JPS6192563A - 微生物培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）　　産業上の利用分野 本発明は微生物を培養増殖させるための培養方法に関す
るものである。さらに詳しくは、微生物をサスペンショ
ン状態で培養する方法において、その培養系中へ酸素を
効率よく供給し、且つ微生物の生育を増大せしめる方法
に関するものである。

＋ｂ＋　　従来技術 微生物の培養、特に大ｍ培養は例えばアミノ酸、核酸関
連物質、ビタミンや、抗生物質の生理活性物質、あるい
は、酵素の生産に必須である。また、アルコール飲料、
乳製品あるいは、醸造食品の生産にもこの技術は不可欠
である。殊に近年発達しつつある遺伝子組み換え技術を
用いた有用物質生産のためには、細菌、酵母、放線菌等
の大ｉｔｌ培養技術が工業的に重要である。

従来、微生物の培養は一般に試ｌ！′ｉｉ管、フラスカ
。

ジャーファーメンタ−などを用いて、実験室規模で行わ
れている。

一方工業的大嶽培養の方法としては、発酵槽の中で撹拌
翼または、通気することにより撹拌を１１ないながら培
養するものが一般的である。

微生物は好気性菌、通性嫌気性菌、偏性嫌気性菌に分類
できる。本発明は酵素の存在を必要とする、または、酸
素の存在を好適な生育条件とする前二者の培養方法の改
良に関するものであり、これらの微生物にはＷ菌の多く
のほかカビ、放線菌、酵母等が含まれる。

これらの微生物培養における酸素供給のために、試験管
フラスコではそれ自体を振とうはにより往復娠とうまた
は、回転撮とうすることで気相中の酸素をサスペンショ
ン液にとり込ませることが行われている。また、ジャー
ファーメンタ−あるいは、工業的人聞培養においては、
サスペンション液中に通気を行なうことによって、サス
ペンション液中の酸素を一定ｍ度に維持している。

しかし、微生物培養を工業的規模で実施しようとする場
合には、上記の酸素供給方法はいずれも不適当である。

すなわち、振とうにより酸素をサスペンション液にとり
込ませる方法は、ナスペンション液量が増大すると、そ
れと共に液表面の面積を増加させることができず、酸素
とり込みの効率が低下するため工業的規模では、酸素の
供給不足を避けることは不可能に近い。また規模の大き
な培養装置全体を振どうするのは現実的でない。

サスペンション液中へ酸素含有ガスを吹き込んで供給す
る場合には、培地によっては発泡によって液面が上昇し
、培養操作の継続に困難を生じ、そのために多量の消泡
剤を要する。

前記したいずれの酸素供給方式も工業的規模でしかも高
密度による培養を行なう場合には、それらの欠点または
困難性はさらに拡大される。

そこで、本発明者は、上記の如き、酸素供給方式の欠点
がなく、種々の微生物の生育にも阻害がなく、工業的規
模においてもまた高密度培養においても採用し得、その
上酸素供給操作が簡単で且つ培養操作のトラブルがない
方法について研究を進めた結果、本発明に到達した。

（Ｃ）　　発明の構成 すなわち、本発明は、微生物をサスペンション（浮ｉ）
状態で培養するに当り、酸素を溶解しているフルオロカ
ーボンを該サスペンション液中に供給することを特徴と
する微生物培養方法である。

かかる本発明方法によれば、酸素を溶解しているフルオ
ロカーボンを微生物が浮遊しているサスペンション液中
へ直接供給することによって、そのフルオロカーボンの
表面からサスペンション液中へ酸素の溶解拡散が起こり
、該液中への酸素の供給が行なわれる。

本発明者の研究によれば、酸素を溶解しているフルオロ
カーボンを微生物が浮遊しているサスペンション液へ直
接供給して、フルオロカーボンと微生物とが接触しても
化学的にもまた物理的にも微生物は安定であり、生育に
は、なんらの悪影響を受けず増殖°することがわかった
。殊に微生物を高密度で培養する場合にはサスペンショ
ンの容積当り大損の酸素を必要とし、そのような場合に
大量に該フルオロカーボンを供給しても高密度培養が何
等の支障なく達成されることがわかった。

本発明の微生物培養方法はサスペンション状態の微生物
培養に適用されるが、サスペンション状態とは、水性媒
体中で微生物それ自体が浮遊しながら、或いは微生物が
微小担体（マイクロキャリアー）に担持されて浮遊しな
がら、またマイクロカプセル中で微生物が生育されるよ
うな神々の浮遊培養をいう。殊に本発明は、微生物自体
を浮遊させながら培養する方式に有利に用いられる。

本発明の微生物培養法において培養される微生物は、野
生型のほかに、人為的に変性させたり、ウィルスを感染
させたり、各種の遺伝子操作により形質転換したもので
あってもよい。例えば、特定のヒトの構造遺伝子を組み
込んだ発現型プラスミドを持つ大腸菌であ？でもよく、
ヒト型の生理活性物質を産生ずる種々の菌であってもよ
い。また、バクテリオファージ等の微生物に感染覆るウ
ィルスを調製する目的でのその微生物であってもよい。

本発明におけるサスペンション状態の微生物培養におい
ては、培養しようとする微生物が培養液中に浮遊した状
態で培養される。培養液は、実質的に水よりなる水性媒
体に、種々の無檄塩、ビタミン塩、補酵素、糖類、アミ
ノ酸、ペプチド、微伍金属元素、抗生物質などの通常微
生物培養に使用される添加成分のうち必要なものが加え
られている。また、微生物の栄養要求性に応じた化学物
質、動植物抽出等の添加物、あるいは、微生物の選択を
目的とした添加物を加えることもできる。

本発明方法において用いられるフルオロカーホンはそれ
自体酵素を溶解づる能力を有していることは云うまでも
ないが、培養条件下で水と混和せず水と２液相を形成す
るものであり、微生物の生台を阻害しないものであるの
が一層望ましい。かかるフルオロカーボンどしては、常
温で液体であるのが有利であり、市販されているものが
広く利用できる。例えば各種熱媒体、電気絶縁材料とし
で使用されているフルオロカーボン、人工血液として使
用されている種々のフルオロカーボンが使用できる。そ
の具体例としては、炭素数８以上のパーフルオロアルカ
ン類、バーフルオロシクルアルカン類（例えば、パーフ
ルオロデカリン、パーフルオロメチルデカリン、炭素数
３〜５のアルキル置換基を有するパーフルオロアルキル
シクロへキサン）、炭素数５〜７のアルキル置換基を有
するパーフルオロアルチルテトラヒドロフラン類。

炭素数４〜６のアルキル置換基を有するパーフルオロア
ルキルテトラヒドロビラン類、パーフルオロアダマンタ
ン類（例えばパーフルオロアダマンタン、パーフルオロ
メチル７ダマンタン、パーツｌ　　　　ルオロジメチル
アダマンクン、パーフルオロメチルエチルアダマンタン
、パーフルオロジエチルアダマンタンなど）が挙げられ
る。前記フルオロカーボンは、種々の基、例えば第３級
アミノ基を含有したものであってもよい。これらは一種
でも二種以上の混合物でも使用される。さらに住友スリ
ーエム（株より発売されている種々のフロリナート＠　
（Ｆ　１ｕｏｒｉｎｅｒｔ　）であってもよい。

前記したフルオロカーボンは単に例示のために挙げたの
であって本発明方法の実施を妨げない限り他のフルオロ
カーボンであっても同等差支えない。

フルオロカーボンはその比重が水に比べて約１．６〜約
２倍と大きく、そのため本発明方法を実施する場合には
、１ノスペンシヨン液の上部に酸素を溶解しているフル
オロカーボンを供給しフルオロカーボンがサスベンジョ
液中に懸濁しながら下方へ落下させる方式を実施するの
が有利である。

特にナスペンション培養を！Ｉ長の培養槽を用いて、そ
の培養槽はその上部に酸素を溶解したフルオロカーボン
を供給し、その下部から酸素溶解間の低下したフルオロ
カーボンを取出すように設計されたものであるのが本発
明方法の実施に特に有利である。

培養槽のサスペンション液中のフルオロカーボンを、供
給するに当っては、その供給口はノズル。

スリット、多孔体、スパージャリングなど種々の形状の
ものが使用でき、またフルオロカーボンはサスペンショ
ン液中で液柱、液滴、液膜などのいずれの形態で存在し
ていてもよいが、好ましいのは液滴の状態である。フル
オロカーボンは、サスペンション液中へ連続的１間歇的
或いは半連続的に供給することができるが、一般には、
サスペンション液中の酸素濃度を検知して所望する酸素
濃度に適応したωのフルオロカーボンを供給することが
望ましい。

本発明方法の実施に当っては、サスペンション液中にお
いて、微生物に栄養分、酸素、その他生前に必要な成分
が充分に接触するために撹拌することもできる。また培
養に必要な栄養分、塩類。

抗生物質などを含んだ新しい培養液をサスペンション状
態で微生物が存在する培養槽に供給しながら、微生物が
産生じた老廃物２代謝産物、その他生前阻害物質を含ん
だ古い培養液をサスペンション液から扱き出し培養槽の
外へ適宜排出するのが、微生物を効率よく増殖させるた
めに望ましく、特に微生物を高密度で生育させるために
は有利である。

前述したようにフルオロカーボンは、水より比重が重い
ために培養槽の下部へ沈隣し、その底部に溜る。この培
養槽の底部に溜ったフルオロカーボンは酸素溶Ｍｉ１！
度が低下しているか殆んど溶解していないものであるか
ら、連続的１間歇的或いは半連続的に培養槽外へ取り出
し、再びＭ索を溶解させる。フルオロカーボンに酸素を
溶解させるには、フルオロカーボン中へ純酸素、空気の
如き酸素含有ガス（このガスにはさらに二酸化炭素など
を含有していてもよい）を吹込む方法または前記ｒ！ｉ
素含有ガスの雰囲気中へフルオロカーボンをスプレーす
る方法などが有利であるが、これら以外の方法であって
も、酸素を溶解さけることができる限り差支えない。

かくして酸素を溶解したフルオロカーボンは、再び培養
＜ｆｆｉへ循環され使用される。なお本発明において培
養槽から取り出されたフルオロカーボンは、その全量に
対して酸素をｉ８解させる必要はなく、一部はそのまま
再び培養槽へ戻すことも可能である。

本発明方法を実施するに当っては、培養槽中のり゛スペ
ンション液に供給されるべきフルオロカーボンのＦｎ　
ＬＪ、フルオロカーボンの種類、フルオロ７Ｊ−ボン中
の酸素の溶解濃度、リースペンション液中の微生物の種
類と密度などにより左右されるが、一般には培養液１ｆ
１当り１時間に対し少くとも０．１．Ｑ、好ましくは少
くとも１すであるのが有利である。

本発明の方法は、前述したようにサスペンション状態で
微生物培養を行っている培養系に酸素をフルオロカーボ
ンを介して供給するのであるが、他の酸素供給手段を一
部併用しても同等差支えない。例えば、サスペンション
液の自由表面に酸素や空気の如き酸素含有ガスを接触さ
せて、該液面から一部の酸素を吸収させてもよく、また
、酸素含有ガスをサスペンション液中に吹込んで補足さ
せることもできる。

かくして本発明によれば、従来の酸素供給手段において
生じる種々の欠点を克服し、温和な酸素供給ができ、従
って安定した操作で微生物を効率的に増殖出来、また品
密度による培養を容易に可能にすることができる。

さらに本発明方法においては、フルオロカーボンが晋ナ
スペンション液と接触し、その液中を流動することによ
って局部的な撹拌が起り、そのため仝休として撹拌効果
が増大し、強い機械的撹拌を要することが少くなるとい
う利点をも有する。この利点は、微生物を高密麿で培養
する場合或いは大規模な装置で培養する場合に特に著し
い。

以下実施例を掲げて本発明方法を説明するが、本発明は
これらに同等限定を受けるものではない。

実施例１゜ 実験に用いた器具を添（＝Ｊ図に示す。これは試験管状
の突起のｆ」いた容ω５００ｄの坂ロフラスコ（バリオ
ガラス製）で菌液の濁度を測定する際には、フラスコを
傾けることにより、液の一部を突起の部分に移すことに
より、そのまま分光光度計にて、１蜀度が測定できるも
のである。

このフラスコを乾熱滅菌した。次にＬ−ブロス（ポリペ
プトン１０！？／　！ｌ　、イースト抽出物５Ｊ／′ρ
、塩化すトリウム５ｇ／す）を作製し、３０分間窒素ガ
スを吹き込みながら、液を撹拌し、溶存酸素を除いた。

その後、すみやかにメンブレンフィルターで濾過滅菌し
たものを上記フラスコに５０ｄ入れた。

一方、フルオロカーボン（住友スリーエム社製。

フロリナートＦＣ−４０）に３０分間酸素カスを吹き込
みながら撹拌し、それに酸素を飽和させた。その後、す
みやかにメンブレンフィルターで濾過滅菌したものを、
上記フラスコに７５ｍ１入れた。さらに、し−ブロス中
で前日より、前培養を行ない、定常期にある大腸菌Ｃ６
００株の菌液を１００μ文加え、フラスコ内部を窒素で
置換し、ゴム栓にて密栓した。

これを３７°Ｃで１辰どう培養し、一定時間毎に菌サス
ペンションのみをデカンテーションにより、Ｅ記の突起
の部分に移し、波長６００ｎｍの光での濁度を求めた。

ここで大腸菌の濁度は上記の糸と同一だが、植菌のみし
てないものの濁度も同時に測定し、これを差し引くこと
によって求めた。

比較例１゜ 実施例１で用いたものと同一の坂ロフラスコを乾熱滅菌
し、メンブレンフィルターで濾過滅菌したＬ−ブロスを
１０（７入れ、前日よりｌ−−ブロスにて前培養を行な
い、定常期にある大腸菌Ｃ６００株２００μ塁を加えた
。通気性のある栓をして、３７℃にて振どう培養し、一
定時間毎に波長６００ｎｍの光での濁度を測定した。

実施例２゜ 実施例１ｅ用いたものと同一の坂ロフラスコを乾熱滅菌
した。

次に濾過滅菌したし一ブロス５０厩を入れた。

一方、フルオロカーボン（住友スリーエム社製。

フロリナートＦ　Ｃ−４０）に３０分間酸素ガスを吹き
込みながら撹拌し、それに酸素を飽和させた。その後す
みやかにメンブレンフィルターで濾過滅菌したものを上
記フラスコに７５ｄ入れた。さらにし−ブロス中で前日
より前培養を行ない、定常期にある大腸菌Ｃ６００株の
菌液を１００μ磨加え、通気性のある栓をそして、３７
℃にて振どう培養し、一定時間毎に波長６ＱＯｎｍの光
での濁度を測定した。

比較例２゜ 実施例１で用いたものと同一の坂ロフラスコを乾熱滅菌
し、実施例１と同様に溶存酸素を除き、濾過滅菌したＬ
−ブロス１００ｍおよび前日よりＬ−ブロスにて前培養
を行ない定常期にある大腸菌０６００株の菌液２００μ
Ｑを加えた。すみやかにフラスコ内部を窒素置換し、ゴ
ム栓にて密栓したも１　　　　のを３７°Ｃにて振どう
培養した・一定時間毎に波長６００ｎｍの光での濁度を
測定した。

実施例１，２　比較例１，２の結果を表に示す。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、実施例に用いた器具の縦断面図である。。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 微生物をサスペンション状態で培養するに当り、酸素を
   溶解しているフルオロカーボンを該サスペンション中に
   供給することを特徴とする微生物培養方法。