JPS62130697A - ペプチドの製造法 - Google Patents
ペプチドの製造法Info
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- JPS62130697A JPS62130697A JP60271050A JP27105085A JPS62130697A JP S62130697 A JPS62130697 A JP S62130697A JP 60271050 A JP60271050 A JP 60271050A JP 27105085 A JP27105085 A JP 27105085A JP S62130697 A JPS62130697 A JP S62130697A
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- JP
- Japan
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- hanp
- peptide
- plasmid
- genome
- activity
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の利用分野）
本発明はペプチドの製造法に関する。さらに詳しくは、
ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰと略す）
ゲノムが挿入された牛・やビローマウイルス（ＢＰＶと
略す）由来のプラスミドベクターによって形質転換され
た動物細胞を培養して得ることを！Ｖｊ徴とするヒヨコ
直腸平滑筋の弛緩活性を有する被ゾチド、又は、α−ｈ
ＡＮＰ抗体と免疫学的に交叉反応するペプチドの製造法
に関する。
ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰと略す）
ゲノムが挿入された牛・やビローマウイルス（ＢＰＶと
略す）由来のプラスミドベクターによって形質転換され
た動物細胞を培養して得ることを！Ｖｊ徴とするヒヨコ
直腸平滑筋の弛緩活性を有する被ゾチド、又は、α−ｈ
ＡＮＰ抗体と免疫学的に交叉反応するペプチドの製造法
に関する。
（本発明が解決しようとする問題点）
近年、ラットの心房抽出液がナトリウム利尿作用を有す
ることが見出され（Ｄｅ Ｂｏｌｄ、Ａ、Ｊ、ら。
ることが見出され（Ｄｅ Ｂｏｌｄ、Ａ、Ｊ、ら。
Ｌｉｆｅ ５ｃｌｅｎｃｅ ２８＋ ８９ ＋ １９８
１ ）、さらに心房中にす） ＩＪウム利尿作用を有す
る分子量２万〜３万および１万以下のペプチド様物質が
存在することが示された（ Ｃｕｒｒｉｓ、 Ｍ、Ｇ、
ら、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２１ ＋７１．１９８３）。
１ ）、さらに心房中にす） ＩＪウム利尿作用を有す
る分子量２万〜３万および１万以下のペプチド様物質が
存在することが示された（ Ｃｕｒｒｉｓ、 Ｍ、Ｇ、
ら、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２１ ＋７１．１９８３）。
又、最近、寒月らはヒト心房から利尿作用を有する２８
個のアミノ酸からなる被プチドを単離し、アミノ酸配列
を決定してこれをα−ｈＡＮＰ （α−ｈｕｍａｎ ａ
ｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐ
ｔｉｄｅ ）と命名した（ Ｋａｎｇａｗａ、に、らｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍ。
個のアミノ酸からなる被プチドを単離し、アミノ酸配列
を決定してこれをα−ｈＡＮＰ （α−ｈｕｍａｎ ａ
ｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐ
ｔｉｄｅ ）と命名した（ Ｋａｎｇａｗａ、に、らｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 、 １
１８ 、１３１ 、１９８４）。そして、彼等はこのペ
プチドが顕著な利尿作用（特にナトリウム利尿作用）の
他に血圧降下作用を有することを明らかにした。さらに
彼等は、ヒト心房中から同様のナトリウム利尿活性を有
するβ−ｈＡＮＰ（アミノ酸５６個からなるα−ｈＡＮ
Ｐの逆平行γ 二量体）および或−ｂＡＮＰ （Ｃ末端部にα−ｈＡＮ
Ｐ構造をもつアミノ酸１２６個からなる刀ｅリペプチド
）を単離・同定し、それらのアミノ酸配列も決定した（
Ｋａｎｇａｗａ、に＋ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３．３
９７．１９８５）。
１８ 、１３１ 、１９８４）。そして、彼等はこのペ
プチドが顕著な利尿作用（特にナトリウム利尿作用）の
他に血圧降下作用を有することを明らかにした。さらに
彼等は、ヒト心房中から同様のナトリウム利尿活性を有
するβ−ｈＡＮＰ（アミノ酸５６個からなるα−ｈＡＮ
Ｐの逆平行γ 二量体）および或−ｂＡＮＰ （Ｃ末端部にα−ｈＡＮ
Ｐ構造をもつアミノ酸１２６個からなる刀ｅリペプチド
）を単離・同定し、それらのアミノ酸配列も決定した（
Ｋａｎｇａｗａ、に＋ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３．３
９７．１９８５）。
一方、本発明者らのグループは、このナトリウム利尿作
用を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ断片をク
ローニングしく Ｏｉｋａｗａ＋Ｓ、ら、 Ｎａｔｕｒ
ｅ３０９ｓ７２４．１９８４）、さらに、大腸菌内で該
ポリペプチドを発現させることにも成功した（特願昭５
９−１１６６０５）。
用を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ断片をク
ローニングしく Ｏｉｋａｗａ＋Ｓ、ら、 Ｎａｔｕｒ
ｅ３０９ｓ７２４．１９８４）、さらに、大腸菌内で該
ポリペプチドを発現させることにも成功した（特願昭５
９−１１６６０５）。
近年、遺伝子操作技術を用いて成長ホルモン。
インシュリン、インターフェロンなど多くの生理滑性物
質が、大腸菌で生産されうるようになっているが、一方
では、大腸菌では生産されにくい物質や、生産されたと
し”Ｃも生物活性をもだない物質があるなどの問題も生
じている。この問題を解決するため、近年、動物細胞を
宿主とした有用物質の生産技術が注目を浴びている。こ
れは、動物細胞を宿主とした場合、翻訳後の蛋白質の修
飾が期待されるからである。
質が、大腸菌で生産されうるようになっているが、一方
では、大腸菌では生産されにくい物質や、生産されたと
し”Ｃも生物活性をもだない物質があるなどの問題も生
じている。この問題を解決するため、近年、動物細胞を
宿主とした有用物質の生産技術が注目を浴びている。こ
れは、動物細胞を宿主とした場合、翻訳後の蛋白質の修
飾が期待されるからである。
一般に、動物の生体内でつくられる有用生理活性物質で
は、翻訳後糖鎖の付加、アシル化、アミド化、プロセッ
シングなど、蛋白質が修飾を受けてはじめて生物活性を
有するものが多い。これらの生理活性物質は、大腸菌中
で生産させたとしても天然型と同等の活性を期待するこ
とはできない。
は、翻訳後糖鎖の付加、アシル化、アミド化、プロセッ
シングなど、蛋白質が修飾を受けてはじめて生物活性を
有するものが多い。これらの生理活性物質は、大腸菌中
で生産させたとしても天然型と同等の活性を期待するこ
とはできない。
何故なら、大腸菌では上記のような修飾機能がないから
である。また、動物細胞では、大腸菌の場合には困難で
ある蛋白質又はペプチドの細胞外への分泌も容易である
という特徴をもっている。
である。また、動物細胞では、大腸菌の場合には困難で
ある蛋白質又はペプチドの細胞外への分泌も容易である
という特徴をもっている。
天然型と同等の生理活性をもつ有用なペプチドを効率的
に生産・供給することは、産業上極めて重要なことであ
る。分子量の小さい一′！ゾチドの場合は、それを化学
的に合成し供給することは可能だが、分子量が大きい場
合は一般に困難である。
に生産・供給することは、産業上極めて重要なことであ
る。分子量の小さい一′！ゾチドの場合は、それを化学
的に合成し供給することは可能だが、分子量が大きい場
合は一般に困難である。
本発明者らは、上記の如き問題点および事実にかんがみ
鋭意研究の結果、ｈＡＮＰ活性を有するポリペプチド（
ヒヨコ直腸平滑筋の弛緩作用を有するポリ被プチド或い
はα−ｈＡＮＰ抗体と免疫学的に交叉反応するポリペプ
チド）を、ｈＡＮＰゲノムが挿入されたＢＰＶ由来のベ
クターによって形質転換された動物細胞を培養すること
により製造しうろことを見出し、本発明を完成するに至
った。
鋭意研究の結果、ｈＡＮＰ活性を有するポリペプチド（
ヒヨコ直腸平滑筋の弛緩作用を有するポリ被プチド或い
はα−ｈＡＮＰ抗体と免疫学的に交叉反応するポリペプ
チド）を、ｈＡＮＰゲノムが挿入されたＢＰＶ由来のベ
クターによって形質転換された動物細胞を培養すること
により製造しうろことを見出し、本発明を完成するに至
った。
（問題点を解決するための具体的手段）まず、既に本発
明者らのグループによって調製したｈＡＮＰのｃＤＮＡ
（Ｏｌｋａｗａ、Ｓ、らｐ Ｎａｔｕｒｅ ３０９
＃７２４．１９８４）をゾローブとして、米国のＭａｎ
ｉａｔｉｓのヒト遺伝子パンク（Ｌａｗｎ、Ｒ，Ｍ、ら
。
明者らのグループによって調製したｈＡＮＰのｃＤＮＡ
（Ｏｌｋａｗａ、Ｓ、らｐ Ｎａｔｕｒｅ ３０９
＃７２４．１９８４）をゾローブとして、米国のＭａｎ
ｉａｔｉｓのヒト遺伝子パンク（Ｌａｗｎ、Ｒ，Ｍ、ら
。
Ｃｅ１ｌ１５．１１５７．１９７８）より、ｈＡＮＰ染
色体遺伝子（ｈＡＮＰ ｆツム： ＢａｍＨＩ ３．４
ｋｂのＤＮＡ断片）が組み込まれているグラスミドｐＢ
ＲｈＡＮＰ−１を単離する。次に、第１図に示すように
、ｐＢＲｈＡＮＰ−１をＢａｍＨＩで切断して得られる
ｈＡＮＰダノムゲノの両端をＨｌｎｄＴＩ［粘着末端に
変えた後、そのＤＮＡ断片が、牛ＡピローマウイルスＤ
ＮＡ （ＢＰＶ−１）と、ｐＢＲ３２２の誘導体である
ｐＭＬ−２とが結合した、プラスミドｐｄＢＰＶ−１（
５ａｒｖｅｒ＋Ｎ、ら＊ Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｅｉ、ＵＳＡ＋７９．７１４７．１９８２）の
Ｈ１ｎｄ１１部位に挿入されたシラスミドｐ ＢＰＶｈ
ＡＮＰ−１を造成する。尚、本プラスミドにハ、牛ハビ
ローマウイルス（ＢＰＶ）の全ｒノムが含まれている。
色体遺伝子（ｈＡＮＰ ｆツム： ＢａｍＨＩ ３．４
ｋｂのＤＮＡ断片）が組み込まれているグラスミドｐＢ
ＲｈＡＮＰ−１を単離する。次に、第１図に示すように
、ｐＢＲｈＡＮＰ−１をＢａｍＨＩで切断して得られる
ｈＡＮＰダノムゲノの両端をＨｌｎｄＴＩ［粘着末端に
変えた後、そのＤＮＡ断片が、牛ＡピローマウイルスＤ
ＮＡ （ＢＰＶ−１）と、ｐＢＲ３２２の誘導体である
ｐＭＬ−２とが結合した、プラスミドｐｄＢＰＶ−１（
５ａｒｖｅｒ＋Ｎ、ら＊ Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｅｉ、ＵＳＡ＋７９．７１４７．１９８２）の
Ｈ１ｎｄ１１部位に挿入されたシラスミドｐ ＢＰＶｈ
ＡＮＰ−１を造成する。尚、本プラスミドにハ、牛ハビ
ローマウイルス（ＢＰＶ）の全ｒノムが含まれている。
また、先述の雑種シラスミドｐｄＢＰＶ−１は、標準的
なリン酸カルシウム法によるトランスフェクション（形
質転換）によってマウス細胞を癌化（フォーカス形成）
することが知られている（ Ｌｏｗｙ、Ｄ、Ｒ，ら、
Ｎａｔｕｒｅ ２８７ ｅ ７２ ＋１９８０）。
なリン酸カルシウム法によるトランスフェクション（形
質転換）によってマウス細胞を癌化（フォーカス形成）
することが知られている（ Ｌｏｗｙ、Ｄ、Ｒ，ら、
Ｎａｔｕｒｅ ２８７ ｅ ７２ ＋１９８０）。
次に、ｐＢＰＶｈＡＮＰ−１をリン酸カルシウム法によ
りマウスＣ１２７細胞に導入し、フォーカスを形成する
（形質転換された）細胞を分離する。そして、この形質
転換細胞を培養することにより、ヒヨコ直腸平滑筋の弛
緩活性を有する或いはα−ｈＡＮＰ抗体と免疫学的な反
応をするペプチドを得ることができる。心房抽出物から
得られる利尿活性を有する両分は同時にヒヨコ平滑筋弛
緩活性を有すること（Ｃｕｒｒｉｅ、Ｍ、Ｇ、ら＋ ５
ｃｉｅｎｃｅ ２２１ ＋ １９８３ ）、また、α−
ｈＡＮＰ抗体と交叉反応することから、ここで生産され
るＲプチドはγ−ｈＡＮＰ 、α−ｈＡＮＰを含む利尿
活性を有する一！ゾチド（ｈＡＮＰ ）であることはま
ちがいない。尚、上記の如き活性を有するペプチドは、
上記マウス形質転換体の培養液中からも細胞内からも得
ることができる。
りマウスＣ１２７細胞に導入し、フォーカスを形成する
（形質転換された）細胞を分離する。そして、この形質
転換細胞を培養することにより、ヒヨコ直腸平滑筋の弛
緩活性を有する或いはα−ｈＡＮＰ抗体と免疫学的な反
応をするペプチドを得ることができる。心房抽出物から
得られる利尿活性を有する両分は同時にヒヨコ平滑筋弛
緩活性を有すること（Ｃｕｒｒｉｅ、Ｍ、Ｇ、ら＋ ５
ｃｉｅｎｃｅ ２２１ ＋ １９８３ ）、また、α−
ｈＡＮＰ抗体と交叉反応することから、ここで生産され
るＲプチドはγ−ｈＡＮＰ 、α−ｈＡＮＰを含む利尿
活性を有する一！ゾチド（ｈＡＮＰ ）であることはま
ちがいない。尚、上記の如き活性を有するペプチドは、
上記マウス形質転換体の培養液中からも細胞内からも得
ることができる。
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明の範囲はそれに限定されるものではない。
、本発明の範囲はそれに限定されるものではない。
既にクローニングしたｃＤＮＡ （Ｏｉｋａｗａ＋８．
ら。
ら。
Ｎａｔｕｒｅ ３０９ 、７２４ 、１９８４ ）をグ
ローブとして、ヒト遺伝子パンク（Ｌａｗｎ＋Ｒ，Ｍ、
ら＋ Ｃｅ １１１５ ＋１１５７．１９７８）からス
クリーニングされたｐＢＲｈＡＮＰ−１（ｈＡＮＰゲノ
ム遺伝子を含む３４ ＫｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片が
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトに挿入されているプラ
スミド）１０μＩを６０ユニツトのＢａｍＨＩで３７℃
、１時間加温することによシ切断した。次に、６５℃１
０分間加温することによシ酵素反応を止め、２．５倍世
のエタノールを加え汐−２０℃に一夜放置することによ
ｐ ＤＮＡ断片を沈澱させた。続いて、該ＤＮＡ断片を
、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，２）、 １０ ｍＭ
ＭｇＳＯ４，０，１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ（ＤＴＴ）からなる溶液５ｏ ｔｔｌｌ中で、Ｋｌｅ
ｎｏｗｅｎｚｙｍｅ（ペーリンガーマンハイム社）５ユ
ニツｌ’ヲ用イて２６℃、２０分間反応させることによ
りＢａｍＩ（Ｉ断点の粘着末端を平滑末端にし、フェノ
ール−クロロフォルム抽出後、常法通りエタノールでＤ
ＮＡ断片を沈澱させた。次に、上記ＤＮＡ断片を２０ｍ
Ｍトリス塩酸（Ｐｌ（７，６） 、 １０ｍＭ ＭｇＣ
Ａ２．０．５ｍＭＡＴＰ 、 １０ ｍＭ ＤＴＴから
なる溶液２０μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡ ＋７ガーゼ２．８
ユニツトを用い２２℃、５時間さらに１４℃で一夜反応
させることにより、上記ＤＮＡ断片にＨｌ ｎｄＩＩ［
リンカ−（Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ ：宝酒造
社ｍ＞を付加した。反応は、６５℃で１０分間加温する
ことによシ止め、ＤＮＡ断片は常法通りエタノールによ
り沈澱して得た。続いて、５０ｍ？ｉｆ ＮａＣ６，１
０ｍＭ ＭｇＣＡ２．１ ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝溶液（ＰＨ７，５）５０μノ中で、Ｈｌ
ｎｄｌＩ［（１２０ユニツト）を用い３７℃２時間加温
することによシ、該ＤＮＡ断片の両末端をＨ１ｎｄｌＩ
ｌ粘着末端とした後、電気泳動法により該ＤＮＡ断片を
抽出・精製した。
ローブとして、ヒト遺伝子パンク（Ｌａｗｎ＋Ｒ，Ｍ、
ら＋ Ｃｅ １１１５ ＋１１５７．１９７８）からス
クリーニングされたｐＢＲｈＡＮＰ−１（ｈＡＮＰゲノ
ム遺伝子を含む３４ ＫｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片が
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトに挿入されているプラ
スミド）１０μＩを６０ユニツトのＢａｍＨＩで３７℃
、１時間加温することによシ切断した。次に、６５℃１
０分間加温することによシ酵素反応を止め、２．５倍世
のエタノールを加え汐−２０℃に一夜放置することによ
ｐ ＤＮＡ断片を沈澱させた。続いて、該ＤＮＡ断片を
、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，２）、 １０ ｍＭ
ＭｇＳＯ４，０，１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ（ＤＴＴ）からなる溶液５ｏ ｔｔｌｌ中で、Ｋｌｅ
ｎｏｗｅｎｚｙｍｅ（ペーリンガーマンハイム社）５ユ
ニツｌ’ヲ用イて２６℃、２０分間反応させることによ
りＢａｍＩ（Ｉ断点の粘着末端を平滑末端にし、フェノ
ール−クロロフォルム抽出後、常法通りエタノールでＤ
ＮＡ断片を沈澱させた。次に、上記ＤＮＡ断片を２０ｍ
Ｍトリス塩酸（Ｐｌ（７，６） 、 １０ｍＭ ＭｇＣ
Ａ２．０．５ｍＭＡＴＰ 、 １０ ｍＭ ＤＴＴから
なる溶液２０μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡ ＋７ガーゼ２．８
ユニツトを用い２２℃、５時間さらに１４℃で一夜反応
させることにより、上記ＤＮＡ断片にＨｌ ｎｄＩＩ［
リンカ−（Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ ：宝酒造
社ｍ＞を付加した。反応は、６５℃で１０分間加温する
ことによシ止め、ＤＮＡ断片は常法通りエタノールによ
り沈澱して得た。続いて、５０ｍ？ｉｆ ＮａＣ６，１
０ｍＭ ＭｇＣＡ２．１ ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝溶液（ＰＨ７，５）５０μノ中で、Ｈｌ
ｎｄｌＩ［（１２０ユニツト）を用い３７℃２時間加温
することによシ、該ＤＮＡ断片の両末端をＨ１ｎｄｌＩ
ｌ粘着末端とした後、電気泳動法により該ＤＮＡ断片を
抽出・精製した。
次に、上記ＤＮＡ断片０．４μｇとＨｌｎｄＩＩｌで消
化したｐｄＢＰＶ−１０，１４１４を、２０μノのライ
ダージョン溶液（１０ｍＭ ＭｇＣＡ２．１ ｍＭ Ａ
ＴＰ 、 ５ｍＭＤＴＴを含む２０ｍＭ）リス塩酸溶液
、 ｐ）１７．６ ）中で、２．８ユニツトのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造社製）と１４℃１６時間反応させた
。この反応液２０μｌを用い常法通シＣａ ＣＬ２処理
した大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換した。形質転換体は
、アンピシリン耐性（Ａｐｒ）を指標にスクリーニング
した。８つの形質転換体からプラスミドＤＮＡを常法通
シ調製し、Ｈｌｎｄｎ［消化によｐ ｈＡＮＰゲノム遺
伝子が含寸れていることを確かめた後、その１つｐＢＰ
ＶｈＡＮＰ−１を選択した。
化したｐｄＢＰＶ−１０，１４１４を、２０μノのライ
ダージョン溶液（１０ｍＭ ＭｇＣＡ２．１ ｍＭ Ａ
ＴＰ 、 ５ｍＭＤＴＴを含む２０ｍＭ）リス塩酸溶液
、 ｐ）１７．６ ）中で、２．８ユニツトのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造社製）と１４℃１６時間反応させた
。この反応液２０μｌを用い常法通シＣａ ＣＬ２処理
した大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換した。形質転換体は
、アンピシリン耐性（Ａｐｒ）を指標にスクリーニング
した。８つの形質転換体からプラスミドＤＮＡを常法通
シ調製し、Ｈｌｎｄｎ［消化によｐ ｈＡＮＰゲノム遺
伝子が含寸れていることを確かめた後、その１つｐＢＰ
ＶｈＡＮＰ−１を選択した。
２、 ｐＢＰＶｈＡＮＰ−１）？ウスＣ１２７細胞ヘ
ノ導入１０％牛脂児血清（Ｋ Ａ、 Ｂｌｏｐｒｏｄｕ
ｃｔ社）を含むＧｉｂｃｏ社製のＤＭＥ （ダルベツコ
変法イーグル）培地中で培養したマウスＣ１２７細胞を
、トランスフェクション前日に６ｃｒｎシヤーレに５×
１０ の細胞数になるようにまき、３７℃、５％ＣＯ２
インキ−ベーター中で培養を開始した。Ｃ１２７細胞へ
のＤＮＡ導入は以下のように行なった。
ノ導入１０％牛脂児血清（Ｋ Ａ、 Ｂｌｏｐｒｏｄｕ
ｃｔ社）を含むＧｉｂｃｏ社製のＤＭＥ （ダルベツコ
変法イーグル）培地中で培養したマウスＣ１２７細胞を
、トランスフェクション前日に６ｃｒｎシヤーレに５×
１０ の細胞数になるようにまき、３７℃、５％ＣＯ２
インキ−ベーター中で培養を開始した。Ｃ１２７細胞へ
のＤＮＡ導入は以下のように行なった。
エタノールによシ沈澱させだｐＢＰＶｈＡＮＰ−１シラ
スミド１０ｐｇヲ、２ ＸＴ（ＢＳ （ｐＨ７，０５）
すなわち１ノ中にＨＥＰＥＳ １０ ｇ、 ＮａＣ４１
６ｇ、 ＫＣＬ ０．７４ｊｉ ＊ ＮＩＬ２Ｔ（ＰＯ
４０，４ｇ＋ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２ ｇを溶解させ、
ＮａＯＨにて、ＰＨ７，０５に調整し、ｆ過滅菌した溶
液２５０μ！で溶解し、２５０ ｍＭ ＣａＣｔｚを滴
下しながら２５０μｌ加えた。この溶液を室温で４５５
分間静置たのち、Ｃ１２７細胞が生育している６ｃｍシ
ャーレに加えた。室温で２００分間静置たのち４．５ｍ
ｌのＤＭＥ培地を加え、３７℃で５１ Ｃｏ２インキュ
ーベーター中で培養した。４時間後に培地を除き、４ｍ
ｌの培地で洗浄後、２５％グリセロールを含むＤＭＥ培
地１ ｍｌを加え、１分間静置した。この液を除いて、
５ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗ったのち、５ゴのＤＭＥ
培地を加え、３７℃で５ ％ Ｃｏ２インキュベーター
中で培養を行なった。翌日、培地を除き、５ｍｌ！のＰ
ＢＳ（−）で２回洗ったのち、０．５ｍｌ！のトリゾシ
ンーＥＤＴＡ溶液（トリプシン０．１２５チ。
スミド１０ｐｇヲ、２ ＸＴ（ＢＳ （ｐＨ７，０５）
すなわち１ノ中にＨＥＰＥＳ １０ ｇ、 ＮａＣ４１
６ｇ、 ＫＣＬ ０．７４ｊｉ ＊ ＮＩＬ２Ｔ（ＰＯ
４０，４ｇ＋ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２ ｇを溶解させ、
ＮａＯＨにて、ＰＨ７，０５に調整し、ｆ過滅菌した溶
液２５０μ！で溶解し、２５０ ｍＭ ＣａＣｔｚを滴
下しながら２５０μｌ加えた。この溶液を室温で４５５
分間静置たのち、Ｃ１２７細胞が生育している６ｃｍシ
ャーレに加えた。室温で２００分間静置たのち４．５ｍ
ｌのＤＭＥ培地を加え、３７℃で５１ Ｃｏ２インキュ
ーベーター中で培養した。４時間後に培地を除き、４ｍ
ｌの培地で洗浄後、２５％グリセロールを含むＤＭＥ培
地１ ｍｌを加え、１分間静置した。この液を除いて、
５ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗ったのち、５ゴのＤＭＥ
培地を加え、３７℃で５ ％ Ｃｏ２インキュベーター
中で培養を行なった。翌日、培地を除き、５ｍｌ！のＰ
ＢＳ（−）で２回洗ったのち、０．５ｍｌ！のトリゾシ
ンーＥＤＴＡ溶液（トリプシン０．１２５チ。
ＥＤＴＡ Ｏ，０１％ ）を加え、３〜４分室温で静置
した。
した。
５ＴＬｌの培地を加え、細胞をはくシし、均一にけんた
くしたのち、１０００ ｒｐｍ 、 ５分間遠心し、細
胞を沈査させた。沈査を３ ｍｌの培地にけんだくし１
罰ずつを４ｍｌの培地を加えである６ｃｒｎシヤーレに
加えた。３７℃５％Ｃ０２インキユベーター中で細胞の
培養を続は培地は３日ごとに交換した。約３週間後に現
われたフォーカスを単離し、２４穴のプレート中で０．
５ ｍｌのＤＭＥ培地で培養を行った。
くしたのち、１０００ ｒｐｍ 、 ５分間遠心し、細
胞を沈査させた。沈査を３ ｍｌの培地にけんだくし１
罰ずつを４ｍｌの培地を加えである６ｃｒｎシヤーレに
加えた。３７℃５％Ｃ０２インキユベーター中で細胞の
培養を続は培地は３日ごとに交換した。約３週間後に現
われたフォーカスを単離し、２４穴のプレート中で０．
５ ｍｌのＤＭＥ培地で培養を行った。
３、形質転換細胞の生産物の生物活性
形質転換株（実施例２でフォーカスを形成したクローン
）の生産物の生物活性は、Ｃｕｒｒｉｅらの方法（Ｃｕ
ｒｒｉｅ＋Ｍ−Ｇ、ら、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２１ ＋
７１ ＋ １９８３）に従い、ヒヨコ直腸平滑筋の弛
緩活性を指標にして調べだ。尚、これまで分離されてい
るα−ｈＡＮＰ。
）の生産物の生物活性は、Ｃｕｒｒｉｅらの方法（Ｃｕ
ｒｒｉｅ＋Ｍ−Ｇ、ら、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２１ ＋
７１ ＋ １９８３）に従い、ヒヨコ直腸平滑筋の弛
緩活性を指標にして調べだ。尚、これまで分離されてい
るα−ｈＡＮＰ。
γ−ｈＡＮＰ 、またラット心房から分離された類似の
一次構造をもつペプチドは、利尿活性とともにヒヨコ直
腸平滑筋の弛緩活性を有することは既に知られている（
Ｋａｎｇａｗａ、に、らＢｌｏｃｈｅｍ、 Ｂｌｏｐ
ｈｙｓ、Ｒｅｓ。
一次構造をもつペプチドは、利尿活性とともにヒヨコ直
腸平滑筋の弛緩活性を有することは既に知られている（
Ｋａｎｇａｗａ、に、らＢｌｏｃｈｅｍ、 Ｂｌｏｐ
ｈｙｓ、Ｒｅｓ。
Ｃｏｍｍｕｎ、、１１８，１３１．１９８４およびＣｕ
ｒｒｉｅ、Ｍ、Ｇ。
ｒｒｉｅ、Ｍ、Ｇ。
ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２１，７１．１９８３）。以下
、本実施例で得られるヒヨコ直腸平滑筋の弛緩活性を有
する生産物を、ＡＮＰと略す。
、本実施例で得られるヒヨコ直腸平滑筋の弛緩活性を有
する生産物を、ＡＮＰと略す。
実施例２で得られたフォーカス形成した９個のクローン
（形質１換休）の培養液１５０μｌについて、上記の方
法でヒヨコ直腸平滑筋弛緩活性（以下、単に弛緩活性と
略す）を調べた。その結果、第１表に示す如くクローン
間に差はみられたが、すべてのクローンの培養液に弛緩
活性が認められた。対照として用いたｈＡＮＰ染色体遺
伝子を含まないＤＮＡ （ｐｄＢＶ −１）によって形
質転換された細胞では弛緩活性はみられなかった。尚、
第１表に示す弛緩活性の強さは、α−ｈＡＮＰ １０
ｐｍｏｌ 、 ２０ｐｍｏｌの活性を標準にして表わし
ている。
（形質１換休）の培養液１５０μｌについて、上記の方
法でヒヨコ直腸平滑筋弛緩活性（以下、単に弛緩活性と
略す）を調べた。その結果、第１表に示す如くクローン
間に差はみられたが、すべてのクローンの培養液に弛緩
活性が認められた。対照として用いたｈＡＮＰ染色体遺
伝子を含まないＤＮＡ （ｐｄＢＶ −１）によって形
質転換された細胞では弛緩活性はみられなかった。尚、
第１表に示す弛緩活性の強さは、α−ｈＡＮＰ １０
ｐｍｏｌ 、 ２０ｐｍｏｌの活性を標準にして表わし
ている。
次に、第１表で弛緩活性の強かったクローンの１つであ
るクローンＡ９について、Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎｅｌ、
Ａ、らの方法（Ｖｌｒｏｌｏｇｙ ２３ 、２９１ 、
１９６４ ）に従い０．３チ軟寒天中でサブクローニン
グを行い、得られたクローンＡ９−１４について、さら
に以下の実験を行った。
るクローンＡ９について、Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎｅｌ、
Ａ、らの方法（Ｖｌｒｏｌｏｇｙ ２３ 、２９１ 、
１９６４ ）に従い０．３チ軟寒天中でサブクローニン
グを行い、得られたクローンＡ９−１４について、さら
に以下の実験を行った。
４、生産物（ＡＮＰ ）の解析
まず、クローン扁９−１４のＡＮＰ生産量の日時変化を
、α−ｈＡＮＰ抗体を用いたラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）により測定した（Ｍｌｙａｔａら、Ｂｌｏｃｈｅ
ｒｎ。
、α−ｈＡＮＰ抗体を用いたラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）により測定した（Ｍｌｙａｔａら、Ｂｌｏｃｈｅ
ｒｎ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｙｎｍｕｎ、 、 １２
９ 、２４８ 、１９８５参考）。
９ 、２４８ 、１９８５参考）。
クローンＡ９−１４を６αシヤーレに５．５ Ｘ １．
０５個／ ５ ｍｌの濃度で接種して２日ごとに培地（
ＤＭＥ培地）を交換し、培地中に分泌したＡＮＰ Ｒを
上記のＲＩＡによって測定した。その結果、第２図に示
す如く、本クローンは、２５日間にわたって恒常的にＡ
ＮＰ （この場合、α−ｈＡＮＰ抗体と交叉反応する物
質）を培地に分泌し続けた。一方、対照となるｈＡＮＰ
遺伝子を含まないｐｄＢＶ−１によって形質転換された
クローン（クローン６８）では、ＡＮＰ生産能は認めら
れなかった。
０５個／ ５ ｍｌの濃度で接種して２日ごとに培地（
ＤＭＥ培地）を交換し、培地中に分泌したＡＮＰ Ｒを
上記のＲＩＡによって測定した。その結果、第２図に示
す如く、本クローンは、２５日間にわたって恒常的にＡ
ＮＰ （この場合、α−ｈＡＮＰ抗体と交叉反応する物
質）を培地に分泌し続けた。一方、対照となるｈＡＮＰ
遺伝子を含まないｐｄＢＶ−１によって形質転換された
クローン（クローン６８）では、ＡＮＰ生産能は認めら
れなかった。
次に、クローンＡ ９−１４を３日ごとに培地を交換し
ながら大量培養（約４ Ｘ １０ ｃａｌｌｓ ）
Ｌ、各培養上清を集め生産物の解析を以下のようにして
行った。
ながら大量培養（約４ Ｘ １０ ｃａｌｌｓ ）
Ｌ、各培養上清を集め生産物の解析を以下のようにして
行った。
１．７１の培養上清に酢酸をＩＮになるように加え、１
００℃で５分間処理し室温に戻した後、該上清をＬＣ−
８ｏｒｂ ＯＤＳカラム（Ｃｈｅｍｃｏ社製）９０ｍノ
に、バッファーＡ（水ニアセトニトリル：１０％トリフ
ルオロ酢酸＝９０：１０：１）を用いてパッチ法で吸着
させ、バッファーＢ（水ニアセトニトリル：１０チドリ
フルオロ酢酸＝４０：６０：１）２００ｄを用いて溶出
させた。そのうち１ｍｌを減圧乾固しＩＮ酢酸に溶解後
、逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫＯＤＳ１２０Ａ：東洋漕達社製
、カラムサイズ：４．６Ｘ ２５０ ｍｍ ）にかけ、
バッファー人で平衡化したのち、バッファーＡからバッ
ファーＢの直線的濃度勾配溶媒により溶出した（流速：
１．５ｍ／！／分。
００℃で５分間処理し室温に戻した後、該上清をＬＣ−
８ｏｒｂ ＯＤＳカラム（Ｃｈｅｍｃｏ社製）９０ｍノ
に、バッファーＡ（水ニアセトニトリル：１０％トリフ
ルオロ酢酸＝９０：１０：１）を用いてパッチ法で吸着
させ、バッファーＢ（水ニアセトニトリル：１０チドリ
フルオロ酢酸＝４０：６０：１）２００ｄを用いて溶出
させた。そのうち１ｍｌを減圧乾固しＩＮ酢酸に溶解後
、逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫＯＤＳ１２０Ａ：東洋漕達社製
、カラムサイズ：４．６Ｘ ２５０ ｍｍ ）にかけ、
バッファー人で平衡化したのち、バッファーＡからバッ
ファーＢの直線的濃度勾配溶媒により溶出した（流速：
１．５ｍ／！／分。
分画サイズ：１．５＋＋＋ｌ）。各溶出分画について、
既述のＲＩＡによｐ ＡＮＰ ｉを測定した。その溶出
パターンおよびＲＩＡの測定結果を第３図に示す。主た
るＲＩＡ活性画分は、第３図に示す如く、γ画分（保持
時間３５分付近）、β画分（保持時間２９分付近）およ
びα画分（保持時間２２分付近）の３個所に認められた
。
既述のＲＩＡによｐ ＡＮＰ ｉを測定した。その溶出
パターンおよびＲＩＡの測定結果を第３図に示す。主た
るＲＩＡ活性画分は、第３図に示す如く、γ画分（保持
時間３５分付近）、β画分（保持時間２９分付近）およ
びα画分（保持時間２２分付近）の３個所に認められた
。
一方、クローンＡ９−１４の培養細胞内に存在するＡＮ
Ｐについても以下の如く解析した。約１．６×１０
個の培養細胞に３２ｍ１のＩＮ酢酸を加えホモダナイズ
し、さらに冷却アセトン６４ｄを加え、３０．０００
Ｘ ｇ 、 ３０分間遠心分離後、その上清を減圧乾固
した。その約１／１０ｉ１をＩＮ酢酸に溶解し、上述と
同じ条件で逆相ＨＰＬＣによシ分画後、各分画をＲＩＡ
にかけた。その結果、第４図に示す如（ＲＩＡ活性のピ
ークは、培養上清の場合と同様α。
Ｐについても以下の如く解析した。約１．６×１０
個の培養細胞に３２ｍ１のＩＮ酢酸を加えホモダナイズ
し、さらに冷却アセトン６４ｄを加え、３０．０００
Ｘ ｇ 、 ３０分間遠心分離後、その上清を減圧乾固
した。その約１／１０ｉ１をＩＮ酢酸に溶解し、上述と
同じ条件で逆相ＨＰＬＣによシ分画後、各分画をＲＩＡ
にかけた。その結果、第４図に示す如（ＲＩＡ活性のピ
ークは、培養上清の場合と同様α。
β、γの３個所に認められた。第５図に、培養上清（４
）と細胞内（Ｂ）のＲＬＡ活性画分の溶出・リーンを比
較して示した。
）と細胞内（Ｂ）のＲＬＡ活性画分の溶出・リーンを比
較して示した。
ｈＡＮＰ染色体遺伝子を含まないベクター（ｐｄＢＶ−
１）によって形質転換されたクローンではＲＩＡ 活性
を示す産物は認められないことから、上記のＲＩＡ活性
画分は、ｈＡＮＰ染色体遺伝子からの産物であることを
示す。また、α、β、γ各両分についてラットを用いた
利尿活性を、Ｋａｎｇａｖａら（Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、 ＋ １１８ ＋
１３１ ＋１９８４）の方法で調べたところ、いずれ
もその生物活性が認められた。
１）によって形質転換されたクローンではＲＩＡ 活性
を示す産物は認められないことから、上記のＲＩＡ活性
画分は、ｈＡＮＰ染色体遺伝子からの産物であることを
示す。また、α、β、γ各両分についてラットを用いた
利尿活性を、Ｋａｎｇａｖａら（Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、 ＋ １１８ ＋
１３１ ＋１９８４）の方法で調べたところ、いずれ
もその生物活性が認められた。
５、生産物の同定
第３図に示した逆相ＨＰＬＣの溶出画分のうち標準のα
−ｈＡＮＰの保持時間（２２分）に相当する両分につい
て生産物の同定を行った。即ち、該両分を、バッファー
Ｂのアセトニトリルの濃度をＡにしたことを除き先述と
同条件で′さらに逆相ＨＰＬＣにかけ、保持時間２２分
に相当する溶出画分を集め、アミノ酸組成はアミノ酸自
動分析機（日立８３５−５０型）を用い、アミノ末端部
のアミノ酸配列は気相プロテインシークエンサーＭｏｄ
ｅｌ ４７０ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍ社製）を用い、常法に従い解析した。
−ｈＡＮＰの保持時間（２２分）に相当する両分につい
て生産物の同定を行った。即ち、該両分を、バッファー
Ｂのアセトニトリルの濃度をＡにしたことを除き先述と
同条件で′さらに逆相ＨＰＬＣにかけ、保持時間２２分
に相当する溶出画分を集め、アミノ酸組成はアミノ酸自
動分析機（日立８３５−５０型）を用い、アミノ末端部
のアミノ酸配列は気相プロテインシークエンサーＭｏｄ
ｅｌ ４７０ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍ社製）を用い、常法に従い解析した。
その結果、アミノ酸組成値は２８個のアミノ酸からなる
α−ｈＡＮＰペプチドとよく一致し、アミノ末端は、Ｓ
ｅｒ −Ｌｅｕ −Ａｒｇ −Ａｒｇ −Ｓｅｒ −Ｓ
ｅｒ −（Ｃｙｓ） −Ｐｈｅ −Ｇｌｙ −Ｇｌｙ
−−＝であることが認められた。この結果は、α−ｈＡ
Ｎｐ−ｅプチドが、動物細胞（この場合マウス細胞）に
おいてｈＡＮＰ染色体遺伝子ｍＲＮＡのプロセシングを
経て（ｈＡＮＰ染色体遺伝子にイントロンが存在してい
ることは知られている）生成された前駆体蛋白質からさ
らに蛋白質のプロセシングを受けて生成したことを示し
ている。
α−ｈＡＮＰペプチドとよく一致し、アミノ末端は、Ｓ
ｅｒ −Ｌｅｕ −Ａｒｇ −Ａｒｇ −Ｓｅｒ −Ｓ
ｅｒ −（Ｃｙｓ） −Ｐｈｅ −Ｇｌｙ −Ｇｌｙ
−−＝であることが認められた。この結果は、α−ｈＡ
Ｎｐ−ｅプチドが、動物細胞（この場合マウス細胞）に
おいてｈＡＮＰ染色体遺伝子ｍＲＮＡのプロセシングを
経て（ｈＡＮＰ染色体遺伝子にイントロンが存在してい
ることは知られている）生成された前駆体蛋白質からさ
らに蛋白質のプロセシングを受けて生成したことを示し
ている。
また、アミノ酸分析結果はないが、第３図において標準
のγ−ｈＡＮＰの保持時間に相当する位置に高いＲＩＡ
活性を示す画分があることから、これらのペプチドも上
記のクローンが生産されていることが予測される。
のγ−ｈＡＮＰの保持時間に相当する位置に高いＲＩＡ
活性を示す画分があることから、これらのペプチドも上
記のクローンが生産されていることが予測される。
第１図は、ｈＡＮＰ染色体を組み込んだ発現ベクターｐ
ＢＰＶｈＡＮＰ−１の造成法の概略を示す。第２図は、
１４）とｐｄＢＶ−１が導入されたクローン（クローン
６８）のＡＮＰ生産量の経時的変化を示す。第３図は、
クローンＡ９−１４の培養上清の逆相Ｔ（ＰＬＣおよび
免疫活性の溶出・ぐターンを、第４図は、同クローンの
細胞内抽出物の逆相ＨＰＩ、Ｃおよび免疫活性の溶出・
やターンを各々示す。第５図は、クローンＡ ９−１４
の培養上清と細胞内抽出物の逆相ＨＰＬＣ溶出に対応し
た免疫活性パターンを示す（時間は、逆相ＨＰＬＣにお
ける保持時間を示す）。
ＢＰＶｈＡＮＰ−１の造成法の概略を示す。第２図は、
１４）とｐｄＢＶ−１が導入されたクローン（クローン
６８）のＡＮＰ生産量の経時的変化を示す。第３図は、
クローンＡ９−１４の培養上清の逆相Ｔ（ＰＬＣおよび
免疫活性の溶出・ぐターンを、第４図は、同クローンの
細胞内抽出物の逆相ＨＰＩ、Ｃおよび免疫活性の溶出・
やターンを各々示す。第５図は、クローンＡ ９−１４
の培養上清と細胞内抽出物の逆相ＨＰＬＣ溶出に対応し
た免疫活性パターンを示す（時間は、逆相ＨＰＬＣにお
ける保持時間を示す）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰ）ゲ
ノムが挿入された牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）由来
のプラスミドベクターによって形質転換された動物細胞
を培養して得ることを特徴とする、ヒヨコ直腸平滑筋の
弛緩活性を有するペプチドの製造法。 ２、上記弛緩活性を有するペプチドが、α−ｈＡＮＰ抗
体と免疫学的に交叉反応することを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の製造法。 ３、上記ベクターが、牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）
の全ゲノムを有していることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の製造法。 ４、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰ）ゲ
ノムが、ヒト染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ I で切
断して得られるＤＮＡ断片由来のゲノムであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ５、動物細胞が、マウスの細胞Ｃ１２７である特許請求
の範囲第１項記載の製造法。 ６、ヒヨコ直腸平滑筋の弛緩活性を有するペプチド又は
α−ｈＡＮＰ抗体と免疫学的に交叉反応するペプチドの
アミノ末端のアミノ酸配列が 【アミノ酸配列があります】 である特許請求の範囲第１項乃至第２項記 載の製造法。 ７、ヒヨコ直腸平滑筋の弛緩活性を有するペプチド又は
α−ｈＡＮＰ抗体と免疫学的に交叉反応するペプチドが
、α−ｈＡＮＰであることを特徴とする特許請求の範囲
第１項乃至第２項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60271050A JPS62130697A (ja) | 1985-12-02 | 1985-12-02 | ペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60271050A JPS62130697A (ja) | 1985-12-02 | 1985-12-02 | ペプチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62130697A true JPS62130697A (ja) | 1987-06-12 |
Family
ID=17494704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60271050A Pending JPS62130697A (ja) | 1985-12-02 | 1985-12-02 | ペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62130697A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100336912C (zh) * | 2005-03-25 | 2007-09-12 | 深圳国家生化工程技术开发中心 | 利用高密度发酵制备重组人心钠肽－rhANP的方法 |
-
1985
- 1985-12-02 JP JP60271050A patent/JPS62130697A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100336912C (zh) * | 2005-03-25 | 2007-09-12 | 深圳国家生化工程技术开发中心 | 利用高密度发酵制备重组人心钠肽－rhANP的方法 |
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