病の伝染および散発の原因である−に由来す
る多くの水試料中に存在することが証明されている。
ｓｓａｎｔｅｓ ）および特に給水網−この最後の２つ
は在郷軍人病の伝染および散発の原因である−に由来す
る多くの水試料中に存在することが証明されている。
レイオネラセアエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ ）
の分類学上および表現型の特徴は周知であり、プレンナ
ー（ＢＲＥＮＤ化ＲＤ、Ｊ、）、フィーレイ（ＦＥＥＬ
ＥＹＪ、 Ｃ，） オヨヒウイーハ−（ＷＥＡＶＥＲＲ
，Ｅ、 ）がパージエイズ マニュアル オプ システ
マテイツク バクテリオ田シイ（ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ Ｍ
ＡＮＵＡＬＯＦ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣＢＡＣＴＥＲＩ
ＯＬＯＧＹ） 、第１巻。
の分類学上および表現型の特徴は周知であり、プレンナ
ー（ＢＲＥＮＤ化ＲＤ、Ｊ、）、フィーレイ（ＦＥＥＬ
ＥＹＪ、 Ｃ，） オヨヒウイーハ−（ＷＥＡＶＥＲＲ
，Ｅ、 ）がパージエイズ マニュアル オプ システ
マテイツク バクテリオ田シイ（ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ Ｍ
ＡＮＵＡＬＯＦ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣＢＡＣＴＥＲＩ
ＯＬＯＧＹ） 、第１巻。
１９８４年、ウィリアムス アンド ゥイルキンス（Ｗ
ｉｌｌｌａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）版、バルー
モア／ロンドンに記載されている。これらの細菌が共通
にもっている特性には次のようなものがおる。
ｉｌｌｌａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）版、バルー
モア／ロンドンに記載されている。これらの細菌が共通
にもっている特性には次のようなものがおる。
−偏性好気性グラム陰性桿菌である。
−実験室培養では複雑な栄養要求性を示す。特にＬ−シ
スティンＨＣ１および第二鉄塩依存性である。オキシダ
ーゼ弱陽性、硝酸塩を還元しない、ウレアーゼ陰性、ゼ
ラチンを液化する。壁には分枝鎖脂肪酸が含まれる。
スティンＨＣ１および第二鉄塩依存性である。オキシダ
ーゼ弱陽性、硝酸塩を還元しない、ウレアーゼ陰性、ゼ
ラチンを液化する。壁には分枝鎖脂肪酸が含まれる。
レイオネラセアエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ ）
のうちレギオネジ ニューモフイラ（Ｌｅｇｌｏｎｅｌ
ｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａと同じ表現型特性を示す
。種を同定するには基本的に、直接螢光抗体法で多価（
現実に使用し得る８つの血清群）の、次に単価の抗−レ
イオネラ特異的螢光免疫血清（１ｒｒｒｎｕｎｓ ｓ：
ｅｒｕｍｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｓｐｅｃｉｆｉ
）ｕｅｓ ａｎｔｌ −ＬｅｇｉｏｎｅｌｌＩ、）を利
用する。
のうちレギオネジ ニューモフイラ（Ｌｅｇｌｏｎｅｌ
ｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａと同じ表現型特性を示す
。種を同定するには基本的に、直接螢光抗体法で多価（
現実に使用し得る８つの血清群）の、次に単価の抗−レ
イオネラ特異的螢光免疫血清（１ｒｒｒｎｕｎｓ ｓ：
ｅｒｕｍｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｓｐｅｃｉｆｉ
）ｕｅｓ ａｎｔｌ −ＬｅｇｉｏｎｅｌｌＩ、）を利
用する。
（以下余白）
現在実施されているようなＭ、Ｌ、のインビトロ（ｌｎ
ｖｌｔｒｏ ）診断では基本的Ｋ、培養によってレイ
オネｔ （Ｌｅｇｌｏｒ＋ｅｌｌａ ）の存在を明らか
にするかまたは抗体価の有意な増加によって証明する。
ｖｌｔｒｏ ）診断では基本的Ｋ、培養によってレイ
オネｔ （Ｌｅｇｌｏｒ＋ｅｌｌａ ）の存在を明らか
にするかまたは抗体価の有意な増加によって証明する。
病理学標本（肺組織１番出液、気管（ｔｒａｃｈｅａｕ
ｘ ） ＊痰、胸膜液、血液１等）内でのレイオネラ（
Ｌｅｇｌｏｎｅｌｌａ ）の培養による研究はデリケー
トであり、たとえばニーデルシュタイン（ＥＤＥＬＳＴ
ＥＩＮ Ｐ、Ｈ，）。
ｘ ） ＊痰、胸膜液、血液１等）内でのレイオネラ（
Ｌｅｇｌｏｎｅｌｌａ ）の培養による研究はデリケー
トであり、たとえばニーデルシュタイン（ＥＤＥＬＳＴ
ＥＩＮ Ｐ、Ｈ，）。
ジー、クリヌ、ミクロビオルー （Ｊ、 Ｃ１１ｎ、
Ｍｉｃｒｏ −ｂｌｏｌ、 ）、 １９８１年、第１４
巻、第２９８−３０３頁に記載されているような抗生物
質の添加によって部分的に選択性にされた英語名「ノ々
ツファード チャーコール イースト エキストラクト
（ＢｕｆｆｅｒｅｄＣｈａｒｃｏａｌ Ｙｅａａｔ Ｅ
ｘｔｒａｃｔ ） Ｊで知られている特殊な寒天化培地
（炭素＃酵母エキストラクト、ビロリン酸第二鉄および
Ｌ−システィンＨＣＩを含有する緩衝培地）（ＢＣＹＥ
−パスキュル（ＰＡＳＣＵＬＬＥＡ、Ｗ、）ら、ジー、
アンフエクト、ディス、（Ｊ。
Ｍｉｃｒｏ −ｂｌｏｌ、 ）、 １９８１年、第１４
巻、第２９８−３０３頁に記載されているような抗生物
質の添加によって部分的に選択性にされた英語名「ノ々
ツファード チャーコール イースト エキストラクト
（ＢｕｆｆｅｒｅｄＣｈａｒｃｏａｌ Ｙｅａａｔ Ｅ
ｘｔｒａｃｔ ） Ｊで知られている特殊な寒天化培地
（炭素＃酵母エキストラクト、ビロリン酸第二鉄および
Ｌ−システィンＨＣＩを含有する緩衝培地）（ＢＣＹＥ
−パスキュル（ＰＡＳＣＵＬＬＥＡ、Ｗ、）ら、ジー、
アンフエクト、ディス、（Ｊ。
Ｉｎｆｏｃｔ、 Ｄｉｇ、 ） 、 １９８０年、第１
４１巻、２７２７〜７３２頁）を必要とする、また、こ
の研究には予備的または同時の汚染防止操作、すなわち
、６０Ｃで１〜２分間の熱処理、またはｐＨ２，２の酸
性緩衝媒質中で１０分間の処理が含まれる、このような
処理は診断試験の選択性を強めるのには適しているが、
同時にこうして処理される試料中のレイオネラ（Ｌｅｇ
ｌｏｎｅｌｌｍ ）の量を減少させるという欠点を呈す
る。さらに、レイオネラ ニューモフイラ（Ｌ、 ｐｎ
ｅｕｍｏｐｈｌｌａ ）の増殖は遅く、最初のコロニー
が出現するのは播ｆ！１１後２〜４日後である。これら
のコロニーの同定には、培養条件（Ｌ−システィンに対
する依存性）または生化学および抗原特性に関連する基
準を基にする。これらの後者の特注はレイオネラ ニュ
ーモフイラ（↓、 ＄−川）の各血清群に特異的な抗血
γ１ｔによる直接螢光抗体法で検出される。
４１巻、２７２７〜７３２頁）を必要とする、また、こ
の研究には予備的または同時の汚染防止操作、すなわち
、６０Ｃで１〜２分間の熱処理、またはｐＨ２，２の酸
性緩衝媒質中で１０分間の処理が含まれる、このような
処理は診断試験の選択性を強めるのには適しているが、
同時にこうして処理される試料中のレイオネラ（Ｌｅｇ
ｌｏｎｅｌｌｍ ）の量を減少させるという欠点を呈す
る。さらに、レイオネラ ニューモフイラ（Ｌ、 ｐｎ
ｅｕｍｏｐｈｌｌａ ）の増殖は遅く、最初のコロニー
が出現するのは播ｆ！１１後２〜４日後である。これら
のコロニーの同定には、培養条件（Ｌ−システィンに対
する依存性）または生化学および抗原特性に関連する基
準を基にする。これらの後者の特注はレイオネラ ニュ
ーモフイラ（↓、 ＄−川）の各血清群に特異的な抗血
γ１ｔによる直接螢光抗体法で検出される。
これらの０ト究は、比較的高？ｌ１度のり、 Ｐ、を含
み得る病理上のサンプルに適用したときは手間がかかり
面倒であり、循環水、またより一般的には環境の汚染の
研究および汚染防止に適用すると実施不可能になってし
まう。レイオネラ（ｌｅｇｌｏｎｅｌｌｅｓ ）の増殖
が遅いこと、これより速く増殖する別の夾雑微生物が存
在すること、実際に選択的な培地を調整することが困難
であることのため、ルーチンなコントロールが特に雌か
しくなる。これらの困難性に加えてさらＫ、レイオネラ
（ｌ二ｇｌｏｎｅｌｌｅｓ ）の異θる種の免疫学的特
性のレベルで観察され得る多様性がある。
み得る病理上のサンプルに適用したときは手間がかかり
面倒であり、循環水、またより一般的には環境の汚染の
研究および汚染防止に適用すると実施不可能になってし
まう。レイオネラ（ｌｅｇｌｏｎｅｌｌｅｓ ）の増殖
が遅いこと、これより速く増殖する別の夾雑微生物が存
在すること、実際に選択的な培地を調整することが困難
であることのため、ルーチンなコントロールが特に雌か
しくなる。これらの困難性に加えてさらＫ、レイオネラ
（ｌ二ｇｌｏｎｅｌｌｅｓ ）の異θる種の免疫学的特
性のレベルで観察され得る多様性がある。
クローン化された特定のヌクレオチド配列、特にクロー
ン化された遺伝子と、探究する微生物の予じめハイブリ
ダイズできるようＫされたゲノムとのハイブリダイゼー
ションを使用する技術を淘用することが先験的に予児さ
れ１りることはほとんどなかった。その第１の理由は、
ハイブリダイゼーションが実際に選択的であるという充
分な確度を以ってこの方法を実施できる程充分特異的な
りＮＡ配列が今日まで未だなかったという事実による。
ン化された遺伝子と、探究する微生物の予じめハイブリ
ダイズできるようＫされたゲノムとのハイブリダイゼー
ションを使用する技術を淘用することが先験的に予児さ
れ１りることはほとんどなかった。その第１の理由は、
ハイブリダイゼーションが実際に選択的であるという充
分な確度を以ってこの方法を実施できる程充分特異的な
りＮＡ配列が今日まで未だなかったという事実による。
この非選択性は、レイオネラ（１ｅｇｌｏｎｅｌｌｅ＋
＋ ）の免疫学的特性のレベルで観察されているのと同
様にゲノム染色体の構造が菌株によって大きく変わり得
るのであるから一層ひどくなる危険があった。これらの
困難性に加えてさらに、レイオネラ（ｌｅｇｌｏｎｅｌ
ｌｅｓ ） Ｋ伴なってこれを含有する媒質中に入って
来ることが多い他の種のＤＮＡが引き起こす余分なハイ
ブリダイゼーションに比例して観際し得る非選択性の結
果化ずる困難性がある。しかしそれにもかかわらず、病
理標本または液体もしくは大気試料、特に液体と外気の
間で熱交換をするあらゆる設備（冷却または加熱システ
ム）中でかき混ぜられる水もしくは空気等に関しては、
Ｌ。
＋ ）の免疫学的特性のレベルで観察されているのと同
様にゲノム染色体の構造が菌株によって大きく変わり得
るのであるから一層ひどくなる危険があった。これらの
困難性に加えてさらに、レイオネラ（ｌｅｇｌｏｎｅｌ
ｌｅｓ ） Ｋ伴なってこれを含有する媒質中に入って
来ることが多い他の種のＤＮＡが引き起こす余分なハイ
ブリダイゼーションに比例して観際し得る非選択性の結
果化ずる困難性がある。しかしそれにもかかわらず、病
理標本または液体もしくは大気試料、特に液体と外気の
間で熱交換をするあらゆる設備（冷却または加熱システ
ム）中でかき混ぜられる水もしくは空気等に関しては、
Ｌ。
Ｐ、を含有し得るあらゆる媒質中でり、 Ｐ、を正確、
選択的かつ急速に検出する技術を実用化できるようＫな
ると顕われたのは以上の技術を適用するｔことである。
選択的かつ急速に検出する技術を実用化できるようＫな
ると顕われたのは以上の技術を適用するｔことである。
本発明の基礎となった発見は、レイオネラ ニューモフ
イラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｉ ｐｎｅｕｍｏｐｈｌｌａ
）の全ゲノムを制限酵素ＢａｍＨＩで断片化して、Ｂ
ａｍＨＩ末端を有する制限断片（以後「旦牲Ｈ１断片」
とする）のうち２０ｋｂ程度のサイズを肩する担ＨＩ断
片、好ましくは約９５〜３０ ｋｂの間に間隔を置いて
並ぶサイズを有するＢａｍＨＩ断片をも予じめ取除いた
断片をプローブのノ・イブリダイズし得る物質として使
用すると、レイオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｅｓ ）、
より特定的にはレイオネラ ニューモフイラ（胎麩−ｏ
ｎｓｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｌｌａ ）を実際上普遍
的に検出できるが同時に、こうして得られた断片の組成
物がレイオネラ（１４ｇ１ｏｎ＊１１ｅｓ ）を単離す
ることができる媒質中にこれに伴なって入って来ること
が多い微生物の核酸とのクロスハイブリダイゼーション
反応は起こさないという点で選択的に検出できるプロー
ブが得られたということである。
イラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｉ ｐｎｅｕｍｏｐｈｌｌａ
）の全ゲノムを制限酵素ＢａｍＨＩで断片化して、Ｂ
ａｍＨＩ末端を有する制限断片（以後「旦牲Ｈ１断片」
とする）のうち２０ｋｂ程度のサイズを肩する担ＨＩ断
片、好ましくは約９５〜３０ ｋｂの間に間隔を置いて
並ぶサイズを有するＢａｍＨＩ断片をも予じめ取除いた
断片をプローブのノ・イブリダイズし得る物質として使
用すると、レイオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｅｓ ）、
より特定的にはレイオネラ ニューモフイラ（胎麩−ｏ
ｎｓｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｌｌａ ）を実際上普遍
的に検出できるが同時に、こうして得られた断片の組成
物がレイオネラ（１４ｇ１ｏｎ＊１１ｅｓ ）を単離す
ることができる媒質中にこれに伴なって入って来ること
が多い微生物の核酸とのクロスハイブリダイゼーション
反応は起こさないという点で選択的に検出できるプロー
ブが得られたということである。
したがって本発明はレイオネラ（１４ｇ１ｏｎａｌｌ＠
ｓ ）、より特定的にはレイオネラ ニューモフイラ（
ｋｇｌｏｎｅｌｌａ ｐｎｓｕｍｏｐｈｌｌａ ）の検
出に有用な組成物の調造方法に係り、この方法の特徴は
、レイオネラ ニューモフイラ（Ｌｓｇｉｏｎｓｌｌａ
ｐｎｓｕｍｏｐｈｌｌａ ）の菌株の全ゲノムＤＮＡ
から出発し、これに制限゛酵素１３ａｍＨＩを作用させ
て断片化すること、得られた１３ａｍＨＩ断片の混合物
から主として２０ｋｂ程度のサイズを有する断片を分離
し、好ましくは９．５〜３０ｋｂの間に並ぶサイズをも
つ断片も共に分離すること、および、レイオネラ（１ｅ
ｇ１ｏｎｅｌｌｅｓ ）の検出に有用な前記組成物を構
成することになる他の断片の混合物を回収することであ
る。この組成物は標識しておくと有利である。従来考え
られていたあらゆるマーカーが使用できる。組成物は放
射活性トレーサーを用いて標識することができ。
ｓ ）、より特定的にはレイオネラ ニューモフイラ（
ｋｇｌｏｎｅｌｌａ ｐｎｓｕｍｏｐｈｌｌａ ）の検
出に有用な組成物の調造方法に係り、この方法の特徴は
、レイオネラ ニューモフイラ（Ｌｓｇｉｏｎｓｌｌａ
ｐｎｓｕｍｏｐｈｌｌａ ）の菌株の全ゲノムＤＮＡ
から出発し、これに制限゛酵素１３ａｍＨＩを作用させ
て断片化すること、得られた１３ａｍＨＩ断片の混合物
から主として２０ｋｂ程度のサイズを有する断片を分離
し、好ましくは９．５〜３０ｋｂの間に並ぶサイズをも
つ断片も共に分離すること、および、レイオネラ（１ｅ
ｇ１ｏｎｅｌｌｅｓ ）の検出に有用な前記組成物を構
成することになる他の断片の混合物を回収することであ
る。この組成物は標識しておくと有利である。従来考え
られていたあらゆるマーカーが使用できる。組成物は放
射活性トレーサーを用いて標識することができ。
また、特に探究すべきＤＮＡ配列とハイブリダイズした
後に酵素１発光体、螢光体等のマーカーにの組成物中に
含まれるＤＮＡ断片を修飾することもできる。
後に酵素１発光体、螢光体等のマーカーにの組成物中に
含まれるＤＮＡ断片を修飾することもできる。
本発明の好ましい組成物は、寄託機関アメリカン タイ
プ カルチャー コレクション（ＡＭＥＲＩＣＡＮ Ｔ
ＹＰＥ ＣＵＬＴＵＲＥ Ｃ０ＬＩＪＣＴＩＯＮ）
からＡＴＣＣ３３１５２として入手できるり、Ｐ。
プ カルチャー コレクション（ＡＭＥＲＩＣＡＮ Ｔ
ＹＰＥ ＣＵＬＴＵＲＥ Ｃ０ＬＩＪＣＴＩＯＮ）
からＡＴＣＣ３３１５２として入手できるり、Ｐ。
株から得られる。しかし、レイオネラ ニューモ株から
（特に後述するＡＴＣＣの寄託番号を有する菌株から）
類似の条件を得ることができる。
（特に後述するＡＴＣＣの寄託番号を有する菌株から）
類似の条件を得ることができる。
さらに詳細には本発明は、レイオネラ（ｌｅｇｌｏ−ｎ
ｅｌｉｅｓ ）から抽出されたかまたは単にハイブリダ
イズできるよう処されているゲノム−ＤＮＡとハイブリ
ダイズさせるととくよってレイオネラ（１４ｇ１−ｏｎ
ａｌｌ＠ｓ ）を選択的に検出するのに有用である。
ｅｌｉｅｓ ）から抽出されたかまたは単にハイブリダ
イズできるよう処されているゲノム−ＤＮＡとハイブリ
ダイズさせるととくよってレイオネラ（１４ｇ１−ｏｎ
ａｌｌ＠ｓ ）を選択的に検出するのに有用である。
レイオネラ ＝ｚ−モフイラ（Ｌｓｇｌｏｎｓｌｌａ
ｐｎｅ−ｕｍｏｐｈｌｌｍ ）のゲノムＤＮＡ断片の組
成物自体にも係り、この組成物は、レイオネラ ニュー
モフィラ（Ｌｓｇｌｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｌ
ｌａ ）のゲノムＤＮＡ断片の混合物で構成されており
、さらに詳細には、一方でレイオネラ エユーモフイラ
（Ｌｅｇｉｏｎ＠１１ａｐｎｓｕｍｏｐｈｌ１ｍ ）の
全ゲノムＤＮＡと、他方で菌株ＡＴＣＣ３３１５２の全
ゲノムのようなレイオネラ ニューモフイラ（Ｌｓｇｌ
ｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｍ ）の全ゲノム
を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、約２０ｋｂ以外のサイ
ズを有する１３ａｍＨＩ断片を分離することＫよって前
記ゲノムから得られた約２０ ｋｂのサイズを有するＢ
ａｍＨＩ断片との両者とハイブリダイズし得る断片自体
ははとんど含まないことを特徴とする。
ｐｎｅ−ｕｍｏｐｈｌｌｍ ）のゲノムＤＮＡ断片の組
成物自体にも係り、この組成物は、レイオネラ ニュー
モフィラ（Ｌｓｇｌｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｌ
ｌａ ）のゲノムＤＮＡ断片の混合物で構成されており
、さらに詳細には、一方でレイオネラ エユーモフイラ
（Ｌｅｇｉｏｎ＠１１ａｐｎｓｕｍｏｐｈｌ１ｍ ）の
全ゲノムＤＮＡと、他方で菌株ＡＴＣＣ３３１５２の全
ゲノムのようなレイオネラ ニューモフイラ（Ｌｓｇｌ
ｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｍ ）の全ゲノム
を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、約２０ｋｂ以外のサイ
ズを有する１３ａｍＨＩ断片を分離することＫよって前
記ゲノムから得られた約２０ ｋｂのサイズを有するＢ
ａｍＨＩ断片との両者とハイブリダイズし得る断片自体
ははとんど含まないことを特徴とする。
２０ｋｂ程度のサイズを有する断片は、レイオネラ（１
４ｇ１ｏｎｅｌｌ＠ｓ ）のゲノムＤＮＡと他の細菌種
および属のゲノムＤＮＡとの両者が含有する相補配列と
非選択的にハイブリダイズする配列を十中へ九含んでい
ることが明らかにされている。また。
４ｇ１ｏｎｅｌｌ＠ｓ ）のゲノムＤＮＡと他の細菌種
および属のゲノムＤＮＡとの両者が含有する相補配列と
非選択的にハイブリダイズする配列を十中へ九含んでい
ることが明らかにされている。また。
２０ｋｂルｔｍＨＩ断片以外の断片でそのサイズがそれ
ぞれ約９．５〜３０ ｋｂの間に並ぶＢａｍＨＩ断片を
も本発明の断片組成物から入念に取り除（と選択性がさ
らに強化されて有利である。
ぞれ約９．５〜３０ ｋｂの間に並ぶＢａｍＨＩ断片を
も本発明の断片組成物から入念に取り除（と選択性がさ
らに強化されて有利である。
換言すると、本発明の好ましい組成物はり、Ｐ。
のゲノム、好ましくは全体に由来するＢａｍＨＩ断片か
ら形成され、この断片のサイズはそれぞれ約９．５ｋｂ
未満と約３０ｋｂより大きい。
ら形成され、この断片のサイズはそれぞれ約９．５ｋｂ
未満と約３０ｋｂより大きい。
上記の定義は、実際断片混合物が他の全ての態様の断片
化を除いて酵素ＢａｍＨＩでり、Ｐ、の全ゲノムを処理
することによって実用上排他的に得られることを仮定し
ている。また実用上の理由から。
化を除いて酵素ＢａｍＨＩでり、Ｐ、の全ゲノムを処理
することによって実用上排他的に得られることを仮定し
ている。また実用上の理由から。
たとえばサイズがさらに小さい断片の混合物を得るため
に別の制限酵素を混合物に作用させることが考えられる
（時として避けることが難かしい「機械的断片化」では
ない）。しかし、この処理によってさらに小さくなった
断片が、処理前に３０ｋｂより大きいサイズをもってい
九ＢａｍＨＩ断片の追加断片化によって生ずる９、５
ｋｂ〜約３０ｋｂのサイズを有するとしても、これらが
上記＆て定義したような９．５〜３０ｋｂのサイズを有
する旦ａｍＨＩ断片とは容易に区別できることは容易に
理解できるであろう。すなわち、これらの断片は適当な
条件下で少なくとも実質的な割合では相互にノ・イブリ
ダイズしないのである。
に別の制限酵素を混合物に作用させることが考えられる
（時として避けることが難かしい「機械的断片化」では
ない）。しかし、この処理によってさらに小さくなった
断片が、処理前に３０ｋｂより大きいサイズをもってい
九ＢａｍＨＩ断片の追加断片化によって生ずる９、５
ｋｂ〜約３０ｋｂのサイズを有するとしても、これらが
上記＆て定義したような９．５〜３０ｋｂのサイズを有
する旦ａｍＨＩ断片とは容易に区別できることは容易に
理解できるであろう。すなわち、これらの断片は適当な
条件下で少なくとも実質的な割合では相互にノ・イブリ
ダイズしないのである。
場合によっては、プローブ組成物の製造に際し上記に定
義した方法を使用して得られる断片の１部のみを使うこ
とになろう。混合物を構成する断片の数が減少した結果
として起こることがある選択性の増加と、たとえり、Ｐ
、のゲノム中に多く反復して表われる配列の場合だけに
してもノ１イブリダイゼーションのレベルで特に有効な
いくつかの配列を除去することＫよって生じ得る感度の
低下とを検討することは常に当業者の問題であろう。
義した方法を使用して得られる断片の１部のみを使うこ
とになろう。混合物を構成する断片の数が減少した結果
として起こることがある選択性の増加と、たとえり、Ｐ
、のゲノム中に多く反復して表われる配列の場合だけに
してもノ１イブリダイゼーションのレベルで特に有効な
いくつかの配列を除去することＫよって生じ得る感度の
低下とを検討することは常に当業者の問題であろう。
ＢａｍＨＩ断片またはこれらから他のものを分離する上
記操作はあらゆる公知の方法によって行なうことができ
、たとえばゲル濾過、電気泳動、適当な勾配中での遠心
によって実施することができる。これらの方法は全て、
明らかに共通に、ＤＮＡ断片を各々のサイズによって分
離する能力を有してい石。
記操作はあらゆる公知の方法によって行なうことができ
、たとえばゲル濾過、電気泳動、適当な勾配中での遠心
によって実施することができる。これらの方法は全て、
明らかに共通に、ＤＮＡ断片を各々のサイズによって分
離する能力を有してい石。
本発明はまた１本発明の組成物を使用する検出方法にも
係る。この時の組成物は予じめ、（たとえば放射活性に
）標識しておくか、または、特に組成物の断片の少なく
ともいくつかと検出すべきり、Ｐ、のゲノムＤＮＡとの
ハイブリダイゼーション後に、検出できるかもしくは自
身が標識されているかもしくは標識できる類似の分子も
しくは他の物質によって認識され得るようＫしておく。
係る。この時の組成物は予じめ、（たとえば放射活性に
）標識しておくか、または、特に組成物の断片の少なく
ともいくつかと検出すべきり、Ｐ、のゲノムＤＮＡとの
ハイブリダイゼーション後に、検出できるかもしくは自
身が標識されているかもしくは標識できる類似の分子も
しくは他の物質によって認識され得るようＫしておく。
このような検出に必要な操作は好ましくは次の操作であ
ることが思い起こされよう。
ることが思い起こされよう。
−分析すべき細胞（またはこれらの核酸に近づく（ハイ
ブリダイゼーションのためＫ）ことができるように予じ
め処理した細胞）の核酸を、ニトロセルロース、ポリア
クリルアミｒ ナイロン（ＮＹＬＯＮ）またはその類似
物のような適切な支持体く付着および固定する。
ブリダイゼーションのためＫ）ことができるように予じ
め処理した細胞）の核酸を、ニトロセルロース、ポリア
クリルアミｒ ナイロン（ＮＹＬＯＮ）またはその類似
物のような適切な支持体く付着および固定する。
−こうして固定したまたは近付けるようＫされた核酸を
本発明のＤＮＡ断片組成物と接触させる。その条件はレ
イオネラ（１３）レギオネラ（ｌ，ｅｇｉｏｎｅｌｌｅ
ｓ ）のＤＮＡが存在するときには有効なハイブリダイ
ゼーションが生起し得るような条件である。
本発明のＤＮＡ断片組成物と接触させる。その条件はレ
イオネラ（１３）レギオネラ（ｌ，ｅｇｉｏｎｅｌｌｅ
ｓ ）のＤＮＡが存在するときには有効なハイブリダイ
ゼーションが生起し得るような条件である。
−ハイブリダイズしていないＤＮＡ断片を全て除去（特
に洗浄）する。
に洗浄）する。
一ハイブリダイズした標識断片を検出する。
上述したようＫこの検出は本発明の組成物に前もって組
み入れられている放射活性トレーサーを利用することが
できる。酵素１発光体または螢光体マーカーを利用する
と好ましいであろう。このような場合１組成物の断片は
予じめ化学的に修飾してこれに化学基を導入しておくと
有利であり。
み入れられている放射活性トレーサーを利用することが
できる。酵素１発光体または螢光体マーカーを利用する
と好ましいであろう。このような場合１組成物の断片は
予じめ化学的に修飾してこれに化学基を導入しておくと
有利であり。
これら化学基はその後、（特に複合体を形成するための
）類似の分子と、またはこれらの基を認識し得る抗体（
この場合これらの化学基は）〜ブテン性または抗原性を
示す）と、直接または間接に結合（カップル）できる。
）類似の分子と、またはこれらの基を認識し得る抗体（
この場合これらの化学基は）〜ブテン性または抗原性を
示す）と、直接または間接に結合（カップル）できる。
これらの操作を実施することができる条件については、
たとえばフランス特許第７８１０９７５号もしくは第８
１２４６３１号またはヨーロツノｑ特許出願公開第００
６３８７９号を参照されたい。
たとえばフランス特許第７８１０９７５号もしくは第８
１２４６３１号またはヨーロツノｑ特許出願公開第００
６３８７９号を参照されたい。
本発明のその他の特徴は、以下の非限定実施例を参照し
た本発明の実施態様および本発明を有効（使用し得る条
件に関する記載から明らかになるであろう。
た本発明の実施態様および本発明を有効（使用し得る条
件に関する記載から明らかになるであろう。
本発明方法の原理は、予じめ標識したり、Ｐ、のＤＮＡ
がレイオネラ（１ａｇｉｏｎ＠１１ｓａ ）、より特定
的にはレイオネラ ニューモフイラ（Ｌｅｇ−１ｏｎａ
ｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｌ１ｍ ）のＤＮＡと比較的選
択的にノーイブリダイズするという確認された事実に基
づいている。
がレイオネラ（１ａｇｉｏｎ＠１１ｓａ ）、より特定
的にはレイオネラ ニューモフイラ（Ｌｅｇ−１ｏｎａ
ｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｌ１ｍ ）のＤＮＡと比較的選
択的にノーイブリダイズするという確認された事実に基
づいている。
しかしこの選択性は完全に満足できるものではない。実
際、Ｌ、Ｐ、の天然媒質中にり、Ｐ、に伴なって存在す
ることが多い他の種とり、Ｐ、のＤＮＡとの間である程
度のクロスハイプリダイゼーシコンが起こる。確かにり
、Ｐ、の全ゲノムで構成したプローブ゛とハイブリダイ
ズしたＤＮＡが他の種に由来するＤＮＡから成るときの
ノ１イプリダイゼーションのシグナルはより弱いが、こ
れらの弱いシグナルでも測定の妨げになり得、特にり、
Ｐ、に対して外来の細菌をかなり大量に含む試料の場合
重大なエラーの危険を伴なうことになる。これら他の種
のうちには、基本的なものとして腸内細菌科（旦１−リ
、より特定的には本発明に至る試験で検討した次の菌株
がある。
際、Ｌ、Ｐ、の天然媒質中にり、Ｐ、に伴なって存在す
ることが多い他の種とり、Ｐ、のＤＮＡとの間である程
度のクロスハイプリダイゼーシコンが起こる。確かにり
、Ｐ、の全ゲノムで構成したプローブ゛とハイブリダイ
ズしたＤＮＡが他の種に由来するＤＮＡから成るときの
ノ１イプリダイゼーションのシグナルはより弱いが、こ
れらの弱いシグナルでも測定の妨げになり得、特にり、
Ｐ、に対して外来の細菌をかなり大量に含む試料の場合
重大なエラーの危険を伴なうことになる。これら他の種
のうちには、基本的なものとして腸内細菌科（旦１−リ
、より特定的には本発明に至る試験で検討した次の菌株
がある。
アシネトノセクター カルコアセチカス（Ａｃ１ｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒｅａｌｅｏａｅｅｔｌｃｕｓ ） フロモノセフチリウム ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂ
ａｅｔｅｒｉｕｍｖｌｏｌａｃ＊ｕｍ ） セラチア ７オンテイコラ（５ｅｒｒａＬｉａ ｆｏｎ
ｔｌｃｏｌａ ）エンテロバクタ−インテルメディウム
（ＥｎｔｅｒｏｂａｅｔｅｒＩｎｔ＠ｒｍｅｄｌｕｍ
） 大腸菌（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｌａ ｅｏｌｉ ）アルカ
リ２ネス フエカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅａ ｆ
ａｅｃａｌｌｇ ）その他。
ｏｂａｃｔｅｒｅａｌｅｏａｅｅｔｌｃｕｓ ） フロモノセフチリウム ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂ
ａｅｔｅｒｉｕｍｖｌｏｌａｃ＊ｕｍ ） セラチア ７オンテイコラ（５ｅｒｒａＬｉａ ｆｏｎ
ｔｌｃｏｌａ ）エンテロバクタ−インテルメディウム
（ＥｎｔｅｒｏｂａｅｔｅｒＩｎｔ＠ｒｍｅｄｌｕｍ
） 大腸菌（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｌａ ｅｏｌｉ ）アルカ
リ２ネス フエカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅａ ｆ
ａｅｃａｌｌｇ ）その他。
試験は次の条件で実施することができる。
１）研冗対象細菌からのＤＮＡの取得
ブレンナー（Ｄ、Ｊ、ＢＲＥＮＮＥＲ）らがジャーナル
オブ クリニカル マイクロバイオロジイ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ＣｌＩｎ１ｃａｌ Ｍｌｅｒｏｂｌｏｌ
ｏｇ）’ ）、第１５巻（１９８２年）Ｋ記載した技術
に従ってＤＮＡを調製した。
オブ クリニカル マイクロバイオロジイ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ＣｌＩｎ１ｃａｌ Ｍｌｅｒｏｂｌｏｌ
ｏｇ）’ ）、第１５巻（１９８２年）Ｋ記載した技術
に従ってＤＮＡを調製した。
回収
次に％種々の制限酵素、特に旦ａｍＨＩ、互肥ＲＩ 、
Ｓｍａ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｉ等を用い各々の製造業者
の指示書に基づいて、前記の条件で得た精製ＤＮＡを処
理した。室温（５ｒｎａ Ｉ ）または３７Ｃ（他の酵
素）で−晩インキユベートした後媒質を１０分間６５Ｃ
に加熱して反応を停止する。
Ｓｍａ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｉ等を用い各々の製造業者
の指示書に基づいて、前記の条件で得た精製ＤＮＡを処
理した。室温（５ｒｎａ Ｉ ）または３７Ｃ（他の酵
素）で−晩インキユベートした後媒質を１０分間６５Ｃ
に加熱して反応を停止する。
前記分離を実施するには２つの方法を用いた。
ａ） サッカロース勾配による分離
前記操作で得たＤＮＡ断片の溶液をサッカロース勾配（
５〜２０％）による分離操作Ｋかける。遠心抜勾配の異
なる両分を回収する。
５〜２０％）による分離操作Ｋかける。遠心抜勾配の異
なる両分を回収する。
各画分のサンプルをサイズマーカー（この場合は酵素Ｈ
１ｎｄｌで切断したラムダファージＤＮＡ ） ａ（存
在するアガロースゲル電気泳動にかけて各両分の断片の
サイズを検討した。サイズが９．６ｋｂ未満または３０
ｋｂより大きい断片の両分を集め、Ｔ、Ｅ、緩衝液（
トリス１０ ｍＭ＋ ＥＤＴＡｌ ｍＭ、 ｐＨ７，５
）に対して透析した。ＤＮＡを沈殿させ、最小量のＴＥ
に再溶解した。
１ｎｄｌで切断したラムダファージＤＮＡ ） ａ（存
在するアガロースゲル電気泳動にかけて各両分の断片の
サイズを検討した。サイズが９．６ｋｂ未満または３０
ｋｂより大きい断片の両分を集め、Ｔ、Ｅ、緩衝液（
トリス１０ ｍＭ＋ ＥＤＴＡｌ ｍＭ、 ｐＨ７，５
）に対して透析した。ＤＮＡを沈殿させ、最小量のＴＥ
に再溶解した。
ｂ） アガロースゲルによる分離
断片をアガロースゲル電気泳動によって分離する。分離
すべき断片の異なるサイズに対応するゲル切片を切り取
る。その後、従来技術、たとえばいわゆる「凍結圧縮法
」（英胎では” ｆｒｅｅｚｅｓｑｕｅｅｚｅ ｍｅｔ
ｈｏｄつまたは透析チューブ内電気泳動（４１ｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒ５ｓｅ ｄａｎａ ｕｎ ｂｏｕｄｌｎ Ｌ
ｄｌａｌｙｇｓ ）によってゲルの別々の部分に含ま
れているＤＮＡをゲルから抽出する。
すべき断片の異なるサイズに対応するゲル切片を切り取
る。その後、従来技術、たとえばいわゆる「凍結圧縮法
」（英胎では” ｆｒｅｅｚｅｓｑｕｅｅｚｅ ｍｅｔ
ｈｏｄつまたは透析チューブ内電気泳動（４１ｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒ５ｓｅ ｄａｎａ ｕｎ ｂｏｕｄｌｎ Ｌ
ｄｌａｌｙｇｓ ）によってゲルの別々の部分に含ま
れているＤＮＡをゲルから抽出する。
３）研究対象試料のフィルターへの付着ニトロセルロー
スフィルター（シュライヒヤーおよびジュール（５ｃｈ
ｌｅｌｃｈｅｒ ａｔ Ｓｃｈ’ｉ；１１ ）のフィル
ター ＢＡ８５）またはナイロンフィルター（ポジゲイ
ン ナズ ド Ｋ−ＣＰＯ８ＩＤＹＮＥ ＮＡＺ ｄｅ
ＰＡＬＬ））上でハイブリダイゼーションを実施した。
スフィルター（シュライヒヤーおよびジュール（５ｃｈ
ｌｅｌｃｈｅｒ ａｔ Ｓｃｈ’ｉ；１１ ）のフィル
ター ＢＡ８５）またはナイロンフィルター（ポジゲイ
ン ナズ ド Ｋ−ＣＰＯ８ＩＤＹＮＥ ＮＡＺ ｄｅ
ＰＡＬＬ））上でハイブリダイゼーションを実施した。
供試ＤＮＡをフィルターに付着させるには本質的にグリ
ュンシュタイン（Ｑｒ＋３Ｂｓｔｅｉｎ ）とホグネス
（Ｈｏｇ−ｎｅｓ＋ｔ ）が記載している技術に従った
。コミニーをフィルター上に付着させ、室温で１０分間
かけて０．５Ｎソーダ／２．５ＮＮａＣノの溶液でイン
サイチュ（ｉｎ丑りで溶菌し、次いでｐＨ５の酢酸ナ
トリウム溶液で中和する。次にフィルターを８００で２
時間乾燥する。
ュンシュタイン（Ｑｒ＋３Ｂｓｔｅｉｎ ）とホグネス
（Ｈｏｇ−ｎｅｓ＋ｔ ）が記載している技術に従った
。コミニーをフィルター上に付着させ、室温で１０分間
かけて０．５Ｎソーダ／２．５ＮＮａＣノの溶液でイン
サイチュ（ｉｎ丑りで溶菌し、次いでｐＨ５の酢酸ナ
トリウム溶液で中和する。次にフィルターを８００で２
時間乾燥する。
４） ハイブリダイゼーション
その後、ニシン精子の変性ＤＮＡ １００μｇ／−溶液
を用いて２ＸＮａＣノ／Ｃ１ｔ１５ Ｘ ＦＰＧ媒質中
で１時間、次に２ Ｘ ＮａＣｊ／ Ｃｉｔ、 Ｉ Ｘ
ＦＰＧ、 Ｋ１（ｊＰＯ４２５ｒｎＭ。
を用いて２ＸＮａＣノ／Ｃ１ｔ１５ Ｘ ＦＰＧ媒質中
で１時間、次に２ Ｘ ＮａＣｊ／ Ｃｉｔ、 Ｉ Ｘ
ＦＰＧ、 Ｋ１（ｊＰＯ４２５ｒｎＭ。
ＥＤＴＡ２ｍＭ、 ドデシル硫酸ナトリウＡ （ＳＤ
Ｓ ） ０．５重量％、デキストラン偵Ｃ酸１０止景チ
の媒質中で１時間、６７Ｃでフィルターを予備的に処理
した、すなわち「プレハイブリダイズ」させた。ここで
、ＩＸＦＰＧは［フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）４００Ｊ
という飽和剤を０．０２チ、ポリビニルピロリドン３５
０を０．００２ｔｓ、および（ＤＮＡの余分な吸着を避
けるためＩＣ）グリシンを０．０２％含有する（％は重
ｔ）溶液を表わし、Ｃｔｔは０．１５ＭＮａＣノと０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液を表わす。
Ｓ ） ０．５重量％、デキストラン偵Ｃ酸１０止景チ
の媒質中で１時間、６７Ｃでフィルターを予備的に処理
した、すなわち「プレハイブリダイズ」させた。ここで
、ＩＸＦＰＧは［フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）４００Ｊ
という飽和剤を０．０２チ、ポリビニルピロリドン３５
０を０．００２ｔｓ、および（ＤＮＡの余分な吸着を避
けるためＩＣ）グリシンを０．０２％含有する（％は重
ｔ）溶液を表わし、Ｃｔｔは０．１５ＭＮａＣノと０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液を表わす。
次に、予じめ１０（Ｉ’で５分間処理して変性した、プ
Ｕ−ブとして働く放射活性ＤＮＡ（放射能：約５Ｘ１０
’ｃｐｍ／μｍ）の組成物を加え、急冷する。次いで一
晩（６７Ｃで約１７時間）ハイブリダイゼーションを起
こさせる。次にフィルターをｏ、１ｓｓｓ二５ＤＳ（０
，１％）溶液中で２０分間ずつ数回洗浄し、最後に６７
Ｃで洗浄する。次いでフィルム「コダック（ＫＯＤＡＫ
）ｘＡＲ−５Ｊを用いて増感板［コダックＸオマト（Ｋ
ＯＤＡＫＸＯＭＡＴ）Ｊ上でフィルターをオートラジオ
グラフィーにかける。
Ｕ−ブとして働く放射活性ＤＮＡ（放射能：約５Ｘ１０
’ｃｐｍ／μｍ）の組成物を加え、急冷する。次いで一
晩（６７Ｃで約１７時間）ハイブリダイゼーションを起
こさせる。次にフィルターをｏ、１ｓｓｓ二５ＤＳ（０
，１％）溶液中で２０分間ずつ数回洗浄し、最後に６７
Ｃで洗浄する。次いでフィルム「コダック（ＫＯＤＡＫ
）ｘＡＲ−５Ｊを用いて増感板［コダックＸオマト（Ｋ
ＯＤＡＫＸＯＭＡＴ）Ｊ上でフィルターをオートラジオ
グラフィーにかける。
レイオネラ（１ｅｇ１ｏｎ＋５ｌｌｅｓ ）より特定的
にはレイオネラ ニューモフイラ（Ｌｅｇｌｏｎｅｌｌ
ａ ＢＢ烈二咥畦狂）と上記の他の菌株とから得たＤＮ
Ａ断片を系統的に分析したところ、主として２０ｋｂ程
度のサイズを有するＢａｍＨＩ断片を除去すると、レイ
オネラ（１３）レギオネラ（ｌ，ｅｇｉｏｎｅｌｌｅｓ
）と他の菌株との間で観察されたクロメノ・イブリダ
イゼーションを抑止できることが確認された。
にはレイオネラ ニューモフイラ（Ｌｅｇｌｏｎｅｌｌ
ａ ＢＢ烈二咥畦狂）と上記の他の菌株とから得たＤＮ
Ａ断片を系統的に分析したところ、主として２０ｋｂ程
度のサイズを有するＢａｍＨＩ断片を除去すると、レイ
オネラ（１３）レギオネラ（ｌ，ｅｇｉｏｎｅｌｌｅｓ
）と他の菌株との間で観察されたクロメノ・イブリダ
イゼーションを抑止できることが確認された。
選択性はレイオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｌｌａ ） Ｎの分析に特に有
効なように明らかＫなった。上述したように、制限酵素
ＢａｍＨＩで断片化し％９．５〜３０ｋｂの間のサイズ
を有する断片、特に ２１．４と１６．２ｋｂのサイズ
に対応する（１）バンドならびに２８゜１２．８および
１０ｋｂの（小）パンｒを予じめ取り除いたＤＮＡ断片
組成物を利用すると特に有利である。
ｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｌｌａ ） Ｎの分析に特に有
効なように明らかＫなった。上述したように、制限酵素
ＢａｍＨＩで断片化し％９．５〜３０ｋｂの間のサイズ
を有する断片、特に ２１．４と１６．２ｋｂのサイズ
に対応する（１）バンドならびに２８゜１２．８および
１０ｋｂの（小）パンｒを予じめ取り除いたＤＮＡ断片
組成物を利用すると特に有利である。
以下、レイオネラ（１４ｇ１ｏｎａｌｌｓａ ）の単離
と検出の方法の好まし囚実施態様を説明する。供試水試
料（通常１））は０２ミクロンの多孔性ポリカーボネー
ト膜を通して濾過する。濾過後この膜を、酸性緩衝ｇ（
ｐＨ２，２）を含浸した濾紙上に、濾過面を上にして１
ｏ分間載せ、次に乾いた濾紙上です早く水気を切り、中
性のｐＨの緩衝液を含浸した３枚目の済紙に載せる。中
和後選択的寒天栄養培地を入れたペトリ皿にフィルター
を入れ。
と検出の方法の好まし囚実施態様を説明する。供試水試
料（通常１））は０２ミクロンの多孔性ポリカーボネー
ト膜を通して濾過する。濾過後この膜を、酸性緩衝ｇ（
ｐＨ２，２）を含浸した濾紙上に、濾過面を上にして１
ｏ分間載せ、次に乾いた濾紙上です早く水気を切り、中
性のｐＨの緩衝液を含浸した３枚目の済紙に載せる。中
和後選択的寒天栄養培地を入れたペトリ皿にフィルター
を入れ。
時間をいろいろ変えて（通常は一晩）３７ｃでインキュ
ベートする。この処理はレイオネラ（１４ｇ１ｏｎｅｌ
ｌｅｓ ）でない微生物を選択的に死滅させるためのも
のである。
ベートする。この処理はレイオネラ（１４ｇ１ｏｎｅｌ
ｌｅｓ ）でない微生物を選択的に死滅させるためのも
のである。
この処理後フィルター上の残渣を少、！（数ｇＬｔ）の
蒸留水中ＫＲ濁させ、この懸濁液をエラベンドル７（Ｅ
ＰＰＥＮＤＯＲＦ）型遠心機中ｉｏ、ｏｏｏ ｙ −ｃ
” ｉ ｏ分遠心する。
蒸留水中ＫＲ濁させ、この懸濁液をエラベンドル７（Ｅ
ＰＰＥＮＤＯＲＦ）型遠心機中ｉｏ、ｏｏｏ ｙ −ｃ
” ｉ ｏ分遠心する。
上清を流出させ、底にあるタンパク質を抽出する（０．
５Ｎソーダで１０分処理、塩酸とトリス緩ａ液で中オロ
。
５Ｎソーダで１０分処理、塩酸とトリス緩ａ液で中オロ
。
この溶液を試験しようとする同量の試料に分ける。
ＤＮＡを熱変性（１００Ｃで５分、氷で１＠、冷）した
後、各試料を［ハイプリードツト（Ｈｙｂｒｉ −ｄｏ
ｔ ） Ｊ型濾過装置を用いて多孔度０．４５のニトロ
セルロース膜で濾過する。
後、各試料を［ハイプリードツト（Ｈｙｂｒｉ −ｄｏ
ｔ ） Ｊ型濾過装置を用いて多孔度０．４５のニトロ
セルロース膜で濾過する。
各試料から直径約３鴎のＤＮＡの「斑点（ｔａｃｈｅ
） Ｊが得られる。フィルターを２時間８０Ｃのオープ
ンに人ね、適切な直径（たとえば５〜７寵）の穿孔器ま
たはパンチを用りて各斑点を切り取る。切り取った小輪
の各々を本発明のプローブとハイブリダイズさせ、その
後固定されなかった過剰のプローブを通常の条件で分離
する。濾紙上にプローブが存在するか否かを、オートラ
ジオグラフィーかまたはプローブが非放射性マーカーた
とえば酵素によって標識されているかもしくは認識され
得る場合は他のいずれかの方法によって直接検出する。
） Ｊが得られる。フィルターを２時間８０Ｃのオープ
ンに人ね、適切な直径（たとえば５〜７寵）の穿孔器ま
たはパンチを用りて各斑点を切り取る。切り取った小輪
の各々を本発明のプローブとハイブリダイズさせ、その
後固定されなかった過剰のプローブを通常の条件で分離
する。濾紙上にプローブが存在するか否かを、オートラ
ジオグラフィーかまたはプローブが非放射性マーカーた
とえば酵素によって標識されているかもしくは認識され
得る場合は他のいずれかの方法によって直接検出する。
非放射性標識方法については前掲の先行特肝を参照した
。Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン
（ＡＡＦ）で標識したプローブを使用すると特に有利で
あり、これをＤＮＡ組成物に固定するＫは本質的に１掲
のフランス特許第８１ ２４６３１号に記載の技術に従
うことができる。この場合、レイオネラ ニューモフイ
ラ（Ｌｓｇｌｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｍ
）が存在すると、ｒＤＮＡ−ＡＡＦＪプローブの検出後
、特に前記特許−記載のような抗−ＡＡＦ抗体を用いた
ときは着色した斑点が現われる。この抗−ＡＡＦ抗体は
それ自体その後、特異的基質の色を変えるという特性を
有する酵素が固定されている第２のカテゴリーの抗体に
よって認識される。
。Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン
（ＡＡＦ）で標識したプローブを使用すると特に有利で
あり、これをＤＮＡ組成物に固定するＫは本質的に１掲
のフランス特許第８１ ２４６３１号に記載の技術に従
うことができる。この場合、レイオネラ ニューモフイ
ラ（Ｌｓｇｌｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｍ
）が存在すると、ｒＤＮＡ−ＡＡＦＪプローブの検出後
、特に前記特許−記載のような抗−ＡＡＦ抗体を用いた
ときは着色した斑点が現われる。この抗−ＡＡＦ抗体は
それ自体その後、特異的基質の色を変えるという特性を
有する酵素が固定されている第２のカテゴリーの抗体に
よって認識される。
上に記載した方法によって、特に次の菌株（ただし例示
としてだけである）のＤＮＡを選択的に識別することが
可能になる。
としてだけである）のＤＮＡを選択的に識別することが
可能になる。
レイオネラ ニューモフィラ（Ｌ、 ｐｎｅｕｍｏｐｈ
ｉｌａ ）血清群１−ＡＴＣＣ３３１５２ レイオネラ ボゼマニイ（ｂ、 ｂｏｚｅｍａｎｒｌ
） −ＡＴＣＣ３３２１７ レイオネラ ロングビーチヤニ（Ｌ、 ｌｏｎｇｂｅａ
ｃｈａｅ ）血清群１−ＡＴＣＣ３３４６２ レギオネラ ミクダディ（山、 ｍ１ｃｄａｄｅｌ ）
−ＡＴＣＣ３３２０４ レイオネラ ワドウオーシ（↓、 ｗａｄ猶□ｏｒｔｈ
ｌ ） −ＡＴＣＣ３３８７７ レイオネラ オークリッジエンシス（↓、 ｏａｋｒｌ
ｄｇｅｒｕｓｌｓ ）−ＡＴＣＣ３３７６ル ギオネラ ジョーダニス（Ｌ、 ｊｏｒｄａｎｌｇ ）
−ＡＴＣＣ３３６２３ レイオネラ フィーレイ（Ｌ、 ｆｅｅｌｅｌ ） −
ＡＴＣＣ３５０７２゜ 以上の方法は感度が高い。微生物の含有量が低い液体を
大９に処理することが可能である。この方法は感度が高
く、短時間でできるため特に有利である。実際、探究す
る細菌のＤＮＡが３００ ｐｙ未満でも、または細菌が
全体で１００，０００未満でも検出することが可能であ
る。比較すると、現状の免疫学的方法には数百万の細菌
を含む裸眼で見える穆のコロニーを得る必要がらり、こ
れには４〜６日培養する必９がある。
ｉｌａ ）血清群１−ＡＴＣＣ３３１５２ レイオネラ ボゼマニイ（ｂ、 ｂｏｚｅｍａｎｒｌ
） −ＡＴＣＣ３３２１７ レイオネラ ロングビーチヤニ（Ｌ、 ｌｏｎｇｂｅａ
ｃｈａｅ ）血清群１−ＡＴＣＣ３３４６２ レギオネラ ミクダディ（山、 ｍ１ｃｄａｄｅｌ ）
−ＡＴＣＣ３３２０４ レイオネラ ワドウオーシ（↓、 ｗａｄ猶□ｏｒｔｈ
ｌ ） −ＡＴＣＣ３３８７７ レイオネラ オークリッジエンシス（↓、 ｏａｋｒｌ
ｄｇｅｒｕｓｌｓ ）−ＡＴＣＣ３３７６ル ギオネラ ジョーダニス（Ｌ、 ｊｏｒｄａｎｌｇ ）
−ＡＴＣＣ３３６２３ レイオネラ フィーレイ（Ｌ、 ｆｅｅｌｅｌ ） −
ＡＴＣＣ３５０７２゜ 以上の方法は感度が高い。微生物の含有量が低い液体を
大９に処理することが可能である。この方法は感度が高
く、短時間でできるため特に有利である。実際、探究す
る細菌のＤＮＡが３００ ｐｙ未満でも、または細菌が
全体で１００，０００未満でも検出することが可能であ
る。比較すると、現状の免疫学的方法には数百万の細菌
を含む裸眼で見える穆のコロニーを得る必要がらり、こ
れには４〜６日培養する必９がある。
逆に本発明の方法によると処理水が１を当りｔｏｏ、ｏ
ｏｏ以上の細菌を含んでいる限り２４時間以内にレイオ
ネラ（１３）レギオネラ（ｌ，ｅｇｉｏｎｅｌｌｅｓ）
を検出することが可能である。
ｏｏ以上の細菌を含んでいる限り２４時間以内にレイオ
ネラ（１３）レギオネラ（ｌ，ｅｇｉｏｎｅｌｌｅｓ）
を検出することが可能である。
また、本発明のＤＮＡ組成物がら除いたＢａｍＨＩ断片
はレイオネラ（ｌ≦ｇｉｏｎｅｌｌｅｓ）またはその他
の種、特に大ｙＡ菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）のリボソームＲＮ
Ａ。
はレイオネラ（ｌ≦ｇｉｏｎｅｌｌｅｓ）またはその他
の種、特に大ｙＡ菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）のリボソームＲＮ
Ａ。
より特定的には１６８と２３Ｓ ＲＮＡ とハイブリ
ダイズするという特異性をもっていることも確かめられ
た。このようなリボソームＲＮＡはベーリンガー マン
ハイム（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲｌ’ｔＷ−ｍ−（Ｒ，Ｆ
、Ａ、） ）から市販されている。したがって、本発明
のＤＮＡ組成物は、レイオネラ ニューモフイシ（Ｌｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）のゲノム
ＤＮＡのうち前記リボソームＲＮＡＫ転写され得るＤＮ
Ａ配列を本質的に含まない、このゲノムＤＮＡの断片の
混合物で構成されるものとして定義することができる。
ダイズするという特異性をもっていることも確かめられ
た。このようなリボソームＲＮＡはベーリンガー マン
ハイム（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲｌ’ｔＷ−ｍ−（Ｒ，Ｆ
、Ａ、） ）から市販されている。したがって、本発明
のＤＮＡ組成物は、レイオネラ ニューモフイシ（Ｌｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）のゲノム
ＤＮＡのうち前記リボソームＲＮＡＫ転写され得るＤＮ
Ａ配列を本質的に含まない、このゲノムＤＮＡの断片の
混合物で構成されるものとして定義することができる。
したがって、本発明はその変形として本発明のＤＮＡ組
成物の製造方法にも係り、その特徴は、Ｌ、Ｐ、の全ゲ
ノムＤＮＡを制限酵素、特にＢａｍＨＩまたはその他い
ずれかの手段によって断片化し、これら断片から大腸菌
（Ｂ、ｃａｌｌ ）またはり、Ｐ、のりボソームＲＮＡ
とハイブリダイズする断片を分離し、その他のハイブリ
ダイズしない断片を回収することでちる。
成物の製造方法にも係り、その特徴は、Ｌ、Ｐ、の全ゲ
ノムＤＮＡを制限酵素、特にＢａｍＨＩまたはその他い
ずれかの手段によって断片化し、これら断片から大腸菌
（Ｂ、ｃａｌｌ ）またはり、Ｐ、のりボソームＲＮＡ
とハイブリダイズする断片を分離し、その他のハイブリ
ダイズしない断片を回収することでちる。
この操作を掛は合わせるために、活性セファローズ（５
ＥＰＨＡＲＯ８Ｅ ）型、たとえばセファローズ（ＳＥ
ＰＨＡＲＯ８Ｅ）６ＭＢという名称で市販されている活
性化アガロースを用いるアフィニティーカラムクロマト
グラフィーを利用すると有利であろう、特にこれら活性
化アガｐ−スと、その製造業者が推奨する緩衝液中に固
定すべき核酸を含む溶液とを接触させることによって、
これら活性化アガロースに核酸を固定することができる
ことが知られている。
ＥＰＨＡＲＯ８Ｅ ）型、たとえばセファローズ（ＳＥ
ＰＨＡＲＯ８Ｅ）６ＭＢという名称で市販されている活
性化アガロースを用いるアフィニティーカラムクロマト
グラフィーを利用すると有利であろう、特にこれら活性
化アガｐ−スと、その製造業者が推奨する緩衝液中に固
定すべき核酸を含む溶液とを接触させることによって、
これら活性化アガロースに核酸を固定することができる
ことが知られている。
さらに一般的に本発明は、細菌の所奈翰およびさらには
夙を選択的に検出するためのプローブにも係る。これら
プローブの特徴は、これらが当該Ｍ菌属のゲノムＤＮＡ
の断片の混合物で構成されていることでチシ、これら断
片は前記属に由来するＤＮＡの組成物と、または細菌の
ＤＮＡがハイブリダイズし得るような状態にされている
限シこれら細菌自体とハイブリダイズする能力を有して
いる。しかし、前記混合物は、一方で前記属の細菌に由
来するゲノムＤＮＡと、他方で前記ゲノムＤＮＡとハイ
ブリダイズし得るが同時に異なる属または種の細菌に由
来するＤＮＡともハイブリダイズし得るＤＮＡ断片との
両者にハイブリダイズする断片はほとんど含まない。
夙を選択的に検出するためのプローブにも係る。これら
プローブの特徴は、これらが当該Ｍ菌属のゲノムＤＮＡ
の断片の混合物で構成されていることでチシ、これら断
片は前記属に由来するＤＮＡの組成物と、または細菌の
ＤＮＡがハイブリダイズし得るような状態にされている
限シこれら細菌自体とハイブリダイズする能力を有して
いる。しかし、前記混合物は、一方で前記属の細菌に由
来するゲノムＤＮＡと、他方で前記ゲノムＤＮＡとハイ
ブリダイズし得るが同時に異なる属または種の細菌に由
来するＤＮＡともハイブリダイズし得るＤＮＡ断片との
両者にハイブリダイズする断片はほとんど含まない。
問題としている凡の細菌の選択的検出に好ましい組成物
は、リボソームＲＮＡに転写し得るゲノムＤＮＡの配列
を有さない。特に好ましい組成物は、大腸菌（Ｅ、 ｃ
ｏｌｔ）の１６８または２３３リボンームＲＮＡとハイ
ブリダイズするゲノムＤＮＡの配列をほとんど含まない
ものである。
は、リボソームＲＮＡに転写し得るゲノムＤＮＡの配列
を有さない。特に好ましい組成物は、大腸菌（Ｅ、 ｃ
ｏｌｔ）の１６８または２３３リボンームＲＮＡとハイ
ブリダイズするゲノムＤＮＡの配列をほとんど含まない
ものである。
問題としている属または種の細菌のゲノムＤＮＡのうち
、少割合のある種の配列のみは除いて大部分を含有する
ＤＮＡ断片の組成物を、所定の属または種に属する細菌
の検出用に選択的プローブとして用いるという可能性は
とりわけ顕著な効果の１つである。
、少割合のある種の配列のみは除いて大部分を含有する
ＤＮＡ断片の組成物を、所定の属または種に属する細菌
の検出用に選択的プローブとして用いるという可能性は
とりわけ顕著な効果の１つである。
しかしながら、「はとんど含まない（もたない）混合物
」という表現は、本発明のＤＮＡ組成物が非反復性かつ
非選択性のある種の配列をも含む場合、これらの配列が
、主要部をなして存在している問題の属または種に特有
なりＮＡ配列の検出の感度と選択性に実質的な程度に影
響しない限り、このような場合を除外するものではない
。特に、主要な配列によって得られるシグナルは時とし
て存在し得る非選択的少数配列の示すシグナルよりもず
っと強いのでちるから、検出の確度は保たれ得る。もち
ろん、「シグナル」という表現は選択的検出に用いる現
象の性質、たとえばプローブとして使用する組成物がも
っているマーカーの放射能、酵素基質に対する作用、等
に応答している。
」という表現は、本発明のＤＮＡ組成物が非反復性かつ
非選択性のある種の配列をも含む場合、これらの配列が
、主要部をなして存在している問題の属または種に特有
なりＮＡ配列の検出の感度と選択性に実質的な程度に影
響しない限り、このような場合を除外するものではない
。特に、主要な配列によって得られるシグナルは時とし
て存在し得る非選択的少数配列の示すシグナルよりもず
っと強いのでちるから、検出の確度は保たれ得る。もち
ろん、「シグナル」という表現は選択的検出に用いる現
象の性質、たとえばプローブとして使用する組成物がも
っているマーカーの放射能、酵素基質に対する作用、等
に応答している。
さらに本発明は、所定の属の細菌の検出のための特異的
プローブとして使用できるＤＮＡ組成物を製造する方法
にも係る。
プローブとして使用できるＤＮＡ組成物を製造する方法
にも係る。
この方法は本質的に以下のステップからなる。
このような組成物の製造用の初期物質は問題とする属に
属する細菌の全ゲノムＤＮＡである。この細菌はその検
出が探求されているものに相当するものが好ましい。た
とえば所定の種または亜種に属する。上記の細菌（以後
「参照細菌ｊと相称する）はレイオネラ ニューモフイ
９ （Ｌｅｇｌｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｍ）
種に属していた。
属する細菌の全ゲノムＤＮＡである。この細菌はその検
出が探求されているものに相当するものが好ましい。た
とえば所定の種または亜種に属する。上記の細菌（以後
「参照細菌ｊと相称する）はレイオネラ ニューモフイ
９ （Ｌｅｇｌｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｍ）
種に属していた。
第一ステップは天然に検出すべき属の細菌に伴なうこと
が多い細菌の属に属するＤＮＡの単離である。レイオネ
ラ（１４ｇ１ｏｎｅｔｌｅａ ）と共に存在することが
多い細菌の属の例は既に挙げた。これら全ゲノムＤＮＡ
をハイブリダイゼーション操作実施用の従来の条件下で
適当な支持体、特にニトロセルロースまたはナイロン（
ＮＹＬＯＮ）に付着させる。
が多い細菌の属に属するＤＮＡの単離である。レイオネ
ラ（１４ｇ１ｏｎｅｔｌｅａ ）と共に存在することが
多い細菌の属の例は既に挙げた。これら全ゲノムＤＮＡ
をハイブリダイゼーション操作実施用の従来の条件下で
適当な支持体、特にニトロセルロースまたはナイロン（
ＮＹＬＯＮ）に付着させる。
次に、参照細菌から得た全ゲノムＤＮＡとテスト用に採
った他の属に属する全ゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションを試みる。
った他の属に属する全ゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションを試みる。
全ゲノムＤＮＡが他の細菌の全ゲノムＤＮＡの少なくと
もいくつかに含まれる配列と共通の非選択的配列を実質
的な割合で含有する限り、参照細菌の全ゲノムＤＮＡと
他の細菌の少なくとも１種、たとえば以後説明の便のた
め「ｌ１ｌＩＩ菌１」という表現で表わすようなものの
全ゲノムＤＮＡとの間の有効なハイブリダイゼーション
がみられるであろう。
もいくつかに含まれる配列と共通の非選択的配列を実質
的な割合で含有する限り、参照細菌の全ゲノムＤＮＡと
他の細菌の少なくとも１種、たとえば以後説明の便のた
め「ｌ１ｌＩＩ菌１」という表現で表わすようなものの
全ゲノムＤＮＡとの間の有効なハイブリダイゼーション
がみられるであろう。
本発明方法の第ニステップは、参照細菌の全ゲノムＤＮ
Ａ調製物の各々を各種の制限酵素たとえばＢａｍＨＩ
、 ＥｃｏＲＩ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、 Ｈｐａ １．
Ｐｖｕ ＩｆＳｍａ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｉ等でそれぞ
れヤ消化し、それぞれの制限酵素で消化して得られるＤ
ＮＡ断片を、たとえば適当なゲル上で断片を電気泳動す
ることによってそのサイズ（応じて分離し、分離した断
片をそれぞれ、たとえば公知のサザーン（ＳＯＵＴＨＥ
ＲＮ）法によってハイブリダイゼーション支持体に移す
ことからなる。
Ａ調製物の各々を各種の制限酵素たとえばＢａｍＨＩ
、 ＥｃｏＲＩ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、 Ｈｐａ １．
Ｐｖｕ ＩｆＳｍａ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｉ等でそれぞ
れヤ消化し、それぞれの制限酵素で消化して得られるＤ
ＮＡ断片を、たとえば適当なゲル上で断片を電気泳動す
ることによってそのサイズ（応じて分離し、分離した断
片をそれぞれ、たとえば公知のサザーン（ＳＯＵＴＨＥ
ＲＮ）法によってハイブリダイゼーション支持体に移す
ことからなる。
この方法の第ニステップはこうして各調製物から単離さ
れた断片の「細菌１」の全ゲノムＤＮＡとのハイブリダ
イゼーションテストである。
れた断片の「細菌１」の全ゲノムＤＮＡとのハイブリダ
イゼーションテストである。
参照Ｉ山頂のゲノムＤＮＡの各調製物に対して次のこと
が観察できる。いくつかの調製物で観察できるハイブリ
ダイゼーションはハイブリダイゼーションフィルター上
に異なるサイズの多くの断片が存在することを示してい
る。「細菌１」のゲノムＤＮＡを放射活性に標識してお
くと、フィルターに保持される放射能を写真で検出した
ときに時に英語で［ｓｍｅａｒｓ Ｊ （ｇ状）といわ
れる長く伸びた斑点がみられる。このことは一般に、き
照馴菌のゲノムＤＮＡ中にも「細菌１」のゲノムＤＮＡ
中にも反復の度合が高い配列が存在することを示す。こ
のようなことは問題となっている調製物から離れておか
れることになる。
が観察できる。いくつかの調製物で観察できるハイブリ
ダイゼーションはハイブリダイゼーションフィルター上
に異なるサイズの多くの断片が存在することを示してい
る。「細菌１」のゲノムＤＮＡを放射活性に標識してお
くと、フィルターに保持される放射能を写真で検出した
ときに時に英語で［ｓｍｅａｒｓ Ｊ （ｇ状）といわ
れる長く伸びた斑点がみられる。このことは一般に、き
照馴菌のゲノムＤＮＡ中にも「細菌１」のゲノムＤＮＡ
中にも反復の度合が高い配列が存在することを示す。こ
のようなことは問題となっている調製物から離れておか
れることになる。
逆に、他の調製物で観察される、比較参照のＤＮＡとの
ハイブリダイゼーションがニトロセルロースフィルター
上の１つまたは限られた数のＤＮＡ画分だけに限定され
ているという結果は、参照細菌のゲノムＤＮＡから分離
した他の両分が「細菌１」のＤＮＡとは全くハイブリダ
イズしない以上これらの両分の還択性と対立している。
ハイブリダイゼーションがニトロセルロースフィルター
上の１つまたは限られた数のＤＮＡ画分だけに限定され
ているという結果は、参照細菌のゲノムＤＮＡから分離
した他の両分が「細菌１」のＤＮＡとは全くハイブリダ
イズしない以上これらの両分の還択性と対立している。
このようなことは、たとえばこの技術を予じめ酵素Ｂａ
ｍＨＩで消化した調製物に対してり、Ｐ、のＤＮＡと共
に用いたときにみられる。
ｍＨＩで消化した調製物に対してり、Ｐ、のＤＮＡと共
に用いたときにみられる。
参照細菌の全ゲノムＤＮＡ調製物から「細菌１」の全ゲ
ノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションを起こさない参
照細菌のＩ）ＮＡ混合物を得るには、参照細菌の全ゲノ
ムＤＮＡを同じ制限酵素（たとえばり、Ｐ、の場合Ｂａ
ｍＨＩ）で消化し、これから、上記のハイブリダイゼー
ションテストにおいて「細菌１」のＤＮＡとハイブリダ
イズする断片のサイズに相当するサイズを有する断片を
除去することで充分である。こうして、今日でも「細菌
１」に対してか照細菌を選択的に検出できる参照細菌の
ＤＮＡ断片の混合物が得られる。
ノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションを起こさない参
照細菌のＩ）ＮＡ混合物を得るには、参照細菌の全ゲノ
ムＤＮＡを同じ制限酵素（たとえばり、Ｐ、の場合Ｂａ
ｍＨＩ）で消化し、これから、上記のハイブリダイゼー
ションテストにおいて「細菌１」のＤＮＡとハイブリダ
イズする断片のサイズに相当するサイズを有する断片を
除去することで充分である。こうして、今日でも「細菌
１」に対してか照細菌を選択的に検出できる参照細菌の
ＤＮＡ断片の混合物が得られる。
本発明の第三ステップは前記第一ステップのハイブリダ
イゼーションテストを繰り返すことから成シ、ここでは
、第一ステップで得られた「細菌１」のＤＮＡとハイブ
リダイズし得る断片をもっていない参照細菌由来ゲノム
ＤＮＡ断片の混合物を、第一ステップで最初に使用した
細菌の全ゲノムＤＮＡの全体とハイブリダイズさせる。
イゼーションテストを繰り返すことから成シ、ここでは
、第一ステップで得られた「細菌１」のＤＮＡとハイブ
リダイズし得る断片をもっていない参照細菌由来ゲノム
ＤＮＡ断片の混合物を、第一ステップで最初に使用した
細菌の全ゲノムＤＮＡの全体とハイブリダイズさせる。
たとえば「細菌２」の全ゲノムＤＮＡとの間で新たな非
選択的ハイブリダイゼーションがみられる場合には、前
記第ニステップの還択操作のサイクルを繰シ返すが、こ
の場合は、参照細菌ＤＮＡをそれぞれ異なる制限酵素で
消化した複数の調製物から得られた異なるサイズの断片
の調製物と、「細菌２」の全ゲノムＤＮＡとの間でハイ
ブリダイゼーションテストを行なう。こうして、参照細
菌の全ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、「細菌
２」のゲノムＤＮＡとハイブリダイズする断片を分離し
た後、参照ｍ菌に由来する「細菌２」に対して選択的な
りＮＡ混合物を再度得ることができる。
選択的ハイブリダイゼーションがみられる場合には、前
記第ニステップの還択操作のサイクルを繰シ返すが、こ
の場合は、参照細菌ＤＮＡをそれぞれ異なる制限酵素で
消化した複数の調製物から得られた異なるサイズの断片
の調製物と、「細菌２」の全ゲノムＤＮＡとの間でハイ
ブリダイゼーションテストを行なう。こうして、参照細
菌の全ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、「細菌
２」のゲノムＤＮＡとハイブリダイズする断片を分離し
た後、参照ｍ菌に由来する「細菌２」に対して選択的な
りＮＡ混合物を再度得ることができる。
参照細菌と「細菌１」とに共通なりＮＡ配列が参照細菌
の全ＤＮＡと「細菌２」のＤＮＡとに共通な配列と少な
くとも部分的に一致することが観察される。これら共通
な配列全体を参照細菌の全ゲノムＤＮ＆から分離すると
、参照細菌に由来し「細菌１」のＤＮＡとも［細菌２」
のＤＮＡともハイブリダイズしないＤＮＡ混合物が得ら
れることになる。
の全ＤＮＡと「細菌２」のＤＮＡとに共通な配列と少な
くとも部分的に一致することが観察される。これら共通
な配列全体を参照細菌の全ゲノムＤＮ＆から分離すると
、参照細菌に由来し「細菌１」のＤＮＡとも［細菌２」
のＤＮＡともハイブリダイズしないＤＮＡ混合物が得ら
れることになる。
あるいは、前記の第二サイクルの７１イブリダイゼーシ
ヨンテストで、参照細菌の全ゲノムから得た、ただし「
細菌１」のＤＮＡと）・イブリダイズする配列から分離
した後の断片混合物を全ゲノムの代わりに用いれば、「
細菌１」と「ａ］菌２」のトチラのＤＮＡともノ・イブ
リダイズしない類似の組成物を得ることができる。
ヨンテストで、参照細菌の全ゲノムから得た、ただし「
細菌１」のＤＮＡと）・イブリダイズする配列から分離
した後の断片混合物を全ゲノムの代わりに用いれば、「
細菌１」と「ａ］菌２」のトチラのＤＮＡともノ・イブ
リダイズしない類似の組成物を得ることができる。
理論的には、「細菌３」の全ゲノムＤＮＡを用いて前記
の操作を操り返すことができる。しかし経験によると、
一般にこの操作は１回または２回より多（繰り返す必要
はない。実際、異なる属の細菌がいくつかの共通配列、
たとえばリボソームＲＮＡをコー１している配列をもち
得るのでちれば、これらの細菌は一般にこれらに完全に
特異的である重要なりＮＡ配列によって特徴付けられる
ことは見逃せない。さらに、細菌ゲノム中でしばしば反
復する配列を除去することが特に肝要でちるａ実際、４
単離された、場合によっては共通の遺伝子では選択的ハ
イブリダイゼーションテストにおいて有意義なシグナル
を生じ得ない。これらの遺伝子は、これらを含むＤＮＡ
混合物から前記の反復配列を除去してしまえば実際に選
択的な配列に対して数の上で小数である。しかもこれら
の反復配列は細菌ではあまシ多くない。このような配列
は本質的にリボソームＲＮＡおよびトランスポゾンをコ
ードする配列で構成される。
の操作を操り返すことができる。しかし経験によると、
一般にこの操作は１回または２回より多（繰り返す必要
はない。実際、異なる属の細菌がいくつかの共通配列、
たとえばリボソームＲＮＡをコー１している配列をもち
得るのでちれば、これらの細菌は一般にこれらに完全に
特異的である重要なりＮＡ配列によって特徴付けられる
ことは見逃せない。さらに、細菌ゲノム中でしばしば反
復する配列を除去することが特に肝要でちるａ実際、４
単離された、場合によっては共通の遺伝子では選択的ハ
イブリダイゼーションテストにおいて有意義なシグナル
を生じ得ない。これらの遺伝子は、これらを含むＤＮＡ
混合物から前記の反復配列を除去してしまえば実際に選
択的な配列に対して数の上で小数である。しかもこれら
の反復配列は細菌ではあまシ多くない。このような配列
は本質的にリボソームＲＮＡおよびトランスポゾンをコ
ードする配列で構成される。
以上上として、所定の属に属する細菌の選択的検出用ゾ
ローブとして使用し得る組成物の製造にこれらの技術を
適用する場合について記載した。
ローブとして使用し得る組成物の製造にこれらの技術を
適用する場合について記載した。
もちろん、この技術をさらに拡大して、所定の属晶
中の特 の細菌を選択的に検出し得るＤＮＡ４’１製
物の製造に適用することができる。
物の製造に適用することができる。
上に記載し、当然り、Ｐ、の選択的検出用ＤＮＡ組成物
の調製に使用した技術は、全（類似した条件で細Ｍ属、
さらには全く異なる細菌徨の選択的検出のために使用す
ることができる。単離された系統発生分類群に属する細
菌の４択的検出に同様な条件でこの方法を適用する可能
性がある。たとえば、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）
、カンピロ／セクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｅｔｅｒ）
、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ） 、アシネト
バクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、 軟性下
府菌上記の方法の１変形においては、第ニステップで、
サイズによって断片化しフィルターに移した１１裏物を
、大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｔ）のリボソームＲＮＡ。
の調製に使用した技術は、全（類似した条件で細Ｍ属、
さらには全く異なる細菌徨の選択的検出のために使用す
ることができる。単離された系統発生分類群に属する細
菌の４択的検出に同様な条件でこの方法を適用する可能
性がある。たとえば、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）
、カンピロ／セクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｅｔｅｒ）
、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ） 、アシネト
バクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、 軟性下
府菌上記の方法の１変形においては、第ニステップで、
サイズによって断片化しフィルターに移した１１裏物を
、大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｔ）のリボソームＲＮＡ。
たとえば前記のようなものとハイブリダイズさせること
もできる。対応する制限酵素で消化したＤＮＡのλ’Ｉ
Ｍ物からリボソームＲＮＡとハイブリダイズする断片を
除去した後、得られた調製物の選択性を前記第三ステッ
プで定義した条件で再度テストできる。場合により、リ
ボソームＲＮＡとハイブリダイズする配列の除去が不充
分で問題とする屑、さらには種の細菌を実際上確実に検
出するには不確かであれば、前記の第一、二および三ス
テップに記載した条件で本発明の方法を繰り返す。大腸
菌（ｇ、 ｃａｌｌ）以外の細菌のリボソームＲＮＡを
使用することも可能である。しかし、種々の細菌種のリ
ボソームＲＮＡ間で高い相同が存在することが思い起こ
されよう。実際、これらのリボソームＲＮＡは系統発生
的進化（または生命の進化と呼んでもよい）を通して高
度に安定した配列を特徴としている。
もできる。対応する制限酵素で消化したＤＮＡのλ’Ｉ
Ｍ物からリボソームＲＮＡとハイブリダイズする断片を
除去した後、得られた調製物の選択性を前記第三ステッ
プで定義した条件で再度テストできる。場合により、リ
ボソームＲＮＡとハイブリダイズする配列の除去が不充
分で問題とする屑、さらには種の細菌を実際上確実に検
出するには不確かであれば、前記の第一、二および三ス
テップに記載した条件で本発明の方法を繰り返す。大腸
菌（ｇ、 ｃａｌｌ）以外の細菌のリボソームＲＮＡを
使用することも可能である。しかし、種々の細菌種のリ
ボソームＲＮＡ間で高い相同が存在することが思い起こ
されよう。実際、これらのリボソームＲＮＡは系統発生
的進化（または生命の進化と呼んでもよい）を通して高
度に安定した配列を特徴としている。
本発明は細菌種全体に対して一般的な特性を示す。邪魔
になるクロスハイブリダイゼーションを示し得る配列を
除去する本発明の原理において、本発明は他の微生物、
特にウィルスの選択的検出に適用することができる。
になるクロスハイブリダイゼーションを示し得る配列を
除去する本発明の原理において、本発明は他の微生物、
特にウィルスの選択的検出に適用することができる。
たとえば、レイオネラ ニューモフイラ（Ｌａｇｉｏｎ
ｅｌｌａｐｎｓｕｍｏｐｈｉ １ｍ）に関して記載した
条件に類似した実験条件でゾルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ
）のＤＮＡの組成物を処理しくただし、制限に使用した
酵素Ｂａｍ ＨＩ を酵素Ｋｐｎ Ｉに替える）、得ら
れた断片組成物からリボソームＲＮＡ、特に前記の１６
Ｓと２３８ＲＮＡとハイブリダイズする６、 ５ ｋｂ
ＫＰｎ Ｉ 断片を分離することによって、ブルセ
ラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）の検出用プローブとして使用で
きる組成物が得られる。
ｅｌｌａｐｎｓｕｍｏｐｈｉ １ｍ）に関して記載した
条件に類似した実験条件でゾルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ
）のＤＮＡの組成物を処理しくただし、制限に使用した
酵素Ｂａｍ ＨＩ を酵素Ｋｐｎ Ｉに替える）、得ら
れた断片組成物からリボソームＲＮＡ、特に前記の１６
Ｓと２３８ＲＮＡとハイブリダイズする６、 ５ ｋｂ
ＫＰｎ Ｉ 断片を分離することによって、ブルセ
ラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）の検出用プローブとして使用で
きる組成物が得られる。
特に次の条件で操作した。
？Ａ７タ熱＠ （ＢｒｕｃｅＬｌａ ｍ＠１ｉｔｅｎｓ
ｉＳ）生物型１゜参照菌株ｒ １６ＭＪ （ＢＣＣＮ
Ｒ１；ＡＴＣＣ２３４５６）のＤＮＡから成る組成物を
用い、これを酵素Ｋｐｎｌで処理し、断片化後、サッカ
ロース勾配遠心またはアガロース電気泳動で６．５ ｋ
ｂ ＤＮＡ断片（１６Ｓと ２３Ｓ ＲＮＡをコード
する遺伝子に相当する）を分離する。したがって、以下
「プローブ組成物」として用いる組成物は、前記の条件
で標識後、分子量が約６．５ｋｂより小さいＤＮＡ断片
と大きいＤＮＡ断片との全体から構成されている。本テ
ストでは８２ｐを用いて切断部を翻訳する（［ニックト
ランスレーションｊ）ことでプローブを標識した。この
プローブのハイブリダイゼーションテストは、現在まで
のところ、ナイロンフィルターたフラボ４クテリウム（
Ｆｌａｖｏｂａｃｔａｒｉｕｍ） ＋キサンゾモニエ（
Ｐｓｅｕｓｏｍｏｎｉａｅ） 、エンテロバクタ−アシ
ネトバクタ−（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ） 、メ
ギオネラ（Ｍｅｇｉｏｎｅｌｌａ ）およびアエロモナ
ス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）のＤＮＡを用いて行なった。
ｉＳ）生物型１゜参照菌株ｒ １６ＭＪ （ＢＣＣＮ
Ｒ１；ＡＴＣＣ２３４５６）のＤＮＡから成る組成物を
用い、これを酵素Ｋｐｎｌで処理し、断片化後、サッカ
ロース勾配遠心またはアガロース電気泳動で６．５ ｋ
ｂ ＤＮＡ断片（１６Ｓと ２３Ｓ ＲＮＡをコード
する遺伝子に相当する）を分離する。したがって、以下
「プローブ組成物」として用いる組成物は、前記の条件
で標識後、分子量が約６．５ｋｂより小さいＤＮＡ断片
と大きいＤＮＡ断片との全体から構成されている。本テ
ストでは８２ｐを用いて切断部を翻訳する（［ニックト
ランスレーションｊ）ことでプローブを標識した。この
プローブのハイブリダイゼーションテストは、現在まで
のところ、ナイロンフィルターたフラボ４クテリウム（
Ｆｌａｖｏｂａｃｔａｒｉｕｍ） ＋キサンゾモニエ（
Ｐｓｅｕｓｏｍｏｎｉａｅ） 、エンテロバクタ−アシ
ネトバクタ−（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ） 、メ
ギオネラ（Ｍｅｇｉｏｎｅｌｌａ ）およびアエロモナ
ス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）のＤＮＡを用いて行なった。
Ｉ・イブリダイゼーション反応はブルセラ（Ｂｒｕｃｅ
ｌｌａ）でしかみられなかった。
ｌｌａ）でしかみられなかった。
本発明は、明らかにそして前記のことからさらに結論さ
れるように、上記に特に記載した適用や実施の態様に限
定されるものではなく、逆に全ての変形例を包含するも
のである。
れるように、上記に特に記載した適用や実施の態様に限
定されるものではなく、逆に全ての変形例を包含するも
のである。
Claims (19)
- （１）細菌の所定の種とさらには属を選択的に検出する
ための組成物であつて、検出すべき所定の種または属の
ゲノムＤＮＡの断片混合物から成つているが、当該種ま
たは属のゲノムＤＮＡのうちリボソームＲＮＡに転写し
得る配列は含有しないことを特徴とする組成物。 - （２）ゲノムＤＮＡのうち大腸菌（￥Ｅ．￥ ￥ｃｏｌ
ｉ￥）の１６Ｓおよび２３ＳリボソームＲＮＡとハイブ
リダイズする配列は本質的に含有しないことを特徴とす
る特許請求の範囲第１項に記載の組成物。 - （３）レギオネラ（ｌ，ｅｇｉｏｎｅＩｌｅｓ）、より
特定的にはレギオネラニユーモフイラ（￥Ｌｅｇｉｏｎ
ｅｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ￥）の選択的検
出用組成物であつて、レギオネラ（ｌ，ｅｇｉｏｎｅＩ
ｌｅｓ）に由来しこれから抽出されたかまたはハイブリ
ダイズできるようにされているＤＮＡ組成物とハイブリ
ダイズする能力を有するレギオネラニユーモフイラ（￥
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ￥
）のゲノムＤＮＡ断片の混合物から成つているが、この
混合物は、一方でレギオネラニユーモフイラ（￥Ｌｅｇ
ｉｏｎｅｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ￥）の全
ゲノムＤＮＡと、他方でレギオネラニユーモフイラ（￥
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ￥
）の全ゲノムを制限酵素￥Ｂａｍ￥ＨＩで処理し、約２
０ｋｂ以外のサイズを有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片を分離
することによつて前記全ゲノムから得られる約２０ｋｂ
のサイズを有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片との両者にハイブ
リダイズし得る断片をほとんど含まないことを特徴とす
る前記選択的検出用組成物。 - （４）前記断片混合物が、レギオネラニユーモフイラ（
￥Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ
￥）のゲノムを制限酵素￥Ｂａｍ￥ＨＩで処理し、約９
．５ｋｂ未満のサイズを有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片と約
３０ｋｂより大きいサイズを有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片
を分離した後に得られる約９．５〜３０ｋｂのサイズを
有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片をほとんど含まないことを特
徴とする特許請求の範囲第３項に記載の組成物。 - （５）約２０ｋｂのサイズを有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片
とハイブリダイズし得る断片、特にＬ．Ｐ．株ＡＴＣＣ
３３１５２を酵素￥Ｂａｍ￥ＨＩで処理して得られる断
片混合物から得られる約９．５〜約３０ｋｂの間に並ぶ
サイズを有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片を含まないことを特
徴とする特許請求の範囲第３項または第４項に記載の組
成物。 - （６）前記混合物が、前記約２０ｋｂ断片をほとんど含
まないレギオネラニユーモフイラ（￥Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｉａ￥）の断片化した全
ゲノムで形成されることを特徴とする特許請求の範囲第
３項〜第５項のいずれかに記載の組成物。 - （７）前記断片混合物が、約９．５〜約３０ｋｂのサイ
ズを有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片をほとんど含まないこと
を特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の組成物。 - （８）約９．５ｋｂ未満と約３０ｋｂより大きいサイズ
を有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片を含有することを特徴とす
る特許請求の範囲第６項または第７項に記載の組成物。 - （９）前記混合物の制限断片のサイズが一般に５０ｋｂ
より大きいことを特徴とする特許請求の範囲第３項〜第
８項のいずれかに記載の組成物。 - （１０）レギオネラニユーモフイラ（￥Ｌｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｉａ￥）のゲノＡＤＮ
ＡのうちリボソームＲＮＡに転写し得る配列をほとんど
含まない前記ゲノムＤＮＡの断片組成物。 - （１１）大腸菌（￥Ｅ．￥ ￥ｃｏｌｉ￥）の１６Ｓお
よび２３ＳリボソームＲＮＡとハイブリダイズするゲノ
ムＤＮＡ配列をほとんど含まないことを特徴とする特許
請求の範囲第１０項に記載の組成物。 - （１２）断片が標識されていることを特徴とする特許請
求の範囲第３項〜第１１項のいずれかに記載の組成物。 - （１３）レギオネラ（ｌ，ｅｇｉｏｎｅｌｌｅｓ）、よ
り特定的にはブルセラ（￥Ｂｒｕｃｅｌｌａ￥）の選択
的検出用組成物であつて、ブルセラ（￥Ｂｒｕｃｅｌｌ
ａ￥）に由来しこれから抽出されたかまたはハイブリダ
イズできるようにされているＤＮＡ組成物とハイブリダ
イズする能力を有するブルセラ（￥Ｂｒｕｃｅｌｌａ￥
）のゲノムＤＮＡ断片の混合物から成つているが、この
混合物は、一方でブルセラ（￥Ｂｒｕｃｅｌｌａ￥）の
全ゲノムＤＮＡと、他方でブルセラ（￥Ｂｒｕｃｅｌｌ
ａ￥）の全ゲノムを制限酵素￥Ｋｐｎ￥Ｉで処理し、約
６．５ｋｂ以外のサイズを有する￥Ｋｐｎ￥Ｉ断片を分
離することによつて前記全ゲノムから得られる約６．５
ｋｂのサイズを有する￥Ｋｐｎ￥Ｉ断片との両者にハイ
ブリダイズし得る断片をほとんど含まないことを特徴と
する前記選択的検出用組成物。 - （１４）細菌の所定の種とさらには属を選択的に検出す
るためのプローブの製造に使用できる物質を製造する方
法であつて、好ましくは予じめ前記所定の種または属に
属する細菌から単離した全ゲノム全体を用い、これを制
限酵素で断片化し、得られた断片の混合物を大腸菌（￥
Ｅ．￥ ￥ｃｏｌｉ￥）のリボソームＲＮＡと接触させ
、このリボソームＲＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡ断
片を分離し、ハイブリダイズしなかつたＤＮＡ断片の混
合物を回収することを特徴とする方法。 - （１５）レギオネラニユーモフイラ（￥Ｌｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｉａ￥）を選択的に検
出するためのプローブの製造に使用できる物質を製造す
る方法であつて、好ましくは予じめレギオネラニユーモ
フイラ（￥Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐ
ｈｉｉａ￥）の頂株から単離した全ゲノム全体を用い、
これを、このゲノムの核酸を￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片に断片
化し得る条件下制限酵素￥Ｂａｍ￥ＨＩで処理し、得ら
れた２０ｋｂ程度の分子量を有する￥Ｂａｍ￥ＨＩ断片
、好ましくはサイズが９．５〜３０ｋｂである￥Ｂａｍ
￥ＨＩ断片全体をも分離し、残留する、レギオネラ（ｌ
，ｅｇｉｏｎｅｌｌｅｓ）の検出用プローブの製造に使
用できる前記物質を構成する断片を回収することを特徴
とする方法。 - （１６）最初に使用するレギオネラニユーモフイラ（￥
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）
のゲノム全体が菌株ＡＴＣＣ３３２５２に由来している
ことを特徴とする特許請求の範囲第１５項に記載の方法
。 - （１７）ブルセラ（￥Ｂｒｕｃｅｌｌａ￥）を選択的に
検出するためのプローブの製造に使用できる物質を製造
する方法であつて、好ましくは予じめブルセラ（￥Ｂｒ
ｕｃｅｌｌａ￥）の菌株から単離した全ゲノム全体を用
い、これを、このゲノムの核酸を￥Ｋｐｎ￥Ｉ断片に断
片化し得る条件下制限酵素￥Ｋｐｎ￥Ｉで処理し、得ら
れた６．５ｋｂ程度の分子量を有する￥Ｋｐｎ￥Ｉ断片
を分離し、残留する、ブルセラ（￥Ｂｒｕｃｅｌｌａ）
の検出用プローブの製造に使用できる前記物質を構成す
る断片を回収することを特徴とする方法。 - （１８）前記物質の核酸が放射性にまたは特に酵素、発
光体もしくはケイ光体のマーカーによつて標識されてい
ることを特徴とする特許請求の範囲第１５項〜第１７項
のいずれかに記載の方法。 - （１９）分析すべき細菌株またはその混合物のＤＮＡを
ハイブリダイゼーシヨン可能な条件下で特許請求の範囲
第３項〜第１２項のいずれかに記載の組成物と接触させ
、場合によつて形成されるハイブリツドを検出すること
を特徴とするレギオネラニユーモフイラ（￥Ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌａ￥ ￥ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ￥）の検出方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8412250 | 1984-08-02 | ||
| FR8412250A FR2568588B1 (fr) | 1984-08-02 | 1984-08-02 | Sonde et procede pour la detection de micro-organismes determines, notamment des legionella dans les milieux les contenant |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188900A true JPS6188900A (ja) | 1986-05-07 |
Family
ID=9306736
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60170994A Pending JPS6188900A (ja) | 1984-08-02 | 1985-08-02 | 媒質中の所定微生物、特にレギオネラの検出用プロ−ブおよび検出方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4810644A (ja) |
| EP (1) | EP0174226B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6188900A (ja) |
| AT (1) | ATE60360T1 (ja) |
| DE (1) | DE3581459D1 (ja) |
| DK (1) | DK350785A (ja) |
| FR (1) | FR2568588B1 (ja) |
| GR (1) | GR851886B (ja) |
| PT (1) | PT80909B (ja) |
Families Citing this family (10)
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|---|---|---|---|---|
| FR2596774B1 (fr) * | 1986-04-04 | 1988-07-22 | Pasteur Institut | Sondes oligonucleotidiques et procedes pour la detection par hybridation des acides nucleiques de bacteries et autres etres vivants |
| AU1043788A (en) * | 1986-12-01 | 1988-06-30 | Mcdonnell Douglas Corporation | Method of identifying unknown organisms |
| US5070011A (en) * | 1989-06-16 | 1991-12-03 | Health Research Inc. | DNA probes for the detection of Haemophilus Ducreyi and method of use |
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| DE19515891C2 (de) * | 1995-04-29 | 1999-10-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Gattungs- und speziesspezifische Identifizierung von Legionellen |
| US6251609B1 (en) | 2000-07-27 | 2001-06-26 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of Legionella pneumophila targeting the mip gene |
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|---|---|---|---|---|
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1984
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-
1985
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- 1985-07-26 DE DE8585401545T patent/DE3581459D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-01 DK DK350785A patent/DK350785A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-08-01 GR GR851886A patent/GR851886B/el unknown
- 1985-08-02 PT PT80909A patent/PT80909B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-08-02 US US06/762,053 patent/US4810644A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-02 JP JP60170994A patent/JPS6188900A/ja active Pending
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| ATE60360T1 (de) | 1991-02-15 |
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| FR2568588B1 (fr) | 1987-02-13 |
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