JPS62111684A - 溶解安定性アルフアーアミラーゼの製造法 - Google Patents
溶解安定性アルフアーアミラーゼの製造法Info
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- JPS62111684A JPS62111684A JP61258703A JP25870386A JPS62111684A JP S62111684 A JPS62111684 A JP S62111684A JP 61258703 A JP61258703 A JP 61258703A JP 25870386 A JP25870386 A JP 25870386A JP S62111684 A JPS62111684 A JP S62111684A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、バシルス番すケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのアルファ
−アミラーゼおよび澱粉、好ましくはマルトデキストリ
ンを含んでなる実質的に溶解安定性のアルファ−アミラ
ーゼ生成物を調製する新規な方法に関する。
ｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのアルファ
−アミラーゼおよび澱粉、好ましくはマルトデキストリ
ンを含んでなる実質的に溶解安定性のアルファ−アミラ
ーゼ生成物を調製する新規な方法に関する。
酵素類は生きている有機体中で自然に発生する生化学的
反応の多くをｍｍする生物触媒である。
反応の多くをｍｍする生物触媒である。
酵素類は多くの分野、例えば、皮なめし、洗浄剤、食品
および製薬の工業において使用される。
および製薬の工業において使用される。
酵素類を生産する伝統的方法において、酵素の沈殿物を
水中に溶解する。しかしながら、高い効力の水中酵素溶
液（高い酵素活性を有する濃縮溶液）は貯蔵不安定性で
あることがある。酵素は溶液の中から外に沈殿しおよび
／または熱感受性である。米国特許第３．２４２．０５
６号は、水性ポリオール溶液を使用してリゾチームの熱
不安定性の防止を促進することを開示している。米国特
許第４，４９７，８９７号は、ポリプロピレングリコー
ル、カルシウムイオンおよびカルボン酸塩を含有するス
ブチリンン・カルルスパーグ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｆｎ
Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）からの安定な液状プロイテナー
ゼを開示している。米国特許第４，５１９，９３４号は
、プロピレングリコール中に分散したバシルス・リケニ
フォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉＳ）からの安定な液状アルファ−アミラーゼを開
示している。
水中に溶解する。しかしながら、高い効力の水中酵素溶
液（高い酵素活性を有する濃縮溶液）は貯蔵不安定性で
あることがある。酵素は溶液の中から外に沈殿しおよび
／または熱感受性である。米国特許第３．２４２．０５
６号は、水性ポリオール溶液を使用してリゾチームの熱
不安定性の防止を促進することを開示している。米国特
許第４，４９７，８９７号は、ポリプロピレングリコー
ル、カルシウムイオンおよびカルボン酸塩を含有するス
ブチリンン・カルルスパーグ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｆｎ
Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）からの安定な液状プロイテナー
ゼを開示している。米国特許第４，５１９，９３４号は
、プロピレングリコール中に分散したバシルス・リケニ
フォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉＳ）からの安定な液状アルファ−アミラーゼを開
示している。
水溶液中のバシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのアルファ
−アミラーゼからなる液状酵素生成物は、乾燥した酵素
沈殿物を水中でまず再構成する不便なしにおよび／また
は溶媒（例えば、プロピレングリコール）の相溶性を考
慮しないで、工業的用途において、例えば、液状洗浄剤
の中に直接使用できるので望ましい、また、乾炸生戒物
からの酵素のダストは回避される。こうして、研究者ら
はこの酵素を水溶液、とくに高い効力（高度に濃縮され
た）水溶液の中に維持する方法を長い間探究してきてい
る。上の節に述べた先行技術のは種々の溶媒（例えば、
プロピレングリコール）の使用を示しているが、酵素が
溶液中にとどまる、高い酵素活性の水性酵素生成物は決
して得られていない。
ｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのアルファ
−アミラーゼからなる液状酵素生成物は、乾燥した酵素
沈殿物を水中でまず再構成する不便なしにおよび／また
は溶媒（例えば、プロピレングリコール）の相溶性を考
慮しないで、工業的用途において、例えば、液状洗浄剤
の中に直接使用できるので望ましい、また、乾炸生戒物
からの酵素のダストは回避される。こうして、研究者ら
はこの酵素を水溶液、とくに高い効力（高度に濃縮され
た）水溶液の中に維持する方法を長い間探究してきてい
る。上の節に述べた先行技術のは種々の溶媒（例えば、
プロピレングリコール）の使用を示しているが、酵素が
溶液中にとどまる、高い酵素活性の水性酵素生成物は決
して得られていない。
例えば、アルファ−アミラーゼは種々の微生物、例えば
、バシルスｅスブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ）（以後Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓと呼ぶこ
とがある）またはバシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（以後Ｂ
、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓと呼ぶことがある）
を適当な栄養培地中で培養することにより得ることがで
きる。
、バシルスｅスブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ）（以後Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓと呼ぶこ
とがある）またはバシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（以後Ｂ
、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓと呼ぶことがある）
を適当な栄養培地中で培養することにより得ることがで
きる。
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓは物理的に安定であるアルフ
ァ−アミラーゼを生産する。すなわち、この酵素は、活
性が３００万ＭＷＵ／ｍｌ ［変更ウォルゲムス（Ｗ
ｏｈｌｇｅｍｕｔｈ）ｍ位／ｍｌ］以上であるときでさ
え、水溶液中から外に認められうる程度に沈殿しない、
しかしながら、これらのアルファ−アミラーゼ溶液は熱
感受性であり、そしてマルトデキストリンを添加して熱
安定性を増強する。同様に、クレソフ（Ｋ ｌ ｅ ｓ
ｏ ｖ）は、［可溶性および固定化グルコアミラーゼ
の基質の熱安定化（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｔｈｅｒｍ
ｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ５ｏｌｕｂ
ｌｅ ａｎｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｇｌｕ
ｃｏａｍｙ ｌ ａｓｅ）Ｊ 、モスクワ国立大学、化
学部、バイオキミャ（Ｂｉｏｋｈｉｍｙａ）、Ｖｏ ｌ
、 ４４ （６）、１０８４−９２ページ（１９７９
）において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｆｇｅｒ）からのグルコアミラーゼの溶
液をマルトデキストリンで熱安定化することを開示して
いる。他方において、バシルス・リケニフォルミス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から得ら
れるアルファ−アミラーゼは熱安定性である［例えば、
ポレスキ−（ｖｏｌｅｓｋｙ）ら、微生物の酵素類：生
産、精製、および単ｇｉ（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｎｚｙ
ｍｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ、ａｎｄ ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ）、Ｖｏｌ、２．
発行２．１２０ページ、１９８５参照］が、水溶液で高
い濃度においてことに物理的に不安定である。
ァ−アミラーゼを生産する。すなわち、この酵素は、活
性が３００万ＭＷＵ／ｍｌ ［変更ウォルゲムス（Ｗ
ｏｈｌｇｅｍｕｔｈ）ｍ位／ｍｌ］以上であるときでさ
え、水溶液中から外に認められうる程度に沈殿しない、
しかしながら、これらのアルファ−アミラーゼ溶液は熱
感受性であり、そしてマルトデキストリンを添加して熱
安定性を増強する。同様に、クレソフ（Ｋ ｌ ｅ ｓ
ｏ ｖ）は、［可溶性および固定化グルコアミラーゼ
の基質の熱安定化（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｔｈｅｒｍ
ｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ５ｏｌｕｂ
ｌｅ ａｎｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｇｌｕ
ｃｏａｍｙ ｌ ａｓｅ）Ｊ 、モスクワ国立大学、化
学部、バイオキミャ（Ｂｉｏｋｈｉｍｙａ）、Ｖｏ ｌ
、 ４４ （６）、１０８４−９２ページ（１９７９
）において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｆｇｅｒ）からのグルコアミラーゼの溶
液をマルトデキストリンで熱安定化することを開示して
いる。他方において、バシルス・リケニフォルミス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から得ら
れるアルファ−アミラーゼは熱安定性である［例えば、
ポレスキ−（ｖｏｌｅｓｋｙ）ら、微生物の酵素類：生
産、精製、および単ｇｉ（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｎｚｙ
ｍｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ、ａｎｄ ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ）、Ｖｏｌ、２．
発行２．１２０ページ、１９８５参照］が、水溶液で高
い濃度においてことに物理的に不安定である。
本発明は次のような方法を提供する。バシルス争すケ−
７オ）レミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ）を発酵させてこの発酵からの熱安定性アル
ファ−アミラーゼおよび固体の廃棄生成物を含有する発
酵培地（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ）を
調製することにより熱安定性アルファ−アミラーゼを製
造する方法において、（ａ）発酵培地に澱粉を添加する
ことからなり、澱粉は、十分な量で添加されたとき、酵
素−ｑ 素の７グロメレーシヨン（ａｇｇｌｏｍｅｒａ
ｔｉｏｎ）を抑制し、これによりアルファ−アミラーゼ
の水溶液中の溶解度を向上させることを特徴とする熱安
定性アルファ−アミラーゼを製造する方法。
７オ）レミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ）を発酵させてこの発酵からの熱安定性アル
ファ−アミラーゼおよび固体の廃棄生成物を含有する発
酵培地（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ）を
調製することにより熱安定性アルファ−アミラーゼを製
造する方法において、（ａ）発酵培地に澱粉を添加する
ことからなり、澱粉は、十分な量で添加されたとき、酵
素−ｑ 素の７グロメレーシヨン（ａｇｇｌｏｍｅｒａ
ｔｉｏｎ）を抑制し、これによりアルファ−アミラーゼ
の水溶液中の溶解度を向上させることを特徴とする熱安
定性アルファ−アミラーゼを製造する方法。
しかしながら、文献のいずれも、酵素がＢ。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからの熱安定性アルファ−
アミラーゼである、高い酵素活性を有する水性生成物を
調製するために澱粉を使用するという本発明の新規な発
見を示唆または開示しいず、こうしてほぼ１．０００
、ＯＯＯＭＷＵ／ｍｌまでの活性を有する水性アルファ
−アミラーゼ溶液の安定化に対する澱粉の効果が研究さ
れた。
アミラーゼである、高い酵素活性を有する水性生成物を
調製するために澱粉を使用するという本発明の新規な発
見を示唆または開示しいず、こうしてほぼ１．０００
、ＯＯＯＭＷＵ／ｍｌまでの活性を有する水性アルファ
−アミラーゼ溶液の安定化に対する澱粉の効果が研究さ
れた。
したがって、本発明の目的は、アルファ−アミラーゼが
Ｂ、 ｌｆｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから得られる、実
質的に溶解安定性のアルファ−アミラーゼ配合物を提供
することである。「実質的に溶解安定性（ｓｕｂｓｔａ
ｎｔｉａｌｌｙ ｓ。
Ｂ、 ｌｆｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから得られる、実
質的に溶解安定性のアルファ−アミラーゼ配合物を提供
することである。「実質的に溶解安定性（ｓｕｂｓｔａ
ｎｔｉａｌｌｙ ｓ。
１ｕｔｉｏｎ ５ｔａｂｌｅ）」とは、その溶液が効
力を有するとき、すなわち、活性が少なくとも３５ 、
０００ＭＷＵ／ｍ １である、高い酵素濃度を溶液が有
するとき、酵素は溶液の中から外に沈殿しないで、溶液
中の酵素の存在が促進されることを意味する。澱粉の量
を調節することにより、実質的に溶解安定性である、１
，０００，０００ＭＷＵ／ｍＩあるいはこれよりなお高
い活性を有する、非常に濃縮された溶液を得ることがで
きる。
力を有するとき、すなわち、活性が少なくとも３５ 、
０００ＭＷＵ／ｍ １である、高い酵素濃度を溶液が有
するとき、酵素は溶液の中から外に沈殿しないで、溶液
中の酵素の存在が促進されることを意味する。澱粉の量
を調節することにより、実質的に溶解安定性である、１
，０００，０００ＭＷＵ／ｍＩあるいはこれよりなお高
い活性を有する、非常に濃縮された溶液を得ることがで
きる。
本発明の液状配合物は、Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓからの熱安定性アルファ−アミラーゼＩｇＡのア
ミラーゼおよび／またはプロテアーゼを含有することが
できる。アミラーゼおよび／またはプロテアーゼを生産
する種々の微生物は、次のものを包含するが、これらの
限定されない：パシルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・リケニフォルミ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉＳ
）、へシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ。
ｍｉｓからの熱安定性アルファ−アミラーゼＩｇＡのア
ミラーゼおよび／またはプロテアーゼを含有することが
できる。アミラーゼおよび／またはプロテアーゼを生産
する種々の微生物は、次のものを包含するが、これらの
限定されない：パシルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・リケニフォルミ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉＳ
）、へシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ。
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびバシ
ルスーアミロリクエファシエンス（Ｂ。
ルスーアミロリクエファシエンス（Ｂ。
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｓ）、また、本発明の
配合物は、好ましくは洗浄剤中の使用が意図され、こう
して両性、アニオン性、カチオン性、非イオン性、双性
または半極性非イオン性の界面活性剤あるいはそれらの
混合物から成る群より選択される洗浄剤の界面活性剤を
約Ｏ％〜約８０％の量でさらに含むことができる。この
ような洗浄剤はよく知られており、そして本発明の液状
酵素配合物と一緒の使用に有効ないくつかの洗浄剤の例
は米国特許第４，３１８，８１８号［レットン（Ｌｅｔ
ｔｏｎ）ら］および米国特許第４゜１１１．８５５号［
バラット（Ｂａｒｒａｔ）ら］中に記載されており、そ
れらの開示を引用によってここに加える。
配合物は、好ましくは洗浄剤中の使用が意図され、こう
して両性、アニオン性、カチオン性、非イオン性、双性
または半極性非イオン性の界面活性剤あるいはそれらの
混合物から成る群より選択される洗浄剤の界面活性剤を
約Ｏ％〜約８０％の量でさらに含むことができる。この
ような洗浄剤はよく知られており、そして本発明の液状
酵素配合物と一緒の使用に有効ないくつかの洗浄剤の例
は米国特許第４，３１８，８１８号［レットン（Ｌｅｔ
ｔｏｎ）ら］および米国特許第４゜１１１．８５５号［
バラット（Ｂａｒｒａｔ）ら］中に記載されており、そ
れらの開示を引用によってここに加える。
次の図表は、従来の処理と比較して、好ましい実施態様
を示す。この図表は、例示のみを目的とし、そして本発
明の実施の仕方を教示するために要求されるものと解釈
すべきではない。
を示す。この図表は、例示のみを目的とし、そして本発
明の実施の仕方を教示するために要求されるものと解釈
すべきではない。
区窓
（Ａ）発酵（バイオマスの分ｇＩ）
（Ｂ）培養濾液（ＰＭ−膜）
（Ｃ）ＵＦ濃縮物
（Ｄ）（ｉ）ケークを得
るための沈殿法または
ＣＤ）（ｉｉ）濃縮物を
得るための真空蒸発法
（Ｅ’）（ｉ）酵素の （Ｅ）（ｉ）酵素のケーケーク
から水中への抽 りから澱粉含有水中への出（ｐＨ８へ
の調節、 抽出または １０℃における１８〜 （Ｅ）（ｉ １）ｐＨ６゜２４
時間の貯蔵）（ｉｌ！５における澱粉の添加に過）また
は よる安定化 （Ｅ”）（ｉｆ）蒸発 の連続 （Ｆ′）酵素のケーク （Ｆ）液状最終生成物生成物 （Ｇ）酵素のケークか ら澱粉含有水中への抽 出、ｐＨ６、５ 実質的に安定な、高い効力の、水性アルファ−アミラー
ゼ調製物を製造する簡単な方法を図表に記載する。この
方法は次の工程からなる： （Ａ）発酵を実施し、（Ｂ
）酵素を含有する発酵培地からバイオマスを濾過により
分離し、（Ｃ）限外濾過（Ｕ Ｆ）により酵素濃縮物を
得、（Ｄ）（ｉ）酵素を含有するケークを沈殿させるか
、あるいは（ｉ ｉ）真空蒸発または追加の限外濾過に
よりそれ以上の濃縮を実施し、次いで（Ｅ）（ｉ）沈殿
した酵素をケークの中から外にかつ水溶液中に抽出し、
ここでこの抽出はケークを再スラリー化するかあるいは
ケークを通して水を循環させることにより実施し、ここ
で抽出溶液は澱粉を含有するかあるいは澱粉を抽出溶液
へ添加し、あるいは（ｉｆ）澱粉を濃縮物へ直接添加し
て、（Ｆ）水性澱粉含有最終生成物を得る。従来法にお
いて、工程（Ｅ′）はその代わり（ｉ）ケークを水中に
スラリー化して酵素をそれから抽出することから成るか
、あるいは（ｉ ｉ）蒸発を続けることから成る０次い
で、酵素含有ケークは再沈殿し、そして過剰の母液を濾
過して乾燥した生成物を歿す（Ｆ′）、あるいは、本発
明を、工程（Ｅ′）および（Ｆ゛）の後に、酵素をこの
沈殿したケークから澱粉含有水溶液中に抽出すること（
Ｇ）により用いる・ことができるであろう。
から水中への抽 りから澱粉含有水中への出（ｐＨ８へ
の調節、 抽出または １０℃における１８〜 （Ｅ）（ｉ １）ｐＨ６゜２４
時間の貯蔵）（ｉｌ！５における澱粉の添加に過）また
は よる安定化 （Ｅ”）（ｉｆ）蒸発 の連続 （Ｆ′）酵素のケーク （Ｆ）液状最終生成物生成物 （Ｇ）酵素のケークか ら澱粉含有水中への抽 出、ｐＨ６、５ 実質的に安定な、高い効力の、水性アルファ−アミラー
ゼ調製物を製造する簡単な方法を図表に記載する。この
方法は次の工程からなる： （Ａ）発酵を実施し、（Ｂ
）酵素を含有する発酵培地からバイオマスを濾過により
分離し、（Ｃ）限外濾過（Ｕ Ｆ）により酵素濃縮物を
得、（Ｄ）（ｉ）酵素を含有するケークを沈殿させるか
、あるいは（ｉ ｉ）真空蒸発または追加の限外濾過に
よりそれ以上の濃縮を実施し、次いで（Ｅ）（ｉ）沈殿
した酵素をケークの中から外にかつ水溶液中に抽出し、
ここでこの抽出はケークを再スラリー化するかあるいは
ケークを通して水を循環させることにより実施し、ここ
で抽出溶液は澱粉を含有するかあるいは澱粉を抽出溶液
へ添加し、あるいは（ｉｆ）澱粉を濃縮物へ直接添加し
て、（Ｆ）水性澱粉含有最終生成物を得る。従来法にお
いて、工程（Ｅ′）はその代わり（ｉ）ケークを水中に
スラリー化して酵素をそれから抽出することから成るか
、あるいは（ｉ ｉ）蒸発を続けることから成る０次い
で、酵素含有ケークは再沈殿し、そして過剰の母液を濾
過して乾燥した生成物を歿す（Ｆ′）、あるいは、本発
明を、工程（Ｅ′）および（Ｆ゛）の後に、酵素をこの
沈殿したケークから澱粉含有水溶液中に抽出すること（
Ｇ）により用いる・ことができるであろう。
酵素の製造後、固体（発酵からのバイオマス）を全体の
発酵培地から任意の標準技術、例えば、濾過および／ま
たは遠心分離により除去して、酵素含有溶液を調製する
０次に、この細胞不含酵素含有溶液を好ましくは約１〜
１０倍に任意の慣用手段１例えば、限外濾過および／ま
たは蒸発により濃縮する。澱粉または澱粉を含有する水
溶液を、約０．１％〜５０％、好ましくは約３％〜１５
％（澱粉対溶液の重量／容量）の量で、前記の溶液また
は濃縮物に添加する。
発酵培地から任意の標準技術、例えば、濾過および／ま
たは遠心分離により除去して、酵素含有溶液を調製する
０次に、この細胞不含酵素含有溶液を好ましくは約１〜
１０倍に任意の慣用手段１例えば、限外濾過および／ま
たは蒸発により濃縮する。澱粉または澱粉を含有する水
溶液を、約０．１％〜５０％、好ましくは約３％〜１５
％（澱粉対溶液の重量／容量）の量で、前記の溶液また
は濃縮物に添加する。
望ましい実施態様において、澱粉の添加前に、沈殿剤を
細胞不含酵素含有溶液（または濃縮物）に添加して、酵
素を含有するケークを沈殿させることができる。よく知
られた沈殿剤は、低分子量の有機溶媒、例えば、メタノ
ール、エタノール、インプロパツール、ｌ−プロパノー
ル、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールおよびそれ
らの混合物あるいは塩類、例えば、硫酸ナトリウム、硫
酸アンモニウムおよびそれらの混合物である。ここで、
「ケーク（ｃａｋｅ）Ｊという用語は、ケークが非常に
湿潤されたスラリート考えられる場合を含めさせるため
に用語「スラリー」を包含する、過剰の母液が存在する
場合、それはスラリーまたはケークから、いくつかの方
法、例えば、通常の濾過、吸引濾過、重力沈降または遠
心分離により除去することができる６次いで、水中に約
０．１％〜５０％Ｗ／Ｖ、より好ましくは約３％〜１５
％ｗ／ｖの澱粉を含有する水溶液を調製し、モしてケー
クから酵素を溶解または抽出するために使用することが
できる。また、ケークからの酵素の抽出は水を用いて実
施し、次いで澱粉を約０．１％〜５０％ｗ／ｖの量で抽
出液に添加することができる。
細胞不含酵素含有溶液（または濃縮物）に添加して、酵
素を含有するケークを沈殿させることができる。よく知
られた沈殿剤は、低分子量の有機溶媒、例えば、メタノ
ール、エタノール、インプロパツール、ｌ−プロパノー
ル、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールおよびそれ
らの混合物あるいは塩類、例えば、硫酸ナトリウム、硫
酸アンモニウムおよびそれらの混合物である。ここで、
「ケーク（ｃａｋｅ）Ｊという用語は、ケークが非常に
湿潤されたスラリート考えられる場合を含めさせるため
に用語「スラリー」を包含する、過剰の母液が存在する
場合、それはスラリーまたはケークから、いくつかの方
法、例えば、通常の濾過、吸引濾過、重力沈降または遠
心分離により除去することができる６次いで、水中に約
０．１％〜５０％Ｗ／Ｖ、より好ましくは約３％〜１５
％ｗ／ｖの澱粉を含有する水溶液を調製し、モしてケー
クから酵素を溶解または抽出するために使用することが
できる。また、ケークからの酵素の抽出は水を用いて実
施し、次いで澱粉を約０．１％〜５０％ｗ／ｖの量で抽
出液に添加することができる。
他の実施態様において、固体の廃棄生成物（すなわち、
発酵からのバイオマス）を酵素の製造後発酵培地から分
離しない、むしろ、澱粉または澱粉の水溶液を全体の発
酵培地へ直接添加する。これは酵素の溶液中の維持を促
進するので、固体の廃棄生成物を除去するとき、固体中
への酵素の損失は少なくなる。澱粉は約０．１％〜５０
％ｗ／ｖの量で全体の発酵培地へ添加すべきである。
発酵からのバイオマス）を酵素の製造後発酵培地から分
離しない、むしろ、澱粉または澱粉の水溶液を全体の発
酵培地へ直接添加する。これは酵素の溶液中の維持を促
進するので、固体の廃棄生成物を除去するとき、固体中
への酵素の損失は少なくなる。澱粉は約０．１％〜５０
％ｗ／ｖの量で全体の発酵培地へ添加すべきである。
任、αの澱粉を本発明において使用することができ、そ
してこれは、また、誘導化された澱粉、例えば、アセチ
ル化澱粉または澱粉グリコレートを包含することを意味
する。澱粉は酵素のための基質であることができる。一
般に、高温、すなわち、例えば、６０℃、において最大
活性を示す酵素は、多少加熱しないかぎり、基質に認め
られうる程度に作用しない、さらに詳しくは、Ｂ、
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアル７フーアミラーゼは
、温度がほぼ４０℃になるまで、澱粉の基質を本質的に
分解し始めず、実質的の加水分解はほぼ６０℃までおこ
らない。こうして、澱粉基質は典型的な周囲の貯蔵条件
下に認められうる程度に分解しないであろう。本発明に
おいて好ましい澱粉基質はコーンシロップおよびマルト
デキストリンデアル、マルトデキストリンはことに好ま
しい、マルトデキストリン源は、例えば、米国アイオワ
州ムスカチンのグレイン・プロセシング・コーボレーシ
ゴン（Ｇｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔ １ｏｎ）により種々の同等物で供給される
マルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮの）、すなわち、トウモロ
コシ製品の加水分解物（穀類の固体物）である、マルト
リン（ＭＡＬＴＲＩＮ）は、非常に望ましい増量特性（
ｂｕｌｋｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）
をもつ、口当りがよい、白色の食品等級の炭水化物であ
る。それは甘味が低く、水中に易溶性であり、そして凝
集抵抗性ある。
してこれは、また、誘導化された澱粉、例えば、アセチ
ル化澱粉または澱粉グリコレートを包含することを意味
する。澱粉は酵素のための基質であることができる。一
般に、高温、すなわち、例えば、６０℃、において最大
活性を示す酵素は、多少加熱しないかぎり、基質に認め
られうる程度に作用しない、さらに詳しくは、Ｂ、
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアル７フーアミラーゼは
、温度がほぼ４０℃になるまで、澱粉の基質を本質的に
分解し始めず、実質的の加水分解はほぼ６０℃までおこ
らない。こうして、澱粉基質は典型的な周囲の貯蔵条件
下に認められうる程度に分解しないであろう。本発明に
おいて好ましい澱粉基質はコーンシロップおよびマルト
デキストリンデアル、マルトデキストリンはことに好ま
しい、マルトデキストリン源は、例えば、米国アイオワ
州ムスカチンのグレイン・プロセシング・コーボレーシ
ゴン（Ｇｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔ １ｏｎ）により種々の同等物で供給される
マルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮの）、すなわち、トウモロ
コシ製品の加水分解物（穀類の固体物）である、マルト
リン（ＭＡＬＴＲＩＮ）は、非常に望ましい増量特性（
ｂｕｌｋｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）
をもつ、口当りがよい、白色の食品等級の炭水化物であ
る。それは甘味が低く、水中に易溶性であり、そして凝
集抵抗性ある。
例えば、マルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）−１００の典型
的な分析は次の通りである： 典−１的な化学的および物理学的データデキストロース
当量 （Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ９．０−１２．０Ｅｑｕｉ
ｖａｌｅｎｔ） 湿分、最大％ ６．０ ＰＨ１２０％溶液 ４．０−４．７形態
白色粉末 典ＩＪな炭水化物のプロフィル（乾燥基準）中側類
１％ 三糖類 ４％三糖類
６％ 四糖類 ５％ 五糖類以上 ８４％ マルトデキストリンの約３％〜１５％ｗ／ｖの濃度は酵
素を溶液中に維持するとき最も有利であることがわかっ
た。
的な分析は次の通りである： 典−１的な化学的および物理学的データデキストロース
当量 （Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ９．０−１２．０Ｅｑｕｉ
ｖａｌｅｎｔ） 湿分、最大％ ６．０ ＰＨ１２０％溶液 ４．０−４．７形態
白色粉末 典ＩＪな炭水化物のプロフィル（乾燥基準）中側類
１％ 三糖類 ４％三糖類
６％ 四糖類 ５％ 五糖類以上 ８４％ マルトデキストリンの約３％〜１５％ｗ／ｖの濃度は酵
素を溶液中に維持するとき最も有利であることがわかっ
た。
その上、マルトデキストリンのデキストロース当量（Ｄ
Ｅ）と酵素の可溶化の維持との間に逆の相関関係が存在
することが、驚くべきことには発見された。換言すると
、マルトデキストリンのデキストロース当量が低くなれ
ばなるほど、酵素の溶液中にとどまる傾向はより強くな
る。好ましくは、デキストロース当量は約３５以下、よ
り好ましくは約２５以下である。この発見は下の実施例
■において明らかにする。
Ｅ）と酵素の可溶化の維持との間に逆の相関関係が存在
することが、驚くべきことには発見された。換言すると
、マルトデキストリンのデキストロース当量が低くなれ
ばなるほど、酵素の溶液中にとどまる傾向はより強くな
る。好ましくは、デキストロース当量は約３５以下、よ
り好ましくは約２５以下である。この発見は下の実施例
■において明らかにする。
他のデキストロース当量をもつ他の臓粉を有利に使用す
ることもできる。正確な機構は未知であるが、いかなる
澱粉も安定な酵素／基質複合体を形成するため有効であ
ると理論づけられる。
ることもできる。正確な機構は未知であるが、いかなる
澱粉も安定な酵素／基質複合体を形成するため有効であ
ると理論づけられる。
好ましい実＃Ａ態様において、澱粉の添加の後または７
ｍに、酵素含有溶液のｐＨを実施例の等重点以上に調節
する。ｐＨはその等電点よりほぼ４゜ＯｐＨ単位ないし
ほぼその等重点までの範囲内であるべきである。好まし
くは、ｐＨはそん等電点よりほぼ３．ＯｐＨ単位より高
くない、アルファ−アミラーゼの等電点は４．８〜５．
５の間で変化し、そしてこのような酸性のｐＨにおいて
、酵素は溶液中にとどまるであろう、しかしながら、Ｐ
Ｈをそのように低く保持することは、酵素が酸性のＰＨ
の条件下に変性するので、アルファ−アミラーゼの溶液
の貯蔵のための別法ではない、酵素がタカーサーム（Ｔ
ＡＫＡ−ＴＨＥＲＭ・）［マイルス・ラボラトリーズ、
インコーホレーテッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、米国インディアナ州エルクハ
ルト、かか供給される］、すなわち、バシルス舎すケニ
フォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓ）の突然変異株の醗酵から得られた熱安定性ア
ルファ−アミラーゼ、である最も好ましい実施態様にお
いて、ｐＨはほぼ５．５〜９．０、より好ましくはほぼ
６．０〜８．２の間であるべきである。タカーサーム（
ＴＡＫＡ−ＴＨＥＲＭ）を使用する好ましい実施態様の
ための最適なｐＨはほぼ６．５〜８．０である。ｐＨを
調節するための好ましい物質は酵素化学の分野において
よく知られており、そしてその例は塩基類、例えば、Ｎ
ａＯＨおよびＫＯＨｌおよび酸類、例えば、塩酸および
酢酸である。
ｍに、酵素含有溶液のｐＨを実施例の等重点以上に調節
する。ｐＨはその等電点よりほぼ４゜ＯｐＨ単位ないし
ほぼその等重点までの範囲内であるべきである。好まし
くは、ｐＨはそん等電点よりほぼ３．ＯｐＨ単位より高
くない、アルファ−アミラーゼの等電点は４．８〜５．
５の間で変化し、そしてこのような酸性のｐＨにおいて
、酵素は溶液中にとどまるであろう、しかしながら、Ｐ
Ｈをそのように低く保持することは、酵素が酸性のＰＨ
の条件下に変性するので、アルファ−アミラーゼの溶液
の貯蔵のための別法ではない、酵素がタカーサーム（Ｔ
ＡＫＡ−ＴＨＥＲＭ・）［マイルス・ラボラトリーズ、
インコーホレーテッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、米国インディアナ州エルクハ
ルト、かか供給される］、すなわち、バシルス舎すケニ
フォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓ）の突然変異株の醗酵から得られた熱安定性ア
ルファ−アミラーゼ、である最も好ましい実施態様にお
いて、ｐＨはほぼ５．５〜９．０、より好ましくはほぼ
６．０〜８．２の間であるべきである。タカーサーム（
ＴＡＫＡ−ＴＨＥＲＭ）を使用する好ましい実施態様の
ための最適なｐＨはほぼ６．５〜８．０である。ｐＨを
調節するための好ましい物質は酵素化学の分野において
よく知られており、そしてその例は塩基類、例えば、Ｎ
ａＯＨおよびＫＯＨｌおよび酸類、例えば、塩酸および
酢酸である。
アルファ−アミラーゼの活性は、実施例において、ウォ
ルゲムス（Ｗｏ ｈ Ｉ ｇｅｍｕ ｔ ｈ） 、 ／
＜イオケミストリー（Ｂｆ ｏｃｈｅｍ、）２９： １
（１９０８）に開示されている方法の変法である、マニ
ュアル・オブ９リクエ７アイイングーアルファ−アミラ
ーゼ拳アッセイ（Ｍａｎｕａｌｏｆ Ｌｉｑｕｅｆｙ
ｆｎｇ ＡＩｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ ＡＳＳａｙ
）に記載されている澱粉−ヨウ素複合体の青色値の減少
を用いて、可溶性澱粉の加水分解を決定することによっ
て測定した。典型的な試験において、５ｍｌのｐＨ５、
４に緩衝化した２％の可溶性澱粉および５ｍｌの水を１
ｍｌの適切に希釈した酵素とともに４０’Ｃに維持した
水浴中でインキュベーションする０時限した間隔（酵素
の添加から５〜３０分）で、アリコート（１ｍｌ）と取
り出し、そして５ｍｌの希釈したヨウ素溶液を含有する
管中に注入し、そして倒立により混合した０次いで、発
現した色をコンパレーター中で比較して反応の終点の到
達を監視した。酵素の活性は［変更ウォルゲムス（Ｍ。
ルゲムス（Ｗｏ ｈ Ｉ ｇｅｍｕ ｔ ｈ） 、 ／
＜イオケミストリー（Ｂｆ ｏｃｈｅｍ、）２９： １
（１９０８）に開示されている方法の変法である、マニ
ュアル・オブ９リクエ７アイイングーアルファ−アミラ
ーゼ拳アッセイ（Ｍａｎｕａｌｏｆ Ｌｉｑｕｅｆｙ
ｆｎｇ ＡＩｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ ＡＳＳａｙ
）に記載されている澱粉−ヨウ素複合体の青色値の減少
を用いて、可溶性澱粉の加水分解を決定することによっ
て測定した。典型的な試験において、５ｍｌのｐＨ５、
４に緩衝化した２％の可溶性澱粉および５ｍｌの水を１
ｍｌの適切に希釈した酵素とともに４０’Ｃに維持した
水浴中でインキュベーションする０時限した間隔（酵素
の添加から５〜３０分）で、アリコート（１ｍｌ）と取
り出し、そして５ｍｌの希釈したヨウ素溶液を含有する
管中に注入し、そして倒立により混合した０次いで、発
現した色をコンパレーター中で比較して反応の終点の到
達を監視した。酵素の活性は［変更ウォルゲムス（Ｍ。
ｄｉｆｉｅｄ Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ）単位／ｍｌコ
（ＭＷＵ／ｍｌ）として計算した。
（ＭＷＵ／ｍｌ）として計算した。
ｌ変更ウォルゲムス（Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ）単位（Ｍ
ＷＵ）は、アッセイの条件下に１ ｍ ｌの可溶性澱粉
を３０分以内に定めた青色値にデキストリン化する活性
である。計算のため、密度は水の密度であると仮定し、
こうして活性／ ｍ １は活性／ｇに等しいと仮定する
。計算は次の通りである： ００Ｘ３０ ＭＷＵ／ｍｌ＝ＭＷＵ／ｇ”□ ＸＷ ＸＷ ここで１００ ＝＝ 各インキュベーション混合物
中の澱粉のｍｇ数であ る。
ＷＵ）は、アッセイの条件下に１ ｍ ｌの可溶性澱粉
を３０分以内に定めた青色値にデキストリン化する活性
である。計算のため、密度は水の密度であると仮定し、
こうして活性／ ｍ １は活性／ｇに等しいと仮定する
。計算は次の通りである： ００Ｘ３０ ＭＷＵ／ｍｌ＝ＭＷＵ／ｇ”□ ＸＷ ＸＷ ここで１００ ＝＝ 各インキュベーション混合物
中の澱粉のｍｇ数であ る。
３０ ＝ 定めたデキストリン化時間
（分）。
Ｔ＝ 終点の到達に要する時間
（分）。
Ｗ＝ 酵素希釈液の１ｍｌのアリ
コート中のインキュベー
ション混合物に添加した酵
素の重量（ｇ）。
澱粉の基質としてマルトデキストリンを使用シた高濃度
におけるアルファ−アミラーゼの安定化の理論を、次に
概略的に説明する。溶液中の遊離酵素の濃度を低下させ
る因子は、また、高い酵素活性において酵素のアグロメ
レーションを防止スることが、予期されざることには発
見された。希薄酵素溶液から水を除去すると、酵素−水
の相互作用ではなく酵素−酵素の相互作用が促進される
傾向がある。こうして、酵素−酵素の相互作用が増大す
ると、酵素は非共有の吸引により会合して酵素は沈殿す
る。
におけるアルファ−アミラーゼの安定化の理論を、次に
概略的に説明する。溶液中の遊離酵素の濃度を低下させ
る因子は、また、高い酵素活性において酵素のアグロメ
レーションを防止スることが、予期されざることには発
見された。希薄酵素溶液から水を除去すると、酵素−水
の相互作用ではなく酵素−酵素の相互作用が促進される
傾向がある。こうして、酵素−酵素の相互作用が増大す
ると、酵素は非共有の吸引により会合して酵素は沈殿す
る。
ｎ （Ｅ）→（Ｅ）ｎ→アグロメレーション→沈殿↓
↓ 氷 水 澱粉（Ｓ）を酵素の抽出物にあるいは酵素の濃縮の間に
添加すると、次の式で表わされるように、高濃度におけ
る酵素の不溶性化が阻止される。
↓ 氷 水 澱粉（Ｓ）を酵素の抽出物にあるいは酵素の濃縮の間に
添加すると、次の式で表わされるように、高濃度におけ
る酵素の不溶性化が阻止される。
ｎ （Ｅ）＋ｍ （Ｓ）＝ （ＥＳ） ＋Ｓｘ
（ｎ −ｍ） Ｅ 、ｎ＞ｍのとき。
（ｎ −ｍ） Ｅ 、ｎ＞ｍのとき。
−Ｘ
平衡のもとに、溶液は一般にＸモルの酵素／澱粉複合体
（ＥＳ）、澱粉（Ｓ ）および遊離 −ｍ 実験データによると、澱粉の不存在下に、遊離酵素（Ｅ
）の濃度が溶液中の酵素の重量に−ｘ 基づいて３５ 、ＯＯＯＭＷＵ／ｍｌより高くなると、
酵素の沈殿がおこる。
（ＥＳ）、澱粉（Ｓ ）および遊離 −ｍ 実験データによると、澱粉の不存在下に、遊離酵素（Ｅ
）の濃度が溶液中の酵素の重量に−ｘ 基づいて３５ 、ＯＯＯＭＷＵ／ｍｌより高くなると、
酵素の沈殿がおこる。
下の実施例において例示するすべての実施態様はタカー
サーム（ＴＡＫＡ−ＴＨＥＲＭ）、すなわち、Ｂ、
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから得られた熱安定性アル
ファ−アミラーゼを使用し、そして本発明はこれにより
限定されることはない。
サーム（ＴＡＫＡ−ＴＨＥＲＭ）、すなわち、Ｂ、
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから得られた熱安定性アル
ファ−アミラーゼを使用し、そして本発明はこれにより
限定されることはない。
１、プ゛ アルク −アミラーゼ タカーサーム（Ｔ
ＡＫＡ−ＴＨＥＲＭ） を成するためのバシルス・リ
ケニフォルミ熱安定性アルファ−アミラーゼを生成する
ためにＢ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉＳのある株（
ＡＴＣＣ５３３７６）を培養するために適当な発酵培地
は、次のようにして１ｏｏｏ文容の醗酵器のために調製
することができる： 塩化カルシウムニ水和物 （薄片） ０．２−１．０ｋｇリン酸
−およびニカリウ １２−２４ ｋｇム 硫酸アンモニウム ２−７ ｋｇ適当な
炭素源 １００−２００ｋｇ綿実粉末
２５−４０ ｋｇ大豆媒質（大豆粉末）
３０−５０ ｋマス（Ｍａｚｕ）ＤＦ６
ｇ ＯＯＯ零 ８−１３ １水
合計１．０００又とする量 寧マズ・カンパ＝ −（Ｍａｚｕ Ｃｏ ｍ ｐ ａ
ｎｙ）により供給される有機消泡剤、その主要成分は
ポリエチレングリコールおよびシリコーンである。
ＡＫＡ−ＴＨＥＲＭ） を成するためのバシルス・リ
ケニフォルミ熱安定性アルファ−アミラーゼを生成する
ためにＢ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉＳのある株（
ＡＴＣＣ５３３７６）を培養するために適当な発酵培地
は、次のようにして１ｏｏｏ文容の醗酵器のために調製
することができる： 塩化カルシウムニ水和物 （薄片） ０．２−１．０ｋｇリン酸
−およびニカリウ １２−２４ ｋｇム 硫酸アンモニウム ２−７ ｋｇ適当な
炭素源 １００−２００ｋｇ綿実粉末
２５−４０ ｋｇ大豆媒質（大豆粉末）
３０−５０ ｋマス（Ｍａｚｕ）ＤＦ６
ｇ ＯＯＯ零 ８−１３ １水
合計１．０００又とする量 寧マズ・カンパ＝ −（Ｍａｚｕ Ｃｏ ｍ ｐ ａ
ｎｙ）により供給される有機消泡剤、その主要成分は
ポリエチレングリコールおよびシリコーンである。
培地にバシルス参りケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｃ７）株の生きてい
る細胞を接種し、そしてＰＨをほぼ中性に維持しながら
４０〜５０℃で７０〜９０時間発酵させた。この発酵後
、培地を適当な凝集剤で凝集させてバイオマスの除去を
促進することができる。バイオマスは遠心分離または濾
過のような手段により除去し、そして液体をドラムフィ
ルターに通過させてそれをみがき、これにより細胞不含
溶液（−次培養濾液または上澄み）を得ることができる
。典型的には、ドラムフィルターをフィルター助剤、例
えば、スーパーエイド（Ｓｕｐｅｒａｉｄ・）で予備被
覆して一次培養波液または上澄みをみがく（すなわち、
清浄花）する。
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｃ７）株の生きてい
る細胞を接種し、そしてＰＨをほぼ中性に維持しながら
４０〜５０℃で７０〜９０時間発酵させた。この発酵後
、培地を適当な凝集剤で凝集させてバイオマスの除去を
促進することができる。バイオマスは遠心分離または濾
過のような手段により除去し、そして液体をドラムフィ
ルターに通過させてそれをみがき、これにより細胞不含
溶液（−次培養濾液または上澄み）を得ることができる
。典型的には、ドラムフィルターをフィルター助剤、例
えば、スーパーエイド（Ｓｕｐｅｒａｉｄ・）で予備被
覆して一次培養波液または上澄みをみがく（すなわち、
清浄花）する。
好ましい実施態様において、−次培養濾液を限外諸過、
例えば、ＰＭ−１０膜（分子量のカット・オフ１０，０
００）を使用する限外謹過または真空によりＣ縮するこ
とができる。次いで、酵素は濃縮された培養癌液から、
好ましくは２０％ｗ／ｖの硫酸ナトリウム、２８％ｗ／
ｖの硫酸アンモニウム、または８０％（Ｖ／Ｖ）のエタ
ノールの添加により、酵素含有ケークの形態で定量的に
沈殿させ１次いでこのケークを水で抽出し、そしてこの
抽出液にマールトデキストリンを添加することができる
。
例えば、ＰＭ−１０膜（分子量のカット・オフ１０，０
００）を使用する限外謹過または真空によりＣ縮するこ
とができる。次いで、酵素は濃縮された培養癌液から、
好ましくは２０％ｗ／ｖの硫酸ナトリウム、２８％ｗ／
ｖの硫酸アンモニウム、または８０％（Ｖ／Ｖ）のエタ
ノールの添加により、酵素含有ケークの形態で定量的に
沈殿させ１次いでこのケークを水で抽出し、そしてこの
抽出液にマールトデキストリンを添加することができる
。
実施例Ｉ
スーパーエイド（Ｓｕｐｅｒａｉｄ’）−ｔ’被被覆た
ドラムフィルターに通過させることによってみがいた、
前述のようなアルファ−アミラーゼの一次培養濾液をｉ
、ｏｏｏの分子量のカー／ ト・オフのロミコン（Ｒｏ
ｍｉｃｏｎ＠）２０ＨＦ−４フイルター装置を使用する
限外鑵過により２０℃において濃縮し、そしていくつか
のアリコートに分割した。各７リコートのＰＨを２０％
ｗ／ｖの水性ＫＯＨで７．６に調節した。次いで、マル
トリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）−２０をいくつかの試料に％
Ｗ ／ Ｖを変化させて添加し、そして試料をよく攪拌
して均一に混合した。わずかの試料を対照［０％Ｗ／ｖ
のマルトリン（ＭＡ Ｌ ＴＲＩ Ｎ） −２０］とし
て保持した。各々を回転蒸発器［プリンクマン−ブチ争
ロトベイパ−（Ｂｒｉｎｋｍａｎ−Ｂｕｃｈｆ Ｒｏ
ｔｏｖａｐｏｒ＠）］を使用して３５℃で特定の試料に
ついて所望のアミラーゼ活性およびマルトリン（ＭＡＬ
ＴＲＩＮ）濃度に減圧濃縮した。すべての試料は０．５
％ｗ／ｖのソルビン酸カリウムを添加して微生物の汚染
化から保存し、次いで２５℃で１月間貯蔵した。特定し
た時間後、試料を遠心分離した。酵素の量（初期、上澄
み中に残留する、または沈殿した）は前述のように活性
（ＭＷＵ／ｍｌ）を測定することにより決定することが
できる。こうして、上澄み中の酵素の量を測定し、これ
から酵素の初期の州を減じて沈殿物中に損失された酵素
の量を得、これを式１００Ｘ（沈殿した酵素／初期の酵
素）を使用して沈殿した酵素％に変換した。
ドラムフィルターに通過させることによってみがいた、
前述のようなアルファ−アミラーゼの一次培養濾液をｉ
、ｏｏｏの分子量のカー／ ト・オフのロミコン（Ｒｏ
ｍｉｃｏｎ＠）２０ＨＦ−４フイルター装置を使用する
限外鑵過により２０℃において濃縮し、そしていくつか
のアリコートに分割した。各７リコートのＰＨを２０％
ｗ／ｖの水性ＫＯＨで７．６に調節した。次いで、マル
トリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）−２０をいくつかの試料に％
Ｗ ／ Ｖを変化させて添加し、そして試料をよく攪拌
して均一に混合した。わずかの試料を対照［０％Ｗ／ｖ
のマルトリン（ＭＡ Ｌ ＴＲＩ Ｎ） −２０］とし
て保持した。各々を回転蒸発器［プリンクマン−ブチ争
ロトベイパ−（Ｂｒｉｎｋｍａｎ−Ｂｕｃｈｆ Ｒｏ
ｔｏｖａｐｏｒ＠）］を使用して３５℃で特定の試料に
ついて所望のアミラーゼ活性およびマルトリン（ＭＡＬ
ＴＲＩＮ）濃度に減圧濃縮した。すべての試料は０．５
％ｗ／ｖのソルビン酸カリウムを添加して微生物の汚染
化から保存し、次いで２５℃で１月間貯蔵した。特定し
た時間後、試料を遠心分離した。酵素の量（初期、上澄
み中に残留する、または沈殿した）は前述のように活性
（ＭＷＵ／ｍｌ）を測定することにより決定することが
できる。こうして、上澄み中の酵素の量を測定し、これ
から酵素の初期の州を減じて沈殿物中に損失された酵素
の量を得、これを式１００Ｘ（沈殿した酵素／初期の酵
素）を使用して沈殿した酵素％に変換した。
結果を下表Ｉに要約する。
表ニーＨ−
２５°Ｃで１月間貯蔵中のアルファ−アミラーゼの沈殿
の程度へのマルトリン−２０の効果本 １、 １，０４３，４７８ ０．００
９３，５２、 １，０４３，４７８ ２．１
１ ２８．５３．９６０，０００ ３，７０
３７．８４．１，０４３，４７８ ６，３
４ ２５．６５．１，１８０．３７８ ７．
４０ 一本 ６．７７９，７２１ ０．００ ８８．８７
、 ７８９，４７４ ２，６ ７９
．４８、 ８４５，５２２ ５．４
１６．４９、 ８９５，５２２ ９．０
１７．６１０、 ８４５，０７０
１１．４ ２５．４１１、 ８４５．０７
０ １３．６ ２２．０寧 １２、 ７１６，４１８ ０．００
８５．２１３、 ８７２，７２７ ２．３
８ ２１．０１４．９７９，５９２ ４．
５４ ６８．８１５． ７８６．１１１
８５ ８．２５ １６．７１６、
７８６，８８５ ８．３３ １７，
８１７、 ８７２，７２７ ＬＬ、３
６ ２５，０本 １８、 ６４０，０００ ０，００
８０，９１９、 ５５１．７２４
２，２ ７１，１２０、 ５７
８．３１３ ４，２ ３９．８２１、
５７８，３１３ ５．７３
５４，０２２、 ５１６，１２９
８，００ １４，４２３、 ５５８，
１４０ １０．００ １５，１本 ２４、 ４７０，５８８ ０，０
０ ５４．８２５、 ４５２，８３
０ ２．１ ６８．２２６．４５
２ 、８３０ ４． Ｚ ４５．
Ｚ２７、 ４７０，５８８ ６゜
３１４．２２８、 ４５２，８３０
８．４ １４．３２９、 ４
８９，７９６ １１，２５ １５．４
本 ３０、 ３６９，２３１ ０．０
０ ５８．０３１．４２１，０５３
２．７４ １．４．０３２、 ４０
６，７８０ ４．２５ １２．７３
３．３Ｂ０，９５２ ６．５７ １
４．５３４、 ３８０，９５２
８．７６ １３．０３５、 ３９３
，４４３ １０．９６ １１．９車試
料１，６，１２，１８，２４およ（／３０は対照であっ
た。
の程度へのマルトリン−２０の効果本 １、 １，０４３，４７８ ０．００
９３，５２、 １，０４３，４７８ ２．１
１ ２８．５３．９６０，０００ ３，７０
３７．８４．１，０４３，４７８ ６，３
４ ２５．６５．１，１８０．３７８ ７．
４０ 一本 ６．７７９，７２１ ０．００ ８８．８７
、 ７８９，４７４ ２，６ ７９
．４８、 ８４５，５２２ ５．４
１６．４９、 ８９５，５２２ ９．０
１７．６１０、 ８４５，０７０
１１．４ ２５．４１１、 ８４５．０７
０ １３．６ ２２．０寧 １２、 ７１６，４１８ ０．００
８５．２１３、 ８７２，７２７ ２．３
８ ２１．０１４．９７９，５９２ ４．
５４ ６８．８１５． ７８６．１１１
８５ ８．２５ １６．７１６、
７８６，８８５ ８．３３ １７，
８１７、 ８７２，７２７ ＬＬ、３
６ ２５，０本 １８、 ６４０，０００ ０，００
８０，９１９、 ５５１．７２４
２，２ ７１，１２０、 ５７
８．３１３ ４，２ ３９．８２１、
５７８，３１３ ５．７３
５４，０２２、 ５１６，１２９
８，００ １４，４２３、 ５５８，
１４０ １０．００ １５，１本 ２４、 ４７０，５８８ ０，０
０ ５４．８２５、 ４５２，８３
０ ２．１ ６８．２２６．４５
２ 、８３０ ４． Ｚ ４５．
Ｚ２７、 ４７０，５８８ ６゜
３１４．２２８、 ４５２，８３０
８．４ １４．３２９、 ４
８９，７９６ １１，２５ １５．４
本 ３０、 ３６９，２３１ ０．０
０ ５８．０３１．４２１，０５３
２．７４ １．４．０３２、 ４０
６，７８０ ４．２５ １２．７３
３．３Ｂ０，９５２ ６．５７ １
４．５３４、 ３８０，９５２
８．７６ １３．０３５、 ３９３
，４４３ １０．９６ １１．９車試
料１，６，１２，１８，２４およ（／３０は対照であっ
た。
表Ｔに記載する結果が示すように、マルトリン（ＭＡＬ
ＴＲＩＮ）は濃縮した培養濾液中の酵素の沈殿を阻止し
た。しかしながら、下の実施例ｍに記載する好ましい実
施態様におけるようによく、酵素は高い効力の溶液中に
維持されない。
ＴＲＩＮ）は濃縮した培養濾液中の酵素の沈殿を阻止し
た。しかしながら、下の実施例ｍに記載する好ましい実
施態様におけるようによく、酵素は高い効力の溶液中に
維持されない。
実施例エエ
実施例工の手順に従ったが、ただし濃縮、ＰＨの調節お
よびマルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）の添加の順序を変更
した。全体の美容濾液を限外症過により７倍に濃縮し、
次いで蒸発させてほぼ７００ 、ＯＯＯＭＷＵ／ｍ１の
濃度にした０次いで、この濃縮物のｐＨを７．６に調節
し、そしてこのｅ細物を４つの部分に分割した。マルト
リン（ＭＡＬＴＲＩＮ）−２０を各々に種々の濃度で添
加した。試料を２５化合物で４０時間おだやかに攪拌し
１次いで遠心分離した。沈殿物中に損失された酵素％を
実施例工と同じ方法で計算した。結果を下表ＩＩに要約
する。
よびマルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）の添加の順序を変更
した。全体の美容濾液を限外症過により７倍に濃縮し、
次いで蒸発させてほぼ７００ 、ＯＯＯＭＷＵ／ｍ１の
濃度にした０次いで、この濃縮物のｐＨを７．６に調節
し、そしてこのｅ細物を４つの部分に分割した。マルト
リン（ＭＡＬＴＲＩＮ）−２０を各々に種々の濃度で添
加した。試料を２５化合物で４０時間おだやかに攪拌し
１次いで遠心分離した。沈殿物中に損失された酵素％を
実施例工と同じ方法で計算した。結果を下表ＩＩに要約
する。
旦
％ｗ／ｖ 沈殿した
マルトリン−２０酵素％
０．００ ８４
２．０ ７４
４．０ ４８
８．０ ６．２
この表から理解できるように、８．０％Ｗ／Ｖまでの種
々の量のマルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）−２０は沈殿に
よる酵素の損失を馴的に減少させた。しかしながら、活
性は、下の実施例■に記載する好ましい実施態様におけ
るようによく、高い効力の溶液において維持されない。
々の量のマルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）−２０は沈殿に
よる酵素の損失を馴的に減少させた。しかしながら、活
性は、下の実施例■に記載する好ましい実施態様におけ
るようによく、高い効力の溶液において維持されない。
実施例ｍ
アルファ−アミラーゼの溶液をＰＭ−１０１Ｉ３を使用
する限外症過により４倍にｅ１ｉｌ！シ、次いでＮａ２
ＳＯ４で沈殿させた後、この実施例において使用した。
する限外症過により４倍にｅ１ｉｌ！シ、次いでＮａ２
ＳＯ４で沈殿させた後、この実施例において使用した。
硫酸ナトリウムを沈殿剤として使用したので、室温より
上の加熱、すなわち、はぼ３０°Ｃへの加熱を実施して
、硫酸ナトリウムの凝集を軽減した。７ ｚ ルターエ
イド（Ｆｉ Ｉｔｅｒａｉｄ）ＦＷ−６（１％ｗ／ｖ）
を添加し、そして酵素含有ケークを減圧痘過により集め
た。酵素含有ケークをフィルター装置から取り出し、そ
して再少量の水中に再スラリー化して酵素をケークから
溶解した。このスラリーを濾過して濃縮された酵素溶液
を調製し、次いで１ 、０００ 、０００ＭＷＵ／ｍｌ
の測定された活性により決定した高い初期酵素濃度に水
で調節し、そしてさらに７つのアリコートに分割した。
上の加熱、すなわち、はぼ３０°Ｃへの加熱を実施して
、硫酸ナトリウムの凝集を軽減した。７ ｚ ルターエ
イド（Ｆｉ Ｉｔｅｒａｉｄ）ＦＷ−６（１％ｗ／ｖ）
を添加し、そして酵素含有ケークを減圧痘過により集め
た。酵素含有ケークをフィルター装置から取り出し、そ
して再少量の水中に再スラリー化して酵素をケークから
溶解した。このスラリーを濾過して濃縮された酵素溶液
を調製し、次いで１ 、０００ 、０００ＭＷＵ／ｍｌ
の測定された活性により決定した高い初期酵素濃度に水
で調節し、そしてさらに７つのアリコートに分割した。
マルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）−２５０をアリコートの
うちの６つに１％、２％、３％、４％、５％および１０
％の量で添加し、そして１つのアリコートを対照（０％
のマリトリン−２５０）として保持した。添加後、試料
をよく攪拌して均一に混合し、モしてｐＨをＫＯＨでｐ
Ｈ８，０に調節した。初期の活性をマルトリン（ＭＡＬ
ＴＲＩＮ）を添加したため希釈物について補正した。す
なわち、それぞれの量のマルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）
−２５０を含有する適切なブランクを、また、調製して
アッセイへのマルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）の影響によ
る誤差を排除した。すべての試料をｉｏ’ｃで２４待間
貯蔵した。特定した時間後、試料を濾過した。前述のよ
うに、酵素の量を活性の測定により決定する。こうして
、濾液中の酵素の量を測定し、そして補正した酵素の初
期量から減じて沈殿物中に損失された酵素の量を得、こ
れを式１ｏｏｘ（沈殿した酵素／初期の酵素）を使用し
て沈殿した酵素％に変換した。結果を下表■に要約する
。
うちの６つに１％、２％、３％、４％、５％および１０
％の量で添加し、そして１つのアリコートを対照（０％
のマリトリン−２５０）として保持した。添加後、試料
をよく攪拌して均一に混合し、モしてｐＨをＫＯＨでｐ
Ｈ８，０に調節した。初期の活性をマルトリン（ＭＡＬ
ＴＲＩＮ）を添加したため希釈物について補正した。す
なわち、それぞれの量のマルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）
−２５０を含有する適切なブランクを、また、調製して
アッセイへのマルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）の影響によ
る誤差を排除した。すべての試料をｉｏ’ｃで２４待間
貯蔵した。特定した時間後、試料を濾過した。前述のよ
うに、酵素の量を活性の測定により決定する。こうして
、濾液中の酵素の量を測定し、そして補正した酵素の初
期量から減じて沈殿物中に損失された酵素の量を得、こ
れを式１ｏｏｘ（沈殿した酵素／初期の酵素）を使用し
て沈殿した酵素％に変換した。結果を下表■に要約する
。
友Ｊ
１０’Ｃで２４時間貯蔵した、１，０００ 、０００Ｍ
ＷＵ／ｍ １（７）高い初期酵素濃度、ｐＨ８，０にお
けるアルファ−アミラーゼの水性安定化へのマルトリン
−２５０の濃度の効果 実施例 マルトリン−２５０沈殿した Ｌ番屋 の濃度（％ｗ／ｖ） 酵素％ｌ対照
０ ８０水性酵素溶液は、Ｎａ２
ＳＯ４の沈殿により不純物を除去しであるので、上の
実施例工に記載する濃縮した培養濾液よりも非常に純粋
であった。
ＷＵ／ｍ １（７）高い初期酵素濃度、ｐＨ８，０にお
けるアルファ−アミラーゼの水性安定化へのマルトリン
−２５０の濃度の効果 実施例 マルトリン−２５０沈殿した Ｌ番屋 の濃度（％ｗ／ｖ） 酵素％ｌ対照
０ ８０水性酵素溶液は、Ｎａ２
ＳＯ４の沈殿により不純物を除去しであるので、上の
実施例工に記載する濃縮した培養濾液よりも非常に純粋
であった。
こうして、木質的にすべての酵素活性を溶液中に維持す
るために３％Ｗ／Ｖより多いマルトリン（ＭＡＬＴＲＩ
Ｎ）は不必要であった。理解できるように、マルトリン
（ＭＡＬＴＲＩＮ）−２５０の濃度が３％ｗ／ｖ以上で
あるとき、酵素は沈殿せず、こうしてその活性により測
定してアミラーゼの１００％が濾液中に残留した。
るために３％Ｗ／Ｖより多いマルトリン（ＭＡＬＴＲＩ
Ｎ）は不必要であった。理解できるように、マルトリン
（ＭＡＬＴＲＩＮ）−２５０の濃度が３％ｗ／ｖ以上で
あるとき、酵素は沈殿せず、こうしてその活性により測
定してアミラーゼの１００％が濾液中に残留した。
実施例■
実施例■を反復したが、ただしこ今度はマルトリン（Ｍ
ＡＬＴＲＩ Ｎ）の添加量を一定に保持し、そしてその
デキストロース当量を変化させた。こうして高い活性に
おけるアルファ−アミラーゼの安定化に対するマルトデ
キストリンのｍ今度（Ｄ Ｐ）の効果を研究した。デキ
ストロース当ｆｆ１（ＤＥ）が異なるマルトデキストリ
ンを、１ 、０００ 、 ＯＯＯＭＷＵ／ｍ １ｃ７）
初期活性を含有する水性濃縮アルファ−アミラーゼの８
つのアリコートに８％ｗ／ｖの量で添加した。各試料の
ｐＨをＫＯＨで８．０に調節し、そして活性をマルトリ
ン（ＭＡＬＴＲＩＮ）の添加について補正した。試料を
１０℃で２４時間貯蔵した。特定した時間後、貯蔵した
試料を濾過した。濾液をアルファ−アミラーゼ活性につ
いてアッセイし、そして沈殿した酵素％を実施例■にお
けるのと同じ方法で計算した。結果を下表に要約する。
ＡＬＴＲＩ Ｎ）の添加量を一定に保持し、そしてその
デキストロース当量を変化させた。こうして高い活性に
おけるアルファ−アミラーゼの安定化に対するマルトデ
キストリンのｍ今度（Ｄ Ｐ）の効果を研究した。デキ
ストロース当ｆｆ１（ＤＥ）が異なるマルトデキストリ
ンを、１ 、０００ 、 ＯＯＯＭＷＵ／ｍ １ｃ７）
初期活性を含有する水性濃縮アルファ−アミラーゼの８
つのアリコートに８％ｗ／ｖの量で添加した。各試料の
ｐＨをＫＯＨで８．０に調節し、そして活性をマルトリ
ン（ＭＡＬＴＲＩＮ）の添加について補正した。試料を
１０℃で２４時間貯蔵した。特定した時間後、貯蔵した
試料を濾過した。濾液をアルファ−アミラーゼ活性につ
いてアッセイし、そして沈殿した酵素％を実施例■にお
けるのと同じ方法で計算した。結果を下表に要約する。
人！
１０℃で２４時間貯蔵した、１，００
０．０００ＭＷＵ／ｍｌの高い初期酵素濃度におけるア
ルファ−アミラーゼの水性安定化へのマルトＩ）Ｈの効
果 実施例 測定した 沈殿した塁蚤ｊ
−一匠訟基且一 ＤＥ 醗泉邂Ａｌ マ
ルトリン−゛ ０４０ ５．２ ４０．０２ マルト
リン− １００１１，４４１，５ ３マルトリン− １５０１６，１４１，５ ４マルトリン− ２００２２，５４５，５ ５マルトリン− ２５０２３，６４５，５ ６マルトリン− ３６５３５，７５１，０ ７マルトース ６８．０ ８２．０８ グル
コース １００．０ ８５．０９対照 なし
−−８０，６表口の結果が示すように、酵素の
安定化はマルトデキストリンのＤＥの減少とともに増加
した。
ルファ−アミラーゼの水性安定化へのマルトＩ）Ｈの効
果 実施例 測定した 沈殿した塁蚤ｊ
−一匠訟基且一 ＤＥ 醗泉邂Ａｌ マ
ルトリン−゛ ０４０ ５．２ ４０．０２ マルト
リン− １００１１，４４１，５ ３マルトリン− １５０１６，１４１，５ ４マルトリン− ２００２２，５４５，５ ５マルトリン− ２５０２３，６４５，５ ６マルトリン− ３６５３５，７５１，０ ７マルトース ６８．０ ８２．０８ グル
コース １００．０ ８５．０９対照 なし
−−８０，６表口の結果が示すように、酵素の
安定化はマルトデキストリンのＤＥの減少とともに増加
した。
また、マルトースまたはグルコースの添加は、対照に比
較して、沈殿した酵素の減少に対してして効果を示さず
、むしろそれをわずかに増加させる効果を示した。
較して、沈殿した酵素の減少に対してして効果を示さず
、むしろそれをわずかに増加させる効果を示した。
Ａ（マルトリンなし）
実施例Ｈに記載するような限外濾過およびＮａ２ＳＯ４
の沈殿法（２０％ｗ／ｖ）により得られた濃縮アル７ア
ーアミラーゼ溶液を、この実施例のために使用した。
の沈殿法（２０％ｗ／ｖ）により得られた濃縮アル７ア
ーアミラーゼ溶液を、この実施例のために使用した。
濃縮酵素溶液のｐＨをＫＯＨでｐＨ８，０に調節し、次
いでこの溶液をさらに３つの試料に分割した。次いで、
試料の各々の酵素の濃度を水で、それぞれ１．０００
、ＯＯＯＭＷＵ／ｍｌ、７００ 、ＯＯＯＭＷＵ／ｍｌ
および３５，０００ＭＷＵ／ｍｌの活性に調節した。次
いで、３つの試料の各々を４つの部分に分割し、そして
５°Ｃ５１０°Ｃ１２４℃および３７℃で１８時間貯蔵
した。特定した時間後、試料をワットマン（Ｗｈａｔｍ
ａｎ）ＮＯ，３の濾紙で濾過し、そして濾液中の酵素の
量を活性の測定により決定し、そして沈殿した酵素％を
１００（初期酵素−濾液酵素）／初期酵素を使用して計
算した。結果を下表Ａに報告する。
いでこの溶液をさらに３つの試料に分割した。次いで、
試料の各々の酵素の濃度を水で、それぞれ１．０００
、ＯＯＯＭＷＵ／ｍｌ、７００ 、ＯＯＯＭＷＵ／ｍｌ
および３５，０００ＭＷＵ／ｍｌの活性に調節した。次
いで、３つの試料の各々を４つの部分に分割し、そして
５°Ｃ５１０°Ｃ１２４℃および３７℃で１８時間貯蔵
した。特定した時間後、試料をワットマン（Ｗｈａｔｍ
ａｎ）ＮＯ，３の濾紙で濾過し、そして濾液中の酵素の
量を活性の測定により決定し、そして沈殿した酵素％を
１００（初期酵素−濾液酵素）／初期酵素を使用して計
算した。結果を下表Ａに報告する。
ハ
種々の温度で１８時間貯蔵した、ＰＨ
８，０における沈殿した酵素への温度および初期酵素濃
度の効果 インキュベー ｐＨ８，０で１ 初期酵素活性 ジョン温度、 ８時間後の沈殿ＭＷＵ
／ｍｌ”ｃ した酵素、％１、 １．００ ０．０００ ５ ８１．３１０
８０．０ ２５ ８０ 、７ ３７ ７５ 、０ １、 ７００゜ ０００ ５ ４４．３１０
４５．６ ２５ ４１．４ ３７ ２３．８ １、 ３５０゜ ０００ ５ ４．８１０
７．３ ２５ ７．３ ３７ ０．０ 上の表の結果は、マルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）の不存
在下の初期酵素と酵素の沈殿度との間の相関関係を明瞭
に示す。１，０００，０００ＭＷＵ／ｍｌの高い初期活
性を含有する水性酵素溶液をｐＨ８，０において１８時
間貯蔵すると、７５〜８１．３％の酵素を沈殿させるが
、これに対しテ３５ 、 ＯＯＯＭＷＵ／ｍ １の低い
初期活性は酵素を沈殿物中にわずかに７．３％の酵素を
損失させるだけである。換言すると、酵素溶液の効力は
増加するにつれて、すなわち、その溶液がより高い濃度
のアルファ−アミラーゼを有するにつれて、酵素は溶液
中にとどまるようりはむしろ沈殿する傾向を有する。
度の効果 インキュベー ｐＨ８，０で１ 初期酵素活性 ジョン温度、 ８時間後の沈殿ＭＷＵ
／ｍｌ”ｃ した酵素、％１、 １．００ ０．０００ ５ ８１．３１０
８０．０ ２５ ８０ 、７ ３７ ７５ 、０ １、 ７００゜ ０００ ５ ４４．３１０
４５．６ ２５ ４１．４ ３７ ２３．８ １、 ３５０゜ ０００ ５ ４．８１０
７．３ ２５ ７．３ ３７ ０．０ 上の表の結果は、マルトリン（ＭＡＬＴＲＩＮ）の不存
在下の初期酵素と酵素の沈殿度との間の相関関係を明瞭
に示す。１，０００，０００ＭＷＵ／ｍｌの高い初期活
性を含有する水性酵素溶液をｐＨ８，０において１８時
間貯蔵すると、７５〜８１．３％の酵素を沈殿させるが
、これに対しテ３５ 、 ＯＯＯＭＷＵ／ｍ １の低い
初期活性は酵素を沈殿物中にわずかに７．３％の酵素を
損失させるだけである。換言すると、酵素溶液の効力は
増加するにつれて、すなわち、その溶液がより高い濃度
のアルファ−アミラーゼを有するにつれて、酵素は溶液
中にとどまるようりはむしろ沈殿する傾向を有する。
、 Ｂ（マルトリンなし）
実施例Ａを反復したが、ただし今度は活性を一定に保持
し、そしてＰＨを変化させた。
し、そしてＰＨを変化させた。
水で１．０００ 、ＯＯＯＭＷＵ／ｍｌの初期活性に調
節した濃縮溶液の実施例Ａにおけるようなアリコートを
、６つのアリコートの分割した。各々をＫＯＨでそれぞ
れｐＨ５，５、ｐＥ（６、５、ｐＨ７、５、ｐＨ８、５
、ｐＨ９，５およびｐＨ１０，５に調節し、そして５℃
で１８時間貯蔵した。貯蔵後、試料をワットマン（Ｗｈ
ａｔｍａｎ）Ｎｏ、３の濾紙で謹過し、濾液中に残留す
る酵素を決定し、次いで沈殿した酵素％を実施例Ａにお
けるのと同一の方法で計算した。結果を下表Ｂに要約す
る。
節した濃縮溶液の実施例Ａにおけるようなアリコートを
、６つのアリコートの分割した。各々をＫＯＨでそれぞ
れｐＨ５，５、ｐＥ（６、５、ｐＨ７、５、ｐＨ８、５
、ｐＨ９，５およびｐＨ１０，５に調節し、そして５℃
で１８時間貯蔵した。貯蔵後、試料をワットマン（Ｗｈ
ａｔｍａｎ）Ｎｏ、３の濾紙で謹過し、濾液中に残留す
る酵素を決定し、次いで沈殿した酵素％を実施例Ａにお
けるのと同一の方法で計算した。結果を下表Ｂに要約す
る。
入互
５℃で１８時１ｍ貯蔵した、高い初期活性における沈殿
したアルファ−アミラーゼ酵素へのｐＨの効果 実施例 沈殿したΩ蚤旦
ｐＨ酵素％ １ ５．５ ０２
６．５ ９．０３ ７．５
Ｂ５．０４ ８．５
８０．０５ ９．５ ７６．５６
１０．５ ５２．０溶液から酵素
が沈殿する程度はｐＨがｐＨ６。
したアルファ−アミラーゼ酵素へのｐＨの効果 実施例 沈殿したΩ蚤旦
ｐＨ酵素％ １ ５．５ ０２
６．５ ９．０３ ７．５
Ｂ５．０４ ８．５
８０．０５ ９．５ ７６．５６
１０．５ ５２．０溶液から酵素
が沈殿する程度はｐＨがｐＨ６。
５からｐＨ８，５へ増加するにつれて増加し、そしてｐ
Ｈ８，５において最高になった。ｐＨ８。
Ｈ８，５において最高になった。ｐＨ８。
６より高いＰＨにおいて、沈殿物中に損失される酵素の
減少が観測され、これは沈殿した酵素の高いアルカリ性
のｐＨにおける可溶化のためであろう。高い初期濃度に
おける酵素の最大の溶解度はｐＨ５，５においておこり
、このｐＨは酵素の等重点に近づくことは注目に値する
。それにもかかわらず、前述のように、このような酸性
のｐＨは長い貯蔵の間に酵素を変性させるであろう。
減少が観測され、これは沈殿した酵素の高いアルカリ性
のｐＨにおける可溶化のためであろう。高い初期濃度に
おける酵素の最大の溶解度はｐＨ５，５においておこり
、このｐＨは酵素の等重点に近づくことは注目に値する
。それにもかかわらず、前述のように、このような酸性
のｐＨは長い貯蔵の間に酵素を変性させるであろう。
比較例Ｃ（マルトリンなし）
ｐＨ８，０におけるアルファ−アミラーゼの沈殿速度へ
の温度の効果 実施例Ｂにおけるような１，０００，０００ＭＷＵ／ｍ
ｌの初期活性を含有する濃縮した水性酵素溶液の７リコ
ートを２つの異なるフラスコ（各試料について１５０ｍ
１）中に分離し、ただし各々のＰＨを水酸化ナトリウム
で８．０に調節した。次いで、これらの２つの試料をそ
れぞれ１０°Ｃおよび３７℃で貯蔵した。ｌｏｍｌのア
リコートを異なる時間間隔、すなわち、２．５時間、４
時間、７時間、１０時間、１２時間および２０時間で各
フラスコから取り出した。取り出した直後に、各アリコ
ートをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｎｏ、３の濾紙で
泣過し、そして溶液をアルファ−アミラーゼについてア
ッセイした。次いで、沈殿した酵素％を実施例Ａにおけ
るのと同じ方法で計算した。結果を下表Ｃに要約する。
の温度の効果 実施例Ｂにおけるような１，０００，０００ＭＷＵ／ｍ
ｌの初期活性を含有する濃縮した水性酵素溶液の７リコ
ートを２つの異なるフラスコ（各試料について１５０ｍ
１）中に分離し、ただし各々のＰＨを水酸化ナトリウム
で８．０に調節した。次いで、これらの２つの試料をそ
れぞれ１０°Ｃおよび３７℃で貯蔵した。ｌｏｍｌのア
リコートを異なる時間間隔、すなわち、２．５時間、４
時間、７時間、１０時間、１２時間および２０時間で各
フラスコから取り出した。取り出した直後に、各アリコ
ートをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｎｏ、３の濾紙で
泣過し、そして溶液をアルファ−アミラーゼについてア
ッセイした。次いで、沈殿した酵素％を実施例Ａにおけ
るのと同じ方法で計算した。結果を下表Ｃに要約する。
人旦
ｐＨ８，０におけるアルファ−アミラーゼの沈殿速度へ
の温度の効果 時間（時間） 沈殿した酵素 ｌＯ℃ ３７℃ ２．５ − − 表Ｃの結果が示すように、低い温度は酵素の沈殿に好適
であるが、３７℃はその可溶化を促進する。
の温度の効果 時間（時間） 沈殿した酵素 ｌＯ℃ ３７℃ ２．５ − − 表Ｃの結果が示すように、低い温度は酵素の沈殿に好適
であるが、３７℃はその可溶化を促進する。
表Ａ、表Ｂおよび表Ｃを要約すると、結果は種々のｐＨ
および温度における溶液中の初期酵素と沈殿物中の酵素
の損失度との相関関係明瞭に示しめしている。酵素溶液
から水を除去する、すなわち、高い活性の濃縮溶液をつ
くると、蛋白質−蛋白質の相互作用が増加し、この作用
は実施例の７グロメレーシヨンを促進して酵素を沈殿さ
せる。
および温度における溶液中の初期酵素と沈殿物中の酵素
の損失度との相関関係明瞭に示しめしている。酵素溶液
から水を除去する、すなわち、高い活性の濃縮溶液をつ
くると、蛋白質−蛋白質の相互作用が増加し、この作用
は実施例の７グロメレーシヨンを促進して酵素を沈殿さ
せる。
実施例工、■および■と比較すると、明らかに示される
ように、高い活性の濃縮溶液へのマルトリン（ＭＡＬＴ
ＲＩＮ）の添加は蛋白質−蛋白質の相互作用を阻止し、
そして酵素の溶解を特徴する
ように、高い活性の濃縮溶液へのマルトリン（ＭＡＬＴ
ＲＩＮ）の添加は蛋白質−蛋白質の相互作用を阻止し、
そして酵素の溶解を特徴する
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、バシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を発酵させてこの発酵か
らの熱安定性アルファ−アミラーゼおよび固体の廃棄生
成物を含有する発酵培地を調製することにより熱安定性
アルファ−アミラーゼを製造する方法において、（ａ）
前記発酵培地に澱粉を添加することからなり、前記澱粉
は、十分な量で添加されたとき、酵素−酵素のアグロメ
レーションを抑制し、これにより前記アルファ−アミラ
ーゼの水溶液中の溶解度を向上させることを特徴とする
熱安定性アルファ−アミラーゼを製造する方法。 ２、前記澱粉の添加前に前記発酵培地を処理して固体の
廃棄生成物を除去して細胞不含酵素含有溶液を調製し、
これに澱粉を添加し、これにより水性の、実質的に溶解
安定性のアルファ−アミラーゼ生成物をつくる特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ３、（ａ）は澱粉を酵素含有溶液中に約０．１％〜５０
％（澱粉対溶液の重量／容量）の量で混合することによ
って達成され、ここで澱粉を直接添加するか、あるいは
澱粉をまずＨ＿２Ｏ中に溶解しそして澱粉の得られた水
溶液を添加する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、酵素含有溶液を約１〜１０倍に濃縮し、そして濃縮
の間または後に澱粉を添加する特許請求の範囲第３項記
載の方法。 ５、澱粉の添加の前または後に、ｐＨを前記酵素のほぼ
等電点から前記等電点よりほぼ４．０のｐＨ単位までの
範囲内のある点に調節する特許請求の範囲第４項記載の
方法。 ６、水性生成物の活性は≧３５，０００ＭＷＵ／ｍｌで
ある特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、澱粉はアルファ−アミラーゼの基質である特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ８、澱粉基質はコーンシロップまたはマルトデキストリ
ンである特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、澱粉基質は約３５以下のデキストロース当量を有す
るマルトデキストリンである特許請求の範囲第８項記載
の方法。 １０、固体の廃棄生成物を除去して細胞不含酵素含有溶
液を形成した後かつ澱粉の添加前に、塩類および低分子
量の有機溶媒から成る群より選択される沈殿剤を前記酵
素含有溶液へ添加して前記酵素を含有するケークを沈殿
物させ、次いで前記酵素を前記酵素含有ケークから（ｉ
）水中に抽出し、次いで前記抽出液に澱粉を約０．１％
〜５０％（澱粉対溶液の重量／容量）の量で添加するか
、あるいは（ｉｉ）澱粉を約０．１％〜５０％（澱粉対
溶液の重量／容量）の量で含有する水中に抽出する特許
請求の範囲第２項記載の方法。 １１、ケークからの酵素の抽出は、水または澱粉の水溶
液をケークを通して循環させるか、あるいはケークを水
または澱粉の水溶液の中にスラリー化することから本質
的に成る特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、澱粉の添加の前または後に、前記抽出液のｐＨを
前記酵素のほぼ等電点から前記等電点よりほぼ４．０の
ｐＨ単位までの範囲内のある点に調節する特許請求の範
囲第１０項記載の方法。 １３、前記塩の沈殿剤は硫酸ナトリウム、硫酸アンモニ
ウムおよびそれらの混合物から成る群より選択され、そ
して前記有機溶媒の沈殿剤はメタノール、エタノール、
１−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール
、ｔｅｒｔ−ブタノールおよびそれらの混合物から成る
群より選択される特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １４、沈殿剤を添加する前に、酵素含有溶液を約１〜１
０倍に濃縮する特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １５、水性生成物の活性は≧３５，０００ＭＷＵ／ｍｌ
である特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、澱粉はアルファ−アミラーゼの基質である特許請
求の範囲第１０項記載の方法。 １７、澱粉基質はコーンシロップまたはマルトデキスト
リンである特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、澱粉基質は約３５以下のデキストロース当量を有
するマルトデキストリンである特許請求の範囲第８項記
載の方法。 １９、特許請求の範囲第２項記載の方法によってつくら
れた水性の、実質的に溶解安定性のアルファ−アミラー
ゼ生成物。 ２０、特許請求の範囲第１４項記載の方法によってつく
られた水性の、実質的に溶解安定性のアルファ−アミラ
ーゼ生成物。 ２１、バシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの熱安定性アルフ
ァ−アミラーゼおよび約０．１％〜５０％ｗ／ｖの量の
澱粉を含んでなることを特徴とする水性の、実質的に溶
解安定性のアルファ−アミラーゼ生成物の配合物。 ２２、バシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの熱安定性アルフ
ァ−アミラーゼ以外のアミラーゼ、プロテアーゼ、また
はそれらの混合物をさらに含む特許請求の範囲第２１項
記載の配合物。 ２３、両性、アニオン性、カチオン性、非イオン性、双
性または半極性非イオン性の界面活性剤あるいはそれら
の混合物から成る群より選択される洗浄剤の界面活性剤
を約０％〜約８０％の量でさらに含む特許請求の範囲第
２１項記載の配合物。 ２４、両性、アニオン性、カチオン性、非イオン性、双
性または半極性非イオン性の界面活性剤あるいはそれら
の混合物から成る群より選択される洗浄剤の界面活性剤
を約０％〜約８０％の量でさらに含む特許請求の範囲第
２２項記載の配合物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US794282 | 1985-11-04 | ||
| US06/794,282 US4724208A (en) | 1985-11-04 | 1985-11-04 | Process for the production of solution stable alpha-amylase and liquid alpha-amylase produced thereby |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62111684A true JPS62111684A (ja) | 1987-05-22 |
| JPH0437717B2 JPH0437717B2 (ja) | 1992-06-22 |
Family
ID=25162214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61258703A Granted JPS62111684A (ja) | 1985-11-04 | 1986-10-31 | 溶解安定性アルフアーアミラーゼの製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4724208A (ja) |
| JP (1) | JPS62111684A (ja) |
| CN (1) | CN1017450B (ja) |
| CA (1) | CA1281300C (ja) |
| DE (1) | DE3636825C2 (ja) |
| DK (1) | DK168050B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5380542A (en) * | 1992-06-19 | 1995-01-10 | Rhone-Poulenc Specialties Chemical Co. | Dietary fiber compositions for use in foods |
| DK0670367T3 (da) * | 1993-05-19 | 2003-11-24 | Kao Corp | Flydendegørende alkalisk alfa-amylase, fremgangsmåde til fremstilling af denne og detergentsammensætning indeholdende denne |
| US5646044A (en) * | 1995-03-02 | 1997-07-08 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Expression systems for the production of target proteins in bacillus |
| RU2177995C2 (ru) * | 1998-02-05 | 2002-01-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов |
| GB9807721D0 (en) * | 1998-04-08 | 1998-06-10 | Chiron Spa | Antigen |
| DE19956382A1 (de) * | 1999-11-24 | 2001-05-31 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Herstellung von mikroverkapselten Enzymen |
| CN100491525C (zh) * | 2000-07-28 | 2009-05-27 | 汉高两合股份公司 | 从芽孢杆菌a7-7(dsm 12368)中提取的新型淀粉分解酶以及含有该新型淀粉分解酶的洗涤剂和清洗剂 |
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| CN109628429B (zh) * | 2019-01-09 | 2021-11-30 | 福州大学 | 一种极端嗜盐、耐表面活性剂的非钙离子依赖型α-淀粉酶及其基因和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4835083A (ja) * | 1971-09-07 | 1973-05-23 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4010073A (en) * | 1975-06-25 | 1977-03-01 | Rohm And Haas Company | Free-flowing enzyme composition |
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-
1985
- 1985-11-04 US US06/794,282 patent/US4724208A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-10-03 CA CA000519803A patent/CA1281300C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-29 DE DE3636825A patent/DE3636825C2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1986-11-03 DK DK523686A patent/DK168050B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-11-03 MX MX4249A patent/MX163682B/es unknown
- 1986-11-03 CN CN86107635.4A patent/CN1017450B/zh not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4835083A (ja) * | 1971-09-07 | 1973-05-23 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN86107635A (zh) | 1987-05-13 |
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