JPS6193197A - 魚類の成長ホルモンポリペプチド - Google Patents
魚類の成長ホルモンポリペプチドInfo
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- JPS6193197A JPS6193197A JP59213361A JP21336184A JPS6193197A JP S6193197 A JPS6193197 A JP S6193197A JP 59213361 A JP59213361 A JP 59213361A JP 21336184 A JP21336184 A JP 21336184A JP S6193197 A JPS6193197 A JP S6193197A
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- Japan
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- dna
- growth hormone
- polypeptide
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- rna
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチドおよび該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａを含む微生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドの製造法に関する。魚類の成長ホルモンは魚類の養殖
産業分野において広い用途が期待される。
ペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａを含む微生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドの製造法に関する。魚類の成長ホルモンは魚類の養殖
産業分野において広い用途が期待される。
従来の技術
哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産されるが
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、Ｕ、 Ｊ、 Ｌｅｗｉｓ
らによってＪ、Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、、 ８
０ 。
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、Ｕ、 Ｊ、 Ｌｅｗｉｓ
らによってＪ、Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、、 ８
０ 。
４４２９ （１９５８）に、＾、Ｓ、 Ｈａｒｔｒｅｅ
によってＢｉｏｃｈｅｍ。
によってＢｉｏｃｈｅｍ。
Ｊ９．旦、 ７５４（１９６，６＞に、Ｃ，Ｈ，Ｌｉら
によって＾ｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ｌ１ｌｉｏｐ
ｈｙｓ、 Ａｃｔａ （Ｓｕｐｐｌ、）、 １ 。
によって＾ｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ｌ１ｌｉｏｐ
ｈｙｓ、 Ａｃｔａ （Ｓｕｐｐｌ、）、 １ 。
３２７ （１９６２）に報告されている。
魚類の成長ホルモンについても、これまでに単離された
という報告は多く見られるが、その生理活性と蛋白化学
的な性質で信頼性のあるものは数が少ない。信頼性のあ
る報告の例には次のようなものがある。
という報告は多く見られるが、その生理活性と蛋白化学
的な性質で信頼性のあるものは数が少ない。信頼性のあ
る報告の例には次のようなものがある。
ティラピアよりの単離例 Ｓ、 Ｗ、 Ｆａｒｍｅｒら
、Ｇｅｎ。
、Ｇｅｎ。
Ｃｏｍｐ、 Ｂｎｄｏｃｒｉｎ、、 ３０． ９
１（１９７６）。
１（１９７６）。
チョウデメよりの単離例 Ｓ、 Ｗ、Ｆａｒｍｅｒら、
コイよりの単離例 Ａ、 Ｆ、 Ｃｏｏｋら、Ｇｅｎ、
Ｃｏｍｐ。
コイよりの単離例 Ａ、 Ｆ、 Ｃｏｏｋら、Ｇｅｎ、
Ｃｏｍｐ。
Ｂｎｄｏｒｃｒｉｎ、、 ５０．３３５（１９８３）。
本発明者らは先にサケ脳下垂体から成長ホルモンを抽出
、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列（３１個）の決定
を行った。また、この物質が硬骨魚類において成長促進
効果を有することも確認している〔特願昭５９−６８６
７０１゜発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳下
垂体からの採取は供給量が限られている。従って魚類の
成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望ま
れている。
、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列（３１個）の決定
を行った。また、この物質が硬骨魚類において成長促進
効果を有することも確認している〔特願昭５９−６８６
７０１゜発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳下
垂体からの採取は供給量が限られている。従って魚類の
成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望ま
れている。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、組換えＤＮＡ技法により魚類の成長ホル
モンを製造する方法について研究を行った。その結果光
に、魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、
魚類の成長ホルモンポリペプチドに相補的なりＮＡの採
取ならびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製
造に成功した。
モンを製造する方法について研究を行った。その結果光
に、魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、
魚類の成長ホルモンポリペプチドに相補的なりＮＡの採
取ならびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製
造に成功した。
即ちサケ脳下垂体からメツセンジャーＲＮ Ａ （ｍＲ
ＮＡ）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ （ｃＤＮ
Ａ）を合成し、次いでサケの成長ホルモンのＮ末端付近
のアミノ酸配列に対応するＩ）ＮＡプローブを合成し、
このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを選択するこ
とにより、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン化するこ
とに成功した。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配列を決定
した（特願昭５９−１３４５３６）。
ＮＡ）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ （ｃＤＮ
Ａ）を合成し、次いでサケの成長ホルモンのＮ末端付近
のアミノ酸配列に対応するＩ）ＮＡプローブを合成し、
このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを選択するこ
とにより、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン化するこ
とに成功した。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配列を決定
した（特願昭５９−１３４５３６）。
本発明者らは、さらに研究を進め、サケの成長ホルモン
をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む
微生物を培養することにより、培１）中にサケ成長ホル
モンポリペプチドが著量生成蓄積することを見出した。
をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む
微生物を培養することにより、培１）中にサケ成長ホル
モンポリペプチドが著量生成蓄積することを見出した。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、とくに第
１表に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごとく製造することができる。
１表に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごとく製造することができる。
即ち、魚類成長ホルモンのｍＲＮＡを鋳型として用いて
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し
、咳ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製す
る。さらに、繊組換え体プラスミドを宿主微生物に挿入
する。繊組換え体プラスミドを有する微生物を培養する
ことによりサケ成長ホルモンポリペプチドを安価に大量
に製造することができる。
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し
、咳ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製す
る。さらに、繊組換え体プラスミドを宿主微生物に挿入
する。繊組換え体プラスミドを有する微生物を培養する
ことによりサケ成長ホルモンポリペプチドを安価に大量
に製造することができる。
本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。
法で調製される。
シロサケ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴ
ｄＴセルロース（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポリＡ）
を有するＲＮＡ （ポ’ＪＡ”ＲＮＡ）を分離する。
ｄＴセルロース（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポリＡ）
を有するＲＮＡ （ポ’ＪＡ”ＲＮＡ）を分離する。
このポＩＪＡ”ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素により二
重＃ＪＩＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ
組換え技法を用い、大場菌のプラスミドＤＮＡのような
ベクターＤＮＡに談合成りＮＡを挿入して得られる。シ
ロサケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを有
する組換え体プラスミドを選択する。
重＃ＪＩＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ
組換え技法を用い、大場菌のプラスミドＤＮＡのような
ベクターＤＮＡに談合成りＮＡを挿入して得られる。シ
ロサケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを有
する組換え体プラスミドを選択する。
次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。
ついて具体的に説明する。
捕獲されたシロサケより脳下垂体を摘出し、即座に液体
窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウム
・インチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｕｍｉｓｏｔｈ
ｉｏｃｙａｎａｔｅンを加え破砕し、可溶化する。次い
でＣ５ＣＪ！溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物とし全
細胞質ＲＮＡを得る。またグアニジウム・イソチオシア
ネート可溶化物にＬｉＣｊ！を加えてＲＮＡのみを沈殿
させ回収することもできる。
窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウム
・インチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｕｍｉｓｏｔｈ
ｉｏｃｙａｎａｔｅンを加え破砕し、可溶化する。次い
でＣ５ＣＪ！溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物とし全
細胞質ＲＮＡを得る。またグアニジウム・イソチオシア
ネート可溶化物にＬｉＣｊ！を加えてＲＮＡのみを沈殿
させ回収することもできる。
抽出したＲＮＡをＮａ（ｌまたはＫ（ｌの高塩濃度（た
とえば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、オリゴ（ｄ７）セ
ルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有するｍＲＮ
Ａをカラムに吸着させる。水、１０ｍ Ｍ ） ｉスー
ＨＣ１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポ
ＩＪ（Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。
とえば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、オリゴ（ｄ７）セ
ルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有するｍＲＮ
Ａをカラムに吸着させる。水、１０ｍ Ｍ ） ｉスー
ＨＣ１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポ
ＩＪ（Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。
以下、Ｏｋａｙａｍａ−８ｅｒｇの方法（（ｌｋａｙａ
ｍａ ＆ ［ｌｅｒｇ；Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、 Ｒｉａｌ
、 ２．１６０１９８２）） ｌＬ″従い、ｃＤＮへ
の合成および、そのベクターへの組み込みを行う。
ｍａ ＆ ［ｌｅｒｇ；Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、 Ｒｉａｌ
、 ２．１６０１９８２）） ｌＬ″従い、ｃＤＮへ
の合成および、そのベクターへの組み込みを行う。
まずベクタープライマーを合成する。ベクターとしては
たとえばｐｃｉ）ｖｌを適当な溶液、たとえばトリス−
ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，ｔ。
たとえばｐｃｉ）ｖｌを適当な溶液、たとえばトリス−
ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，ｔ。
ｍＭ）、 ＭｇＣＣ（たとえば６ｍＭ）、ＮａＣｆ（
たとえば１０ｍＭ）を含む溶液中でＫｐｎ Ｉで処理し
、ｐＣＤＶｌのＫｐｎ １部位を切断する。
たとえば１０ｍＭ）を含む溶液中でＫｐｎ Ｉで処理し
、ｐＣＤＶｌのＫｐｎ １部位を切断する。
このＤＮＡをトリス−ＨＣ１）１ｉ衝液（たとえばｐＨ
６，８，３０ｍＭ）、 カコジル酸ナトリウム（たと
えば１４０ｍＭ）、ＣｏＣ１ａ（たとえば１ｍＭ）、ジ
チオスレイトール（たとえば０．１ｍＭ＞およびｄＴＴ
Ｐ （たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼとともに一定温度（
たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間）イン
キユベートし、ベクターＤＮＡの両３′末端に６０個前
後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡをトリ
ス−ＨＣ１緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍ Ｍ
） 、Ｍ ｇ ＣＩｔ ｘ（たとえば６ｍＭ）、ＮａＣ
ｆ （たとえば１００ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで
切断後、低融点アガロースゲル電気泳動ＣＬａｒｓ Ｗ
ｉｅｓｌａｎｄｅｒ ：＾ｎａｌｙｔｉｃａ１）＋ｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９８，３０５（１９７９）］にて
分画し、約３．１キロベースの断片を回収する。次いで
該ＤＮＡをＭｇＣＪｔまたはＫＣｌの高塩濃度（たとえ
ば０．５Ｍ）溶液に溶解し、ポＩＪ（ｄＡ）セルロース
カラムに通塔してポＩＪ（Ｔ）を有・するベクタープラ
イマー分子のみをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）
リスーＨＣ１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出
し、ポ！Ｉ （Ｔ）の付加したベクタープライマー分子
のみを単離する。
６，８，３０ｍＭ）、 カコジル酸ナトリウム（たと
えば１４０ｍＭ）、ＣｏＣ１ａ（たとえば１ｍＭ）、ジ
チオスレイトール（たとえば０．１ｍＭ＞およびｄＴＴ
Ｐ （たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼとともに一定温度（
たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間）イン
キユベートし、ベクターＤＮＡの両３′末端に６０個前
後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡをトリ
ス−ＨＣ１緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍ Ｍ
） 、Ｍ ｇ ＣＩｔ ｘ（たとえば６ｍＭ）、ＮａＣ
ｆ （たとえば１００ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで
切断後、低融点アガロースゲル電気泳動ＣＬａｒｓ Ｗ
ｉｅｓｌａｎｄｅｒ ：＾ｎａｌｙｔｉｃａ１）＋ｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９８，３０５（１９７９）］にて
分画し、約３．１キロベースの断片を回収する。次いで
該ＤＮＡをＭｇＣＪｔまたはＫＣｌの高塩濃度（たとえ
ば０．５Ｍ）溶液に溶解し、ポＩＪ（ｄＡ）セルロース
カラムに通塔してポＩＪ（Ｔ）を有・するベクタープラ
イマー分子のみをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）
リスーＨＣ１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出
し、ポ！Ｉ （Ｔ）の付加したベクタープライマー分子
のみを単離する。
次にリンカ−ＤＮＡを合成する。たとえばｐＬＩＤＮＡ
を適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣ１緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，１０ｍＭ） 、 ＭｇＣＪｔ。
を適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣ１緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，１０ｍＭ） 、 ＭｇＣＪｔ。
（たとえば６ｍＭ）、ＮａＣＪ （たとえば５０ｍＭ）
を含む溶液中でＰｓｔｌで処理し、ｐＬｌのＰｓｔ１部
位を切断する。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧ
ＴＰを加える以外はベクタープライマー合成の場合と同
様に処理し、１５個前後のオリゴｄＧ鎖を付加する。該
ＤＮＡを適当な溶液たとえばトリス−Ｈ（Ｊ緩衝液（た
とえばｐＨ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣＪｔ２（たとえ
ば６ｍＭ＞。
を含む溶液中でＰｓｔｌで処理し、ｐＬｌのＰｓｔ１部
位を切断する。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧ
ＴＰを加える以外はベクタープライマー合成の場合と同
様に処理し、１５個前後のオリゴｄＧ鎖を付加する。該
ＤＮＡを適当な溶液たとえばトリス−Ｈ（Ｊ緩衝液（た
とえばｐＨ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣＪｔ２（たとえ
ば６ｍＭ＞。
Ｎａ（Ｊ （たとえば６０ｍＭ＞を含む溶液中Ｈｉｎｄ
Ｉ［［にて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約０
．５キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパ
ーにて回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを優る
。
Ｉ［［にて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約０
．５キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパ
ーにて回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを優る
。
以上のようにして得たポリ （Ａ）”ＲＮＡ、ベクター
プライマー、リンカ−ＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行
う。ポリ （Ａ）′″ＲＮＡ 、ベクタープライマー
ＤＮＡをトリス−Ｈ（ｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，
５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２ （たとえば８ｍＭ）、ＫＣｊ
！ （たとえば３０ｍＭ）、ジチオスレイトール（たと
えば０．３ｍＭ）、ｄＡＴＰ。
プライマー、リンカ−ＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行
う。ポリ （Ａ）′″ＲＮＡ 、ベクタープライマー
ＤＮＡをトリス−Ｈ（ｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，
５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２ （たとえば８ｍＭ）、ＫＣｊ
！ （たとえば３０ｍＭ）、ジチオスレイトール（たと
えば０．３ｍＭ）、ｄＡＴＰ。
ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ （たとえば各々２ｍＭ
）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７
℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こう
して辱たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の３′末端に、ｄＴＴＰ
がｄＣＴＰに変わる以外はベクタープライマーにｄＴｌ
、Ｉを付加した条件と同様の操作でオリゴｄＣ鎖を１５
個前後付加する。
）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７
℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こう
して辱たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の３′末端に、ｄＴＴＰ
がｄＣＴＰに変わる以外はベクタープライマーにｄＴｌ
、Ｉを付加した条件と同様の操作でオリゴｄＣ鎖を１５
個前後付加する。
このＤＮＡをトリス−ＨＣ１緩衝液（たとえばｐＨ７，
５，１０ｍＭ）、ＭｇＣＪｔ（たとえば６ ｍＭ） 。
５，１０ｍＭ）、ＭｇＣＪｔ（たとえば６ ｍＭ） 。
ＭｇＣＪｔ （たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎ
ｄＩ［［で切断する。このＤＮＡに、先に調製したリン
カ−ＤＮＡを混合し、トリス−Ｈ（ｌ緩衝液（たとえば
ｐＨ１，５，２０ｍＭ）、Ｍｇ（１２（たとえば４ ｍ
Ｍ） 、 （ＮＨｎ）＊ＳＯａ （たとえば１０ｍＭ
＞、ＫＣｌ（たとえば０．１Ｍ）、β−二ココチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドβ−ＮＡＤ）（たとえば０．
１ｍＭ）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼとともに
一定時間（たとえば１６時間）、一定温度（たとえば１
２℃）でインキュベートする。こうしてｃＤＮＡとリン
カ−ＤＮＡとの環状化が行われる。この反応液にｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ。
ｄＩ［［で切断する。このＤＮＡに、先に調製したリン
カ−ＤＮＡを混合し、トリス−Ｈ（ｌ緩衝液（たとえば
ｐＨ１，５，２０ｍＭ）、Ｍｇ（１２（たとえば４ ｍ
Ｍ） 、 （ＮＨｎ）＊ＳＯａ （たとえば１０ｍＭ
＞、ＫＣｌ（たとえば０．１Ｍ）、β−二ココチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドβ−ＮＡＤ）（たとえば０．
１ｍＭ）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼとともに
一定時間（たとえば１６時間）、一定温度（たとえば１
２℃）でインキュベートする。こうしてｃＤＮＡとリン
カ−ＤＮＡとの環状化が行われる。この反応液にｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ。
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよう
加え、大腸菌Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ、大腸菌ＤＮＡ
−ポリメラーゼ■、大腸菌リボヌクレアーゼＨを加え
、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換することにより、完全な二
重鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを得る。
加え、大腸菌Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ、大腸菌ＤＮＡ
−ポリメラーゼ■、大腸菌リボヌクレアーゼＨを加え
、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換することにより、完全な二
重鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを得る。
こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大腸菌ｃ６００ＳＦ８株を、たとえば５ｃｏｔｔらの方
法〔重定勝哉：細胞工学 １゜６１６（１９８３） ）
により形質転換する。上記で得た組換え体プラスミド上
にはアンピシリン耐性遺伝子が存在するため、形質転換
した大腸菌はアンピシリン耐性を示す。以下の手法はこ
れらアンピシリン耐性（Ａｐ”）菌株から魚類の成長ホ
ルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を持つ新規組換え
体プラスミドＤＮＡを保有する菌株を選択するのに一般
的に用いられる。すなわち、上記で得られた形質転換株
をニトロセルロースフィルター上に固定し、既知のシロ
サケ成長ホルモンのアミノ酸配列より予想されるＤＮＡ
配列を有する合成りＮＡプローブと会合させ、強く会合
するものを選択する［Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ −ｆｌｏｇ
ｎｅｓｓの方法、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
大腸菌ｃ６００ＳＦ８株を、たとえば５ｃｏｔｔらの方
法〔重定勝哉：細胞工学 １゜６１６（１９８３） ）
により形質転換する。上記で得た組換え体プラスミド上
にはアンピシリン耐性遺伝子が存在するため、形質転換
した大腸菌はアンピシリン耐性を示す。以下の手法はこ
れらアンピシリン耐性（Ａｐ”）菌株から魚類の成長ホ
ルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を持つ新規組換え
体プラスミドＤＮＡを保有する菌株を選択するのに一般
的に用いられる。すなわち、上記で得られた形質転換株
をニトロセルロースフィルター上に固定し、既知のシロ
サケ成長ホルモンのアミノ酸配列より予想されるＤＮＡ
配列を有する合成りＮＡプローブと会合させ、強く会合
するものを選択する［Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ −ｆｌｏｇ
ｎｅｓｓの方法、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 、 ロＳＡ、、 ７２．
３９６Ｈ１９７５）］ 。プローブＤＮＡは通常のトリ
エステル法（Ｊ、Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、。
３９６Ｈ１９７５）］ 。プローブＤＮＡは通常のトリ
エステル法（Ｊ、Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、。
■、７３２７（１９７５） ］で会合される。合成りＮ
Ａプローブによる選択は５ｏｕｔｈｅｒｎらの方法［Ｊ
、 Ｍｏｌ。
Ａプローブによる選択は５ｏｕｔｈｅｒｎらの方法［Ｊ
、 Ｍｏｌ。
８１吐町、 ５０３ （１９７５））によってさらに確
実にでき、この方法でシロサケ成長ホルモンｍＲＮＡに
相補性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミドＤＮＡ
を同定できる。
実にでき、この方法でシロサケ成長ホルモンｍＲＮＡに
相補性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミドＤＮＡ
を同定できる。
このようにして得られる組換え体プラスミドの１例がｐ
ＳＧＨＩ ［特願昭５９−１３４５３６］である。この
プラスミドをサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの供
給源として用いることができる。
ＳＧＨＩ ［特願昭５９−１３４５３６］である。この
プラスミドをサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの供
給源として用いることができる。
微生物中でのサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発
現によるサケ成長ホルモンポリペプチドの生産： サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
から該ＤＮＡを切り出し、これをベクターＩ）ＮＡに組
み込み、得られる組換え体ＤＮＡを微生物に導入し、得
られる形質転換体を培養することによってサケ成長ホル
モンポリペプチドを培養物中に生成Ｍｇさせ、これを採
取することによっテサケ成長ホルモンポリペプチドを製
造することができる。
現によるサケ成長ホルモンポリペプチドの生産： サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
から該ＤＮＡを切り出し、これをベクターＩ）ＮＡに組
み込み、得られる組換え体ＤＮＡを微生物に導入し、得
られる形質転換体を培養することによってサケ成長ホル
モンポリペプチドを培養物中に生成Ｍｇさせ、これを採
取することによっテサケ成長ホルモンポリペプチドを製
造することができる。
サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
としては、上記ｐＳＣ，Ｈ１が好適な例としてあげられ
る。
としては、上記ｐＳＣ，Ｈ１が好適な例としてあげられ
る。
ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤＮＡを微生物中で
発現させることができるものなら、いかなるものでも用
いることができる。好ましくは、適当なプロモーター、
たとえばトリプトファン（ｔｒｐ）系、ラクトース（ｌ
ａｃ）系、ＰＬ系などのプロモーターを持ち、その下流
にＤＮＡを挿入でき、しかも内在するシャインダルガー
ノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と翻訳開始コドン（
ＡＴＧ）との間を適当な距離たとえば６〜１８塩基対に
調節したベクターＤＮＡが用いられる。具体的に好適な
ベクターＤＮＡとしては、プラスミドｐＧＥＬｌをあげ
ることができる。ｐＧＥＬ １は第３図に示すプラスミ
ドで、それを含む大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉＩＧＥＬＩ（ＦＥＲＭＢＰ−６２９ンとして昭和５
９年１０月６日付で工業技術院微生物工業技術研究所（
微工研）に寄託されている。ポリペプチドをコードする
ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換えは、制限酵素を用い
て両ＤＮＡを消化後、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ
を用いて結合する一般的組換えＤＮＡ手法を用いて行う
ことができる。
発現させることができるものなら、いかなるものでも用
いることができる。好ましくは、適当なプロモーター、
たとえばトリプトファン（ｔｒｐ）系、ラクトース（ｌ
ａｃ）系、ＰＬ系などのプロモーターを持ち、その下流
にＤＮＡを挿入でき、しかも内在するシャインダルガー
ノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と翻訳開始コドン（
ＡＴＧ）との間を適当な距離たとえば６〜１８塩基対に
調節したベクターＤＮＡが用いられる。具体的に好適な
ベクターＤＮＡとしては、プラスミドｐＧＥＬｌをあげ
ることができる。ｐＧＥＬ １は第３図に示すプラスミ
ドで、それを含む大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉＩＧＥＬＩ（ＦＥＲＭＢＰ−６２９ンとして昭和５
９年１０月６日付で工業技術院微生物工業技術研究所（
微工研）に寄託されている。ポリペプチドをコードする
ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換えは、制限酵素を用い
て両ＤＮＡを消化後、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ
を用いて結合する一般的組換えＤＮＡ手法を用いて行う
ことができる。
具体例として示したｐＳＧ）ｌ １とｐＧＥし１の場合
は第３図に示したごと＜ 、ｐｓＧＨｌからシロサケ成
長ホルモンをコードするＭ ｂ ｏ ｌｌ−５ａｌ Ｉ
消化断片と、Ｓａｔ Ｉ −ＢａｍＨＩ消化断片とを別
々に得、ｐＧＥしｌからはトリプトファンプロモーター
を含むＨｉ口ｄＩＩＩ−Ｂａｍｌ（Ｉ消化断片を得る。
は第３図に示したごと＜ 、ｐｓＧＨｌからシロサケ成
長ホルモンをコードするＭ ｂ ｏ ｌｌ−５ａｌ Ｉ
消化断片と、Ｓａｔ Ｉ −ＢａｍＨＩ消化断片とを別
々に得、ｐＧＥしｌからはトリプトファンプロモーター
を含むＨｉ口ｄＩＩＩ−Ｂａｍｌ（Ｉ消化断片を得る。
一方、以下のような合成りＮＡリンカ−を作製する。
Ｍｅｔ ｌｉｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ上記ＤＮＡ断片
と合成りＮＡ！ＩンカーとをＴ４Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガー
ゼで結合し、第３図に示した組換えプラスミドｐｓＧＩ
ＩＩＢ ２を得る。本プラスミドは成熟シロサケ成長ホ
ルモンをコードする。
と合成りＮＡ！ＩンカーとをＴ４Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガー
ゼで結合し、第３図に示した組換えプラスミドｐｓＧＩ
ＩＩＢ ２を得る。本プラスミドは成熟シロサケ成長ホ
ルモンをコードする。
上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。
とおりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１−２０
μｇのＤＮＡを２−２２−２Ｏ０好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のトリス−ＨＣｊ！（ｐＨ６，０〜９，５好まし
くはｐＨ７，０〜８．０）、０〜２００ｍＭのＮａＣｆ
、２〜３０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭ ｇ
Ｃｊ！ ＊を含む反応液中で、制限酵素０．１−１００
単位（好ましくはｌμｇのＤＮＡに対して１〜３単位）
を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素によ
り異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反応の
停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱するこ
とによるが、フェノールまたはジエチルピロカーボネー
着トなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も
用いることができる。
μｇのＤＮＡを２−２２−２Ｏ０好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のトリス−ＨＣｊ！（ｐＨ６，０〜９，５好まし
くはｐＨ７，０〜８．０）、０〜２００ｍＭのＮａＣｆ
、２〜３０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭ ｇ
Ｃｊ！ ＊を含む反応液中で、制限酵素０．１−１００
単位（好ましくはｌμｇのＤＮＡに対して１〜３単位）
を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素によ
り異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反応の
停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱するこ
とによるが、フェノールまたはジエチルピロカーボネー
着トなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も
用いることができる。
制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、低融
点アガロースゲル電気泳動法ＣＬ、 Ｗｉｅｓｌａｎｄ
ｅｒ：＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ’ｅｍｉｓｔ
ｒｙ ９Ｂ 、 ３０５（１９７９）以下ＬＧＴ法とい
う〕やポリアクリルアミドゲル電気泳動法などによって
行う。
点アガロースゲル電気泳動法ＣＬ、 Ｗｉｅｓｌａｎｄ
ｅｒ：＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ’ｅｍｉｓｔ
ｒｙ ９Ｂ 、 ３０５（１９７９）以下ＬＧＴ法とい
う〕やポリアクリルアミドゲル電気泳動法などによって
行う。
ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
ｌ Ｏ−４０ｍＭ）のトリス−ＨＣｌ（ｐ Ｈ６，１〜
９，５、好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、２−２２
−２Ｏ好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣｊ！２．０．
１−１０ｍＭ （好ましくは０．５〜２、０ ｍ Ｍ
）のＡＴＰ、１−５０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍＭ
）のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ０，３〜ＩＯ単位を用い、１〜３７℃（好まし
くは３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２
〜２０時間）行う。
ｌ Ｏ−４０ｍＭ）のトリス−ＨＣｌ（ｐ Ｈ６，１〜
９，５、好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、２−２２
−２Ｏ好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣｊ！２．０．
１−１０ｍＭ （好ましくは０．５〜２、０ ｍ Ｍ
）のＡＴＰ、１−５０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍＭ
）のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ０，３〜ＩＯ単位を用い、１〜３７℃（好まし
くは３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２
〜２０時間）行う。
結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりＣｏｈｅｎらの形質転換法〔Ｓ。
必要によりＣｏｈｅｎらの形質転換法〔Ｓ。
Ｎ、 Ｃｏｈｅｎら： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ６９゜２１）０（１
９７２１）によって、大腸菌に導入する。
＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ６９゜２１）０（１
９７２１）によって、大腸菌に導入する。
組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはＢｉ
ｒｎｂｏｉｍらの方法［：）１． Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍら： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、ユ、
１５１３（１９７９） ３などを用いて行う。
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはＢｉ
ｒｎｂｏｉｍらの方法［：）１． Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍら： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、ユ、
１５１３（１９７９） ３などを用いて行う。
プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。
さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある時はマキ
サム・ギルバード法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ。
サム・ギルバード法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ。
Ｓｃｉ、、 ７４．５６０（１９７７） ］またはＭ１
３ファージを用いたＳａｎｇｅｒ法〔ＳａｎｇｅｒらＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
３ファージを用いたＳａｎｇｅｒ法〔ＳａｎｇｅｒらＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ｕＳ＾、、 ７４．５４６３（１９７７）；＾ｍｅｒｓ
ｈａｍ社Ｍ１３ Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ ］によって決定する。
ｈａｍ社Ｍ１３ Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ ］によって決定する。
以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。
ることができる。
本発明のシロサケ成長ホルモンペプチドは以下のとおり
に製造できる。
に製造できる。
すなわち、プラスミド（例えばｐｓＧＨＩｌ］２＞を用
いて大腸菌に−１２ＨＢＩＯＩを形質転換させ、アンピ
シリン耐性（＾ｐ１以下同じ）のコロニーの中からｐｓ
ＧＨＩＢ２を有する大腸菌を選びだす。ρＳＧ旧８２を
有する大腸菌を培地に培養することにより培養物中にシ
ロサケ成長ホルモンポリペプチドを生成させることがで
きる。
いて大腸菌に−１２ＨＢＩＯＩを形質転換させ、アンピ
シリン耐性（＾ｐ１以下同じ）のコロニーの中からｐｓ
ＧＨＩＢ２を有する大腸菌を選びだす。ρＳＧ旧８２を
有する大腸菌を培地に培養することにより培養物中にシ
ロサケ成長ホルモンポリペプチドを生成させることがで
きる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにサケ成
長ホルモンポリペプチドの生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。
長ホルモンポリペプチドの生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース。
ラクトース、グリセロール、マンニトール、ソルビトー
ルなどが、窒素源としては、ＮＨ４Ｃｌ。
ルなどが、窒素源としては、ＮＨ４Ｃｌ。
（ＮＨ，）２５０４ 、カザミノ酸、酵母エキス、ポリ
ペプトン、肉エキス、バクトドリプトン、コーン・ステ
イープリカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ ＊
ＨＰ Ｏ−、Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏ４，Ｎ ａ Ｃ１。
ペプトン、肉エキス、バクトドリプトン、コーン・ステ
イープリカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ ＊
ＨＰ Ｏ−、Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏ４，Ｎ ａ Ｃ１。
Ｍｇ５Ｏａ、ビタミンＢ＋ 、ＭｇＣ１ｚなどが使用で
きる。
きる。
培養はｐＨ５，５〜８．５．温度１８〜４０℃で通気攪
拌培養により行われる。
拌培養により行われる。
培養５〜９０時間で培養菌体中にシロザケ成長ホ′ルモ
ンポリベプチドが蓄積するので、培養物から菌体を集菌
し、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰り返して
菌体を破砕し、遠心してえられる上清から通常のポリペ
プチドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。
ンポリベプチドが蓄積するので、培養物から菌体を集菌
し、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰り返して
菌体を破砕し、遠心してえられる上清から通常のポリペ
プチドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。
また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接Ｌａａｍ＋
ｎｌｉのサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａ
ｔｕｒｅ。
ｎｌｉのサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａ
ｔｕｒｅ。
２２７ 、６８０（１９７０） ）に加熱溶解後、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル［Ｌａｅｍｍｌ ｉの方法
：同上文献］にかけ、クマシーブリリアントブルー染色
によって行う。
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル［Ｌａｅｍｍｌ ｉの方法
：同上文献］にかけ、クマシーブリリアントブルー染色
によって行う。
実施例１．成熟シロサケ成長ホルモンをコードする組換
え体プラスミドρＳＧ旧口２の造成：シロサケ成長ホル
モンをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＳＧ）ＩＩ
（参考例１）５μｇを２０ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ
１，５）、 ｔｏ醋Ｍ ｇ Ｃｊ！ ２および１０ｍ
Ｍ ＮａＣｊ！を含む溶液（以下“Ｙ−１０緩衝液”
と略記する）４０μｌに溶かし、制限酵素Ｍ ｂ ｏ
ＩＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社
製）１０単位を加え３７℃３時間消化反応を行った。つ
づいて該溶液のｐＪａｃ１’ａ度を１７５ｍＭとなるよ
う調整し、Ｓａｌ［（宝酒造社製 以下特記しない限り
制限酵素はすべて宝酒造社製を用いた）１０単位を加え
、３７℃３時間消化反応を行った。この反応液から低融
点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）により、Ｎ末
端付近に相当する１６３ｂｐのＤＮＡ断片約０．２μｇ
を得た。
え体プラスミドρＳＧ旧口２の造成：シロサケ成長ホル
モンをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＳＧ）ＩＩ
（参考例１）５μｇを２０ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ
１，５）、 ｔｏ醋Ｍ ｇ Ｃｊ！ ２および１０ｍ
Ｍ ＮａＣｊ！を含む溶液（以下“Ｙ−１０緩衝液”
と略記する）４０μｌに溶かし、制限酵素Ｍ ｂ ｏ
ＩＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社
製）１０単位を加え３７℃３時間消化反応を行った。つ
づいて該溶液のｐＪａｃ１’ａ度を１７５ｍＭとなるよ
う調整し、Ｓａｌ［（宝酒造社製 以下特記しない限り
制限酵素はすべて宝酒造社製を用いた）１０単位を加え
、３７℃３時間消化反応を行った。この反応液から低融
点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）により、Ｎ末
端付近に相当する１６３ｂｐのＤＮＡ断片約０．２μｇ
を得た。
次にｐＳＧ旧の５μｇを２０ｍＭ ）リス−ＨＣｊ！（
ｐＨ７，５＞、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびｌｏＯＩ
ｉＭ Ｎ ａ Ｃ１を含む溶液（以下“Ｙ−１００緩
衝液”と略記する）４ Ｑｕｉｔに溶かし、ＢａｍＨＩ
Ｉ Ｏ単位を加え、３７℃３時間消化反応を行った
。つづいて該反応液のＮａＣ１濃度を１７５ｍＭに調整
し、Ｓａｊ！１）０単位を加え３７℃３時間消化反応を
行った。該反応液からＬＧＴ法により、Ｃ末端側と３′
−非翻訳領域を含む約９００ｂｐのＤＮＡ断片約０．５
μｇを得た。
ｐＨ７，５＞、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびｌｏＯＩ
ｉＭ Ｎ ａ Ｃ１を含む溶液（以下“Ｙ−１００緩
衝液”と略記する）４ Ｑｕｉｔに溶かし、ＢａｍＨＩ
Ｉ Ｏ単位を加え、３７℃３時間消化反応を行った
。つづいて該反応液のＮａＣ１濃度を１７５ｍＭに調整
し、Ｓａｊ！１）０単位を加え３７℃３時間消化反応を
行った。該反応液からＬＧＴ法により、Ｃ末端側と３′
−非翻訳領域を含む約９００ｂｐのＤＮＡ断片約０．５
μｇを得た。
別にｐＧ［！Ｌ１５μｇを４０μｌのＹ−１００緩衝液
に溶かし、ＢａｍＨＩとＨ４ｎｄＩ［［とを各々１０単
位加え、３０℃３時間消化反応を行った。この反応液か
らトリプトファンプロモーターを含む約２．７ＫｂのＤ
ＮＡ断片約１μｇを辱た。
に溶かし、ＢａｍＨＩとＨ４ｎｄＩ［［とを各々１０単
位加え、３０℃３時間消化反応を行った。この反応液か
らトリプトファンプロモーターを含む約２．７ＫｂのＤ
ＮＡ断片約１μｇを辱た。
一方成熟シロザケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発
現に必要な翻訳開始コドンＡＴＣを付加し、さらにベク
ターＤＮＡと上記ＤＮＡとを連結する目的で下記のＤＮ
Ａ！Ｊンカーを合成した。
現に必要な翻訳開始コドンＡＴＣを付加し、さらにベク
ターＤＮＡと上記ＤＮＡとを連結する目的で下記のＤＮ
Ａ！Ｊンカーを合成した。
まず−末鎖Ｄ Ｎ Ａ 、 １７ｍａｒと１２ｍａｒを
通常のトリエステル法（Ｒ，Ｃｒｅａ ら：Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
通常のトリエステル法（Ｒ，Ｃｒｅａ ら：Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、、 ？５．５７６５（１９７８）
３により合成した。
３により合成した。
１７ｍｅｒおよび１２ｍｅｒの一本鎮ＤＮＡ各々１２ｐ
ｍｏｌｅを５０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５
）、１０ｍＭ Ｍ ｇ ＣＩ、。
ｍｏｌｅを５０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５
）、１０ｍＭ Ｍ ｇ ＣＩ、。
１０ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ ＡＴＰを含
む溶液２０μｌに溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（宝酒造社製）６単位を加え、３７℃、６０分間リン
酸化反応を行った。 。
む溶液２０μｌに溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（宝酒造社製）６単位を加え、３７℃、６０分間リン
酸化反応を行った。 。
上記で得たρ５ＧＨ１由来のＭｂｏｌｌ−Ｓａｌｌ断片
（１６３ｂｐ） ｏ、 １ ｐｍｏｌｅ、 Ｓａｌｌ−
ＢａｍＨＩ断片（約９００ｂｐ）０、０６ｐｍｏｌｅ、
ｐＧＢＬｌのＨｉｎｄ ＩＩＩ −ＢａｍＨｌ 断片
（約２．７Ｋｂ） ０．０２ｐｍｏｌｅ を５０ｍＭ
）リス−ＨＣＩｔ （ｐＨ７，５） 。
（１６３ｂｐ） ｏ、 １ ｐｍｏｌｅ、 Ｓａｌｌ−
ＢａｍＨＩ断片（約９００ｂｐ）０、０６ｐｍｏｌｅ、
ｐＧＢＬｌのＨｉｎｄ ＩＩＩ −ＢａｍＨｌ 断片
（約２．７Ｋｂ） ０．０２ｐｍｏｌｅ を５０ｍＭ
）リス−ＨＣＩｔ （ｐＨ７，５） 。
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、 １０ｍＭジチオスレイト
ールおよび１ｍＭＡＴＰを含む溶液３０μｌに溶かし、
これに上記の合成りＮＡ！Ｉン酸化反応液５μβを加え
た。この混合液にＴ４１Ｊガーゼ（宝酒造社製）６単位
を加え、４℃、１８時間結合反応を行った。
ールおよび１ｍＭＡＴＰを含む溶液３０μｌに溶かし、
これに上記の合成りＮＡ！Ｉン酸化反応液５μβを加え
た。この混合液にＴ４１Ｊガーゼ（宝酒造社製）６単位
を加え、４℃、１８時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換しＡｐ
ｌのコロニーを得、このコロニーよりプラスミドＤＮＡ
を回収し、第３図に示したＰＳＧＨＩＢ２を得た。ｐｓ
ＧＨＩＢ２の構造はＥｃｏＲｌ、 ｔｌｉｎｄ ＩＩＩ
、 Ｃ１ａｌ。
ｌのコロニーを得、このコロニーよりプラスミドＤＮＡ
を回収し、第３図に示したＰＳＧＨＩＢ２を得た。ｐｓ
ＧＨＩＢ２の構造はＥｃｏＲｌ、 ｔｌｉｎｄ ＩＩＩ
、 Ｃ１ａｌ。
Ｂｇｌ Ｕ、 Ｓａｌ Ｉ 、 ＢａｍＨＩで切断して
アガロースゲル電気泳動にて確認した。ρＳＧ旧口２中
のシロザケ成長ホルモンをコードするＤＮＡのＮ末端付
近の配列は であることをＭ１３ファージを用いたＳａｎｇｅｒ法［
Ｓａｎｇｅｒ ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、、７４゜５４６３（１
９７７） ； へｍｅｒｓｈａｍ社 Ｍ１３ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ａｎｄ ５ｅｑｕｅｎｃｉｒｕｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ］に従って決定した。その結果ｐＳＧ旧口
２は成熟型シロザケ成長ホルモンポリペプチドをコード
するＤＮＡを含むことがわかった。プラスミドｐｓＧＨ
Ｉ８２を含む大腸菌は［！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉＥＳＧＩ４１８２ （Ｆ［！ＲＭ ｆｉＰ−６１
２） （！：して昭和５９年９月２０日付で工業技術院
微生物工業技術研究所１工研）に寄託されている。
アガロースゲル電気泳動にて確認した。ρＳＧ旧口２中
のシロザケ成長ホルモンをコードするＤＮＡのＮ末端付
近の配列は であることをＭ１３ファージを用いたＳａｎｇｅｒ法［
Ｓａｎｇｅｒ ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、、７４゜５４６３（１
９７７） ； へｍｅｒｓｈａｍ社 Ｍ１３ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ａｎｄ ５ｅｑｕｅｎｃｉｒｕｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ］に従って決定した。その結果ｐＳＧ旧口
２は成熟型シロザケ成長ホルモンポリペプチドをコード
するＤＮＡを含むことがわかった。プラスミドｐｓＧＨ
Ｉ８２を含む大腸菌は［！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉＥＳＧＩ４１８２ （Ｆ［！ＲＭ ｆｉＰ−６１
２） （！：して昭和５９年９月２０日付で工業技術院
微生物工業技術研究所１工研）に寄託されている。
実施例２． ｐｓＧＩＩＩＢ２を含む大腸菌によるシ
ロザケ成長ホルモンポリペプチドの生産： 実施例１で碍た組換え体プラスミドｐｓＧＩＩＩＢ２を
用い常法により大腸菌Ｗ３１）ＯＮ［１４９株を形質転
換した。賜られたＡｐｌコロニーを８ｍｌのＭＣＧ培地
〔０，６％ＮａＪＰＯ，，０，３％Ｋ）１．ＰＯ，、０
，５％ＮａＣ］、 ０．１％Ｎ）１４Ｃ１，０，５％
グルコース、０，５％カザミノ酸、１ｍＭ ＭｇＳＯ
４，４μｇ／ｍｌビタミンＢ ｌ＋ ｐＨ７，２］に接
種し、３０℃で１８時間培養した。、得られた培養液を
８．００Ｏｒｐｍ、 １０分間遠心して菌体を回収し
た。この菌体をＬａｅｍｍｌｉ のサンプルバッファー
に懸濁後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、クマシーブリリアントブルーにて染色して、分子
量約２５．０００の部位にポリペプチドバンドを検出し
た。このバンドは該プラスミドを含まない大腸菌を用い
た場合には： 存在しなかった。この結果、ｐＳＧ）１
）８２を保有する大腸菌はシロザケ成長ホルモンポリペ
プチドを大量に生産していることがわかった。
ロザケ成長ホルモンポリペプチドの生産： 実施例１で碍た組換え体プラスミドｐｓＧＩＩＩＢ２を
用い常法により大腸菌Ｗ３１）ＯＮ［１４９株を形質転
換した。賜られたＡｐｌコロニーを８ｍｌのＭＣＧ培地
〔０，６％ＮａＪＰＯ，，０，３％Ｋ）１．ＰＯ，、０
，５％ＮａＣ］、 ０．１％Ｎ）１４Ｃ１，０，５％
グルコース、０，５％カザミノ酸、１ｍＭ ＭｇＳＯ
４，４μｇ／ｍｌビタミンＢ ｌ＋ ｐＨ７，２］に接
種し、３０℃で１８時間培養した。、得られた培養液を
８．００Ｏｒｐｍ、 １０分間遠心して菌体を回収し
た。この菌体をＬａｅｍｍｌｉ のサンプルバッファー
に懸濁後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、クマシーブリリアントブルーにて染色して、分子
量約２５．０００の部位にポリペプチドバンドを検出し
た。このバンドは該プラスミドを含まない大腸菌を用い
た場合には： 存在しなかった。この結果、ｐＳＧ）１
）８２を保有する大腸菌はシロザケ成長ホルモンポリペ
プチドを大量に生産していることがわかった。
参考例１． （１）シロザケ脳下垂体よりのボ！ＩＡ
”１ｌｌｉ＾の調製； シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネート−セ
シウムクロライド法ＣＭａｎｉａｔｉｓ ら編。
”１ｌｌｉ＾の調製； シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネート−セ
シウムクロライド法ＣＭａｎｉａｔｉｓ ら編。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｐ１９６．
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ刊；重定勝哉、
細胞工学、 ２ 、６１６（１９８３） ］に従いポリ
Ａを有するＲＮＡを下記のごとく調製した。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ刊；重定勝哉、
細胞工学、 ２ 、６１６（１９８３） ］に従いポリ
Ａを有するＲＮＡを下記のごとく調製した。
シロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約３０個体分）を４Ｍグ
アニジウムチオシアネート、０．５％ザルコシン、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７ンおよび０．１ Ｍｇ−
メルカプトエタノールからなる溶液１０ｍ１中でテフロ
ンホモゲナイヂ−（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化した。
アニジウムチオシアネート、０．５％ザルコシン、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７ンおよび０．１ Ｍｇ−
メルカプトエタノールからなる溶液１０ｍ１中でテフロ
ンホモゲナイヂ−（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化した。
このホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤＮＡを
分断した。５．７ＭＣｓＣｆ、Ｏ，１Ｍ ＥＤＴＡ（
ｐＨ８１の溶液各１、２ｍｌを超遠心管中に分注してあ
き、前記ホモジネートを重層した。）ｌｉｔａｃｈｉ
ＲＰ Ｓ ４０ローターにて３５．０００ｒｐｍ 、
１５時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡ
の沈殿を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリス−ＨＣｊ！（
ｐＨ８，０）溶液１０ｍ１に溶解し、フェノール−クロ
ロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収した。得
られたＲＮＡ約１ｍｇを１０ｍＭ）リス−Ｈ（１（ｐｉ
（８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１ｍ
ｌに溶かした。
分断した。５．７ＭＣｓＣｆ、Ｏ，１Ｍ ＥＤＴＡ（
ｐＨ８１の溶液各１、２ｍｌを超遠心管中に分注してあ
き、前記ホモジネートを重層した。）ｌｉｔａｃｈｉ
ＲＰ Ｓ ４０ローターにて３５．０００ｒｐｍ 、
１５時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡ
の沈殿を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリス−ＨＣｊ！（
ｐＨ８，０）溶液１０ｍ１に溶解し、フェノール−クロ
ロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収した。得
られたＲＮＡ約１ｍｇを１０ｍＭ）リス−Ｈ（１（ｐｉ
（８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１ｍ
ｌに溶かした。
６５℃、５分間インキュベートし、０．１ｍｌの５ＭＮ
ａＣＲを加えた。混合物をオリゴｄＴセルロース・カラ
ム（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）り（
１７トグラフイーにかけた。吸着したポリ八を有するｍ
ＲＮＡをｌｏｍＭ）リス−ＨＣｊ！（ｐＨ８，０）およ
びＩｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液で溶出しポＩＪ Ａ
を有するｍＲＮＲＮＡ約１ｍｇた。
ａＣＲを加えた。混合物をオリゴｄＴセルロース・カラ
ム（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）り（
１７トグラフイーにかけた。吸着したポリ八を有するｍ
ＲＮＡをｌｏｍＭ）リス−ＨＣｊ！（ｐＨ８，０）およ
びＩｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液で溶出しポＩＪ Ａ
を有するｍＲＮＲＮＡ約１ｍｇた。
（２） ｃ Ｄ Ｎ Ａ合成と該ＤＮＡのベクターへ
の挿入： Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｃｒｇの方法［Ｍｏｌ、Ｃｅ１）．
Ｂｉｏｌ、、 ２．１６１（１９８２） ）に従い、ｃ
ＤＮＡの合成とそれを組み込んだ組換え体プラスミドの
造成を行った。その工程の概略を第１図に示す。
の挿入： Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｃｒｇの方法［Ｍｏｌ、Ｃｅ１）．
Ｂｉｏｌ、、 ２．１６１（１９８２） ）に従い、ｃ
ＤＮＡの合成とそれを組み込んだ組換え体プラスミドの
造成を行った。その工程の概略を第１図に示す。
ｐＣＤＶ １ ［Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ ：
Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ。
Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ。
Ｒｉａｌ、、 ３．２８０（１９８３） ］ ４００
ｕｇを１０ｍＭトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、
６ｍＭ ＭｇＣＪ！。
ｕｇを１０ｍＭトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、
６ｍＭ ＭｇＣＪ！。
および１０ｍＭ ＮａＣＲからなる溶液３００ｔｔｌ
に加え、さらに５００単位のＫｐｎｌ（宝酒造社製）を
加えて、３７℃、６時間反応させ、プラスミド中のＫｐ
ｎ１部位で切断した。フェノール−クロロホルム抽出後
、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。Ｋｐｎ Ｉ
切断した該ＤＮＡ約２００μｇを４０ｍＭカコジル酸ナ
トリウム、３０ｍＭトリス−ＨＣＲ（ｐＨ６，８）、、
１ｍＭ ＣａＣｊ！２および０．１ ｍ Ｍジチオス
レイトール（以下ＤＴＴと略記する）からなる緩衝液（
以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴＰを０．２５ｍ
Ｍとなるよう加えた溶液２００μ！に加え、さらに８１
単位のターミナルデオキシ又りレオチジルトランスフェ
ラーゼ（以下ＴｄＴと略記する） （Ｐ −Ｌ ＆ｉ
ｏｃｈｅ−ｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃ｌＪ分
間反応させた。ココで、ｐＣＤＶｌのＫｐｎ Ｉ切断部
位の３′末端にポＵｄＴ鎮が約６７個付加された。該溶
液からフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿
により、ポリｄＴ鎮の付加したｐＣＤＶ ｌＤＮＡ約１
００μｇを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｊ！ （ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２゜１０
０ｍＭ ＮａＣ１からなる緩衝液１５０ｔｔｌに加え
、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加え
、３７℃２時間反応させた。該反応物を低融点アガロー
スゲル電気泳動後、約３． Ｉ ＫｂのＤＮＡ断片を回
収し、約６０μｇのボＩＪｄＴＩＮ付加ｐｃＤＶ１を１
等だ。該ＤＮＡを１０ｍＭ）リス−ＨＣｊ！（ｐＨ８，
０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５００μβ
に溶解し、６５℃５分間インキュベート後、氷冷して５
０μ！の５Ｍ ＮａＣ１を加えた。混合物をオリゴｄ
Ａセルロースカラム（コラポラティブリサーチ社製）ク
ロヤトグラフィーにかけた。ポリｄＴ鎮長が充分なもの
はカラムに吸着し、これを１０ｍＭ）リス−ＨＣβ（ｐ
Ｈ８，０）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し
、ポリｄＴ＃ＪＩの付加したｐｃＤｖＩ（以下ベクター
プライマーと略記する）２７μｇを得た。
に加え、さらに５００単位のＫｐｎｌ（宝酒造社製）を
加えて、３７℃、６時間反応させ、プラスミド中のＫｐ
ｎ１部位で切断した。フェノール−クロロホルム抽出後
、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。Ｋｐｎ Ｉ
切断した該ＤＮＡ約２００μｇを４０ｍＭカコジル酸ナ
トリウム、３０ｍＭトリス−ＨＣＲ（ｐＨ６，８）、、
１ｍＭ ＣａＣｊ！２および０．１ ｍ Ｍジチオス
レイトール（以下ＤＴＴと略記する）からなる緩衝液（
以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴＰを０．２５ｍ
Ｍとなるよう加えた溶液２００μ！に加え、さらに８１
単位のターミナルデオキシ又りレオチジルトランスフェ
ラーゼ（以下ＴｄＴと略記する） （Ｐ −Ｌ ＆ｉ
ｏｃｈｅ−ｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃ｌＪ分
間反応させた。ココで、ｐＣＤＶｌのＫｐｎ Ｉ切断部
位の３′末端にポＵｄＴ鎮が約６７個付加された。該溶
液からフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿
により、ポリｄＴ鎮の付加したｐＣＤＶ ｌＤＮＡ約１
００μｇを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｊ！ （ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２゜１０
０ｍＭ ＮａＣ１からなる緩衝液１５０ｔｔｌに加え
、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加え
、３７℃２時間反応させた。該反応物を低融点アガロー
スゲル電気泳動後、約３． Ｉ ＫｂのＤＮＡ断片を回
収し、約６０μｇのボＩＪｄＴＩＮ付加ｐｃＤＶ１を１
等だ。該ＤＮＡを１０ｍＭ）リス−ＨＣｊ！（ｐＨ８，
０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５００μβ
に溶解し、６５℃５分間インキュベート後、氷冷して５
０μ！の５Ｍ ＮａＣ１を加えた。混合物をオリゴｄ
Ａセルロースカラム（コラポラティブリサーチ社製）ク
ロヤトグラフィーにかけた。ポリｄＴ鎮長が充分なもの
はカラムに吸着し、これを１０ｍＭ）リス−ＨＣβ（ｐ
Ｈ８，０）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し
、ポリｄＴ＃ＪＩの付加したｐｃＤｖＩ（以下ベクター
プライマーと略記する）２７μｇを得た。
次にリンカ−ＤＮＡの調製を行なう。
ｐ Ｌ １ ［Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ ：
Ｍｏｌ、 Ｃａ１ｌ、Ｂｉｏｌ、。
Ｍｏｌ、 Ｃａ１ｌ、Ｂｉｏｌ、。
３、 ２８０（１９８３）］約１４ｐｇをｌＯｍＭ）リ
ス−Ｈ（、ｊ’ （ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣ１
，および５０ｍＭ ＮａＣｊ！からなる緩衝液２００
μｊ！に加え、さらに５０単位のＰｓｔｌ（宝酒造社製
）を加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰ
ｓｔ）部位で切断させた。該反応物をフェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、Ｐｓ（１で切
断したＩ）ＬＩＤＮＡ約１３μｇを回収した。該ＤＮＡ
約１３μｇをＴｄＴ緩（ｌｒ液に終濃度０．２５ｍＭの
ｄＧＴＰを含む溶液５０μβに加え、さらにＴ ｄ Ｔ
（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｃ＋＋＋１ｃａｌｓ社製）５４
単位を加えて３７℃１３分間インキコベートし、ｐＬｌ
のＰｓｔｌ切断部位３′末端にｄＧ鎖を約１４個付加し
た。フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿に
てＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１００ ＪＪ ＲのＩ
ＯｍＭ）リス−Ｈ（１（ｐ）１７．５）、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ１．および６０ｍＭＮａ（ｌからなる緩衝液１０
０μｌに加え、さらに８０単位のＨ＋ｎｄ［［（宝酒造
社製）を加えて３７℃３時間インキュベートし、ｐＬ
Ｉ ＤＮＡのＨｉｎｄｌｎ部位で切断した。該反応物を
アガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５ Ｋ ｂ
のＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法ＣＤｒｅｔｚｅｎら
、＾ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １）２．２９５（
１９８１） ）にて回収し、オリゴｄＧ鎮付きのリンカ
−ＤＮＡ （以下単にリンカ−ＤＮＡと略記する）を得
た。
ス−Ｈ（、ｊ’ （ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣ１
，および５０ｍＭ ＮａＣｊ！からなる緩衝液２００
μｊ！に加え、さらに５０単位のＰｓｔｌ（宝酒造社製
）を加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰ
ｓｔ）部位で切断させた。該反応物をフェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、Ｐｓ（１で切
断したＩ）ＬＩＤＮＡ約１３μｇを回収した。該ＤＮＡ
約１３μｇをＴｄＴ緩（ｌｒ液に終濃度０．２５ｍＭの
ｄＧＴＰを含む溶液５０μβに加え、さらにＴ ｄ Ｔ
（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｃ＋＋＋１ｃａｌｓ社製）５４
単位を加えて３７℃１３分間インキコベートし、ｐＬｌ
のＰｓｔｌ切断部位３′末端にｄＧ鎖を約１４個付加し
た。フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿に
てＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１００ ＪＪ ＲのＩ
ＯｍＭ）リス−Ｈ（１（ｐ）１７．５）、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ１．および６０ｍＭＮａ（ｌからなる緩衝液１０
０μｌに加え、さらに８０単位のＨ＋ｎｄ［［（宝酒造
社製）を加えて３７℃３時間インキュベートし、ｐＬ
Ｉ ＤＮＡのＨｉｎｄｌｎ部位で切断した。該反応物を
アガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５ Ｋ ｂ
のＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法ＣＤｒｅｔｚｅｎら
、＾ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １）２．２９５（
１９８１） ）にて回収し、オリゴｄＧ鎮付きのリンカ
−ＤＮＡ （以下単にリンカ−ＤＮＡと略記する）を得
た。
上記で調製したポＩＪ（Ａ）ＲＮＡ約２μｇ１ベクター
プライマー約１．４μｇを５０ｍＭ）リス−ＨＣｆ （
ｐＨ８，３） 、８ｍＭ ＭｇＣ１＊ 、３０ｍＭ
Ｋ（１，０，３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ （
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ａＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および
ｌＯ単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液２２，
３μｌに溶解し、ｌＯ単位の逆転写酵素（生化学工業社
製）を加え、３７℃４０分間インキコベートし、ｍＲＮ
Ａに相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、ＲＮ
Ａ−ＤＮＡ二重二重材加したベクタープライマーＤＮＡ
を回収した。該ＤＮＡを６６μＭｄＣＴＰおよび０，２
μｇポ’ＪＡを含むＴｄＴ緩衡緩衝０μｌに溶かし、１
４単位のＴ ｄ Ｔ （Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社製）を加えて３７℃８分間インキニベートし
、ｃ ＤＮＡ３′末端に１２個のｄＣ鎖を付加した。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール
沈殿によりｄＣ鎮の付加したｃＤＮＡ−ベクタープライ
マーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡをトリス−ＨＣｌ （
ｐＨ７，５）、８ｍＭ ＭｇＣ１，ｂよび６０ｍＭ
ＮａＣｊ！からなる液４００ｐｌに溶かし、２０単位
のＨｉｎｄＩ［［（宝酒造社製）を加え、３７℃２時間
インキュベートし、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ部位で切断した。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
殿して０．５ ｐｍｏｌｅのｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ−ベク
タープライマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ０．０８ ｐｍ
ｏＩｅおよび前記のリンカ−ＤＮＡ０．１６ ｐｍｏｌ
ｅを４０μｌのトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、０
．ＩＭ ＮａＣ１および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる
溶液４０μβに加え、６５℃、４２℃、０℃でそれぞれ
１０分、２５分。
プライマー約１．４μｇを５０ｍＭ）リス−ＨＣｆ （
ｐＨ８，３） 、８ｍＭ ＭｇＣ１＊ 、３０ｍＭ
Ｋ（１，０，３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ （
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ａＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および
ｌＯ単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液２２，
３μｌに溶解し、ｌＯ単位の逆転写酵素（生化学工業社
製）を加え、３７℃４０分間インキコベートし、ｍＲＮ
Ａに相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、ＲＮ
Ａ−ＤＮＡ二重二重材加したベクタープライマーＤＮＡ
を回収した。該ＤＮＡを６６μＭｄＣＴＰおよび０，２
μｇポ’ＪＡを含むＴｄＴ緩衡緩衝０μｌに溶かし、１
４単位のＴ ｄ Ｔ （Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社製）を加えて３７℃８分間インキニベートし
、ｃ ＤＮＡ３′末端に１２個のｄＣ鎖を付加した。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール
沈殿によりｄＣ鎮の付加したｃＤＮＡ−ベクタープライ
マーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡをトリス−ＨＣｌ （
ｐＨ７，５）、８ｍＭ ＭｇＣ１，ｂよび６０ｍＭ
ＮａＣｊ！からなる液４００ｐｌに溶かし、２０単位
のＨｉｎｄＩ［［（宝酒造社製）を加え、３７℃２時間
インキュベートし、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ部位で切断した。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
殿して０．５ ｐｍｏｌｅのｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ−ベク
タープライマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ０．０８ ｐｍ
ｏＩｅおよび前記のリンカ−ＤＮＡ０．１６ ｐｍｏｌ
ｅを４０μｌのトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、０
．ＩＭ ＮａＣ１および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる
溶液４０μβに加え、６５℃、４２℃、０℃でそれぞれ
１０分、２５分。
３０分間インキコベートした。２０ｍＭ）リス−ＨＣ４
（ｐ Ｈ７，５）、 ４ｍＭ Ｍｇ ＣＩｔ−、ＩＯ
ＩＩＩＭ （ＮＨ−）２Ｓ口、。
（ｐ Ｈ７，５）、 ４ｍＭ Ｍｇ ＣＩｔ−、ＩＯ
ＩＩＩＭ （ＮＨ−）２Ｓ口、。
０．１Ｍ Ｋ（ｌおよびＯ，ｌ ｍ Ｍｇ−ＮＡＤの
組成で、全量４００μｍとなるよう反応液を調製した。
組成で、全量４００μｍとなるよう反応液を調製した。
該反応液に１０単位の大腸菌ＤＮＡＵガーゼ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え、１）℃
−夜インキユベートした。該反応液を各４０μＭのｄＮ
ＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤとなるよう成分を追加調
製し、５単位の大腸菌ＤＮＡＩＪガーゼ、７単位の大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ社製）および２単位の大腸菌リボヌクレアー
ゼＨ（Ｐ−Ｌ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳ社製）を加え
、１２℃、２５℃で順次１時間ずつインキュベートした
。
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え、１）℃
−夜インキユベートした。該反応液を各４０μＭのｄＮ
ＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤとなるよう成分を追加調
製し、５単位の大腸菌ＤＮＡＩＪガーゼ、７単位の大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ社製）および２単位の大腸菌リボヌクレアー
ゼＨ（Ｐ−Ｌ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳ社製）を加え
、１２℃、２５℃で順次１時間ずつインキュベートした
。
上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、
ＲＮＡ−ＤＮ八へ重鎮のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換され
、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプラスミドが生成した。
ＲＮＡ−ＤＮ八へ重鎮のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換され
、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプラスミドが生成した。
（３） シロザケ成長ホルモンｃＤＮＡを含む組換え
ＤＮＡの選択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌ｃ６
００ｓＦ８ 株ＣＣａｍｅｒｏｎ：Ｐｒｏｃ、 ｔｌ
ｌａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＤＮＡの選択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌ｃ６
００ｓＦ８ 株ＣＣａｍｅｒｏｎ：Ｐｒｏｃ、 ｔｌ
ｌａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
υＳＡ、ユ、３４１６（１９７５） ］を５ｃｏｔｔ
らの方法〔重定得哉：細胞工学、 ２，６１６（１９８
３） ）に従い形質転換した。得られた約１万個のコロ
ニーのうち４８００（Ｉｎニトロセルロース上に固定し
た。シロザケ成長ホルモンのＮ末端から２３番目−２８
番目のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡ、すなわち（
３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴまたは０．１２
番目はＣまたはＴ、１５番目はＣまたはＴであり、組み
合わせて１６通りの合成りＮＡの混合物となる）を３２
ｐで標識したプローブに４０℃で強く会合した８菌株を
選んだ［Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ。
らの方法〔重定得哉：細胞工学、 ２，６１６（１９８
３） ）に従い形質転換した。得られた約１万個のコロ
ニーのうち４８００（Ｉｎニトロセルロース上に固定し
た。シロザケ成長ホルモンのＮ末端から２３番目−２８
番目のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡ、すなわち（
３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴまたは０．１２
番目はＣまたはＴ、１５番目はＣまたはＴであり、組み
合わせて１６通りの合成りＮＡの混合物となる）を３２
ｐで標識したプローブに４０℃で強く会合した８菌株を
選んだ［Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ。
７２．３９６Ｈ１９７５） ）。得られた８菌株につい
て５ｏｕｔｈｅｒｎの方法ＣＪ１Ｍｏｌ、Ｂｉｏ＋、、
９８．５０３＜１９７５） ）により、上記プローブお
よびＣ末端付近のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡプ
ローブ （し） （３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまたはＧ、９
番目はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、１２番目はＧまたは
Ａであり、組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物
となる）とも会合が５１）認された。これらのプラスミ
ドはｐｓＧＨｌ、３，６，８゜９、１０．１４．１７と
命名したが、いずれも、シロザケ成長ホルモンのアミノ
酸配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長
ホルモンｃＤＮＡを含んでいるものと考えられた。
て５ｏｕｔｈｅｒｎの方法ＣＪ１Ｍｏｌ、Ｂｉｏ＋、、
９８．５０３＜１９７５） ）により、上記プローブお
よびＣ末端付近のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡプ
ローブ （し） （３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまたはＧ、９
番目はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、１２番目はＧまたは
Ａであり、組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物
となる）とも会合が５１）認された。これらのプラスミ
ドはｐｓＧＨｌ、３，６，８゜９、１０．１４．１７と
命名したが、いずれも、シロザケ成長ホルモンのアミノ
酸配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長
ホルモンｃＤＮＡを含んでいるものと考えられた。
（４）該プラスミドｐＳＧＨ１の塩基配列：上記で辱ら
れたプラスミド８種につき、種々の制限酵素で消化し、
ｃＤＮＡ部分の切断地図を決定した。制限酵素部位の存
在位置から、得られたプラスミドは３群に分類でき、ｐ
ｓＧ４１）．６．９．１０゜１７の群、ｐｓＧＩ（３の
群、ｐｓＧＨ８、１４の群と分けられた。それぞれの群
の制限酵素地図を第２図に示す。
れたプラスミド８種につき、種々の制限酵素で消化し、
ｃＤＮＡ部分の切断地図を決定した。制限酵素部位の存
在位置から、得られたプラスミドは３群に分類でき、ｐ
ｓＧ４１）．６．９．１０゜１７の群、ｐｓＧＩ（３の
群、ｐｓＧＨ８、１４の群と分けられた。それぞれの群
の制限酵素地図を第２図に示す。
次に実施例３で行った合成りＮＡプローブと最も強い会
合を示し、かつほぼ完全長のｃＯＮ＾を含むと考えられ
るｐＳＧＨ１を含む群のプラスミド、特にｐＳＧＨ１に
ついて、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１３フ
ァージを用いた３ａｎｇｅｔ法［Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ、５ｃｉ９． ＵＳＡ
、７４． ５４６３ （１９７？）＝Ａｍｅｒｓｈａｍ
社 Ｍ １３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇｈａｎｄｂＯｏｋ ）に従って決定した。配列
を第」表に示す。第１表中、塩基数１−６６がシグナル
ペプチドを、６７−６３０がシロザケ成長ホルモンの成
熟ペプチドをコードする。ｐｓＧｌ（１に含まれるｃＤ
ＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は、シロザケ成長
ホルモンペプチドから決定されているＮ末端付近および
Ｃ末端付近のアミノ酸配列と完全に一致し、該ｃＤＮ＾
はシロザケ成長ホルモンをコードしていることが確認さ
れた。ｐＳＧＨ１、ｐＳＧＨ３。
合を示し、かつほぼ完全長のｃＯＮ＾を含むと考えられ
るｐＳＧＨ１を含む群のプラスミド、特にｐＳＧＨ１に
ついて、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１３フ
ァージを用いた３ａｎｇｅｔ法［Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ、５ｃｉ９． ＵＳＡ
、７４． ５４６３ （１９７？）＝Ａｍｅｒｓｈａｍ
社 Ｍ １３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇｈａｎｄｂＯｏｋ ）に従って決定した。配列
を第」表に示す。第１表中、塩基数１−６６がシグナル
ペプチドを、６７−６３０がシロザケ成長ホルモンの成
熟ペプチドをコードする。ｐｓＧｌ（１に含まれるｃＤ
ＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は、シロザケ成長
ホルモンペプチドから決定されているＮ末端付近および
Ｃ末端付近のアミノ酸配列と完全に一致し、該ｃＤＮ＾
はシロザケ成長ホルモンをコードしていることが確認さ
れた。ｐＳＧＨ１、ｐＳＧＨ３。
ｐｓＧＨ８を含む大腸菌（それぞれＩＩ！ＳＧＨｌ 、
ＢＳＧ）ｌ ３゜ＥＳＧＨ８）は昭和５９年６月２３
日付で、ＦＥＲＭ ０Ｐ−５５１゜５５２および５５３
として微工研に寄託されている。
ＢＳＧ）ｌ ３゜ＥＳＧＨ８）は昭和５９年６月２３
日付で、ＦＥＲＭ ０Ｐ−５５１゜５５２および５５３
として微工研に寄託されている。
−Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ ＣＵｎｉｖｅｒｓａｌコ
Ｍ Ｉ ＡＡｒｇＬｙｓＳｅｒＬｅｕＧｌｕ
＾ＩａＡｓｎＣｙｓＩｈｒＬｅｕ＊＋１％発明の効果 本発明によれば、魚類の成長ホルモンポリペプチドを微
生物を用いて大量に生産することができる。
Ｍ Ｉ ＡＡｒｇＬｙｓＳｅｒＬｅｕＧｌｕ
＾ＩａＡｓｎＣｙｓＩｈｒＬｅｕ＊＋１％発明の効果 本発明によれば、魚類の成長ホルモンポリペプチドを微
生物を用いて大量に生産することができる。
第１図はロｋａｙａｒＩｌａ−Ｂｅｒｇ法によるｃＤＮ
八合へと、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成過
程の概略を示す。 第２図はｐｓＧＨ１、ｐＳＧＨ３、ｐｓＧＨ８に含まれ
るｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第３図はプラスミドｐＳＧ）ｌＩ８２の造成過程を示す
。 ρ５ＧＨＩおよびｐＳＧ）１）８２におけるＭｂｏ １
）部位は多数存在するが、プラスミド造成上必要な部位
のみ示した。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社図 べ゛クデーブ）イＺ−ＤＮＡ
、、ＲＮＡ以Ｌ＝＝＝＝＝＝ 手続補正書（方式） 昭和６０年２月２２日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２１３３６１号 ２、発明の名称 魚類の成長ホルモンポリペプチド ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称（１０
２）協和醗酵工業株式会社 昭和６０年１月９日（発送日：同６０年１月２９日）５
、補正の対象 明細書全文 明 細 書 １、発明の名称 魚類の成長ホルモンポリペプチド ２、特許請求の範囲 （１）第１表に示したペプチド配列を有する魚類の成長
ホルモンポリペプチド。 （２）魚類の成長ホルモンがニシン類（Ｃｌｕｐｅｉｆ
ｏｒｍｅｓ）の成長ホルモンである特許請求の範囲第１
項のポリペプチド。 （３） 魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードす
るＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物を栄
養培地に培養し、該培養物中に魚類の成長ホルモンポリ
ペプチドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを
採取することを特徴とする魚類の成長ホルモンポリペプ
チドの製造法。 （４）該ポリペプチドが第１表に示したペプチド配列を
有する特許請求の範囲第３項の製造法。 ３、発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチドおよび該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａを含む微生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドの製造法に関する。魚類の成長ホルモンは魚類の養殖
産業分野にふいて広い用途が期待される。 従来の技術 哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産されるが
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、ニー・ジェイ・レビイス
（Ｕ、 Ｊ、 Ｌｅｗｉｓ）らによってジャーナル・オ
プ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、＾ｒｎ
、Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、）、 ８０．４４２９（１９
５８）に、エイ・ニス＋１バートリー（＾、 Ｓ、 Ｈ
ａｒｔｒｅｅ）によってバイオケミカル・ジャーナル（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ＞。 且０ 、７５４（１９６６） に、シー・エイチ・シ
ー（Ｃ，Ｈ。 Ｌｉ）らによってアーチブス・オプ・バイオケミストシ
イ・アンド・バイオフィジクス、アクタ。 （サブルメント） （Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ（ＳｕｐＨ１，） ） 、
ユ、３２７ （１９６２）に報告されている。 魚類の成長ホルモンについても、これまでに単離された
という報告は多く見られるが、その生理活性と蛋白化学
的な性質で信頼性のあるものは数が少ない。信頼性のあ
る報告の例には次のようなものがある。 ティラビアよりの単離例ニス・ダブリュ・ファーマー（
Ｓ、Ｗ、Ｆａｒｍｅｒ）ら、ジェネラル−７７）’ ・
コンパラティプ・エンドクリノロシイ （Ｇｅｎ、 Ｃ
ｏｍｐ。 Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、）、 ３０．９Ｈ１９７６）。 チョウザメよりの単離例ニス・グブリュ・ファー？ −
（Ｓ、 ＩＩ、 Ｆａｒｍｅｒ）ら、エンドクリノロシ
イ（［ｊｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、 −≦１０８
． ３７７（２９８２ン。 コイよりの単離例エイ・エフ・クック（＾、Ｆ。 Ｃｏｏｋ ）ら、ジェネラル・アン１゛・コンパラティ
ブ・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ、Ｃａｍｐ、 Ｂｎ
ｄｏｒｃｒｉｎ、） 。 邸、 ３３５．（１９８３）。 本発明者らは先にサケ脳下垂体から成長ホルモンを抽出
、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列（３１個）の決定
を行った。また、この物質が硬骨魚類において成長促進
効果を有することも確認しているＣ特願昭５９−６８６
７０）。 発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳下
垂体からの採取は供給量が限られている。従って魚類の
成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望ま
れている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技法により魚類の成長ホル
モンを製造する方法について研究を行った。その結果光
に、魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、
魚類の成長ホルモンポリペプチドに相補的なりＮＡの採
取ならびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製
造に成功した。 即ちサケ脳下垂体からメツセンジャーＲＮ Ａ （＋ｎ
ＲＮＡ）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ （ｃＤ
ＮＡ）を合成し、次いでサケの成長ホルモンのＮ末端付
近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを合成し、
このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを選択するこ
とにより、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン化するこ
とに成功した。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配列を決定
した（特願昭５９−１３４５３６）。 本発明者らは、さらに研究を進め、サケの成長ホルモン
をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む
微生物を培養することにより、培養物中にサケ成長ホル
モンポリペプチドが著量生成蓄積することを見出した。 以下本発明の詳細な説明する。 本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、とくに第
１表に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごとく製造することができる。 即ち、魚類成長ホルモンのｍＲＮＡを鋳型きして用いて
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し
、該ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製す
る。さらに、繊組換え体プラスミドを宿主微生物に挿入
する。繊組換え体プラスミドを有する微生物を培養する
ことによりサケ成長ホルモンポリペプチドを安価に大量
に製造することができる。 本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。 シロサケ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴ
ｄＴセルｏ−ス（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポリＡ）
を有するＲＮＡ （ポリΔ″″ＲＮＡ）を分離する。 このポリＡ″ＲＮＡ を鋳型とし、逆転写酵素により二
重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ組換
え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡのようなベク
ターＤＮＡに談合成りＮＡを挿入して得られる。シロサ
ケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを有する
組換え体プラスミドを選択する。 次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。 捕獲されたシロサケより脳下垂体を摘出し、即座に液体
窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウム
・イソチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｕｍｉｓｏｔｈ
ｉｏｃｙａｎａｔｅ）を加え破砕し、可溶化する。次い
でＣ５Ｃｊ！溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物とし全
細胞質ＲＮＡを得る。またグアニジウム・インチオシア
ネート可溶化物にＬｉＣｊ＋を加えてＲＮＡのみを沈殿
させ回収することもできる。 抽出したＲＮＡをＮａＣｊ！またはＫＣｊ！の高塩濃度
（たとえば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、オリゴ（ｄＴ
）セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有するｍ
ＲＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）リスーＨ
ＣＪＭ衡液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポ！
Ｉ （Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。 以下、オカヤマ・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
）の方法〔オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
＆ Ｂｅｒｇ）；モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジイ（Ｍｏｌ、 Ｃｅ１）．Ｂｉｏｌ、） ２
．１６０１９８２））に従い、ｃＤＮＡの合成および、
そのベクターへの組み込みを行う。 まずベクタープライマーを合成する。ベクターとしては
たとえばｐＣＤＶｌを適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ
ＣＩＨ衝液（たとえばｐＨ１，５゜１０ｍＭ）、 Ｍ
ｇ ＣＲｘ＜たとえば６ｍＭ）、ＮａＣｆ（たとえば
ｌＯｍＭ）を含む溶液中で Ｋｐｎ Ｉで処理し、ｐＣ
ＤＶｌのＫｐｎ Ｉ部位を切断する。 このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ６，
８，３Ｏｎ＋Ｍ）、 カコジル酸ナトリウム（たとえ
ば１４０ｍＭ）、ＣｏＣ１ｘ（たとえば１ｍＭ）、ジチ
オスレイトール（たとえば０．１ｍＭ）右よびｄＴＴＰ
（たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼとともに一定温度（た
とえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間）インキ
ュベートし、ベクターＤＮＡの両３′末端に６０個前後
のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡをトリス
−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍＭ） 、
ＭｇＣ１ｘ （たとえば６ｍＭ） 、 ＮａＣ１（たと
えば１００ｍＭを含む溶液中ＥＣ０ＲＩで切断後、低融
点アガロースゲル電気泳動〔ラルス・ライスラング−（
Ｌａｒｓ Ｗｉｅｓ−Ｉａｎｄｅｒ ） ： アナリテ
ィカル・バイオケミストリイ（＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、 ９８，３０５（１９７
９））にて分画し、約３．１キロベースの断片を回収す
る。 次いで該ＤＮＡをＮａＣ１またはＫＣＩの高塩濃度（た
とえば０．５Ｍ）溶液に溶解し、ポ！Ｉ （ｄＡ）セル
ロースカラムに通塔してポリ（Ｔ）を有するベクタープ
ライマー分子のみをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ
）リスーＨＣｊ！＄１衝液のような低塩濃度溶液を用い
て溶出し、ポリ（Ｔ）の付加したベクタープライマー分
子のみを単離する。 次にリンカ−ＤＮＡを合成する。たとえばｐＬＩＤＮＡ
を適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，１０ｍＭ＞、ＭｇＣｊ！２（たとえば６
ｍＭ）、ＮａＣ１（たとえば５０＋ｎＭ）を含む溶液中
でｐｓｔｌで処理し、ｐＬｌのＰｓｔｒ部位を切断する
。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰを加える
以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処理し、
１５１前後のオリゴｄＧ鎖を付加する。該ＤＮＡを適当
な溶液たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ７
、５、１０ｍ Ｍ ） 、 Ｍ ｇ Ｃ１ｚ （たとえ
ば６ｍＭ）。 ＮａＣｊ＋（たとえば６０ｍＭ−）を含む溶液中Ｈｉｎ
ｄＩＩＩにて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約
０．５キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペー
パーにて回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを得
る。 以上のようにして得たポリ （Ａ）”ＲＮＡ、ベクター
プライマー、リンカ−ＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行
う。ポリ （Ａ）ゝＲＮＡ 、ベクタープライマーＤＮ
Ａをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，５０
ｍＭ）、ＭｇＣ１，（たとえば８ｍＭ）、ＫＣｌ（たと
えば３０ｍＭ＞、ジチオスレイトール（たとえば０．３
ｍＭ＞、ｄＡＴＰ。 ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣ；ＴＰ （たとえば各々２ｍ
Ｍ）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３
７℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こ
うして得たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮の３′末端に、ｄＴＴ
ＰがｄＣＴＰに変わる以外はベクタープライマーにｄＴ
鎮を付加した条件と同様の操作でオリゴｄ（ＪＪＩを１
５個前後付加する。 このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液〈たとえばｐＨ７，
５，１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２＜たとえば６ ｍＭ） 。 ＮａＣ１（たとえば６０ｍＭ＞を含む溶液中Ｈｉｎｄｎ
ｌで切断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカ−Ｄ
ＮＡを混合し、トリス−ＨｃＩ１）１衡液（たとえばｐ
Ｈ７，５，２０ｍＭ）、ＭｇＣｊ！ｚ（たとえば４ｍＭ
）、（ＮＨ，）ｉｓｏ＜ （たとえば１０ｍＭ）、ＫＣ
Ｉ （たとえば０．１Ｍ）、β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ）（たとえば０．１ｍＭ
）を含む溶液中、大腸ｍＤＮＡリガーゼとともに一定時
間（たとえば１６時間）、一定温度（たとえば１２℃）
でインキュベートする。こうしてｃＤＮＡとリンカ−Ｄ
ＮＡとの環状化が行われる。この反応液にｄＡＴＰ、ｄ
ＴＴＰ。 ｒｉＧＴＰ、ｄｃＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよ
う加え、大腸菌Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ、大ｇ１菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ１）人ｖｋ菌リボヌクレアーゼＨを加え
、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換することにより、完全な二
重鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを得る。 こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を、たとえばスコツ） （Ｓｃ
ｏｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学２、６１６＜１
９８３） ）により形質転換する。上記で得た組換え体
プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝子が存在するた
め、形質転換した大腸菌はアンピシリン耐性を示す。以
下の手法はこれらアンピシリン耐性（Ａ ｐ”）菌株か
ら魚類の成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を
持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを保有する菌株を選
択するのに一般的に用いられる。すなわち、上記で得ら
れた形質転換株をニトロセルロースフィルター上に固定
し、既知のシロサケ成長ホルモンのアミノ酸配列より予
想されるＤＮＡ配列を有する合成りＮＡプローブと会合
させ、強く会合するものを選択する〔グルンステインー
ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方
法、プロシーディング・オプ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、）、 ＵＳＡ、、 ７２．３９６１（１
９７５）］。 プローブＤＮＡは通常のトリエステル法〔ジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、Ａｍ
、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、）、９７，７３２？ （１
９７５） ）で合成される。合成りＮＡプローブによる
選択はサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ）らの方法〔ジャ
ーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジイ（ＪｌＭｏ
ｌ、 Ｒｉ吐）９８゜５０３ （１９７５））によって
さらに確実にでき、この方法でシロサケ成長ホルモンｍ
ＲＮＡに相補性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミ
ドＤＮＡを同定できる。 このようにして得られる組換え体プラスミドの１例がｐ
ｓＧＨｌ （特願昭５９−１３４５３６）である。この
プラスミドをサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの供
給源として用いることができる。 微生物中でのサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発
現によるサケ成長ホルモンポリペプチドの生産： サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
から該ＤＮＡを切り出し、これをベクターＤＮＡに組み
込み、得られる組換え体ＤＮＡを微生物に導入し、得ら
れる形質転換体を培養することによってサケ成長ホルモ
ンポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、これを採取
することによってサケ成長ホルモンポリペプチドを製造
することができる。 サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
としては、上記ｐｓＧＨＩが好適な例としてあげられる
。 ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤＮＡを微生物中で
発現させることができるものなら、いかなるものでも用
いることができる。好ましくは、適当なプロモーター、
たとえばトリプトファン（ｔｒｐ）系、ラクトース（Ｉ
ａｃ）系、ＰＬ系などのプロモーターを持ち、その下流
にＤＮＡを挿入でき、しかも内在するシャインダルガー
ノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と翻訳開始コドン（
ＡＴＧ）との間を適当な距離たとえば６〜１８塩基対に
調節したベクターＤＮＡが用いられる。具体的に好適な
ベクターＤＮＡとしては、プラスミドｐＧＥＬ１をあげ
ることができる。ｐＧＥＬｌは第３図に示すプラスミド
で、それを含む大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ ＩＧＥＬＩ （ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９）とし
て昭和５９年１０月６日付で工業技術院微生物工業技術
研究所（機工ｇＦ）に寄託されている。ポリペプチドを
コードするＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換えは、制限
酵素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ ４ ＤＮＡ ’）
ガーゼを用いて結合する一般的組換えＤＮＡ手法を用い
て行うことができる。 具体例として示したρ５ＧＩ（］とＩ］Ｇ［ｉＬ Ｉの
場合は第３図に示したごと＜ 、ｐＳＧ）１）からシロ
ザケ成長ホルモンをコードするＭｂ ｏ ｌｌ−３ａｌ
Ｉ消化断片と、Ｓａｌ ｉ Ｂａｍｔｌ ＋消化断片
とを別々に得、ｐＧ［ｉＬ ｌからはトリプトファンプ
ロモーターを含む旧ｎｄ［ｌ−ＢａｍＨＩ消化断片を得
る。一方、以下のような合成りＮＡリンカ−を作製する
。 上記ＤＮＡ断片と合成りＮＡ リンカ−とをＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼで結合し、第３図に示した組換えプラスミド
ｐｓＧＨＩＢ ２を得る。本プラスミドは成熟ンロザケ
成長ホルモンをコードする。 上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。 ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１〜２０
μｇのＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のトリス−ＨＣｊ！（ｐＨ６，０〜９．５好まし
くはｐ Ｈ７，０〜８．０）、０〜２００ｍＭのＮａＣ
１，２〜３０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ＞のＭｇＣ
ｌ２を含む反応液中で、制限酵素０．１〜１００単位（
好ましくは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位）を用い
、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により異な
る）において、１５分間〜２４時間行う。反応の停止は
、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱することによ
るが、フェノールまたはジエチルピロカーボネートなど
の試薬により制限酵素を失活させる方法も用いることが
できる。 制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、低融
点アガロースゲル電気泳動法〔エル・ライスラング−（
１，１ｌｉｅＳ１ａｎｄｅｒ） ：アナリティカル・バ
イオケミストリイ（＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）９８ 、３０５（１９７９）以下ＬＧ
Ｔ法という〕やポリアクリルアミドゲル電気泳動法など
によって行う。 ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のトリス−ＨＣＩ（ｐＨ６，１〜９．
５、好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、２−２２−２
Ｏ好ましくは５〜ＩＱｍＭ）のＭｇＣ１ｚ 、０．１−
１０ｍＭ （好ましくは０．５〜２、０ ｍ Ｍ ）の
ＡＴＰ、１〜５０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍＭ）の
ジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ０．３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは
３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２
０時間）行う。 結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりＣｏｈｅｎらの形質転換法〔ニスーエヌｅコ
ーエン（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ ）らニブロン−ディング
・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ｘ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、
） 。 ＵＳＡ ６９．２１）０（１９７２，）） ニよって、
大腸菌に導入する。 組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはバー
ンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ）らの方法〔エイチ・シ
ー・バーンボイム（Ｈ９Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ）ら：
ユニクレイック・アシγズ・リサーチ（Ｎｕ −ｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｃｌｓ Ｒｅｓ、 ）ユ、 １５２３（１
９７９＞）などを用いて行う。 プラスミドＤＮＡを１−１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。 さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある時はマキ
サム・ギルバード法〔プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）、 ７４
． ５６ｊ（１９７７） ］またはＭ１３ファージを用
いたサンガー（Ｓへｎｇｅｒ ）法〔サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ ）らプロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミイ・オブ・サイｘンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、）。 ７４、５４６３（１９７７）； アマ−ジャム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ ）社Ｍ１３クローニング・アンド噛シーク
エンンング・ハンドブック（ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
５ｅｑｕｅｎｃ＋ｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ））によって
決定する。 以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。 本発明のンロデケ成長ホルモンペプチドは以下のとおり
に製造できる。 すなわち、プラスミド（例えばρ５Ｇ）ｌＩ［］２）を
用いて大ｎｍＫ−１２ＨＢＩＯＩを形質転換サセ、アン
ピシリン耐性（ＡｐＲ以下同じ）のコロニーの中からｐ
ｓＧＨＩ８２を有する大腸菌を選びだす。ρ５ＧＨＩ８
２を有する大腸菌を培地に培養することにより培養物中
にシロサケ成長ホルモンポリペプチドを生成させること
ができる。 ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにサケ成
長ホルモンポリペプチドの生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。 炭素源としては、グルコース、フラクトース。 ラクトース、グリセロール、マンニトール、ソルビトー
ルなどが、窒素源としては、ＮＨ４ＣＡ。 （ＮＨ４）２ｓｏ＜ 、カザミノ酸、酵母エキス、ポリ
ペプトン、肉エキス、バクトドリプトン、コーン・ステ
イープリカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ２Ｈ
ＰＯ４、ＫＨｚＰＣＬ 、Ｎａ（１゜Ｍｇ５ｏ４．ビタ
ミンＢ＋、ＭｇＣβ２などが使用できる。 培養はｐ Ｈ５，５〜８，５．温度１８〜４０℃で通気
攪拌培養により行われる。 培養５〜９０時間で培養菌体中にシロサケ成長ホルモン
ポリペプチドが蓄積するので、培養物から菌体を集菌し
、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰り返して菌
体を破砕し、遠心してえられる上清から通常のポリペプ
チドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。 また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レムリ（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ）のサンプルバッファー〔レムリ（Ｌａｅ
ｍｍ ｌ ｉ） 、ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）、２
２７ 、６８０（１９７０））に加熱溶解後、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル〔レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の
方法：同上文献〕にかけ、クマシーブリリアントブルー
染色によって行う。 実施例１．成熟シロサケ成長ホルモンをコードする組換
え体プラスミドρ５ＧＨＩＢ２の造成：シロサケ成長ホ
ルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＳＧ）１
）（参考例１）５μｇを２０ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ
７，５）、１０ｍＭ Ｍ ｇ Ｃ１ｘおよび１０ｍＭ
ＮａＣ１を含む溶液（以下”Ｙ−１０緩衝液′と略記
する）４０μｌに溶かし、制限酵素Ｍ ｂ ｏ ＩＩ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社！！１
）１０単位を加え３７℃３時間消化反応を行った。つづ
いて該溶液のＮａＣｊ！ａ度を１７５ｎ＋Ｍとなるよう
調整し、５ａｆｌ（宝酒造社製 以下特記しない限り制
限酵素はすべて宝酒造社製を用いた）１０単位を加え、
３７℃３時間消化反応を行った。この反応液から低融点
アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）により、Ｎ末端
付近に相当する１６３ｂｐのＤＮＡ断片約０．２μｇを
得た。 次にｐｓＧｌｌｌ の５μｇを２０ｍＭ ）リス−Ｈ（
１（ｐＨ７，５） 、 １０ｍＭ ＭｇＣＬおよび１
００ｍＭ Ｎ ａ Ｃｆｆｉを含む溶液（以下“Ｙ−
１００緩衝液”と略記する）４０μβに溶かし、Ｂａｍ
）ＩＩ １０単位を加え、３７℃３時間消化反応を行
った。つづいて該反応液のＮａＣｊＩＣ度を１７５ｍＭ
に調整し、５ａｆｌｌＯ単位を加え３７℃３時間消化反
応を行った。該反応液からＬＧＴ法により、Ｃ末端側と
３′−非翻訳領域を含む約９００ｂｐのＤＮＡ断片約０
．５μｇを得た。 別にｐＧＥＬｌ ５μｇを４０μβのＹ−１００緩衝液
に溶かし、ＢａｍＨＩと）（ｉｎｄ［［とを各々ＩＯ単
位加え、３０℃３時間消化反応を行った。この反応液か
らトリプトファンプロモーターを含む約２．７ＫｂのＤ
ＮＡ断片約１μｇを１尋だ。 一方成熟７０ザケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発
現に必要な翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、さらにベク
ターＤＮＡと上記ＤＮＡとを連結する目的で下記のＤＮ
Ａ！Ｊンカーを合成した。 まず−重鎖ＤＮＡ、１７ｎ＋ｅｒと１２ｍｅｒを通常の
、トリエステル法〔アール・フレア（Ｒ，Ｃｒｅａ）
ラ：プロンーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ’オブ・サイエンｘ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾
Ｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ） ［ＩＳＡ、、 ７５．５７６５（１９
７８） 〕により合成した。 １７ｍａｒおよび１２ｍｅｒの一本鎮ＤＮＡ各々１２ｐ
ｍｏｌｅを５ＱｍＭ ）すｘ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５
）、１０ｍＭ Ｍ ｇ Ｃ１２゜ｌＱｍＭジチオスレ
イトール右よび１ｄＡＴＰを含む溶液２０μ２に溶かし
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）６ＩＬ
位を加え、３７℃、６０分間リン酸化反応を行った。 上記で得たｐｓＧＨ１由来のＭｂｏＩ［−３ａｉｌ断片
＜１６３ｂｐ） ｏ、 １）１ｍｏｌｅ、 ５ａ１）−
ＢａｌＴｌ）ＩＩ 断片（約９００ｂｐ）０、０６μｍ
ｏｌｅ、 ｐＧＢＬｌの旧ｎｄｌＩ［−Ｂａｍｌｌｌ
断片（約２．７Ｋｂ） ０．０２ｐｍｏｌｅ を５０ｍ
Ｍ ）リス−ＨＣＩｔ （ｐＨ７，５） 。 １０１′ｎＭ ＭｇＣ１ｘ 、 １０＋ＴＩＭジチオ
スレイトールおよび１ｍＭＡＴＰを含む溶液３０μｌに
溶かし、これに上記の合成りＮＡＩＪン酸化反応液５μ
ｌを加えた。この混合液にＴ４リガーゼ（宝酒造社製）
６単位を加え、４℃、１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換しＡｐ
ｌのコロニーを（尋、このコロニーよりプラスミドＤＮ
Ａを回収し、第３図に示したｐＳＧ）１）８２を陽だ。 ｐＳＧ）ｌＩＢ２の構造は巳ｃｏＲＩ、 Ｈｉｎｄ Ｉ
［Ｉ 、 Ｃ１ａｆ。 ＢｇＩ ｎ、 Ｓａｌ Ｉ 、 ＢａｍＨＩで切断して
アガロースゲル電気永動にて確認した。ｐＳＧ）１）８
２中のシロヂケ成長ホルモンをコードするＤＮＡのＮ末
端付近の配列は であることをＭ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ ）法〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）ら、プロシ
ーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ） ＬＩＳ＾、。 ７４ 、５４６３（１９７７） ；アマ−ジャム（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ ）社Ｍ１３クローニング・アンド・シー
フェンシング・ハイドブック（ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ）に従って
決定した。その結果ｐＳＧ）ｌＩ［１２は成熟型シロザ
ケ成長ホルモンポリペプチドをコードするＤＮＡを含む
ことがわかった。プラスミドｐｓＧＨＩＢ２を含む大腸
菌はε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉεＳＣ旧８２
（ＦＥＲＭ［ＩＰ−６１２）として昭和５９年９月２０
日付で工業技術院微生物工業技術研究所（機工研）に寄
託されている。 実施例２． ｐｓＧＨＩＢ２を含む大腸菌によるンロ
ザケ成長ホルモンポリペプチドの生産： 実施例１で得た粗換え体プラスミドｐｓＧＨＩ８２を用
い常法により大腸菌Ｗ３１）ＤＮａ４９株を形質転換し
た。得られたＡｐｌコロニーを８ｍｌのＭＣＣ。 培地（０，６％ＮａＪＰＯ−，０，３％Ｋ）ｌ、Ｐ口、
、 ０．５％１ｉａＣ１，０，１％ＮＨ４Ｃｌ、
０．５％グルコース、０．５％カヂミノ酸、１ｎＭ
Ｍｇ５Ｏａ 、４μｇ／ｍ＋ビタミン日２．ρ）１７．
２）に接種し、３０℃で１８時間培養した。得られた培
萎液を８．００Ｏｒｐｍ、 １０分間遠心して菌体を
回収した。この菌体をＬａｅｎ＋＋ｎｌｉのサンプルバ
ッファーに懸濁後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーにて染色し
て、分子量約２５．０００の部位にポリペプチドバンド
を検出した。このバンドは該プラスミドを含まない大腸
菌を用いた場合には１ 存在しなかった。この結果、ｐ
ｓＧＨＩＢ２を保有する大腸菌はシロザケ成長ホルモン
ポリペプチドを大量に生産していることがわかった。 参考例１． （１）シロザケ脳下垂体よりのポＩＪ
Ａ″ＲＮＡの調製： 。 シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネート−セ
シウムクロライド法〔マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）ら騙、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、 ｐ１９６．コールド・ス
プリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ ）刊；重定勝哉、細胞工学、 ２．６１６（１
９８３） ３に従いポリＡを有するＲＮＡを下記のごと
く調製した。 シロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約３０個体分）を４Ｍグ
アニジウムチオシアネート、０．５％ザルコシン、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）および０．ＩＭβ−メ
ルカプトエタノールからなる溶液ＩＱｎ＋１中でテフロ
ンホモゲナイザ−（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化した。 このホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤＮＡを
分断した。５．７ＭＣ５ＣＲ，Ｏ，１Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８）の溶液者１．２１）１）を超遠心管中に分注
してふき、前記ホモジネートを重層した。旧ｔａｃｈｉ
ＲＰｓ４０ローターにて３５．０００ｒｐｍ 、 １５
時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡの沈
殿を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリｘ−ＭＣＩ （ｐＨ
８，０）溶液ＩＱｍｌに溶解し、フェノール−クロロホ
ルムで抽出後、エタノール沈殿により回収した。得られ
たＲＮＡ約ｌ■をｌＯｍＭ）すｘ−ＨＣ！！ （ｐＨ８
，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１＃１）
に溶かした０６５℃、５分間インキコベートし、０．１
＋＋＋１の５ＭＮａＣ７！を加えた。混合物をオリゴ（
ＩＴセルロースζカラム（Ｐ −Ｌ ＢｉｏｃｈｅＩ
ＩＩｉｃａｌｓ社製）りｏｖトゲラフイーにかけた。吸
着したポリＡを有するｍＲＮＡをＩＯｍＭ）すｘ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶
液で溶出しボ＋７Ａを有するｍＲＮＡ約１０μｇを得た
。 （２） ＣＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿入
： オカヤマーパーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ）の方
法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（
Ａｌｏｌ、Ｃｅ１）．Ｂｉｏｌ、 ） 、 ２ 、１６
１（１９８２） ：ｌに従い、ｃＤＮＡの合成とそれを
組み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工
程の概略を第１図に示す。 ｐｃＤＶｌ 〔オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａ−Ｙ
ａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ）： モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ
、）、 ３＋ −２８０（１９８３） ） ４００
ｐ ｇを１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、６
ｍＭ ＭｇＣＬおよび１０ｍＭＮａＣ１からなる溶液
３００μｌに加え、さ・らに５００単位のＫｐｎｌ（を
酒造社製）を加えて、３７℃、６時間反応させ、プラス
ミド中のＫｐｎ １部位で切断した。フェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。Ｋｐｎｌ切断した該ＤＮＡ約２００．ｃｏｇを４０
ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（
ｐＨ６，８）、１ ｍＭ ＣａＣｌ２および０．１
ｍ Ｍジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）か
らなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴ
Ｐを０．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００μβに加
え、さらに８１単位のターミナルデオキンヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼ（以下ＴｄＴと略記する） （
Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、
３７℃１）分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶ １のＫ
ｐｎｌ切断部位の３′末端にポリｄＴ１）が約６７個付
加された。該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、
エタノール沈殿により、ポリｄＴ鎖の付加したｐＣＤＶ
ＩＤＮＡ約１００μｇを回収した。該ＤＮＡをｌＯｍＭ
）リス−Ｈ（１（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ１
ｘ、１００ｍＭＮａＣｆからなる緩衝液１５０μｌに加
え、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩ （宝酒造社製）を
加え、３７℃２時間反応させた。該反応物を低融点アガ
ロースゲル電気泳動後、約３． Ｉ Ｋ ｂのＤＮＡ断
片を回収し、約６０／Ｊｇ（Ｄポ１ＪｄＴｔＪＩ付加ｐ
ｃＤＶ１を得た。該ＤＮＡをｌｏｍＭ）すｘ−ＨＣｌ（
ｐＨ８，０）お、Ｊ：び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶
液５００μｐに溶解し、６５℃５分間インキュベート後
、氷冷して５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ１を加えた。 混合物をオリゴｄＡセルロースカラム（コラボラティブ
リサーチ社製）クロマトグラフィーにかけた。ポリｄＴ
鎮長が充分なものはカラムに吸着し、これを１０ｍＭト
！ＩスーＨＣｆ （ｐＨ８，’０）およびｌ ｍＭ
Ｅ Ｄ Ｔ Ａからなる溶液で溶出し、ポリｄＴ鎖の付
加したｐｃＤＶｌ （以下ベクタープライマーと略記す
る）２７μｇを得た。 次にリンカ−ＤＮＡの調製を行なう。 ｐＬｌ （オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
＆Ｂｅｒｇ ） ニーｔ−レキニラ−・アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏ！、
）、 ３．２８０（１’９８３））約１４μｇを１０
ｍＭ）リス−ＭＣＩ （ｐＨ７，５）。 ６ｍＭ ＭｇＣｌ１ｘおよび５０ｍＭ ＮａＣ１か
らなる緩衝液２００μｌに加え、さらに５０単位のＰｓ
ｔｌ（宝酒造社製）を加え、３７℃４時間反応させ、ｐ
ＬＩＤＮＡ中のＰｓｔ）部位で切断させた。該反応物を
フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行
い、Ｐｓｔｉで切断した１）ＬＩＤＮＡ約１３μｇを回
収した。該ＤＮＡ約１３μｇをＴｄＴｌｌ衡液にａｍ度
０．２５ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液５０μｌに加え、さ
らにＴｄＴ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
５４単位を加えて３７ｔ１３分間インキニベートし、ｐ
ＬｌのＰｓｔｌ切断部位３′末端にｄＧ鎮を約１４個付
加した。 フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿にてＤ
ＮＡを回収した。該ＤＮＡを１００μｌのｌＱｍＭ）リ
ス−ＨＣ，ｆ！ （ｐＨ７，５）、６ｍＭＭ ｇＣ１２
および６０ｍＭ ＮａＣ１からなる緩衝液１００μｌ
に加え、さらに８０単位の旧ｎｄＩ［［（宝酒造社製）
を加えて３７℃３時間インキュベートし、ｐＬＩＤＮＡ
のＨｉｎｄｌｌｉ部位テ切断シタ。 該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．
５ Ｋ ｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツ
ェン（口ｒｅｔｚｅｎ）ら、アナリティカル・バイオケ
ミストリイ（＾ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 １）
２．２９５（１９８１） ）にて回収し、オリゴｄＧ鎮
付きのリンカ−ＤＮＡ （以下単にリンカ−ＤＮＡと略
記する）を得た。 上記でｍｌしたポＩＪ（Ａ）ＲＮＡ約２μｇ、ベクター
プライマー約１．４μｇを５０ｍＭトリス−ＨＣｊ！
（ｐＨ８，３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ２．３０ｍＭ
ＭＣＩ！、０．３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ （
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および
１０単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌｓ社製）からなる溶液２
２．３μｌに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工
業社製）を加え、３７℃４０分間インキュベートし、ｍ
ＲＮＡに相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェ
ノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮の付加したベクタープライマーＤ
ＮＡを回収した。該ＤＮＡを６６μＭｄＣＴＰおよび０
．２μｇポリＡを含むＴｄＴｌｌ衡液２０μβに溶かし
、１４単位のＴ ｄ Ｔ （Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ社製）を加えて３７℃８分間インキニペー
トし、ｃＤＮＡ３′末端に１２個のｄ（ＪＪを付加した
。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノ
ール沈殿によりｄｃｌｌの付加したｃＤＮＡ−ベクター
プライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡをトリス−ＨＣ
１（ｐＨ７，５＞ 、６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１２お
よび６０ｍＭ ＮａＣｊ！からなる液４００ｐｌに溶
かし、２０単位のＨｉｎｄｌｌ［（宝酒造社製）を加え
、３７℃２時間インキュベートし、Ｈｉ ｎｄｌＩ［部
位で切断した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿してＱ、５ ｐｍｏｌｅのｄＣ鎖付
加ｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを得た。該ＤＮ
Ａ０．０８ ｐｍｏｌｅおよび前記ノリンカーＤＮＡ０
． ｌ ６ ｐｍｏｌｅを４０ＡｌｌｌのトリスーＮＣ
Ｒ（ｐＨ７，５＞、０．ＩＭ ＮａＣｊ！および１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡからなる溶液４０μｌに加え、６５℃、
４２℃、０℃でそれぞれ１０分、２５分３０分間インキ
コベートした。２ＱｍＭトリスーＨＣＪ （ｐ Ｈ７，
５）、４ｍＭ Ｍｇ ＣＩ２． １０ｍＭ （ＮＨ４）
２ＳＯＱ、１Ｍ ＫＣｊ！および０．１ ｍ Ｍｇ−
ＮＡＤの組成で、全量４００μｌとなるよう反応液を調
製した該反応液に１０単位の大腸菌ＤＮＡ リガーゼ（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え
、１）℃−夜インキユベートした。該反応液を各４０μ
ＭのｄＮＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤとなるよう成分
を追加調製し、５単位の大腸菌ＤＮＡ！Ｉガーゼ、７単
位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および２単位の大腸菌リボヌ
クレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ ｆｌｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社
製）を加え、１２℃、２５℃で順次１時間ずつインキユ
ベートした上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの
環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮のＲＮＡ部分がＤＮＡ
にＷ換され、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプラスミドが
生成した。 （３）シロサケ成長ホルモンｃＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａの選択： 実施例２で１尋た組換え体プラスミドを用い、大腸１ｃ
６００３Ｆ８株〔カメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ） ニブａ
シーディング・オブ・ヂ・ナショナル・アヵデミイ・オ
ブ・サイエンｘ （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ）ＵＳＡ。 、 ユ２．３４１６（１９７５） ）をスコツト（Ｓ
ｃｏｔｔ）らの方法ｃ重定勝哉：細胞工学、 ２．６Ｊ
６（，１９８３） ）に従い形質転換した。得られた約
１万個のコロニーのうち４８００個ヲニトロニドロース
上に固定シタ。シロサケ成長ホルモンのＮ末端から２３
番目−２８番目のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡ、
すなわち、（３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴま
たはＣ９１２番目はＣまたはＴ、１５番目はＣまたはＴ
であり、組み合わせて１６通りの合成りＮＡの混合物と
なる）を２２ｐで標識したプローブに４Ｑ℃で強く会合
した８菌株を選んだ〔グルンスティンーホグネス（Ｇｒ
ｕｎｓｔｅＩｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ ）の方法。 プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アヵデミイ
・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
。 Ｓｃｉ、 ） ＵＳＡ、 ７２，３９６Ｈ１９７５）
〕、得られた８菌殊についてサザーン＜５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ ）の方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジイ（Ｊ、Ｍｏｌ。 ９ｉｏ１． ＞、邸、 ５０３（１９７５） ：ｌによ
り、上記プローブおよびＣ末端付近のアミノ酸配列に対
応する合成りＮＡプローブ （３番目の塩基はＣまたは７１６番目はＡまたはＧ、９
番目はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、１２番目はＧまたは
八であり、組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物
となる）とも会合が確認された。これらのプラスミドは
ｐｓＧＨｌ、３，６．８゜９ 、１０．１４．１７と命
名したが、いずれも、シロサケ成長ホルモンのアミノ酸
配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長ホ
ルモンｃＤＮＡを含んでいるものと考えられた。 （４）該プラスミドｐｓＧＨ１の塩基配列二上記で得ら
れたプラスミド８種につき、種々の制限酵素で消化し、
ｃＯＮＡ ８分の切断地図を決定した。制限酵素部位の
存在位置から、得られたプラスミドは３群に分類でき、
ｌｌ５ＧＩ１）．６．９．１０゜１７の群、ｐＳＧＨ３
の群、ｐＳＧ）ｌ ８ 、１４の群と分けられた。それ
ぞれの群の制限酵素地図を第２図に示す。 次に実施例３で行った合成りＮＡプローブと最も強い会
合を示し、かつほぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えられ
るｐｓＧＨ１を含む群のプラスミド、特にｐＳＧＨｌに
ついて、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１３フ
γ−ジを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）法〔サンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディング・オブ・デ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘ ンス（Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、） 、 ＵＳＡ
、７４． ５４６３（１９７７） ： アマ−ジャム（
＾ｍｅｒｓｈａｍ ）社 Ｍ１３クローニング番アント
−シーフェンシング・ハンドブック（ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ’ｈａｎｄｂｏｏｋ）
）に従って決定した。配列を第１表に示す。第１表中
、塩基数１−６６がシグナルペプチドを、６７−６３０
がシロサケ成長ホルモンの成熟ペプチドをコードする。 ｐｓＧｌ（１に含まれるｃＤＮＡ配列から予想されるア
ミノ酸配列は、シロサケ成長ホルモンペプチドから決定
されているＮ末端付近およびＣ末端付近のアミノ酸配列
と完全に一致し、該ｃ（ＩＮ＾はシロサケ成長ホルモン
をコードしていることが確認された。ｐｓＧＨ１、ｐＳ
Ｇ）ｌ ３ 、 ｐｓＧ）Ｉ ８を含む大ＩＩ！菌（そ
れぞれＦ！ＳＧＨ１、ε５ＧＨ３，ＥＳＧＨ８）は昭和
５９年６月２３日付で、ＰＥＲＭ ＢＰ−５５１，５５
２および５５３として機工研に寄託されている。 −Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ ＣＵｎｉｖｅｒｓａ
ｌコ ネ １ ４〔ＡｒｇＬｙｓ’＋ｅｒＬｅ
ｕＧＩｕＡＩ ａＡｓｎＵｙｓｌｌｙＬｅｕ−＊発明の
効果 本発明によれば、魚類の成長ホルモンポリペプチドを微
生物を用いて大量に生産することができる。 ４、図面の簡単な説明 第１図はオカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
）法によるｃＯＮ八合へと、該ＤＮＡを含む組換え体
プラスミドのａ成過程の概略を示す。 第２図はｐＳＧ）ｌ １ 、ｐＳＧＨ３、ｐＳＧＨ８に
含まれるｃＤＮ＾の制限酵素地図を示す。 第３図はプラスミドｐＳＧ旧Ｂ２の造成過程を示す。 ｐＳＧ）１）およびｐｓＧＨＩＢ２におけるＭｂｏ １
）部位は多数存在するが、プラスミド造成上必要な部位
のみ示した。
八合へと、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成過
程の概略を示す。 第２図はｐｓＧＨ１、ｐＳＧＨ３、ｐｓＧＨ８に含まれ
るｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第３図はプラスミドｐＳＧ）ｌＩ８２の造成過程を示す
。 ρ５ＧＨＩおよびｐＳＧ）１）８２におけるＭｂｏ １
）部位は多数存在するが、プラスミド造成上必要な部位
のみ示した。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社図 べ゛クデーブ）イＺ−ＤＮＡ
、、ＲＮＡ以Ｌ＝＝＝＝＝＝ 手続補正書（方式） 昭和６０年２月２２日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２１３３６１号 ２、発明の名称 魚類の成長ホルモンポリペプチド ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称（１０
２）協和醗酵工業株式会社 昭和６０年１月９日（発送日：同６０年１月２９日）５
、補正の対象 明細書全文 明 細 書 １、発明の名称 魚類の成長ホルモンポリペプチド ２、特許請求の範囲 （１）第１表に示したペプチド配列を有する魚類の成長
ホルモンポリペプチド。 （２）魚類の成長ホルモンがニシン類（Ｃｌｕｐｅｉｆ
ｏｒｍｅｓ）の成長ホルモンである特許請求の範囲第１
項のポリペプチド。 （３） 魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードす
るＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物を栄
養培地に培養し、該培養物中に魚類の成長ホルモンポリ
ペプチドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを
採取することを特徴とする魚類の成長ホルモンポリペプ
チドの製造法。 （４）該ポリペプチドが第１表に示したペプチド配列を
有する特許請求の範囲第３項の製造法。 ３、発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチドおよび該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａを含む微生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドの製造法に関する。魚類の成長ホルモンは魚類の養殖
産業分野にふいて広い用途が期待される。 従来の技術 哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産されるが
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、ニー・ジェイ・レビイス
（Ｕ、 Ｊ、 Ｌｅｗｉｓ）らによってジャーナル・オ
プ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、＾ｒｎ
、Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、）、 ８０．４４２９（１９
５８）に、エイ・ニス＋１バートリー（＾、 Ｓ、 Ｈ
ａｒｔｒｅｅ）によってバイオケミカル・ジャーナル（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ＞。 且０ 、７５４（１９６６） に、シー・エイチ・シ
ー（Ｃ，Ｈ。 Ｌｉ）らによってアーチブス・オプ・バイオケミストシ
イ・アンド・バイオフィジクス、アクタ。 （サブルメント） （Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ（ＳｕｐＨ１，） ） 、
ユ、３２７ （１９６２）に報告されている。 魚類の成長ホルモンについても、これまでに単離された
という報告は多く見られるが、その生理活性と蛋白化学
的な性質で信頼性のあるものは数が少ない。信頼性のあ
る報告の例には次のようなものがある。 ティラビアよりの単離例ニス・ダブリュ・ファーマー（
Ｓ、Ｗ、Ｆａｒｍｅｒ）ら、ジェネラル−７７）’ ・
コンパラティプ・エンドクリノロシイ （Ｇｅｎ、 Ｃ
ｏｍｐ。 Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、）、 ３０．９Ｈ１９７６）。 チョウザメよりの単離例ニス・グブリュ・ファー？ −
（Ｓ、 ＩＩ、 Ｆａｒｍｅｒ）ら、エンドクリノロシ
イ（［ｊｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、 −≦１０８
． ３７７（２９８２ン。 コイよりの単離例エイ・エフ・クック（＾、Ｆ。 Ｃｏｏｋ ）ら、ジェネラル・アン１゛・コンパラティ
ブ・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ、Ｃａｍｐ、 Ｂｎ
ｄｏｒｃｒｉｎ、） 。 邸、 ３３５．（１９８３）。 本発明者らは先にサケ脳下垂体から成長ホルモンを抽出
、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列（３１個）の決定
を行った。また、この物質が硬骨魚類において成長促進
効果を有することも確認しているＣ特願昭５９−６８６
７０）。 発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳下
垂体からの採取は供給量が限られている。従って魚類の
成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望ま
れている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技法により魚類の成長ホル
モンを製造する方法について研究を行った。その結果光
に、魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、
魚類の成長ホルモンポリペプチドに相補的なりＮＡの採
取ならびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製
造に成功した。 即ちサケ脳下垂体からメツセンジャーＲＮ Ａ （＋ｎ
ＲＮＡ）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ （ｃＤ
ＮＡ）を合成し、次いでサケの成長ホルモンのＮ末端付
近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを合成し、
このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを選択するこ
とにより、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン化するこ
とに成功した。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配列を決定
した（特願昭５９−１３４５３６）。 本発明者らは、さらに研究を進め、サケの成長ホルモン
をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む
微生物を培養することにより、培養物中にサケ成長ホル
モンポリペプチドが著量生成蓄積することを見出した。 以下本発明の詳細な説明する。 本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、とくに第
１表に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごとく製造することができる。 即ち、魚類成長ホルモンのｍＲＮＡを鋳型きして用いて
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し
、該ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製す
る。さらに、繊組換え体プラスミドを宿主微生物に挿入
する。繊組換え体プラスミドを有する微生物を培養する
ことによりサケ成長ホルモンポリペプチドを安価に大量
に製造することができる。 本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。 シロサケ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴ
ｄＴセルｏ−ス（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポリＡ）
を有するＲＮＡ （ポリΔ″″ＲＮＡ）を分離する。 このポリＡ″ＲＮＡ を鋳型とし、逆転写酵素により二
重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ組換
え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡのようなベク
ターＤＮＡに談合成りＮＡを挿入して得られる。シロサ
ケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを有する
組換え体プラスミドを選択する。 次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。 捕獲されたシロサケより脳下垂体を摘出し、即座に液体
窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウム
・イソチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｕｍｉｓｏｔｈ
ｉｏｃｙａｎａｔｅ）を加え破砕し、可溶化する。次い
でＣ５Ｃｊ！溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物とし全
細胞質ＲＮＡを得る。またグアニジウム・インチオシア
ネート可溶化物にＬｉＣｊ＋を加えてＲＮＡのみを沈殿
させ回収することもできる。 抽出したＲＮＡをＮａＣｊ！またはＫＣｊ！の高塩濃度
（たとえば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、オリゴ（ｄＴ
）セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有するｍ
ＲＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）リスーＨ
ＣＪＭ衡液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポ！
Ｉ （Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。 以下、オカヤマ・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
）の方法〔オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
＆ Ｂｅｒｇ）；モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジイ（Ｍｏｌ、 Ｃｅ１）．Ｂｉｏｌ、） ２
．１６０１９８２））に従い、ｃＤＮＡの合成および、
そのベクターへの組み込みを行う。 まずベクタープライマーを合成する。ベクターとしては
たとえばｐＣＤＶｌを適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ
ＣＩＨ衝液（たとえばｐＨ１，５゜１０ｍＭ）、 Ｍ
ｇ ＣＲｘ＜たとえば６ｍＭ）、ＮａＣｆ（たとえば
ｌＯｍＭ）を含む溶液中で Ｋｐｎ Ｉで処理し、ｐＣ
ＤＶｌのＫｐｎ Ｉ部位を切断する。 このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ６，
８，３Ｏｎ＋Ｍ）、 カコジル酸ナトリウム（たとえ
ば１４０ｍＭ）、ＣｏＣ１ｘ（たとえば１ｍＭ）、ジチ
オスレイトール（たとえば０．１ｍＭ）右よびｄＴＴＰ
（たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼとともに一定温度（た
とえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間）インキ
ュベートし、ベクターＤＮＡの両３′末端に６０個前後
のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡをトリス
−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍＭ） 、
ＭｇＣ１ｘ （たとえば６ｍＭ） 、 ＮａＣ１（たと
えば１００ｍＭを含む溶液中ＥＣ０ＲＩで切断後、低融
点アガロースゲル電気泳動〔ラルス・ライスラング−（
Ｌａｒｓ Ｗｉｅｓ−Ｉａｎｄｅｒ ） ： アナリテ
ィカル・バイオケミストリイ（＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、 ９８，３０５（１９７
９））にて分画し、約３．１キロベースの断片を回収す
る。 次いで該ＤＮＡをＮａＣ１またはＫＣＩの高塩濃度（た
とえば０．５Ｍ）溶液に溶解し、ポ！Ｉ （ｄＡ）セル
ロースカラムに通塔してポリ（Ｔ）を有するベクタープ
ライマー分子のみをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ
）リスーＨＣｊ！＄１衝液のような低塩濃度溶液を用い
て溶出し、ポリ（Ｔ）の付加したベクタープライマー分
子のみを単離する。 次にリンカ−ＤＮＡを合成する。たとえばｐＬＩＤＮＡ
を適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，１０ｍＭ＞、ＭｇＣｊ！２（たとえば６
ｍＭ）、ＮａＣ１（たとえば５０＋ｎＭ）を含む溶液中
でｐｓｔｌで処理し、ｐＬｌのＰｓｔｒ部位を切断する
。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰを加える
以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処理し、
１５１前後のオリゴｄＧ鎖を付加する。該ＤＮＡを適当
な溶液たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ７
、５、１０ｍ Ｍ ） 、 Ｍ ｇ Ｃ１ｚ （たとえ
ば６ｍＭ）。 ＮａＣｊ＋（たとえば６０ｍＭ−）を含む溶液中Ｈｉｎ
ｄＩＩＩにて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約
０．５キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペー
パーにて回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを得
る。 以上のようにして得たポリ （Ａ）”ＲＮＡ、ベクター
プライマー、リンカ−ＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行
う。ポリ （Ａ）ゝＲＮＡ 、ベクタープライマーＤＮ
Ａをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，５０
ｍＭ）、ＭｇＣ１，（たとえば８ｍＭ）、ＫＣｌ（たと
えば３０ｍＭ＞、ジチオスレイトール（たとえば０．３
ｍＭ＞、ｄＡＴＰ。 ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣ；ＴＰ （たとえば各々２ｍ
Ｍ）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３
７℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こ
うして得たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮の３′末端に、ｄＴＴ
ＰがｄＣＴＰに変わる以外はベクタープライマーにｄＴ
鎮を付加した条件と同様の操作でオリゴｄ（ＪＪＩを１
５個前後付加する。 このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液〈たとえばｐＨ７，
５，１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２＜たとえば６ ｍＭ） 。 ＮａＣ１（たとえば６０ｍＭ＞を含む溶液中Ｈｉｎｄｎ
ｌで切断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカ−Ｄ
ＮＡを混合し、トリス−ＨｃＩ１）１衡液（たとえばｐ
Ｈ７，５，２０ｍＭ）、ＭｇＣｊ！ｚ（たとえば４ｍＭ
）、（ＮＨ，）ｉｓｏ＜ （たとえば１０ｍＭ）、ＫＣ
Ｉ （たとえば０．１Ｍ）、β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ）（たとえば０．１ｍＭ
）を含む溶液中、大腸ｍＤＮＡリガーゼとともに一定時
間（たとえば１６時間）、一定温度（たとえば１２℃）
でインキュベートする。こうしてｃＤＮＡとリンカ−Ｄ
ＮＡとの環状化が行われる。この反応液にｄＡＴＰ、ｄ
ＴＴＰ。 ｒｉＧＴＰ、ｄｃＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよ
う加え、大腸菌Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ、大ｇ１菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ１）人ｖｋ菌リボヌクレアーゼＨを加え
、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換することにより、完全な二
重鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを得る。 こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を、たとえばスコツ） （Ｓｃ
ｏｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学２、６１６＜１
９８３） ）により形質転換する。上記で得た組換え体
プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝子が存在するた
め、形質転換した大腸菌はアンピシリン耐性を示す。以
下の手法はこれらアンピシリン耐性（Ａ ｐ”）菌株か
ら魚類の成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を
持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを保有する菌株を選
択するのに一般的に用いられる。すなわち、上記で得ら
れた形質転換株をニトロセルロースフィルター上に固定
し、既知のシロサケ成長ホルモンのアミノ酸配列より予
想されるＤＮＡ配列を有する合成りＮＡプローブと会合
させ、強く会合するものを選択する〔グルンステインー
ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方
法、プロシーディング・オプ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、）、 ＵＳＡ、、 ７２．３９６１（１
９７５）］。 プローブＤＮＡは通常のトリエステル法〔ジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、Ａｍ
、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、）、９７，７３２？ （１
９７５） ）で合成される。合成りＮＡプローブによる
選択はサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ）らの方法〔ジャ
ーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジイ（ＪｌＭｏ
ｌ、 Ｒｉ吐）９８゜５０３ （１９７５））によって
さらに確実にでき、この方法でシロサケ成長ホルモンｍ
ＲＮＡに相補性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミ
ドＤＮＡを同定できる。 このようにして得られる組換え体プラスミドの１例がｐ
ｓＧＨｌ （特願昭５９−１３４５３６）である。この
プラスミドをサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの供
給源として用いることができる。 微生物中でのサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発
現によるサケ成長ホルモンポリペプチドの生産： サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
から該ＤＮＡを切り出し、これをベクターＤＮＡに組み
込み、得られる組換え体ＤＮＡを微生物に導入し、得ら
れる形質転換体を培養することによってサケ成長ホルモ
ンポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、これを採取
することによってサケ成長ホルモンポリペプチドを製造
することができる。 サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
としては、上記ｐｓＧＨＩが好適な例としてあげられる
。 ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤＮＡを微生物中で
発現させることができるものなら、いかなるものでも用
いることができる。好ましくは、適当なプロモーター、
たとえばトリプトファン（ｔｒｐ）系、ラクトース（Ｉ
ａｃ）系、ＰＬ系などのプロモーターを持ち、その下流
にＤＮＡを挿入でき、しかも内在するシャインダルガー
ノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と翻訳開始コドン（
ＡＴＧ）との間を適当な距離たとえば６〜１８塩基対に
調節したベクターＤＮＡが用いられる。具体的に好適な
ベクターＤＮＡとしては、プラスミドｐＧＥＬ１をあげ
ることができる。ｐＧＥＬｌは第３図に示すプラスミド
で、それを含む大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ ＩＧＥＬＩ （ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９）とし
て昭和５９年１０月６日付で工業技術院微生物工業技術
研究所（機工ｇＦ）に寄託されている。ポリペプチドを
コードするＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換えは、制限
酵素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ ４ ＤＮＡ ’）
ガーゼを用いて結合する一般的組換えＤＮＡ手法を用い
て行うことができる。 具体例として示したρ５ＧＩ（］とＩ］Ｇ［ｉＬ Ｉの
場合は第３図に示したごと＜ 、ｐＳＧ）１）からシロ
ザケ成長ホルモンをコードするＭｂ ｏ ｌｌ−３ａｌ
Ｉ消化断片と、Ｓａｌ ｉ Ｂａｍｔｌ ＋消化断片
とを別々に得、ｐＧ［ｉＬ ｌからはトリプトファンプ
ロモーターを含む旧ｎｄ［ｌ−ＢａｍＨＩ消化断片を得
る。一方、以下のような合成りＮＡリンカ−を作製する
。 上記ＤＮＡ断片と合成りＮＡ リンカ−とをＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼで結合し、第３図に示した組換えプラスミド
ｐｓＧＨＩＢ ２を得る。本プラスミドは成熟ンロザケ
成長ホルモンをコードする。 上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。 ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１〜２０
μｇのＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のトリス−ＨＣｊ！（ｐＨ６，０〜９．５好まし
くはｐ Ｈ７，０〜８．０）、０〜２００ｍＭのＮａＣ
１，２〜３０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ＞のＭｇＣ
ｌ２を含む反応液中で、制限酵素０．１〜１００単位（
好ましくは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位）を用い
、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により異な
る）において、１５分間〜２４時間行う。反応の停止は
、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱することによ
るが、フェノールまたはジエチルピロカーボネートなど
の試薬により制限酵素を失活させる方法も用いることが
できる。 制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、低融
点アガロースゲル電気泳動法〔エル・ライスラング−（
１，１ｌｉｅＳ１ａｎｄｅｒ） ：アナリティカル・バ
イオケミストリイ（＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）９８ 、３０５（１９７９）以下ＬＧ
Ｔ法という〕やポリアクリルアミドゲル電気泳動法など
によって行う。 ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のトリス−ＨＣＩ（ｐＨ６，１〜９．
５、好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、２−２２−２
Ｏ好ましくは５〜ＩＱｍＭ）のＭｇＣ１ｚ 、０．１−
１０ｍＭ （好ましくは０．５〜２、０ ｍ Ｍ ）の
ＡＴＰ、１〜５０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍＭ）の
ジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ０．３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは
３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２
０時間）行う。 結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりＣｏｈｅｎらの形質転換法〔ニスーエヌｅコ
ーエン（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ ）らニブロン−ディング
・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ｘ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、
） 。 ＵＳＡ ６９．２１）０（１９７２，）） ニよって、
大腸菌に導入する。 組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはバー
ンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ）らの方法〔エイチ・シ
ー・バーンボイム（Ｈ９Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ）ら：
ユニクレイック・アシγズ・リサーチ（Ｎｕ −ｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｃｌｓ Ｒｅｓ、 ）ユ、 １５２３（１
９７９＞）などを用いて行う。 プラスミドＤＮＡを１−１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。 さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある時はマキ
サム・ギルバード法〔プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）、 ７４
． ５６ｊ（１９７７） ］またはＭ１３ファージを用
いたサンガー（Ｓへｎｇｅｒ ）法〔サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ ）らプロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミイ・オブ・サイｘンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、）。 ７４、５４６３（１９７７）； アマ−ジャム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ ）社Ｍ１３クローニング・アンド噛シーク
エンンング・ハンドブック（ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
５ｅｑｕｅｎｃ＋ｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ））によって
決定する。 以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。 本発明のンロデケ成長ホルモンペプチドは以下のとおり
に製造できる。 すなわち、プラスミド（例えばρ５Ｇ）ｌＩ［］２）を
用いて大ｎｍＫ−１２ＨＢＩＯＩを形質転換サセ、アン
ピシリン耐性（ＡｐＲ以下同じ）のコロニーの中からｐ
ｓＧＨＩ８２を有する大腸菌を選びだす。ρ５ＧＨＩ８
２を有する大腸菌を培地に培養することにより培養物中
にシロサケ成長ホルモンポリペプチドを生成させること
ができる。 ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにサケ成
長ホルモンポリペプチドの生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。 炭素源としては、グルコース、フラクトース。 ラクトース、グリセロール、マンニトール、ソルビトー
ルなどが、窒素源としては、ＮＨ４ＣＡ。 （ＮＨ４）２ｓｏ＜ 、カザミノ酸、酵母エキス、ポリ
ペプトン、肉エキス、バクトドリプトン、コーン・ステ
イープリカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ２Ｈ
ＰＯ４、ＫＨｚＰＣＬ 、Ｎａ（１゜Ｍｇ５ｏ４．ビタ
ミンＢ＋、ＭｇＣβ２などが使用できる。 培養はｐ Ｈ５，５〜８，５．温度１８〜４０℃で通気
攪拌培養により行われる。 培養５〜９０時間で培養菌体中にシロサケ成長ホルモン
ポリペプチドが蓄積するので、培養物から菌体を集菌し
、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰り返して菌
体を破砕し、遠心してえられる上清から通常のポリペプ
チドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。 また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レムリ（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ）のサンプルバッファー〔レムリ（Ｌａｅ
ｍｍ ｌ ｉ） 、ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）、２
２７ 、６８０（１９７０））に加熱溶解後、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル〔レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の
方法：同上文献〕にかけ、クマシーブリリアントブルー
染色によって行う。 実施例１．成熟シロサケ成長ホルモンをコードする組換
え体プラスミドρ５ＧＨＩＢ２の造成：シロサケ成長ホ
ルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＳＧ）１
）（参考例１）５μｇを２０ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ
７，５）、１０ｍＭ Ｍ ｇ Ｃ１ｘおよび１０ｍＭ
ＮａＣ１を含む溶液（以下”Ｙ−１０緩衝液′と略記
する）４０μｌに溶かし、制限酵素Ｍ ｂ ｏ ＩＩ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社！！１
）１０単位を加え３７℃３時間消化反応を行った。つづ
いて該溶液のＮａＣｊ！ａ度を１７５ｎ＋Ｍとなるよう
調整し、５ａｆｌ（宝酒造社製 以下特記しない限り制
限酵素はすべて宝酒造社製を用いた）１０単位を加え、
３７℃３時間消化反応を行った。この反応液から低融点
アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）により、Ｎ末端
付近に相当する１６３ｂｐのＤＮＡ断片約０．２μｇを
得た。 次にｐｓＧｌｌｌ の５μｇを２０ｍＭ ）リス−Ｈ（
１（ｐＨ７，５） 、 １０ｍＭ ＭｇＣＬおよび１
００ｍＭ Ｎ ａ Ｃｆｆｉを含む溶液（以下“Ｙ−
１００緩衝液”と略記する）４０μβに溶かし、Ｂａｍ
）ＩＩ １０単位を加え、３７℃３時間消化反応を行
った。つづいて該反応液のＮａＣｊＩＣ度を１７５ｍＭ
に調整し、５ａｆｌｌＯ単位を加え３７℃３時間消化反
応を行った。該反応液からＬＧＴ法により、Ｃ末端側と
３′−非翻訳領域を含む約９００ｂｐのＤＮＡ断片約０
．５μｇを得た。 別にｐＧＥＬｌ ５μｇを４０μβのＹ−１００緩衝液
に溶かし、ＢａｍＨＩと）（ｉｎｄ［［とを各々ＩＯ単
位加え、３０℃３時間消化反応を行った。この反応液か
らトリプトファンプロモーターを含む約２．７ＫｂのＤ
ＮＡ断片約１μｇを１尋だ。 一方成熟７０ザケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発
現に必要な翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、さらにベク
ターＤＮＡと上記ＤＮＡとを連結する目的で下記のＤＮ
Ａ！Ｊンカーを合成した。 まず−重鎖ＤＮＡ、１７ｎ＋ｅｒと１２ｍｅｒを通常の
、トリエステル法〔アール・フレア（Ｒ，Ｃｒｅａ）
ラ：プロンーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ’オブ・サイエンｘ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾
Ｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ） ［ＩＳＡ、、 ７５．５７６５（１９
７８） 〕により合成した。 １７ｍａｒおよび１２ｍｅｒの一本鎮ＤＮＡ各々１２ｐ
ｍｏｌｅを５ＱｍＭ ）すｘ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５
）、１０ｍＭ Ｍ ｇ Ｃ１２゜ｌＱｍＭジチオスレ
イトール右よび１ｄＡＴＰを含む溶液２０μ２に溶かし
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）６ＩＬ
位を加え、３７℃、６０分間リン酸化反応を行った。 上記で得たｐｓＧＨ１由来のＭｂｏＩ［−３ａｉｌ断片
＜１６３ｂｐ） ｏ、 １）１ｍｏｌｅ、 ５ａ１）−
ＢａｌＴｌ）ＩＩ 断片（約９００ｂｐ）０、０６μｍ
ｏｌｅ、 ｐＧＢＬｌの旧ｎｄｌＩ［−Ｂａｍｌｌｌ
断片（約２．７Ｋｂ） ０．０２ｐｍｏｌｅ を５０ｍ
Ｍ ）リス−ＨＣＩｔ （ｐＨ７，５） 。 １０１′ｎＭ ＭｇＣ１ｘ 、 １０＋ＴＩＭジチオ
スレイトールおよび１ｍＭＡＴＰを含む溶液３０μｌに
溶かし、これに上記の合成りＮＡＩＪン酸化反応液５μ
ｌを加えた。この混合液にＴ４リガーゼ（宝酒造社製）
６単位を加え、４℃、１８時間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換しＡｐ
ｌのコロニーを（尋、このコロニーよりプラスミドＤＮ
Ａを回収し、第３図に示したｐＳＧ）１）８２を陽だ。 ｐＳＧ）ｌＩＢ２の構造は巳ｃｏＲＩ、 Ｈｉｎｄ Ｉ
［Ｉ 、 Ｃ１ａｆ。 ＢｇＩ ｎ、 Ｓａｌ Ｉ 、 ＢａｍＨＩで切断して
アガロースゲル電気永動にて確認した。ｐＳＧ）１）８
２中のシロヂケ成長ホルモンをコードするＤＮＡのＮ末
端付近の配列は であることをＭ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ ）法〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）ら、プロシ
ーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ） ＬＩＳ＾、。 ７４ 、５４６３（１９７７） ；アマ−ジャム（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ ）社Ｍ１３クローニング・アンド・シー
フェンシング・ハイドブック（ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ）に従って
決定した。その結果ｐＳＧ）ｌＩ［１２は成熟型シロザ
ケ成長ホルモンポリペプチドをコードするＤＮＡを含む
ことがわかった。プラスミドｐｓＧＨＩＢ２を含む大腸
菌はε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉεＳＣ旧８２
（ＦＥＲＭ［ＩＰ−６１２）として昭和５９年９月２０
日付で工業技術院微生物工業技術研究所（機工研）に寄
託されている。 実施例２． ｐｓＧＨＩＢ２を含む大腸菌によるンロ
ザケ成長ホルモンポリペプチドの生産： 実施例１で得た粗換え体プラスミドｐｓＧＨＩ８２を用
い常法により大腸菌Ｗ３１）ＤＮａ４９株を形質転換し
た。得られたＡｐｌコロニーを８ｍｌのＭＣＣ。 培地（０，６％ＮａＪＰＯ−，０，３％Ｋ）ｌ、Ｐ口、
、 ０．５％１ｉａＣ１，０，１％ＮＨ４Ｃｌ、
０．５％グルコース、０．５％カヂミノ酸、１ｎＭ
Ｍｇ５Ｏａ 、４μｇ／ｍ＋ビタミン日２．ρ）１７．
２）に接種し、３０℃で１８時間培養した。得られた培
萎液を８．００Ｏｒｐｍ、 １０分間遠心して菌体を
回収した。この菌体をＬａｅｎ＋＋ｎｌｉのサンプルバ
ッファーに懸濁後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーにて染色し
て、分子量約２５．０００の部位にポリペプチドバンド
を検出した。このバンドは該プラスミドを含まない大腸
菌を用いた場合には１ 存在しなかった。この結果、ｐ
ｓＧＨＩＢ２を保有する大腸菌はシロザケ成長ホルモン
ポリペプチドを大量に生産していることがわかった。 参考例１． （１）シロザケ脳下垂体よりのポＩＪ
Ａ″ＲＮＡの調製： 。 シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネート−セ
シウムクロライド法〔マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）ら騙、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、 ｐ１９６．コールド・ス
プリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ ）刊；重定勝哉、細胞工学、 ２．６１６（１
９８３） ３に従いポリＡを有するＲＮＡを下記のごと
く調製した。 シロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約３０個体分）を４Ｍグ
アニジウムチオシアネート、０．５％ザルコシン、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）および０．ＩＭβ−メ
ルカプトエタノールからなる溶液ＩＱｎ＋１中でテフロ
ンホモゲナイザ−（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化した。 このホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤＮＡを
分断した。５．７ＭＣ５ＣＲ，Ｏ，１Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８）の溶液者１．２１）１）を超遠心管中に分注
してふき、前記ホモジネートを重層した。旧ｔａｃｈｉ
ＲＰｓ４０ローターにて３５．０００ｒｐｍ 、 １５
時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡの沈
殿を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリｘ−ＭＣＩ （ｐＨ
８，０）溶液ＩＱｍｌに溶解し、フェノール−クロロホ
ルムで抽出後、エタノール沈殿により回収した。得られ
たＲＮＡ約ｌ■をｌＯｍＭ）すｘ−ＨＣ！！ （ｐＨ８
，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１＃１）
に溶かした０６５℃、５分間インキコベートし、０．１
＋＋＋１の５ＭＮａＣ７！を加えた。混合物をオリゴ（
ＩＴセルロースζカラム（Ｐ −Ｌ ＢｉｏｃｈｅＩ
ＩＩｉｃａｌｓ社製）りｏｖトゲラフイーにかけた。吸
着したポリＡを有するｍＲＮＡをＩＯｍＭ）すｘ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶
液で溶出しボ＋７Ａを有するｍＲＮＡ約１０μｇを得た
。 （２） ＣＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿入
： オカヤマーパーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ）の方
法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（
Ａｌｏｌ、Ｃｅ１）．Ｂｉｏｌ、 ） 、 ２ 、１６
１（１９８２） ：ｌに従い、ｃＤＮＡの合成とそれを
組み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工
程の概略を第１図に示す。 ｐｃＤＶｌ 〔オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａ−Ｙ
ａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ）： モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ
、）、 ３＋ −２８０（１９８３） ） ４００
ｐ ｇを１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、６
ｍＭ ＭｇＣＬおよび１０ｍＭＮａＣ１からなる溶液
３００μｌに加え、さ・らに５００単位のＫｐｎｌ（を
酒造社製）を加えて、３７℃、６時間反応させ、プラス
ミド中のＫｐｎ １部位で切断した。フェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。Ｋｐｎｌ切断した該ＤＮＡ約２００．ｃｏｇを４０
ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（
ｐＨ６，８）、１ ｍＭ ＣａＣｌ２および０．１
ｍ Ｍジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）か
らなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴ
Ｐを０．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００μβに加
え、さらに８１単位のターミナルデオキンヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼ（以下ＴｄＴと略記する） （
Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、
３７℃１）分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶ １のＫ
ｐｎｌ切断部位の３′末端にポリｄＴ１）が約６７個付
加された。該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、
エタノール沈殿により、ポリｄＴ鎖の付加したｐＣＤＶ
ＩＤＮＡ約１００μｇを回収した。該ＤＮＡをｌＯｍＭ
）リス−Ｈ（１（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ１
ｘ、１００ｍＭＮａＣｆからなる緩衝液１５０μｌに加
え、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩ （宝酒造社製）を
加え、３７℃２時間反応させた。該反応物を低融点アガ
ロースゲル電気泳動後、約３． Ｉ Ｋ ｂのＤＮＡ断
片を回収し、約６０／Ｊｇ（Ｄポ１ＪｄＴｔＪＩ付加ｐ
ｃＤＶ１を得た。該ＤＮＡをｌｏｍＭ）すｘ−ＨＣｌ（
ｐＨ８，０）お、Ｊ：び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶
液５００μｐに溶解し、６５℃５分間インキュベート後
、氷冷して５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ１を加えた。 混合物をオリゴｄＡセルロースカラム（コラボラティブ
リサーチ社製）クロマトグラフィーにかけた。ポリｄＴ
鎮長が充分なものはカラムに吸着し、これを１０ｍＭト
！ＩスーＨＣｆ （ｐＨ８，’０）およびｌ ｍＭ
Ｅ Ｄ Ｔ Ａからなる溶液で溶出し、ポリｄＴ鎖の付
加したｐｃＤＶｌ （以下ベクタープライマーと略記す
る）２７μｇを得た。 次にリンカ−ＤＮＡの調製を行なう。 ｐＬｌ （オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
＆Ｂｅｒｇ ） ニーｔ−レキニラ−・アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏ！、
）、 ３．２８０（１’９８３））約１４μｇを１０
ｍＭ）リス−ＭＣＩ （ｐＨ７，５）。 ６ｍＭ ＭｇＣｌ１ｘおよび５０ｍＭ ＮａＣ１か
らなる緩衝液２００μｌに加え、さらに５０単位のＰｓ
ｔｌ（宝酒造社製）を加え、３７℃４時間反応させ、ｐ
ＬＩＤＮＡ中のＰｓｔ）部位で切断させた。該反応物を
フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行
い、Ｐｓｔｉで切断した１）ＬＩＤＮＡ約１３μｇを回
収した。該ＤＮＡ約１３μｇをＴｄＴｌｌ衡液にａｍ度
０．２５ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液５０μｌに加え、さ
らにＴｄＴ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
５４単位を加えて３７ｔ１３分間インキニベートし、ｐ
ＬｌのＰｓｔｌ切断部位３′末端にｄＧ鎮を約１４個付
加した。 フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿にてＤ
ＮＡを回収した。該ＤＮＡを１００μｌのｌＱｍＭ）リ
ス−ＨＣ，ｆ！ （ｐＨ７，５）、６ｍＭＭ ｇＣ１２
および６０ｍＭ ＮａＣ１からなる緩衝液１００μｌ
に加え、さらに８０単位の旧ｎｄＩ［［（宝酒造社製）
を加えて３７℃３時間インキュベートし、ｐＬＩＤＮＡ
のＨｉｎｄｌｌｉ部位テ切断シタ。 該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．
５ Ｋ ｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツ
ェン（口ｒｅｔｚｅｎ）ら、アナリティカル・バイオケ
ミストリイ（＾ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 １）
２．２９５（１９８１） ）にて回収し、オリゴｄＧ鎮
付きのリンカ−ＤＮＡ （以下単にリンカ−ＤＮＡと略
記する）を得た。 上記でｍｌしたポＩＪ（Ａ）ＲＮＡ約２μｇ、ベクター
プライマー約１．４μｇを５０ｍＭトリス−ＨＣｊ！
（ｐＨ８，３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ２．３０ｍＭ
ＭＣＩ！、０．３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ （
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および
１０単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌｓ社製）からなる溶液２
２．３μｌに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工
業社製）を加え、３７℃４０分間インキュベートし、ｍ
ＲＮＡに相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェ
ノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮の付加したベクタープライマーＤ
ＮＡを回収した。該ＤＮＡを６６μＭｄＣＴＰおよび０
．２μｇポリＡを含むＴｄＴｌｌ衡液２０μβに溶かし
、１４単位のＴ ｄ Ｔ （Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ社製）を加えて３７℃８分間インキニペー
トし、ｃＤＮＡ３′末端に１２個のｄ（ＪＪを付加した
。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノ
ール沈殿によりｄｃｌｌの付加したｃＤＮＡ−ベクター
プライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡをトリス−ＨＣ
１（ｐＨ７，５＞ 、６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１２お
よび６０ｍＭ ＮａＣｊ！からなる液４００ｐｌに溶
かし、２０単位のＨｉｎｄｌｌ［（宝酒造社製）を加え
、３７℃２時間インキュベートし、Ｈｉ ｎｄｌＩ［部
位で切断した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿してＱ、５ ｐｍｏｌｅのｄＣ鎖付
加ｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを得た。該ＤＮ
Ａ０．０８ ｐｍｏｌｅおよび前記ノリンカーＤＮＡ０
． ｌ ６ ｐｍｏｌｅを４０ＡｌｌｌのトリスーＮＣ
Ｒ（ｐＨ７，５＞、０．ＩＭ ＮａＣｊ！および１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡからなる溶液４０μｌに加え、６５℃、
４２℃、０℃でそれぞれ１０分、２５分３０分間インキ
コベートした。２ＱｍＭトリスーＨＣＪ （ｐ Ｈ７，
５）、４ｍＭ Ｍｇ ＣＩ２． １０ｍＭ （ＮＨ４）
２ＳＯＱ、１Ｍ ＫＣｊ！および０．１ ｍ Ｍｇ−
ＮＡＤの組成で、全量４００μｌとなるよう反応液を調
製した該反応液に１０単位の大腸菌ＤＮＡ リガーゼ（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え
、１）℃−夜インキユベートした。該反応液を各４０μ
ＭのｄＮＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤとなるよう成分
を追加調製し、５単位の大腸菌ＤＮＡ！Ｉガーゼ、７単
位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および２単位の大腸菌リボヌ
クレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ ｆｌｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社
製）を加え、１２℃、２５℃で順次１時間ずつインキユ
ベートした上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの
環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮のＲＮＡ部分がＤＮＡ
にＷ換され、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプラスミドが
生成した。 （３）シロサケ成長ホルモンｃＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａの選択： 実施例２で１尋た組換え体プラスミドを用い、大腸１ｃ
６００３Ｆ８株〔カメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ） ニブａ
シーディング・オブ・ヂ・ナショナル・アヵデミイ・オ
ブ・サイエンｘ （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ）ＵＳＡ。 、 ユ２．３４１６（１９７５） ）をスコツト（Ｓ
ｃｏｔｔ）らの方法ｃ重定勝哉：細胞工学、 ２．６Ｊ
６（，１９８３） ）に従い形質転換した。得られた約
１万個のコロニーのうち４８００個ヲニトロニドロース
上に固定シタ。シロサケ成長ホルモンのＮ末端から２３
番目−２８番目のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡ、
すなわち、（３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴま
たはＣ９１２番目はＣまたはＴ、１５番目はＣまたはＴ
であり、組み合わせて１６通りの合成りＮＡの混合物と
なる）を２２ｐで標識したプローブに４Ｑ℃で強く会合
した８菌株を選んだ〔グルンスティンーホグネス（Ｇｒ
ｕｎｓｔｅＩｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ ）の方法。 プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アヵデミイ
・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
。 Ｓｃｉ、 ） ＵＳＡ、 ７２，３９６Ｈ１９７５）
〕、得られた８菌殊についてサザーン＜５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ ）の方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジイ（Ｊ、Ｍｏｌ。 ９ｉｏ１． ＞、邸、 ５０３（１９７５） ：ｌによ
り、上記プローブおよびＣ末端付近のアミノ酸配列に対
応する合成りＮＡプローブ （３番目の塩基はＣまたは７１６番目はＡまたはＧ、９
番目はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、１２番目はＧまたは
八であり、組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物
となる）とも会合が確認された。これらのプラスミドは
ｐｓＧＨｌ、３，６．８゜９ 、１０．１４．１７と命
名したが、いずれも、シロサケ成長ホルモンのアミノ酸
配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長ホ
ルモンｃＤＮＡを含んでいるものと考えられた。 （４）該プラスミドｐｓＧＨ１の塩基配列二上記で得ら
れたプラスミド８種につき、種々の制限酵素で消化し、
ｃＯＮＡ ８分の切断地図を決定した。制限酵素部位の
存在位置から、得られたプラスミドは３群に分類でき、
ｌｌ５ＧＩ１）．６．９．１０゜１７の群、ｐＳＧＨ３
の群、ｐＳＧ）ｌ ８ 、１４の群と分けられた。それ
ぞれの群の制限酵素地図を第２図に示す。 次に実施例３で行った合成りＮＡプローブと最も強い会
合を示し、かつほぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えられ
るｐｓＧＨ１を含む群のプラスミド、特にｐＳＧＨｌに
ついて、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１３フ
γ−ジを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）法〔サンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディング・オブ・デ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘ ンス（Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、） 、 ＵＳＡ
、７４． ５４６３（１９７７） ： アマ−ジャム（
＾ｍｅｒｓｈａｍ ）社 Ｍ１３クローニング番アント
−シーフェンシング・ハンドブック（ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ’ｈａｎｄｂｏｏｋ）
）に従って決定した。配列を第１表に示す。第１表中
、塩基数１−６６がシグナルペプチドを、６７−６３０
がシロサケ成長ホルモンの成熟ペプチドをコードする。 ｐｓＧｌ（１に含まれるｃＤＮＡ配列から予想されるア
ミノ酸配列は、シロサケ成長ホルモンペプチドから決定
されているＮ末端付近およびＣ末端付近のアミノ酸配列
と完全に一致し、該ｃ（ＩＮ＾はシロサケ成長ホルモン
をコードしていることが確認された。ｐｓＧＨ１、ｐＳ
Ｇ）ｌ ３ 、 ｐｓＧ）Ｉ ８を含む大ＩＩ！菌（そ
れぞれＦ！ＳＧＨ１、ε５ＧＨ３，ＥＳＧＨ８）は昭和
５９年６月２３日付で、ＰＥＲＭ ＢＰ−５５１，５５
２および５５３として機工研に寄託されている。 −Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ ＣＵｎｉｖｅｒｓａ
ｌコ ネ １ ４〔ＡｒｇＬｙｓ’＋ｅｒＬｅ
ｕＧＩｕＡＩ ａＡｓｎＵｙｓｌｌｙＬｅｕ−＊発明の
効果 本発明によれば、魚類の成長ホルモンポリペプチドを微
生物を用いて大量に生産することができる。 ４、図面の簡単な説明 第１図はオカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
）法によるｃＯＮ八合へと、該ＤＮＡを含む組換え体
プラスミドのａ成過程の概略を示す。 第２図はｐＳＧ）ｌ １ 、ｐＳＧＨ３、ｐＳＧＨ８に
含まれるｃＤＮ＾の制限酵素地図を示す。 第３図はプラスミドｐＳＧ旧Ｂ２の造成過程を示す。 ｐＳＧ）１）およびｐｓＧＨＩＢ２におけるＭｂｏ １
）部位は多数存在するが、プラスミド造成上必要な部位
のみ示した。
Claims (4)
- （１）第１表に示したペプチド配列を有する魚類の成長
ホルモンポリペプチド。 - （２）魚類の成長ホルモンがニシン類（Ｃｌｕｐｅｉｆ
ｏｒｍｅｓ）の成長ホルモンである特許請求の範囲第１
項のポリペプチド。 - （３）魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物を栄養培
地に培養し、該培養物中に魚類の成長ホルモンポリペプ
チドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを採取
することを特徴とする魚類の成長ホルモンポリペプチド
の製造法。 - （４）該ポリペプチドが第１表に示したペプチド配列を
有する特許請求の範囲第３項の製造法。
Priority Applications (9)
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|---|---|---|---|
| JP59213361A JPS6193197A (ja) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | 魚類の成長ホルモンポリペプチド |
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| SU853913602A RU1825376C (ru) | 1984-06-29 | 1985-06-28 | Способ получени ДНК, кодирующей гормон роста лосос , способ конст-ни промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей ДНК-фрагмент, кодирующий гормон роста лосос , дл получени плазмид pS GH1, pS GH3, pS GH9, pS GH10, pS GH14 и pS GH17, способ получени реком-ной плазмидной ДНК pS GH1B2, кодирующей гормон роста лосос , способ получени реком-ной плазмидной ДНК pSGH II С2, кодирующей гормон роста лосос , способ получени реком-ного гормона роста лосос |
| CN 85104988 CN85104988A (zh) | 1984-10-12 | 1985-07-01 | 鱼生长激素多肽 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (2)
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Families Citing this family (1)
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6115699A (ja) * | 1984-06-29 | 1986-01-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
-
1984
- 1984-10-12 JP JP59213361A patent/JPS6193197A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6115699A (ja) * | 1984-06-29 | 1986-01-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH051799B2 (ja) | 1993-01-11 |
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