JPS6192599A - プロスタグランジンの分析方法及び装置 - Google Patents
プロスタグランジンの分析方法及び装置Info
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- JPS6192599A JPS6192599A JP21189284A JP21189284A JPS6192599A JP S6192599 A JPS6192599 A JP S6192599A JP 21189284 A JP21189284 A JP 21189284A JP 21189284 A JP21189284 A JP 21189284A JP S6192599 A JPS6192599 A JP S6192599A
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- prostaglandin
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、プロスタグランジンの分析方法並びにその装
置に係り、特に１５位にＯＨ基を有するプロスタグラン
ジン類の各成分を、効果的に且つ経済的に分析するため
の方法並びに装置に関するものである。
置に係り、特に１５位にＯＨ基を有するプロスタグラン
ジン類の各成分を、効果的に且つ経済的に分析するため
の方法並びに装置に関するものである。
従来技術
プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ
； Ｐ Ｇ）は、５員環に二つの側鎖を有する、炭素数
が２０から成るモノカルボン酸の誘導体である。ところ
で、このＰＣには多くの種類があり、各ＰＧでそれぞれ
生理活性が異なるところから、それら各成分を分離して
定量することが必要とされている。
； Ｐ Ｇ）は、５員環に二つの側鎖を有する、炭素数
が２０から成るモノカルボン酸の誘導体である。ところ
で、このＰＣには多くの種類があり、各ＰＧでそれぞれ
生理活性が異なるところから、それら各成分を分離して
定量することが必要とされている。
また、かかるＰＧの幅広い生理作用としては、例えば平
滑筋収縮作用、血圧降下作用、抗脂肪分解作用、血小板
凝集阻止作用等があり、臨床医学。
滑筋収縮作用、血圧降下作用、抗脂肪分解作用、血小板
凝集阻止作用等があり、臨床医学。
薬理学、臨床病理学、生化学等の分野で注目されている
が、そのようなＰＣＩ］の分析には、従来にあっては、
主としてラジオイムノアッセイ （ＲＩＡ）法、ガスク
ロマトグラフィー法、薄層クロマトグラフィー法、高速
液体クロマトグラフィー法等が用いられている。
が、そのようなＰＣＩ］の分析には、従来にあっては、
主としてラジオイムノアッセイ （ＲＩＡ）法、ガスク
ロマトグラフィー法、薄層クロマトグラフィー法、高速
液体クロマトグラフィー法等が用いられている。
問題点
しかしながら、従来からのｔＡ法によるＰＧ類の分析手
法にあっては、ｐｃｔを含む試料の前処理が煩雑であり
、またＰＧ類の内の一成分毎の分析となり、複数のＰＣ
成分を同時に分析することは不可能であった他、全ての
ＰＧに対する抗体が入手出来ず、その為に分離分析し得
ないＰＧ酸成分存在していたのである。また、ガスクロ
マトグラフィー手法にあっては、ＰＣ試料の前処理が煩
雑である他、ＰＣ成分の誘導体化が複雑であり、定量上
の問題を内在していると共に、高感度測定が出来ず、微
量のＰＣＩＩＩを正確に分析することが困難である問題
を有している。さらに、薄層クロマトグラフィー手法に
おいては、定量性がない致命的な問題を内在しているの
である。
法にあっては、ｐｃｔを含む試料の前処理が煩雑であり
、またＰＧ類の内の一成分毎の分析となり、複数のＰＣ
成分を同時に分析することは不可能であった他、全ての
ＰＧに対する抗体が入手出来ず、その為に分離分析し得
ないＰＧ酸成分存在していたのである。また、ガスクロ
マトグラフィー手法にあっては、ＰＣ試料の前処理が煩
雑である他、ＰＣ成分の誘導体化が複雑であり、定量上
の問題を内在していると共に、高感度測定が出来ず、微
量のＰＣＩＩＩを正確に分析することが困難である問題
を有している。さらに、薄層クロマトグラフィー手法に
おいては、定量性がない致命的な問題を内在しているの
である。
また、従来の高速液体クロマトグラフィー手法を用いる
ｐｃの分析手法には、ＰＣ試料を分離カラムでそれぞれ
のＰＣ成分に分離せしめた後、直接ＵＶ検出器で検出す
る方法と、カラム導入前にラベル化して螢光検出器で測
定するプレラベル法があるが、前者の直接法は低感度で
ある問題があり、また後者のプレラベル法はＰＧ試料に
対する前処理が煩雑であり、またその誘導体化が複雑で
あり、且つ安定性がないため、定量性に欠ける問題があ
り、例えば血液中の微量のＰＣの測定は困難であったの
である。
ｐｃの分析手法には、ＰＣ試料を分離カラムでそれぞれ
のＰＣ成分に分離せしめた後、直接ＵＶ検出器で検出す
る方法と、カラム導入前にラベル化して螢光検出器で測
定するプレラベル法があるが、前者の直接法は低感度で
ある問題があり、また後者のプレラベル法はＰＧ試料に
対する前処理が煩雑であり、またその誘導体化が複雑で
あり、且つ安定性がないため、定量性に欠ける問題があ
り、例えば血液中の微量のＰＣの測定は困難であったの
である。
発明の概要
本発明は、かかる事情を背景にして為されたものであっ
て、その目的とするところは、廉価にして、容易且つ迅
速に、しかも正確に複数のｐＱＩｐを同時に分析するこ
とのできる方法並びに装置を提供することにある。
て、その目的とするところは、廉価にして、容易且つ迅
速に、しかも正確に複数のｐＱＩｐを同時に分析するこ
とのできる方法並びに装置を提供することにある。
そして、かくの如き目的を達成するために、本発明は、
１５位にＯＨ基を有するプロスタグランジン（ＰＣ）類
を含む試料を分離カラムにて各々の成分に分離した後、
順次分離される各ＰＣ成分を含む流出液を、それにニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＝）を含ま
せた状態下において、固定化された１５−ヒドロキシプ
ロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（１５−ｈｙｄｒｏ
ｘｙ−ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅ
ｎａｓｅ ； １５− ＯＨＰ Ｇ Ｄ Ｈ）を有する
反応カラム内に流通せしめることにより、各ＰＧ酸成分
前記ＮＡＤ”とを順次反応させた後、かかる反応によっ
て生じた物質の螢光測定を行なって、各ＰＧ酸成分検出
するようにしたのである。
１５位にＯＨ基を有するプロスタグランジン（ＰＣ）類
を含む試料を分離カラムにて各々の成分に分離した後、
順次分離される各ＰＣ成分を含む流出液を、それにニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＝）を含ま
せた状態下において、固定化された１５−ヒドロキシプ
ロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（１５−ｈｙｄｒｏ
ｘｙ−ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅ
ｎａｓｅ ； １５− ＯＨＰ Ｇ Ｄ Ｈ）を有する
反応カラム内に流通せしめることにより、各ＰＧ酸成分
前記ＮＡＤ”とを順次反応させた後、かかる反応によっ
て生じた物質の螢光測定を行なって、各ＰＧ酸成分検出
するようにしたのである。
かかる本発明に従えば、先ず、Ｅｌ、Ｅ２等の１５位に
Ｏ）［基を有するＰＧ類が被分析試料として調製される
。なお、血液等の生体試料が被分析試料である場合にお
いては、適当な処理（例えば、酢酸エチルなどの有機溶
媒による溶媒抽出操作など）によってＰＧ類を取り出し
、分析に供されることとなるが、そのような取り出され
たＰ（Ｊ’ＪＩが、従来の如く分析の為に誘導体化され
ることは、全（必要でないのである。
Ｏ）［基を有するＰＧ類が被分析試料として調製される
。なお、血液等の生体試料が被分析試料である場合にお
いては、適当な処理（例えば、酢酸エチルなどの有機溶
媒による溶媒抽出操作など）によってＰＧ類を取り出し
、分析に供されることとなるが、そのような取り出され
たＰ（Ｊ’ＪＩが、従来の如く分析の為に誘導体化され
ることは、全（必要でないのである。
次いで、この１５−０ＨＰＧ類は所定の分離カラムにて
各成分に分離されることとなるが、該分離手段としては
、ＰＣ各成分に迅速に分離することの出来る液体クロマ
トグラフィー、特に高速液体クロマトグラフィ一方式が
採用される。なお、この液体クロマトグラフィ一方式に
よるＰＣの分離に際して、かかるＰ Ｇ ｉ−Ｑを分離
するカラムとしては、逆相系の逆相分配型カラム：内径
１．５ ＋ａｍ〜５ ｍｍ、長さ５０鶴〜２５０ ａｍ
、例えば日本分光工業株式会社ｆｌＪｐ Ｓ −Ｆｉｎ
ｅｐａｋ Ｓ Ｉ Ｌ Ｃｇ （内径１．５鰭、長
さ２５０ｍ５）が好適に用いられる。また１９分離カラ
ム内を流通せしめられる溶離液としては、メタノールや
アセトニトリルとＮｅｔ ｆｉｉ液（リン酸緩衝液やＴ
ｒｉｓ緩（Ｌ液等）の混合溶媒が用いられることとなる
。
各成分に分離されることとなるが、該分離手段としては
、ＰＣ各成分に迅速に分離することの出来る液体クロマ
トグラフィー、特に高速液体クロマトグラフィ一方式が
採用される。なお、この液体クロマトグラフィ一方式に
よるＰＣの分離に際して、かかるＰ Ｇ ｉ−Ｑを分離
するカラムとしては、逆相系の逆相分配型カラム：内径
１．５ ＋ａｍ〜５ ｍｍ、長さ５０鶴〜２５０ ａｍ
、例えば日本分光工業株式会社ｆｌＪｐ Ｓ −Ｆｉｎ
ｅｐａｋ Ｓ Ｉ Ｌ Ｃｇ （内径１．５鰭、長
さ２５０ｍ５）が好適に用いられる。また１９分離カラ
ム内を流通せしめられる溶離液としては、メタノールや
アセトニトリルとＮｅｔ ｆｉｉ液（リン酸緩衝液やＴ
ｒｉｓ緩（Ｌ液等）の混合溶媒が用いられることとなる
。
そして、この液体クロマトグラフィ一方式で順次分離さ
れた各ＰＧ酸成分含む溶出液（流出液）には、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ”）を含む反応
液の所定間が連続的に混入せしめられるのである。なお
、かかるＮＡＤ＝を含む反応液は、エチレンジアミン四
酢酸二ナトリウム、ジチオスレイトール及び緩衝液（リ
ン酸緩衝液やＴｒｉｓ緩衝液等）からなる反応液にＮＡ
Ｄ−を溶解して調製され、またこの反応液のｐ １＋は
７〜９、濃度は０．１〜１ｍＭが好ましい。尤も、この
ＮＡＤ”は、初めから溶離液中に混入されていても、或
いは溶離液とは別途に分離カラムに供給されて、分離カ
ラムから流出する各ＰＣ成分を含む溶出液中に予め混入
されているようにしても何等差支えない。
れた各ＰＧ酸成分含む溶出液（流出液）には、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ”）を含む反応
液の所定間が連続的に混入せしめられるのである。なお
、かかるＮＡＤ＝を含む反応液は、エチレンジアミン四
酢酸二ナトリウム、ジチオスレイトール及び緩衝液（リ
ン酸緩衝液やＴｒｉｓ緩衝液等）からなる反応液にＮＡ
Ｄ−を溶解して調製され、またこの反応液のｐ １＋は
７〜９、濃度は０．１〜１ｍＭが好ましい。尤も、この
ＮＡＤ”は、初めから溶離液中に混入されていても、或
いは溶離液とは別途に分離カラムに供給されて、分離カ
ラムから流出する各ＰＣ成分を含む溶出液中に予め混入
されているようにしても何等差支えない。
かくして得られた混合液は、多孔質のガラスピーズ等の
適当な支持体に固定化された１５−ヒドロキシプロスタ
グランジンデヒドロゲナーゼ（１５−ＯＨＰ Ｇ Ｄ
Ｈ）を有する反応カラム内を流通せしめられ、これによ
り前記順次分離される各ＰＧ酸成分ＮＡＤ”とが順次反
応せしめられるのである。この反応は、反応式として下
記に示されるように、 １５−デヒドロ−ＰＣ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ”１５−０ＨＰＧ
ＤＨが触媒的に作用することにより、基本骨格の５員間
から延びる一つの測鎖中の１５位にあるＯＨ基がＮＡＤ
”によって脱水素されて、デヒドロ体に変換され、これ
と共に螢光物質であるＮＡＤＨが生成するのである。な
お、この反応は、中性乃至アルカリ性下において進行す
るものであって、それ故前記混合液が中性乃至はアルカ
リ性となるように、前記反応液酸いは前記溶離液のｐＨ
がコントロールされることとなる。
適当な支持体に固定化された１５−ヒドロキシプロスタ
グランジンデヒドロゲナーゼ（１５−ＯＨＰ Ｇ Ｄ
Ｈ）を有する反応カラム内を流通せしめられ、これによ
り前記順次分離される各ＰＧ酸成分ＮＡＤ”とが順次反
応せしめられるのである。この反応は、反応式として下
記に示されるように、 １５−デヒドロ−ＰＣ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ”１５−０ＨＰＧ
ＤＨが触媒的に作用することにより、基本骨格の５員間
から延びる一つの測鎖中の１５位にあるＯＨ基がＮＡＤ
”によって脱水素されて、デヒドロ体に変換され、これ
と共に螢光物質であるＮＡＤＨが生成するのである。な
お、この反応は、中性乃至アルカリ性下において進行す
るものであって、それ故前記混合液が中性乃至はアルカ
リ性となるように、前記反応液酸いは前記溶離液のｐＨ
がコントロールされることとなる。
また、この１５−０ＨＰＧＤＨは、例えばＪ、Ｂｉ。
ｃｈｅｍ、、８４．１４８５〜９４ （１９７８）に従
って調製され、酸素の固定化は公知の方法、例えば１１
．Ｈ，Ｗｅｅｔａｌ＋。
って調製され、酸素の固定化は公知の方法、例えば１１
．Ｈ，Ｗｅｅｔａｌ＋。
“ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｈｒ＋ｚｙｍｅｓ、
Ａｎｔｉｇｅｎｓ、 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ″、 Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅ
ｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ（１９７５） ｌ記載
の方法により行なわれる。
Ａｎｔｉｇｅｎｓ、 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ″、 Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅ
ｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ（１９７５） ｌ記載
の方法により行なわれる。
このように、反応カラム内で固定、保持される１５−０
ＨＰＣＤＩ＋は、該カラム内に流入せしめられた各ＰＧ
酸成分ＮＡＤ”とを速やかに反応させて、螢光物質：
ＮＡＤＨを生ぜしめる作用を為すのである。そして、こ
の１５−０ＨＰＧＤＨは適当な支持体等に固定化されて
いるが故に、連続的に供給して消費する方式とは異なり
、供給液中の濃度、供給速度変化等の反応を不安定化す
る要素が除かれ、しかも一旦固定化された後は、数十回
乃至数百回の繰返し使用が可能であるため、分析コスト
が安価となって、通常の汎用分析手段として有利に採用
され得るのである。
ＨＰＣＤＩ＋は、該カラム内に流入せしめられた各ＰＧ
酸成分ＮＡＤ”とを速やかに反応させて、螢光物質：
ＮＡＤＨを生ぜしめる作用を為すのである。そして、こ
の１５−０ＨＰＧＤＨは適当な支持体等に固定化されて
いるが故に、連続的に供給して消費する方式とは異なり
、供給液中の濃度、供給速度変化等の反応を不安定化す
る要素が除かれ、しかも一旦固定化された後は、数十回
乃至数百回の繰返し使用が可能であるため、分析コスト
が安価となって、通常の汎用分析手段として有利に採用
され得るのである。
そして、かかる反応によって生じたＮＡＤＨは３４０
ｎｍ付近に吸収スペクトルの極大を示し、そして４６０
ｎｍ付近に螢光スペクトルの極大を示すものである。そ
れ故、励起波長を３４０ｎｍ。
ｎｍ付近に吸収スペクトルの極大を示し、そして４６０
ｎｍ付近に螢光スペクトルの極大を示すものである。そ
れ故、励起波長を３４０ｎｍ。
螢光波長を４６０ｎｍに設定して螢光分析を行なうこと
によって、ＮＡＤＨが極微量でも存在すれば、換言すれ
ば反応カラム内に流入せしめられた溶出液中にＰＧ酸成
分存在すれば、これを検出。
によって、ＮＡＤＨが極微量でも存在すれば、換言すれ
ば反応カラム内に流入せしめられた溶出液中にＰＧ酸成
分存在すれば、これを検出。
分析することが出来るのである。
また、血中のＰＧ等で、より高感度の検出が要求される
場合には、前記反応カラムから流出する反応によって生
したＮＡＤＨを含む流出液に対して、さらにジアフォラ
ーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）及びリザズリン（ｒｅｓ
ａｚｕｒｉｎ ）を混入せしめて反応させることにより
、該流出液中に存在するＮＡＤＨをＮＡＤ”とすると同
時に、螢光物質：リゾルフィン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ
）を生成せしめ、そしてこのリゾルフィンを螢光測定す
ることにより、各ＰＣ成分を検出するようにすることに
より、より一層微量のＰＧを効果的に検出、定量するこ
とが出来るのである。この系では、数１０ｐｇオーダの
定量が可能となる。
場合には、前記反応カラムから流出する反応によって生
したＮＡＤＨを含む流出液に対して、さらにジアフォラ
ーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）及びリザズリン（ｒｅｓ
ａｚｕｒｉｎ ）を混入せしめて反応させることにより
、該流出液中に存在するＮＡＤＨをＮＡＤ”とすると同
時に、螢光物質：リゾルフィン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ
）を生成せしめ、そしてこのリゾルフィンを螢光測定す
ることにより、各ＰＣ成分を検出するようにすることに
より、より一層微量のＰＧを効果的に検出、定量するこ
とが出来るのである。この系では、数１０ｐｇオーダの
定量が可能となる。
なお、このようにして生じたりゾルフィンは、５７ Ｏ
ｎｍ付近に吸収スペクトルの極大を示し、そして５８０
ｎｍ付近に螢光スペクトルの極大を示すものである。
ｎｍ付近に吸収スペクトルの極大を示し、そして５８０
ｎｍ付近に螢光スペクトルの極大を示すものである。
それ故、励起波長を５７０ｎｍ。
螢光波長を５８０ｎｍに設定して螢光分析を行なうこと
によって、そのようなりゾルフィンを効果的に測定し得
、以て各ＰＣ成分の有効な分析、計量を行ない得るので
ある。
によって、そのようなりゾルフィンを効果的に測定し得
、以て各ＰＣ成分の有効な分析、計量を行ない得るので
ある。
また、このようなジアフォラーゼ及びリザズリンは、一
般に同一の溶液中に存在せしめられて、反応カラムから
流出する流出液中に混入せしめられるが、またそれら化
合物は、別々の溶液とされて、かかる流出液中に混入せ
しめられても良く、更にはジアフォラーゼを前記１５−
０ＨＰＣＤＩ−［と同様に適当な支持体に固定化せしめ
て、第二の反応カラム内に収容せしめ、前記流出液にリ
ザズリンを混入せしめて得られる混合液を、この第二の
反応カラｌ、内に流通せしめて、螢光物質：リゾルフィ
ンを生成せ１−めるようにすることも出来るのである。
般に同一の溶液中に存在せしめられて、反応カラムから
流出する流出液中に混入せしめられるが、またそれら化
合物は、別々の溶液とされて、かかる流出液中に混入せ
しめられても良く、更にはジアフォラーゼを前記１５−
０ＨＰＣＤＩ−［と同様に適当な支持体に固定化せしめ
て、第二の反応カラム内に収容せしめ、前記流出液にリ
ザズリンを混入せしめて得られる混合液を、この第二の
反応カラｌ、内に流通せしめて、螢光物質：リゾルフィ
ンを生成せ１−めるようにすることも出来るのである。
尤も、このリザズリンは、前記ＮＡＤ“と同様に分離カ
ラムよりも上流側において溶離液中に導入することがで
き、また分離カラムよりも下流側においても、前記流出
液とジアフォラーゼとの接触前であれば、如何なる段階
でも流出液中に導入することが可能である。
ラムよりも上流側において溶離液中に導入することがで
き、また分離カラムよりも下流側においても、前記流出
液とジアフォラーゼとの接触前であれば、如何なる段階
でも流出液中に導入することが可能である。
なお、Ｌ述のようにジアフォラーゼを固定化すれば、ジ
アフォラーゼの損失がなく、分析操作上において、更に
は経済性において優れた利点を発揮し得るのである。
アフォラーゼの損失がなく、分析操作上において、更に
は経済性において優れた利点を発揮し得るのである。
このように、本発明に従うＰＧの分析手法は、ＰＧＭを
各成分に分離した後、これに反応物としてのＮＡＤ”を
存在せしめてなる混合物を、反応触媒としての１５−０
ＨＰＧＤＨが固定された反応カラムに流通させることに
より、螢光物質：ＮＡＤ、、Ｈを生成せしめ、或いはこ
れに加えてジアフォラーゼ及びリザズリンを存在せしめ
て、螢光物質：リゾルフィンを生成せしめ、しかる後、
このＮＡＤＨ或いはりゾルフィンを検出するようにした
ものであって、これによりＰＧ類の迅速５確実な、そし
て安定した分析を可能と為し得たのである。
各成分に分離した後、これに反応物としてのＮＡＤ”を
存在せしめてなる混合物を、反応触媒としての１５−０
ＨＰＧＤＨが固定された反応カラムに流通させることに
より、螢光物質：ＮＡＤ、、Ｈを生成せしめ、或いはこ
れに加えてジアフォラーゼ及びリザズリンを存在せしめ
て、螢光物質：リゾルフィンを生成せしめ、しかる後、
このＮＡＤＨ或いはりゾルフィンを検出するようにした
ものであって、これによりＰＧ類の迅速５確実な、そし
て安定した分析を可能と為し得たのである。
また、かかる本発明を実施するに好適に装置としては、
（ａｌ １５位に（１１１基を有するＰＧ類を含む試料
を、分離カラムを用いて各成分に順次分離−Ｕしめる液
体クロマトグラフィ一方式による分離機構と、（ｂｌｌ
骨分離機構ら流出する各ＰＧ成分を含む流出液が、流通
せしめられる流路に接続され、該流出液にＮＡＤ”を含
む反応液を混入せしめる混入機構と、ｆｃ）固定ｊヒさ
れた１５−０ＨＰＣ；ＤＨを有し、前記混入機構による
混入操作によって形成された反応液と流出液との混合液
が流通せしめられて、該混合液中の各ＰＣ成分と前記Ｎ
ＡＤ”とを順次反応せしめる反応カラムと、（ｄｌ該反
応カラムの下流側に設けられ、該反応カラムから流出す
る流出液中に含まれる反応生成物を螢光測定して検出す
る検出手段とを、含むように構成した装置があり、また
上記ｔａ）、 （ｂｌ、 ｆｃ）及びｆｄｌ中のｆｃ）
とｆｄｌの間に、ｔｅｌ該反応カラムから流出する流出
液が流通せしめられる流路に接続され、該流出液にジ了
フォラーゼ及びリザズリンを混入せしめる第二の混入機
構と、（ｆｌ該第二の混入機構による混入操作によって
形成された混合液を流通せしめつつ所定の反応を惹起さ
せ、螢光物質：リゾルフィンを生成せしめる反応容器と
を含むように構成した装置もある。
（ａｌ １５位に（１１１基を有するＰＧ類を含む試料
を、分離カラムを用いて各成分に順次分離−Ｕしめる液
体クロマトグラフィ一方式による分離機構と、（ｂｌｌ
骨分離機構ら流出する各ＰＧ成分を含む流出液が、流通
せしめられる流路に接続され、該流出液にＮＡＤ”を含
む反応液を混入せしめる混入機構と、ｆｃ）固定ｊヒさ
れた１５−０ＨＰＣ；ＤＨを有し、前記混入機構による
混入操作によって形成された反応液と流出液との混合液
が流通せしめられて、該混合液中の各ＰＣ成分と前記Ｎ
ＡＤ”とを順次反応せしめる反応カラムと、（ｄｌ該反
応カラムの下流側に設けられ、該反応カラムから流出す
る流出液中に含まれる反応生成物を螢光測定して検出す
る検出手段とを、含むように構成した装置があり、また
上記ｔａ）、 （ｂｌ、 ｆｃ）及びｆｄｌ中のｆｃ）
とｆｄｌの間に、ｔｅｌ該反応カラムから流出する流出
液が流通せしめられる流路に接続され、該流出液にジ了
フォラーゼ及びリザズリンを混入せしめる第二の混入機
構と、（ｆｌ該第二の混入機構による混入操作によって
形成された混合液を流通せしめつつ所定の反応を惹起さ
せ、螢光物質：リゾルフィンを生成せしめる反応容器と
を含むように構成した装置もある。
実施例
この好適な装置の一例が系統図として第１図に示されて
いる。この第１図において、２は溶離液溜であり、逆相
分配型の分離カラム４に保持された各ＰＧ成分を順次溶
出せしめる、移動相としての溶離液がそれぞれ収容され
ている。そして、それらの／８離液は／８離液ポンプ６
によって、分離カラム４に連続的に供給されるようにな
っているのである。また、溶離液ポンプ６と分離カラム
４との間に試料注入器８が設けられており、該注入器８
より注入された各種ＰＧを含む試料が、分離カラム４に
導かれるようになっている。
いる。この第１図において、２は溶離液溜であり、逆相
分配型の分離カラム４に保持された各ＰＧ成分を順次溶
出せしめる、移動相としての溶離液がそれぞれ収容され
ている。そして、それらの／８離液は／８離液ポンプ６
によって、分離カラム４に連続的に供給されるようにな
っているのである。また、溶離液ポンプ６と分離カラム
４との間に試料注入器８が設けられており、該注入器８
より注入された各種ＰＧを含む試料が、分離カラム４に
導かれるようになっている。
一方、１０はＮＡＤ”を含む反応液が収容されている反
応液溜であり、この反応液溜１０内の反応液は反応液ポ
ンプ１２によって所定割合で送り出されると共に、分離
カラム４から流出する溶出液が流出する溶出液流路１４
に接続された反応液流路１６を介して、かかる溶出液に
混入されるようになっている。
応液溜であり、この反応液溜１０内の反応液は反応液ポ
ンプ１２によって所定割合で送り出されると共に、分離
カラム４から流出する溶出液が流出する溶出液流路１４
に接続された反応液流路１６を介して、かかる溶出液に
混入されるようになっている。
また、この溶出液流路１４の前記反応液流路１６との接
続点よりも下流側の流路上には、反応カラム１８が設け
られており、前記分離カラム４で順次分離された各ＰＧ
成分を含む溶出液と反応液との混合液が、流入せしめら
れるようになっている。
続点よりも下流側の流路上には、反応カラム１８が設け
られており、前記分離カラム４で順次分離された各ＰＧ
成分を含む溶出液と反応液との混合液が、流入せしめら
れるようになっている。
そして、この反応カラム１８内には、固定化された状態
の１５− ＯＴＩＰ ＣＤ １１が保持されており、こ
の１５− ＯＨＰ Ｇ Ｄ Ｈの触媒作用により、前記
溶出液に含まれるＰＣ成分とＮＡＤ’ とが反応せしめ
られることとなるのである。
の１５− ＯＴＩＰ ＣＤ １１が保持されており、こ
の１５− ＯＨＰ Ｇ Ｄ Ｈの触媒作用により、前記
溶出液に含まれるＰＣ成分とＮＡＤ’ とが反応せしめ
られることとなるのである。
この１５−０ＨＰＧＤＨを有する反応カラム１８は、適
当な支持体に１５− ＯＨＰ Ｇ Ｄ Ｈを吸着。
当な支持体に１５− ＯＨＰ Ｇ Ｄ Ｈを吸着。
共有結合等の方式で固定し、そしてその支持体をカラム
内に充填することにより、或いはカラムとしてチューブ
が使用される場合には、該チューブ自体の内表面に前記
手法に従って１５−０ＨＰＧＤＨを固定化せしめる等の
方法により得られるが、特に支持体として多孔質ガラス
ピーズを用い、その表面にアルキルアミンを結合せしめ
た後、グルタルアルデヒド等のカップリング剤の存在下
で１５−（１１（Ｐ Ｇ Ｄ Ｎをその表面に化学的に
固定化する方法が、好適に採用される。
内に充填することにより、或いはカラムとしてチューブ
が使用される場合には、該チューブ自体の内表面に前記
手法に従って１５−０ＨＰＧＤＨを固定化せしめる等の
方法により得られるが、特に支持体として多孔質ガラス
ピーズを用い、その表面にアルキルアミンを結合せしめ
た後、グルタルアルデヒド等のカップリング剤の存在下
で１５−（１１（Ｐ Ｇ Ｄ Ｎをその表面に化学的に
固定化する方法が、好適に採用される。
次いで、かかるカラム１８内における反応によって生じ
たＮＡＤ’は該カラム１８から流出し、そして該カラム
１８の下流側に設けられた検出器２０にて通常の螢光測
定手法に従って検出され、分析されることとなるのであ
る。
たＮＡＤ’は該カラム１８から流出し、そして該カラム
１８の下流側に設けられた検出器２０にて通常の螢光測
定手法に従って検出され、分析されることとなるのであ
る。
また、第２図には、本発明を実施するに好適な装置の他
の一例が示されている。そこでは、前例の装置に対して
、さらに第二反応液溜２２及び第二反応液ポンプ２４が
設けられており、該第二反応液溜２２の第二の反応液が
反応カラム１８から流出する流出液にｌ尾大せしめられ
た後、その混合液が反応器としての反応コイル２６内を
流通せしめられた後、検出器２０に導かれるようになっ
ている。なお、前例の装置と同様な作用効果を有する部
分には、同一の符℃を付して詳しい説明は省略すること
とする。
の一例が示されている。そこでは、前例の装置に対して
、さらに第二反応液溜２２及び第二反応液ポンプ２４が
設けられており、該第二反応液溜２２の第二の反応液が
反応カラム１８から流出する流出液にｌ尾大せしめられ
た後、その混合液が反応器としての反応コイル２６内を
流通せしめられた後、検出器２０に導かれるようになっ
ている。なお、前例の装置と同様な作用効果を有する部
分には、同一の符℃を付して詳しい説明は省略すること
とする。
要するに、かかる第２図の装置において、反応カラム１
８から流出するＮ Ａ Ｄ １１を含む流出液に対して
、第二反応液溜２２内に収容された第二の反応液として
のジアフォラーゼ・リザズリン溶液が、第二反応液ポン
プ２４によって混入せしめられ、そして反応コイル２６
内を流通せしめられることにより、リゾルフィンを生成
せしめ、そしてそのように生成したりゾルフィンを検出
器２０によって螢光測定することにより、各ＰＣ成分の
さらに微量のものが分析、定量され得るようになってい
るのである。
８から流出するＮ Ａ Ｄ １１を含む流出液に対して
、第二反応液溜２２内に収容された第二の反応液として
のジアフォラーゼ・リザズリン溶液が、第二反応液ポン
プ２４によって混入せしめられ、そして反応コイル２６
内を流通せしめられることにより、リゾルフィンを生成
せしめ、そしてそのように生成したりゾルフィンを検出
器２０によって螢光測定することにより、各ＰＣ成分の
さらに微量のものが分析、定量され得るようになってい
るのである。
また、かかる第２図の装置においては、ジアフォラーゼ
及びリザズリンを同時に含む溶液が第二反応液として用
いられているが、これに代えて川にリザズリンを含む溶
液を第二反応液として用い、これを反応カラム１８から
流出する流出液に混入せしめる一方、該反応カラム１８
と同様にジアフォラーゼを固定化せしめた第２の反応カ
ラムを反応コイル２６に代えてその位置に設け、該第二
の反応カラム内に、前記リザズリンを含む第二の反応液
を混入して成る混合液を流通せしめることにより、螢光
物質：リゾルフィンを生成せしめて、これを検出器２０
で測定するようにすることも可能である。
及びリザズリンを同時に含む溶液が第二反応液として用
いられているが、これに代えて川にリザズリンを含む溶
液を第二反応液として用い、これを反応カラム１８から
流出する流出液に混入せしめる一方、該反応カラム１８
と同様にジアフォラーゼを固定化せしめた第２の反応カ
ラムを反応コイル２６に代えてその位置に設け、該第二
の反応カラム内に、前記リザズリンを含む第二の反応液
を混入して成る混合液を流通せしめることにより、螢光
物質：リゾルフィンを生成せしめて、これを検出器２０
で測定するようにすることも可能である。
なお、これらの装置においては、ＮＡＤＨやリゾルフィ
ンを効果的に生成せしめ、その分析を有効ならしめるた
めに、少なくともがかるＮ Ａ Ｄ Ｈを生成せしめる
反応カラム１８部分を所定の温度、一般に１０°Ｃ〜４
０°Ｃ程度に保持する恒温機構を設りる必要があり、ま
た第２図の装置の場合にあっても、少なくとも反応カラ
ム１８部分及び反応コイル２６部分、または少なくとも
反応カラム１８部分及びジアフォラーセを固定化せしめ
た第二の反応カラム部分を、別個に若しくは同時に、所
定の温度（１０〜４０ ’Ｃ程度）に保持する恒温機構
を設けることが望ましいのである。
ンを効果的に生成せしめ、その分析を有効ならしめるた
めに、少なくともがかるＮ Ａ Ｄ Ｈを生成せしめる
反応カラム１８部分を所定の温度、一般に１０°Ｃ〜４
０°Ｃ程度に保持する恒温機構を設りる必要があり、ま
た第２図の装置の場合にあっても、少なくとも反応カラ
ム１８部分及び反応コイル２６部分、または少なくとも
反応カラム１８部分及びジアフォラーセを固定化せしめ
た第二の反応カラム部分を、別個に若しくは同時に、所
定の温度（１０〜４０ ’Ｃ程度）に保持する恒温機構
を設けることが望ましいのである。
このような分析装置を用いる場合には、ＰＧの分離や分
離された各ＰＣ成分とＮＡＤ”との反応や、更にはりプ
ルフィンの生成反応、そしてそれらの反応によって生じ
たＮ Ａ Ｄ Ｉ−１或いはりゾルフィンの検出が全べ
て連続的に行ない得、しかも高価な１５−０ＨＰＧＤＨ
を連続的に供給（消費）する必要がなく、また固定化さ
れた１５−０ＨＰＱＤＨ更にはジアフォラーゼは、数十
回乃至数百回の繰り返し使用が出来るため、少量の１５
−０ＨＰＧＤＨ，ジアフォラーゼを用いるだけで、極め
て経済的に且つ迅速にしかも安定的に、ＰＧを分析する
ことが可能となったのである。
離された各ＰＣ成分とＮＡＤ”との反応や、更にはりプ
ルフィンの生成反応、そしてそれらの反応によって生じ
たＮ Ａ Ｄ Ｉ−１或いはりゾルフィンの検出が全べ
て連続的に行ない得、しかも高価な１５−０ＨＰＧＤＨ
を連続的に供給（消費）する必要がなく、また固定化さ
れた１５−０ＨＰＱＤＨ更にはジアフォラーゼは、数十
回乃至数百回の繰り返し使用が出来るため、少量の１５
−０ＨＰＧＤＨ，ジアフォラーゼを用いるだけで、極め
て経済的に且つ迅速にしかも安定的に、ＰＧを分析する
ことが可能となったのである。
因みに、かかる本発明手法の効果を確認するために、第
１図の装置を用いて、各ＰＧを含む標準試料に対して行
なわれた分析結果が第３図に示されている。
１図の装置を用いて、各ＰＧを含む標準試料に対して行
なわれた分析結果が第３図に示されている。
測定条件は、以下の通りである。
分離カラム（４）：Ｃｏ逆相型カラム（オクチル基を化
学的に結合させた １０μｍ前後の球状シリカ ゲルを充填） （内ｉ冬２．１龍、長さ２５０鰭） ／８離液：４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，０
０／アセ１−ニトリル（７５／２５、体積比） ／８潟市液流量： ０．１ ｍ ｌ ／分反応カラム（
１８）：内径２．１ｍＭ、長さ５０ｍｍ（１５−０ＨＰ
ＧＤＨを固 定化した酵素カラム） 反応液：１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
と１ｍＭのジチオスレイトー ルとを含む０．１ Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，
３０）にＮＡＤ”を溶解して０．４５ｍＭの濃度に調整
したン容液反応液流量：０．１ｍＭ／分 検出器（２０）：螢光検出器（Ｆ、Ｐ−２１０、日本分
光工業■製〕 励起波長３４０ ｎｍ 螢光波長４７０ｎｍ 測定温度：２０“Ｃ（分離カラム、反応カラムとも） 溶離液ポンプ（６）；ＢｆＰ−Ｉ Ｃ日本分光工業■
製〕 反応液ポンプ四２）：ＢＩＰ−１（日本分光工業（４１
製〕 なお、１５−ＯＨＰ Ｇ Ｄ ｌ−［の固定化は次の方
法によった。
学的に結合させた １０μｍ前後の球状シリカ ゲルを充填） （内ｉ冬２．１龍、長さ２５０鰭） ／８離液：４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，０
０／アセ１−ニトリル（７５／２５、体積比） ／８潟市液流量： ０．１ ｍ ｌ ／分反応カラム（
１８）：内径２．１ｍＭ、長さ５０ｍｍ（１５−０ＨＰ
ＧＤＨを固 定化した酵素カラム） 反応液：１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
と１ｍＭのジチオスレイトー ルとを含む０．１ Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，
３０）にＮＡＤ”を溶解して０．４５ｍＭの濃度に調整
したン容液反応液流量：０．１ｍＭ／分 検出器（２０）：螢光検出器（Ｆ、Ｐ−２１０、日本分
光工業■製〕 励起波長３４０ ｎｍ 螢光波長４７０ｎｍ 測定温度：２０“Ｃ（分離カラム、反応カラムとも） 溶離液ポンプ（６）；ＢｆＰ−Ｉ Ｃ日本分光工業■
製〕 反応液ポンプ四２）：ＢＩＰ−１（日本分光工業（４１
製〕 なお、１５−ＯＨＰ Ｇ Ｄ ｌ−［の固定化は次の方
法によった。
■ １５０ｍｇのアミノプロピルＣＰＧ（２００〜４０
０メンシユ、エレクトロヌクレオ、ニクス社製）、２．
５％のグルタルアルデヒド１．５ｍＭを加える。
０メンシユ、エレクトロヌクレオ、ニクス社製）、２．
５％のグルタルアルデヒド１．５ｍＭを加える。
■ 室温で３０分間脱気する。
■ 常圧下、室温で１時間更に反応させる。
■ 蒸留水で洗浄する。
■ １５−ＯＨＰＧＤＨ＊ （７０ユニツト、１ｍＭの
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム１ｍＭのジチオス
レイトールを含む０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＴ（
７，３０）１ｍ／に溶解したもの〕を加える。
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム１ｍＭのジチオス
レイトールを含む０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＴ（
７，３０）１ｍ／に溶解したもの〕を加える。
■ 水冷下、３０分間脱気する。
■ 水冷下、常圧で３０分間更に反応させる。
■ 蒸留水で洗浄する。
＊ Ｈ，０ｈｎｏ、Ｙ、Ｍｏｒｉｋａｗａ、 ａｎｄ
Ｐ、Ｈｉｒａｔａ。
Ｐ、Ｈｉｒａｔａ。
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８４．１４８５−１４９４ （
１９７Ｂ）に基づいて調整した。
１９７Ｂ）に基づいて調整した。
また、分析は次のようにして行なった。
すなわち、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２を各々１６０ｎｇ、８０
ｎｇ含むエタノール溶液３μｌを、試料注入器８より一
気に注入し、前記測定条件に設定された分離カラム４及
び反応カラム１８を通して、検出器２０にて螢光分析を
行なった。種々の濃度のＰＣを含む試料を用いて同様に
測定を行ない、第４図に示される検量線を得た。
ｎｇ含むエタノール溶液３μｌを、試料注入器８より一
気に注入し、前記測定条件に設定された分離カラム４及
び反応カラム１８を通して、検出器２０にて螢光分析を
行なった。種々の濃度のＰＣを含む試料を用いて同様に
測定を行ない、第４図に示される検量線を得た。
この検量線より、本発明の測定法における各ＰＧの測定
範囲は、ＰＧＥ１ ：２ｎｇ〜１００ｎｇ１１００ｎ
： １ ｎｇ〜Ｉ ００ｎｇであった。この結果より
、本発明の分析手法は非常に感度のよい測定法であると
言うことができる。
範囲は、ＰＧＥ１ ：２ｎｇ〜１００ｎｇ１１００ｎ
： １ ｎｇ〜Ｉ ００ｎｇであった。この結果より
、本発明の分析手法は非常に感度のよい測定法であると
言うことができる。
発明の効果
以上詳記したように、本発明は、分離カラムを用いた液
体クロマトグラフィ一方式による各ＰＧ酸成分分離と、
固定化せしめた１５−０ＨＰＧＤＩ］を用いる各ＰＣ成
分とＮＡＤ＝の反応とを巧みに組み合わせることによっ
て、かかるＰＧ酸成分存在に応じてＮ Ａ Ｄ ＩＩを
効果的に生ぜしめ、そしてこのＮＡＤＨ量によって、或
いはかかる生成したＮＡＤＨの存在下において、それを
ＮＡＤ”とすると同時に、螢光物質：レイゾルフィンを
生成せしめて、その生成量によって、各−ＰＧ酸成分分
析を行なおうとするものであり、これにより、（ａｌ前
処理が簡単となる；反応検出に酵素の高い基質特異性を
利用しているので、従来の高速液体クロマトグラフィー
手法、ＲＩＡ法、ガスクロマトグラフィー法に比して簡
便な前処理で良い、（ｂｌ特異性が高（、高感度である
；従来のＲＩＡ法以外の方法は、カルボン酸全般に対す
るラヘル化を利用した検出方法或いはラヘル化せずに検
出する方法で、多成分系の生体試料の分析には適用し難
く感、度が低いのに対し、本発明では、１５−０ＨＰＧ
Ｄ Ｈを有するＰＧにのみ反応を利用した分析であり、
Ｎ Ａ Ｄ ｔｌまたはりゾルフィンの螢光測定を行な
うため、従来法に比して十倍或いはそれ以上の感度を有
するのである、（Ｃ）分析コストが安い；１５− ＯＨ
Ｐ Ｇ Ｄ Ｈ、ジアフォラーゼの如き高価な酵素を固
定化することにより、−回の分析で４成分以上のＰＧを
測定することが可能であり、また２００検体程度の分析
まで連続使用が可能である、等の優れた特徴を有し、そ
こに大きな意義を有するものである。
体クロマトグラフィ一方式による各ＰＧ酸成分分離と、
固定化せしめた１５−０ＨＰＧＤＩ］を用いる各ＰＣ成
分とＮＡＤ＝の反応とを巧みに組み合わせることによっ
て、かかるＰＧ酸成分存在に応じてＮ Ａ Ｄ ＩＩを
効果的に生ぜしめ、そしてこのＮＡＤＨ量によって、或
いはかかる生成したＮＡＤＨの存在下において、それを
ＮＡＤ”とすると同時に、螢光物質：レイゾルフィンを
生成せしめて、その生成量によって、各−ＰＧ酸成分分
析を行なおうとするものであり、これにより、（ａｌ前
処理が簡単となる；反応検出に酵素の高い基質特異性を
利用しているので、従来の高速液体クロマトグラフィー
手法、ＲＩＡ法、ガスクロマトグラフィー法に比して簡
便な前処理で良い、（ｂｌ特異性が高（、高感度である
；従来のＲＩＡ法以外の方法は、カルボン酸全般に対す
るラヘル化を利用した検出方法或いはラヘル化せずに検
出する方法で、多成分系の生体試料の分析には適用し難
く感、度が低いのに対し、本発明では、１５−０ＨＰＧ
Ｄ Ｈを有するＰＧにのみ反応を利用した分析であり、
Ｎ Ａ Ｄ ｔｌまたはりゾルフィンの螢光測定を行な
うため、従来法に比して十倍或いはそれ以上の感度を有
するのである、（Ｃ）分析コストが安い；１５− ＯＨ
Ｐ Ｇ Ｄ Ｈ、ジアフォラーゼの如き高価な酵素を固
定化することにより、−回の分析で４成分以上のＰＧを
測定することが可能であり、また２００検体程度の分析
まで連続使用が可能である、等の優れた特徴を有し、そ
こに大きな意義を有するものである。
第１図及び第２図はそれぞれ本発明に係るＰＧ分析装置
の一実施例を示す系統図であり、第３図は本発明手法に
従って得られた一つのクロマトグラムであり、第４図は
検量線を示す。 ２：／８離液溜 ４：分離カラム６ ’ ／５ｉ
ＰｉＩｌ液ポンプ ８：試料注入器ｌＯ：反応液溜
１２；反応液ポンプ１４：溶出液流路 １６：反応液
流路 １８二反応カラム ２０：検出器 ２２：第二反応液溜 ２４：第二反応液ポンプ ２６：反応コイル
の一実施例を示す系統図であり、第３図は本発明手法に
従って得られた一つのクロマトグラムであり、第４図は
検量線を示す。 ２：／８離液溜 ４：分離カラム６ ’ ／５ｉ
ＰｉＩｌ液ポンプ ８：試料注入器ｌＯ：反応液溜
１２；反応液ポンプ１４：溶出液流路 １６：反応液
流路 １８二反応カラム ２０：検出器 ２２：第二反応液溜 ２４：第二反応液ポンプ ２６：反応コイル
Claims (14)
- （１）１５位にＯＨ基を有するプロスタグランジン類を
含む試料を分離カラムにて各々の成分に分離した後、順
次分離される各プロスタグランジン成分を含む流出液を
、それにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含ま
せた状態下において、固定化された１５−ヒドロキシプ
ロスタグランジンデヒドロゲナーゼを有する反応カラム
内に流通せしめることにより、各プロスタグランジン成
分と前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを順
次反応させた後、かかる反応によって生じた物質の螢光
測定を行なって各プロスタグランジン成分を検出するこ
とを特徴とするプロスタグランジンの分析方法。 - （２）前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが、
それを含む反応液として前記分離カラムからの流出液に
混入せしめられ、次いでその混合液が、固定化された１
５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼを
有する反応カラム内に流通せしめられる特許請求の範囲
第１項記載の分析方法。 - （３）１５位にＯＨ基を有するプロスタグランジン類を
含む試料を分離カラムにて各々の成分に分離した後、順
次分離される各プロスタグランジン成分を含む流出液を
、それにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含ま
せた状態下において、固定化された１５−ヒドロキシプ
ロスタグランジンデヒドロゲナーゼを有する反応カラム
内に流通せしめることにより、各プロスタグランジン成
分と前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを順
次反応させた後、更にこれにジアフォラーゼを混入せし
めて、リザズリンの存在下に反応させることにより、螢
光物質：リゾルフィンを生成せしめ、そしてその螢光測
定を行なって各プロスタグランジン成分を検出すること
を特徴とするプロスタグランジンの分析方法。 - （４）前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが、
それを含む反応液として前記分離カラムからの流出液に
混入せしめられ、次いでその混合液が、固定化された１
５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼを
有する反応カラム内に流通せしめられる特許請求の範囲
第３項記載の分析方法。 - （５）前記リザズリンが、前記ジアフォラーゼと共に若
しくはそれとは別個に、前記各プロスタグランジン成分
と前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとの反応
物を含む流出液中に加えられる特許請求の範囲第３項又
は第４項記載の分析方法。 - （６）１５位にＯＨ基を有するプロスタグランジン類を
含む試料を分離カラムにて各々の成分に分離した後、順
次分離される各プロスタグランジン成分を含む流出液を
、それにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含ま
せた状態下において、固定化された１５−ヒドロキシプ
ロスタグランジンデヒドロゲナーゼを有する第一の反応
カラム内に流通せしめることにより、各プロスタグラン
ジン成分と前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
とを順次反応させた後、更にこれを、リザズリンの存在
下において、固定化されたジアフォラーゼを有する第二
の反応カラム内に流通せしめて反応させることにより、
螢光物質：リゾルフィンを生成せしめて、そしてその螢
光測定を行なって各プロスタグランジン成分を検出する
ことを特徴とするプロスタグランジンの分析方法。 - （７）前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが、
それを含む反応液として前記分離カラムからの流出液に
混入せしめられ、次いでその混合液が、固定化された１
５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼを
有する反応カラム内に流通せしめられる特許請求の範囲
第６項記載の分析方法。 - （８）前記リザズリンが、前記ジアフォラーゼと共に若
しくはそれとは別個に、前記各プロスタグランジン成分
と前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとの反応
物を含む流出液中に加えられる特許請求の範囲第６項又
は第７項記載の分析方法。 - （９）１５位にＯＨ基を有するプロスタグランジン類を
含む試料を分離カラムを用いて各成分に順次分離せしめ
る液体クロマトグラフィ方式による分離機構と、 該分離機構から流出する各プロスタグランジン成分を含
む流出液が流出せしめられる流路に接続され、該流出液
にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む反応液
を混入せしめる混入機構と、 固定化された１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒ
ドロゲナーゼを有し、前記混入機構による混入操作によ
って形成された反応液と流出液との混合液が流通せしめ
られて、該混合液中の各プロスタグランジン成分と前記
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを順次反応せ
しめる反応カラムと、 該反応カラムの下流側に設けられ、該反応カラムから流
出する流出液中に含まれる反応生成物を螢光測定して検
出する検出手段とを、 含むことを特徴とするプロスタグランジンの分析装置。 - （１０）少なくとも前記反応カラム部分を所定の温度に
保持する恒温機構を設けた特許請求の範囲第９項記載の
装置。 - （１１）１５位にＯＨ基を有するプロスタグランジン類
を含む試料を分離カラムを用いて各成分に順次分離せし
める液体クロマトグラフィ方式による分離機構と、 該分離機構から流出する各プロスタグランジン成分を含
む流出液が流出せしめられる流路に接続され、該流出液
にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む反応液
を混入せしめる第一の混入機構と、 固定化された１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒ
ドロゲナーゼを有し、前記第一の混入機構による混入操
作によって形成された反応液と流出液との混合液が流通
せしめられて、該混合液中の各プロスタグランジン成分
と前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを順次
反応せしめる反応カラムと、 該反応カラムから流出する流出液が流通せしめられる流
路に接続され、該流出液にジアフォラーゼ及びリザズリ
ンを混入せしめる第二の混入機構と、 該第二の混入機構による混入操作によって形成された混
合液を流通せしめつつ所定の反応を惹起させ、螢光物質
：リゾルフィンを生成せしめる反応器と、 該反応器の下流側に設けられ、該反応器から流出する流
出液中に含まれるリゾルフィンを螢光測定することによ
り、各プロスタグランジン成分を検出する検出手段とを
、 含むことを特徴とするプロスタグランジンの分析装置。 - （１２）少なくとも前記反応カラム部分及び前記反応器
部分を別個に若しくは同時に所定の温度に保持する恒温
機構を設けた特許請求の範囲第１１項記載の装置。 - （１３）１５位にＯＨ基を有するプロスタグランジン類
を含む試料を分離カラムを用いて各成分に順次分離せし
める液体クロマトグラフィ方式による分離機構と、 該分離機構から流出する各プロスタグランジン成分を含
む流出液が流出せしめられる流路に接続され、該流出液
にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む反応液
を混入せしめる第一の混入機構と、 固定化された１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒ
ドロゲナーゼを有し、前記第一の混入機構による混入操
作によって形成された反応液と流出液との混合液が流通
せしめられて、該混合液中の各プロスタグランジン成分
と前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを順次
反応せしめる第一の反応カラムと、 該第一の反応カラムから流出する流出液が流通せしめら
れる流路に接続され、該流出液にリザズリンを混入せし
める第二の混入機構と、固定化されたジアフォラーゼを
有し、前記第二の混入機構による混入操作によって形成
された混合液を流通せしめつつ所定の反応を惹起させて
、螢光物質：リゾルフィンを生成せしめる第二の反応カ
ラムと、 該第二の反応カラムの下流側に設けられ、該第二の反応
カラムから流出する流出液中に含まれるリゾルフィンを
螢光測定することにより、各プロスタグランジン成分を
検出する検出手段とを、 含むことを特徴とするプロスタグランジンの分析装置。 - （１４）少なくとも前記第一の反応カラム部分及び前記
第二の反応カラム部分を別個に若しくは同時に所定の温
度に保持する恒温機構を設けた特許請求の範囲第１３項
記載の装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21189284A JPS6192599A (ja) | 1984-10-09 | 1984-10-09 | プロスタグランジンの分析方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21189284A JPS6192599A (ja) | 1984-10-09 | 1984-10-09 | プロスタグランジンの分析方法及び装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6192599A true JPS6192599A (ja) | 1986-05-10 |
Family
ID=16613365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21189284A Pending JPS6192599A (ja) | 1984-10-09 | 1984-10-09 | プロスタグランジンの分析方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6192599A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5308774A (en) * | 1990-01-08 | 1994-05-03 | Hitachi, Ltd. | Liquid chromatographic method and apparatus for analyzing biological samples |
| KR101044634B1 (ko) | 2009-02-05 | 2011-06-29 | 국민대학교산학협력단 | 프로스타글란딘 Ｈ2（ＰＧＨ2）의 안정화 방법 및 프로스타글란딘 합성효소（ｍＰＧＥＳ―1）의 활성 측정방법 |
-
1984
- 1984-10-09 JP JP21189284A patent/JPS6192599A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5308774A (en) * | 1990-01-08 | 1994-05-03 | Hitachi, Ltd. | Liquid chromatographic method and apparatus for analyzing biological samples |
| KR101044634B1 (ko) | 2009-02-05 | 2011-06-29 | 국민대학교산학협력단 | 프로스타글란딘 Ｈ2（ＰＧＨ2）의 안정화 방법 및 프로스타글란딘 합성효소（ｍＰＧＥＳ―1）의 활성 측정방법 |
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