JPS62135499A - プラスモジウム フアルシパルムの赤血球内侵入期に得られる該プラスモジウム フアルシパルムの抗原と、該抗原の精製法と、該抗原および該抗原の抗体の投与量決定法と、該抗原を含むマラリア用ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はマラリアの管理に関するものであり、特に人間
にとってこの病気の最も重い形態であるプラスモジウム
　ファルシパルム（Ｐ　ｌａｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ）　　によって引き起こされるマラリア
の管理法とこの病気に対するワクチン注射に関するもの
である。

さらに正確には、本発明はプラスモジウム　ファルシパ
ルムの培地となる２つのタンパク質と、寄生体中でその
前駆体と、このタンパク質およびその抗体の血清中への
投与量決定法と、有効成分としてこのタンパク質を用い
たワクチンとに関するものである。

従来の技術 こされる、世界に広範囲に広がった周期的に熱発作をお
こす病であり、しばしば死に至る。この原生動物は蚊（
はまだら蚊属）を介して人間に伝搬される。

殺虫剤の多量使用と人間に対する予防用および治療用化
学療法によって一時的には大巾に減ったが、広く普及し
た殺虫剤に対する昆虫の抵抗力の増大とキニーネやニバ
キンのように広く使用される治療薬に対する病気自体の
抵抗力の増大によって、この病気が新たに広がり始めて
いる。

この憂慮すべき事実を考えて、研究者はこの病気の最も
危険な形態すなわちプラスモジウム　ファルシパルムに
より起こされるマラリアに対するワクチンを開発するこ
とによって予防しようとしている。

この原生動物は複雑なライフサイクルを有しているとい
うことは知られている。マラリアの感染型を有するスポ
ロゾイト（踵状芽胞）は蚊が刺すことによって血管中に
入る。このスポロゾイトは肝懺中に入って免疫反応無し
に増殖し、約１０日後、メロゾイトの型で肝臓から出る
。このメロゾイトは赤血球に感染して、その中で増殖す
る。その結果、この赤血球が破裂して発熱発作を生じる
。こうして放出されたメロゾイトが他の赤血球を攻撃し
、その結果、周期的に発熱発作が生じる。

また、この赤血球から出た寄生物の幾分かは有性形とな
り、蚊に感染する。この有性形の寄生物は昆虫の胃中で
受精し、スポロゾイトの形になって昆虫の唾液に入り、
感染源となる。

イフサイクルを考えると、抗スポロゾイトワクチンまた
は抗メロゾイトワクチンによって生命の危険に露された
患者を保護することに考えが至る。

しかし、前者の解決策には重大な問題点がある。

すなわち、ワクチンは完全に有効でなければならない。

つまり、組織中に入る可能性のある全てのスポロゾイト
を破壊しなければならない。さもないと、特異抗体なし
でメロゾイトが作られ且つ増殖するため感染が拡大する
ことになる。

従って、本特許出願人は特に赤血球の再侵入期を阻止で
きる抗メロゾイト型ワクチンを研究することにした。さ
らに、抗体を投与して繰り返し病原体と接触した患者を
免疫性にする研究を行うことができ、しかも、化学療法
処置中の病気の進展を追跡できるようなテストを完成す
ることにも注目した。

上記の各用途に利用できる抗原を同定し且つ単離するた
めに、本特許出願人は寄生物が感染した赤血球から得ら
れる生成物に特に興味を持った。

さらに詳細には、免疫学的に活性なプラスモジウム　フ
ァルシパルムの外抗原（ｅｘｏａｎｔｉｇｅｎｅ）　ヲ
同定するために、本特許出願人は、メロゾイトが赤血球
にインビトロでは侵入しないようになっている人間の血
漿から得られる免疫グロブリンを精製し、その精製エキ
スを利用して３５３て標識したメチオニンの存在下で、
複分裂生殖サイクルの種々の段階のプラスモジウム　フ
ァルシパルムの同時培養による培養基中で得られた生成
物を免疫沈着させた。

このサイクルを完全に解明しかつ寄生物により合成され
た生成物を完全に分離するために、本特許出願人は放射
性合成が停止している「不感培養基」と呼ばれる標識し
ない培養基での期間と３５３でメチオニオンを標識する
期間とでの培養基および感染赤血球を研究することにし
た。これら２段階は「標識／トレース（追跡）」とよば
れている。

この手法は同じタイプの研究を行うためにロドリゲス　
ダ　シルバ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　Ｄａ　５ｉｌｖａ）
達が提案している方法（参照文献１８）とは大巾に違っ
ている。彼達は６時間の標識時間の終りに培養基と浮遊
物とを分析している。

この研究の詳細な実験結果は本明細書の実験の部（１）
に示してある。

その結果によると標識終了後赤血球中にＩｇＧ免疫とし
て４つの主要抗原（１４０，１２６，１８０および７０
ＫＤａ）が３忍められている。これらの中の２つ（１２
６および１８０ＫＤａ）　　は「トレース」の最初の１
２時間で消えている。この培養基中では主要生成物であ
る５０ＫＤａ　　（４７ＫＤａ成分がこれよりも少量入
っている）が１２時間後に現われるが、すぐに消える。

これら２つの抗原は寄生物に感染した赤血球中では観察
されない。

２次元電気泳動法の分析の結果、５０ＫＤａのバンドは
ｐ１５．５の単一のタンパク質によって形成され、４７
　Ｋ　Ｄ　ａのバンドはｐｉが約５．９と約６．１の２
つの部分に分離していることがわかる。

文献には既にタンパク質性のプラスモジウム抗原の存在
とその分子量が種々の間陽にわたっていることが示され
ている。

例えば、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０，１３６，２
１５号にはそれぞれ、上澄液、洗浄液および低張洗浄液
と呼ばれる異った型の抗原中に抗原タンパク質を見付け
たことが開示されている。これら抗原の分子量は３５．
０００〜８０．０００ダルトンの間に分布する。

主要であると考えられる２つの免疫物質は、それぞれ分
子量が４２．０００と５４．０００のものである。また
、４９、０００ダルトンのバンドがひとつあり、このバ
ンドはさらに５４．０００と４６．０００ダルトンに分
けられる。

先ず最初に注意することは、単に分子量を示しても抗原
を区別したことにはならず、ＳＯ３ＰＡＧＥ分野の精度
限界である１０００ダルトンの間には抗原としての共通
の特殊性や機能をもたない、プラスモジウムの複数の明
確に異なるタンパク質が含まれているのが一般的である
という点である。この特許出願に記載の抗原をさらに規
定する場合には、これら抗原の糖タンパク特性を明らか
にし、これらタンパク質に対する免疫性を有する実験動
物により合成された抗体により全ての寄生物とその子（
リング）とが標識されていることを示すことが必要であ
る。さらに、人間の血清はインビトロでは、メロゾイト
が健康な赤血球内に侵入するのを阻止する。これは、上
記の標的抗原がメロゾイトの表面にあることを示してい
る。

以下の本発明の説明で述べるように、本発明による抗原
は上記の特徴とは全く無関係である。

エル、ペラン（Ｌ、　ＰＥＲＲＩＮ）　達の「マラリア
：免疫、ワクチン注射および免疫診断」　（エクスペリ
Ｘ　７　シフ　（ＥＸＰＥＲＩＥＮＴ［Ａ）第４０巻、
第１２号、　　１９８４年１２月、第１３４３〜１３５
０頁、バーセル。スイス）には３５、０００〜２００．
０００ダルトンの分子量分布を有するシゾントおよび／
またはメロゾイトに対して特別であるとことわった抗原
が示されている。これらのタンパク質は本発明にでてく
るものではない。

ヨーロッパ特許出願［ＥＰ−Ａ−０，１１２，７８４号
は赤血球の細胞破壊溶解後の寄生物から抽出したタンパ
ク質に関するものである。この種のタンパク質の一つは
平均分子量が５０．０００程度、はぼ５０００ダルトン
であることと、寄生物の抽出物であって、本発明のよう
な培養基からの抽出物ではないことを特徴とするる。こ
の種のものは３５３で標識化したメチオニンと新陳代謝
によって合体しても同定できない。一方、分子量が５０
．０００の本発明のタンパク質はここに記載のものとは
明らかに異なっている。

このことについては以下に記述する。

英国特許ＧＢ−Ａ−２，０９９，３００号には小片に分
裂した赤血球の内部で新陳代謝された赤血球シゾントの
膜とメロゾイトの膜とに付着した分子量が１８０．００
０〜２５０．０００ダルトンのタンパク質が示されてい
る。

これらのタンパク質は感染済み赤血球を可溶化して得ら
れるもので、本発明のタンパク質とは全く異なっている
。

上記ロドリゲスダシルバ（Ｒｏｄｏｒｉｇｕｅｚ　Ｄａ
　５ｉｌｖａ）達の文献（参照文献１８）には寄生物と
培養基の抽出物から得られる分子が示されている。この
分子は上澄液中で同定されるもので、標識後最大六時間
後に作られている。すなわち、本発明に出てくる抗原よ
りも前に出現するものである。この分子に対する特殊な
単クローン抗体は本発明のものとは異なる分子量のタン
パク質であると考えられ、このタンパク質は寄生物の未
成熟の段階も含めて全ての成長段階においてその一部に
付着している。

従って、この分子は本発明のものとは全く異なるもので
ある。

英国特許ＧＢ−Ａ−２，１１４，２８８には競争的阻害
による循環しているプラスモジウムの抗原の検出法が記
載されている。この抗原は寄生物感染赤血球の抽出物で
、基本的には未成熟型に対応する。この抗原は侵蝕性プ
ラスモジウムおよび人間のプラスモジウムの他の種と交
叉反応する。これは本発明の場合と全く異なる。

ＰＣＴ特許特許出願−へ一肌５００．９７７号にはｐｌ
が４．７〜５．５で分子量が４１，０００〜５８．００
０のタンパク質抗原が示されているが、これも本発明の
ものとは異なる。

従って、本発明の目的はプラスモジウム　ファルシパル
ムの抗原を赤血球内部から単離することにある。

問題を解決するための手段 本発明の対象とするプラスモジウム　ファルシパルムの
赤血球内部から単離される抗原は以下のように構成され
ることを特徴としている：ａ）増員生殖の間の核増加期
中に合成され且つ寄生物担持（ｐａｒａｓ　ｉ　ｔｏｐ
ｈｏｒｅ）空胞の所でシゾントの周囲に局在する１２６
ＫＤａのタンパク質、ｂ）プラスモジウム　ファルシパ
ルムに！染した患者の血清中またはこの微生物の培養基
中に、この微生物が赤血球内に侵入している期間（赤血
球内部）に現われ且つａ）で定義した１２６ＫＤａのタ
ンパク質を前駆体として有する等電点（ｐｌ）が５．５
である５０ＫＤａのタンパク質、およびＣ）プラスモジ
ウム　ファルシパルムに感染した患者の血清中またはこ
の微生物の培養基中に、その赤血球内侵入期に現われ且
つａ）で定義した　１２６ＫＤａのタンパク質を前駆体
として有する、電気泳動によって酊が約５．９と約６．
１の２つの点に分離する４７ＫＤａのタンパク質。

上記１２６ＫＤａのタンパク質はプラスモジウム　ファ
ルシパルムに感染した患者の血清中またはその微生物の
培養基中に、その赤血球内侵入期の間に現われる１８Ｋ
Ｄａのタンパク質の前駆体であることも知られている。

さらに、天然状態では、上記４７ＫＤａのタンパク質と
上記１８ＫＤａのタンパク質は二硫化物のブリッジを介
して合体し約６５ＫＤａのタンパク質となる。

従って、本発明の対象とする抗原は上記のタンパク質に
よっても構成されている。

上記の１２６ＫＤａと４７ＫＤａの分子量はプラスモジ
ウム　ファルシパルムの特殊株、すなわちＦＣＲ−３株
（参照文献１）について求められた。従って、他の株を
利用した場合には、上記分子量は少し変化し、一般には
１２６〜１３０ＫＤａと４７〜５０ＫＤａの間に各々あ
る。すなわち、一般に人手可能なプラスモジウム　ファ
ルシパルムＩ刊×−１株から分離した場合には１３０Ｋ
Ｄａと５０ＫＤａの値が認められ、後者は電気泳動によ
ってｐ＋が約５．９と約６．１の２つの点に分けられる
。

結論すると、以下の記述および特許請求の範囲の記載に
おいては、ａ）の「１２６ＫＤａのタンパク質」の定義
は、株が異なっていても分子量が１２６ＫＤａから１３
０ＫＯａである対応　する全てのタンパク質を表わし、
ｃ）の「４７ＫＯａのタンパク質」は、株が異なっても
分子量が４７ＫＤａ〜５０ＫＤａの間にある全てのタン
パク質を表わす。

また、本発明で抗原という場合には、上記の種々の抗原
から得られ、且つ上記１２６ＫＤａのタンパク質の特異
ポリクロナール血清によって同定される免疫タンパク質
抗原をも含むものである。

従来法によって、プラスモジウム　ファルシパ丑の培養
基の上澄液から、高度免疫血清の［ｇＧを含有する抗原
をカラム上でアフィニティークロマトグラフィーを用い
て作ることができ、この抗原を用いて上記の５０ＫＤａ
の分子あるいは４７ＫＤａの分子の特異抗体を作るマウ
スハイブリドーマを作ることができる。

これらの抗体は分子量が５０ＫＤａまたは４７ＫＤａで
特定化されるが、この寄生物中では共通の前駆体、例え
ば分子１１２６ＫＤａが認められる。

上記のハイブリドーマの入手法と選択法の一例は本明細
書の実験の部（ＩＩ）に例示してある。

５０Ｋ［］ａ、　　６５ＫＤａ、　４７Ｋ（ｌｅａと１
８にＤａ（７）分子ハフラスモジラム　ファルシパルム
の異時性培養基の上澄液を分子５０．６５．４７または
１８ＫＤａの各特異抗体を備えたアフィニティークロマ
トグラフィーのカラム、特に、セファローズ（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）　　４ビー（４Ｂ）（ファルマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）社）に通すことによって精製すること
ができる。上記各特異抗体は、対応する単クローン抗体
を製造するハイブリドーマから従来法でＢられる。上記
抗体はゲル１ｍｌ当たりＩｇＧ約１０ｍｇの割合でカラ
ムに存在する。

また、１２６ＫＤａの分子はプラスモジウム　ファルシ
パルムが寄生した赤血球を可溶化して精製することがで
きる。例えば、０．５％のデオキシコール酸す）　ＩＪ
ウラム用い且つ分子５０ＫＤａおよび／または分子４７
ＫＤａおよび／または１８にＤａおよび／または６５Ｋ
Ｏａを特異的に識別する単クローン抗体を備えたカラム
に上記の溶液を通す。

この精製に特異的ポリクローン抗体を用いることもでき
る。

これらの精製法については実験の部（Ｉ）で例を示す。

本発明によればさらに、タンパク質に対する抗体、特に
分子５０．６５．１８．４５にＤａを免疫化したまたは
免疫化中の患者の血清中に投与する場合の投与量決定法
が提供される。

免疫学的反応を発生させている種々の方法が可能で、例
えば放射性の標識を用いたＲＩＡ法（ラジオイムノアッ
セイ）を用いることができる。

しかし、簡単さと取扱者の安全という理由で、７標識と
して一つまたは複数の酵素を用いた方法を使うのが好ま
しい。これに関しては例えば公知の各種のエライザ（Ｅ
ＬＩＳＡ）　　（酸素結合免疫溶媒測定）法を挙げるこ
とができる。

この型式の方法のひとつであって、良い結果を与える本
発明の方法は基本的に以下の操作段階で構成される。す
なわち、 ■）被投与抗体に対応する分子（１８，４７，６５，５
０および／または１２６Ｋ［ｌａ　）の特異単クローン
抗体を担体上に固定し、 ２）担体上に残っている自由サイトを飽和させ、３）プ
ラスモジウム　ファルシパルムの異時性培養の上澄液か
ら得られる抗原を過剰に加えて反応させ、 ４）検査する培養基と３）で担体に固定された抗原とを
反応させ、 ５）４）までの全体を酵素で標識化した人間の抗免疫グ
ロブリン抗体とを反応させ、 ６）前もって較正してある特異酵素反応を用いて、５）
の段階で担体に固定された酵素の量から検査培養基中に
存在する特異抗体の量を求める。

本発明はまた、マラリアの発病時に患者の血清中に、あ
るいは培養基中に分子１８．４７．６５．５０ＫＤａを
投与する量を決定する方法と、可溶死後赤血球中に分子
１２６ＫＤａを投与する量を決定する方法をも提供する
。

いずれの場合でも、免疫学的測定法、特にＥＬＩＳＡ型
の測定法により投与量を決定する。

本発明の好ましい一実施例では、上記投与量決定法は基
本的に次の段階で構成される。すなわち、１）投与すべ
き分子の特異単クローン抗体を担体に固定し、 ２）担体上の残った自由サイトを飽和させ、３）被投与
抗体を受は入れられる培養基と反応させ、 ４）免疫患者から取った基準血清と３．）までの全体と
を反応させる、 ５）酵素で標識化した人間の抗ＩｇＧの抗グロブリンと
反応させ、 ６）前もって較正してある酵素の活性量を用いて検査培
養基中に存在する抗原の量を求める。

例示として、実験の部（■〜■）で、分子５０ＫＤａと
４７ＫＤａに関するこの型式の投与量決定法を説明する
。ただしこれは単なる例にしかすぎない。

マラリア患者の病状経過は実験の部（■）に示すように
本発明による抗原を一定間隔で血清中に投与することに
よって研究することができる。

本特許出願人は、タンパク質５０ＫＯ（Ｕ３Ｏ）の一単
位を、ヘマトクリット６％、初期寄生物７％が含まれる
１ｍｌの容積中に、プラスモジウム　ファルシパルムの
ＦＣＲ−３株の培養により２４時間の間に放出される分
子５０ＫＤａの量として定義した。

本発明によればさらに、マラリアに対するワクチンが提
供される。このワクチンは活性主成分として少なくとも
一つのタンパク質１８．４７．５０．６５および１２６
ＫＤａを含み、好ましくはアジュバントが付加されてい
ることを特徴としている。

各抗原は単独で、または５０ＫＤａと４７ＫＤａの抗原
を組合せて用いるのが好ましい。組合せる場合には例え
ば等量ずつとする。

アジュバントは水酸化アルミニウム（ＡＩ（ＯＨ）３）
が好ましい。

本発明の好ましい実施例では、０．５ｍｊ！のワクチン
の一投与量中に次のものが含まれる；１）タンパク質５
０ＫＤａおよび／または４７ＫＤａまたは１２６ＫＤａ
またはさらに１８および／または６５ＫＤａを０．５〜
１．５ｍｇ、好ましくは１ｍｇ５２）水酸化アルミニウ
ムを０．３〜２ｍｇ、好ましくは１ｍｇ。

３）等優性緩衝溶液の必要量。

ワクチン投与は例えば１月の間隔を置いて３回続けて各
−投与量のワクチンを注射し、３回目の注射後１年後に
もう１回注射するのが好ましい。

この注射は肩甲骨工高の皮下あるいは前腕または大腿の
外皮を通して行うのが好ましい。

また、筋肉内注射も可能である。

以下、本発明の詳細並びにその応用例を以下の実験の部
で説明するが、これらは単なる例示にすぎない。

一分析 １、寄生物の培養と同期化 人間の血清Ａ゛を１０％加えた培養基ＲＰ！、＋１１６
４０（参照文献２）中で、寄生物１０％、ヘマトクリッ
ト６９６を有する人間の赤血球Ｏ゛中のプラスモジウム
　ファルシパルムの株ＦＣＲ−３（参考文Ｂ　ｌ　）を
培養する（参考文、秋３）。この培養基は２７時間間を
置いて２回ソルビトールで処理して同期化する（参考文
献４）。

２、再浸入の阻止 ニー、つ゛エルネス（Ａ、Ｖｅｒｎｅｓ）達の方法（参
考文献４）に従った。シゾントを含む同期化した培養基
（１回当り１００μβ、ヘマトクリット１．５％、寄生
物１％）を正常な、すなわち免疫化した標準の精製［ｇ
Ｇに１８時間異なる濃度で露し、洗浄し、さらに８時間
標準培養基中で培養し、次いで１６時間放射性の前駆体
（イソロイシンの１４εまたはヒポキサンチンの３日）
を加えた培養基中で培養する。次いで、蒸留水で寄生物
の付いた赤血球を回収し、不溶物をガラス繊維（マッシ
、　（ｌｌａｓｈ）社の多孔質回収器）で回収し、その
放射能をＬＳ−１８００型アベツクマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）　　シンチレーションカウンターを用いてルマック
（Ｌｕｍａｃ）社のアクアルマ（Ａｑｕａｌｕｍａ）型
有機液体く複数の溶媒の混合物）中で測定する。

３、”Ｓを含むメチオニンによる標識 １で得られた赤血球を１％のへマドクリットを含む培養
基中で懸濁液にし、複数の２５ｃｆｆｌの培養ビン中に
５ｍｌずつ分配する。ソルビトールで第２回目の処理を
してから３０時間後に、メチオニンを含まない培養基（
ＲＰ！、１１１６４０、ジブコ（ＧＩＢＣＯ）社の「セ
ラタクタミンキット（Ｓｅｌａｃｔａｍｉｎｅ　Ｋｉｔ
）　ｊ　）中で赤血球を洗い、同じ培養基に３５３を含
むメチオニンを４０μＣｉ／ｍｌ加えて（＞８００Ｃｉ
　ｍｍｏｌ−’、アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　
）　５時間培養する。寄生物を含まない赤血球を入れた
培養ビンをブランクとして上記したのと同じ処理をする
。標識期間終了（１＝０）時に、一つの培養ビンを遠心
分離（４００ｇ、１０分）にかけて上澄液を回収して残
った、標識済みの、寄生物に感染した赤血球をいわゆる
「不感性培養基」といわれる放射能の無い培養基を５−
用いて懸濁液とし、再び３７℃で培養する。

次いで上記上澄液も１２時間ごとに同じ条件下に計４８
時間置く。第２の培養ビンも同一の処理をするが、各段
階で寄生物感染赤血球の一部を同量ずつ回収して、標識
期間開始後の０．１２．２４．３６．４８時間後の５つ
のサンプルとする。

すべての培養上澄液は回収後直ちに２０．０００　ｇで
１時間遠心分離する。得られた赤血球を洗い、無血清の
ＲＰ！、１１培養基中で懸濁液にする。以上の上澄液と
赤血球の懸濁液には０．６％のナトリウムドデシルサル
フェー）　（ＳＯ３）を加え、１０分間１００℃に加熱
する。冷却後０．５％のＳＯ３と２，５％のトリトンエ
ックス−１００（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（０−ム　
アンド　ハース（ＲＯＨＭ　＆　ＨＡＡＳ）社の界面活
性剤の商標名）とをエリクソンーブロベル（Ｅｒｉｃｋ
ｓｏｎ−Ｂｌｏｂｅｌ）法（参考文献５）に従って添加
する。

４、ＩｇＧの精製と免疫ツルバントの製法免疫グロブリ
ンはマラリア風土病地域（マダガスカル）から来たヨー
ロッパ人の血液提供者の血漿と免疫の無いブランクの血
漿とから、サン−プランカール（Ｓａｉｎｔ−Ｂｌａｎ
ｃａｒｄ）達の方法（参照文献６）によってＤＥＡＩＥ
　）　ＩＪスアクリル（アンデュストリ　ビオロジック
　フランセーズ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｑｕｅＦｒａｎｃａ　１ｓｅ）社製）を用いたイオン交
換クロマトグラフィーによって精製した。ＩｇＧの濃度
はレーザ一式比濁分析法によって測定した（参考文献７
）。

免疫ツルバントは臭化シアンで活性化したセファローズ
　４ビー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ）　（７７ルマシ
７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）上に上記ＩｇＧを結合
させることにより製造する。量は、メーカーの指示に従
ってゲルｌ−当りタンパク質が６ｍｇの割合とする。

５、免疫ソープション 可溶化された各サンプル（寄生物感染赤血球で１０μβ
、培養基で５−）は、上記のセファローズ４ビー（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ）に結合された１００μβのｒｇ
Ｇを含む２つの連続カラムに取付ける。第１カラムは非
免疫のＩｇＧを用いて作り（不特定吸着用）、第２カラ
ムは阻害化ＩｇＧを用いて作る（免疫ソープション用）
。次いで、各ゲルを０．５％のＳＯ３と０．２％のＴｒ
ｉｔｏｎ−Ｘ〜１００を含む緩衝液で５回洗浄し、この
緩衝液中で３分間１００℃で溶離してサンプルを作り、
そのサンプルをポリアクリルアミド−３Ｏ３のゲル（Ｓ
［１Ｓ−ＰＡＧＥ）で電気泳動する（参照文献８）。

６　、５Ｏ３−ＰＡＧＥとフルオログラフィー−次元５
Ｏ３−ＰＡＧＥ分析はラエムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）法
（参照文献８）により１２％のアクリルアミドゲル中で
行う。フルオログラフィーはアール、ニー。

ラスキー（ＲｏＡ、　Ｌａ５ｋｅｙ）達の方法（参照文
献９）で行う。

標識の結果、赤血球中に４つの主要抗原（１４０，１２
６，１０８および７０ＫＤａ　（キロダルトン））が、
免疫性■ｇＧにより同定された。その中の２つ（１２６
と１０８ＫＤａ＞は、「トレース（追跡）」といわれる
「不感性培養基」での処理の始めの１２時間中に消える
。この培養基の中の主生成物である５０ＫＤａ　（４７
ＫＤａの成分もより少量伴っている）は１２時間で現わ
れ、次いで減少する。これら２つの抗原は寄生物感染赤
血球中には観察されない。

７．２次元電子泳動 「トレース」を１２時間行った後に得られた上澄液を含
む免疫ツルバントの溶離物にはＳＯ３３％、９．９５Ｍ
の尿素、ノニデット　ピー４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−
４０）（シェル（Ｓｈｅｌｌ）社の剥離剤）４％、アム
フォリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）　　（ＬＫＢ社、ｐ）
Ｉ　３．５〜１０）　２％および０，１Ｍのジチオテレ
イトールをさらに加える（参照文献１０）。次いで、オ
フ７Ｌ／／ｌ／（０°ｌ’ａｒｒｅｌ）法（参照文献１
１）によって２次元ＰＡＧＥ分析をする。

この２次元電気泳動分析によって、５０ＫＤａのバンド
は等電点が５．５の単一タンパク質であり、４７ＫＤａ
のバンドは等電点が約５．９と約６．１の２つの点に分
離されることが示される。

上澄液と、３５Ｓを含むメチオニンで５時間標識した後
の４８時間の間に回収された寄生物感染赤血球と、対応
する免疫吸着された溶離物とについて３塩化酢酸（ＴＣ
Ａ）により沈降させた後に測定した放射能は以下の第１
表に示してある。

この表には各採取時の寄生物感染段階の分布も示してあ
る。

■、イイントロ培養したプラスモジウム　ファル１、材
料と方法 ａ）　マウス 免疫リンパ球を人手するため並びにインビボでモノクロ
ナール抗体を作るためにマウスＢＡＬＢ／Ｃ（Ｉ　ＦＦ
Ａ−ＣＲＥＤＯ）を用いた。これらの年令は６〜１２週
である。

ｂ）　抗原 マウスを免疫化するのに用いる抗原はトレガー（Ｔｒａ
ｇｅｒ）とイエンセ７　（Ｊｅｎｓｅｎ）の方法（参照
文献３）に従ってＡ型の人間の血清１０％を追加したＲ
Ｐ！、１１１６４０培養基でＲｈ＋で０型の人間の赤血
球上にプラスモジウム　ファルシパルムのＦＣＲ−３株
ヲ１養して得た。寄生物が感染した培養基はヴエルネス
（Ｖｅｒｎｅｓ）達の方法に従ってソルビトールで２回
処理して同期化する（参照文献４）。抗原は再侵入直後
に回収した５０ｍ１の上澄液から精製した。この培養基
のへマドクリットは２％で赤血球の１０％はシゾイトを
含んでいた。アフィニティークロマトグラフィーによる
精製は上記上澄液を基準となる高度免疫血清のＩｇＧを
用いて作ったカラムを通して行われた。

得られた物質は３つに均等に分けた後に以下の手順に従
ってマウスの免疫化に用いた。すなわち、１辱られた物
質をフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバントと
一緒に０日目と２１１日目２回腹腔中に注射し、その後
７日目に静脈注射した。

Ｃ）　細胞融合とハイブリッドの培養 ３回目の注射後三口辺にマウスを殺し、膵臓を無菌状態
で取出す。無血清培養基内でこの肺臓をすりつぶし、細
胞を洗った後、この肺臓細胞を数え、非分泌性マウスミ
エローマ細胞Ｎ５−１（参照文献１２）にＮＳ−１細胞
１つ当り上記肺臓細胞を１０の割合で混入する。細胞融
合はポリエチレングリコール１５００　（メルク（！Ｊ
ｅｒｃｋ）社製）とジメチルスルホオサイドを用いて、
ガルフルーコル（Ｇａｌｆｒｅ　−Ｃａｌｌ）　（参照
文献１３）の方法で行った。融合後、仔牛の胎児の血清
（ＳＶＦ）の存在下で洗浄した細胞を、非免疫マウスＢ
ＡＬＢ／Ｃの腹膜マクロファージの栄養床を２４時間収
容した底が平らな４つのマイクロ滴定器（コスタ−（Ｃ
ｏｓｔａｒ）、　第１２巻　９０５〜９６ページ、　Ｆ
ｌｏｂｉｏ、　　フランス）のキャップに均一に分ける
（各キャップ毎に５０００の細胞）（参照文献１４）。

ドゥルヘツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改良したイーグル
（Ｅａｇｌｅ）の培養基（参照文献１５）中で２４時間
培養する。これは１０％のＳＶＦを含む。この培養基に
は非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ｌ−グルタ
ミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ヒポキサンチ
ンおよびチミジンが添加されている（以下ＨＴ培養基と
よぶ）。

翌日以後に、上記ＨＴ培養基にアミノブチリンを添加し
て非融合ミエローマ細胞を除去し、ＩＪ　）ルフィール
ド（Ｌｉｔｔｌｅｆ　１ｅｌｄ）に従った培養基１１Ａ
Ｔを作った（参照文献１６）。

選択試験時に正の融合点にある細胞を希釈限界によって
２回クローン化した。第１回目のクローン化の後、残っ
た細胞をアミンブチリン中で順次分離してＨＴ培養基で
培養した。

細胞は以下の手順で凍結した：＋４℃へ冷却、１０分間
４００ｇで遠心分離、遠心沈降物を予め０度に維持した
ＤＭＳＯＩＯ％と５ＶＦ９０％の混合物中に入れ、整数
に等分割し、遠沈管にユング（Ｎｕｎｃ）ビオーブｏ　
ツク（Ｂ　１ｏ−Ｂ　１ｏｃｋ）　、フランス）を−８
０℃にして２４時間放置後、液体チッ素中で貯蔵する。

ｄ）　ハイブリドーマの選別 ハイブリドーマを選別するために、複数のテストをシス
テム的に行った。

プラスモジウム　ファルシパルムのＦＣＲ−３株の培養
上澄液を蛍光抗体法（［Ｆ）と抗体電子伝達法（「プロ
ット」）で調べた。ｓｓＳを含むメチオニンで５時間標
識した寄生物を剥離剤ノニデットピー４０（Ｎｏｎｉｄ
ｅｔ　Ｐ−４０）　）で可溶化した抽出物と、３５３を
含むメチオニンで５時間標識し且つ１２時間「トレース
」した培養基の上澄液との免疫沈降度を測定することに
よって上記ハイブリドーマを特徴付けた。

タンパク質ニーーセファローズ　４ビー（Ａ−３ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ４Ｂ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）社）に結合させたウサギマウス抗ＩｇＧ血清を用いた
。ポリアクリルアミドゲル（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）の電気
泳動結果をフルオログラフィーで調べたく免疫沈降法）
。

ｅ）　精製モノクロナールＩｇＧの製造単クローンＩｇ
Ｇを多量生産するために、先ずマウスに０．５ｍ１ｌ！
のプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペン
タデカン）を腹膜注射する（セルヴア、テビュ（Ｓｅｒ
ｖａ、　Ｔｅｂｕ）、フランス）。１５日後に同じく腹
膜に上記細胞（５ＸＩＯ’）を同位置に注射する。

１５日口辺後に腹水を回収し、分割し、１５００ｇで３
０分間＋４℃にて遠心分離する。

この［ｇＧはデアエートリスアクリル（Ｄ８八Ｅ−ＴＲ
ＩＳＡＣＲＹＬ）カラム（ＩＢＦフランス）を用いてイ
オン交換クロマトグラフィーで精製した。ポリアクリル
アミドゲルでの電気泳動による純度調節後、タンパク質
濃度をビオ−ラッド（Ｂ１．０−ＲＡＤ）社の「ビオ　
ラッド（３ｉｏ　Ｒａｄ）　　タンパク貿測定器」を用
いて測定した。

これらのＩｇＧのサンプルは使用時まで一８０℃で保存
した。

２、結果 プラスモジウム　ファルシパルムの免疫学的特異活性を
有する３９のハイブリドーマの中の２つを取った。これ
らを選んだのは培養したプラスモジウム　ファルシパル
ムが分泌した５０ＫＤａと４７ＫＤａ分子とその寄生物
内の共通前駆体に対して特異性を有しているからである
。

これら２つのハイブリドーマの特徴は第■表に示してあ
る。

第■表 プラスモジウム　ファルシパルムが培養基中に分泌した
５０ＫＤａと４７ＫＤａ分子の特異的ハイブリドーマと
その分子内の前駆体の特徴 ＊　おそら＜ＩｇＧｚ 木本　上記培養条件では１２６−５０ＫＤａの変換は完
全ではない。これは寄生物の最適増殖に対するインビト
ロ培養条件が一部不完全であることを示している。

■、抗原５０ＫＤａ、　　４７ＫＤａおよび１２６ＫＤ
ａの精製上記培養基を先ずタンパク質を備えていないセ
フ　７０−ズ　４ビー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ）カ
ラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）に通し
、次に上記の第■表のハイブリドーマ２３Ｄ５　２Ｈ６
から得られる単クロー、ン抗体に結合されたファローズ
４ビー　（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ）カラムに通す。

ＩｇＧはゲル１ｍｌ当り１０ｍｇにする。

洗浄後、ｐＨ１１，２の０．１Ｍジメチルアミンにより
溶離し、透析し、濃縮する。

２、抗原４７ＫＤａの精製 上記と同じ方法で第■表のハイブリドーマ３Ｅ９１Ａ１
１から作った単クローン抗体を付けたカラムを用いた。

３、抗原１２６ＫＤａの精製 上記培養基の代りに０．５％のナトリウムデオキシクロ
レートで可溶化した寄生物感染赤血球を用い、上記の単
クローン抗体のいずれかひとつを用いて上記と同じ方法
を行った。

■、酵素免疫法（εＬＩＳＡ）による、インビトロの培
１、材料 ａ）　単クローン抗体 プラスモジウム　ファルシパルムの５０ＫＤａに対する
人間用抗体の投与量を求めるために２３Ｄ５２Ｈ６クロ
ーンを用いた。

ｂ）　抗原 免疫キャプチャーによる人間の特異ＩｇＧの投与ニ用い
る抗原はプラスモジウム　ファルシパルムの異時性培養
の上澄液である。培養条件は以下の通りである。

時間０： ヘマトクリット６％（ＯＲｈ＋の人間の赤血球）寄生物
７％（ＦＣＲ−３株） 新規培養基 ２４時間後に回収 次いでこの培養基を遠心分離（６００ｇで３０分、＋４
℃）する。回収した上澄液を等分し、使用時まで−８０
℃で保存する。

Ｃ）　基準血清 各操作中の投与量の変動を減らすために、各血清の結果
は各皿上で並行してテストされる基準血清の結果と比較
する。

この基準血清は前記の高度免疫血清であって、ここでは
”　１００％抗体”と考えた。

また、既往歴がないことがわかっているフランスの部会
に過去ずっと住んでいる７オの子供の血清も各皿上でテ
ストした。これはバックグラウンドのノイズを測定する
ためである。

ｄ）　テストした血清 この研究では１７８の血清をテストした。これら血清は
年令のわかっている患者より取った。その分布は第■表
に示してある。

５０の血清はフランスで採取したもので、新生児（５）
またはマラリャの既往歴がないことがわかっている成年
（４５）から取った（ブランク群）。

１０８の血清はガボンのフランスビーユで採取した。年
令分布は第■表に示してある。

２０の血清はブリモーインハシオン−パルストール（マ
ラリア）愚者からのもので、各地から集めた。

これら血清は採取時に複数のサンプルに分け、使用時ま
で一２０℃に保持した。

上記３種類の中から取った３８の血清に対して、培養基
とＦＣＲ−３株のプラスモジウム　ファルシパルム感染
赤血球をもとにして免疫沈降を実施できた。この免疫沈
降法は既に説明した。

ｅ）　使用したＥＬＩＳＡ法 プラスモジウム　ファルシパルムの抗５０ＫＤａ抗体の
定量は底の平らなミクロ滴定プレート（コスクール、フ
ロビオ（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｆｌｏｂｉｏ）、フランス）
を用いて行った。

このプレートは予備処理なしで２００μβの容積で、ｐ
）１９．６の０．１５Ｍ緩衝液ＰＢＳ　（リン酸塩緩衝
剤）中にハイブリドーマ２３Ｄ５　２Ｈ６から得られた
精製ＩｇＧの６．２５ガンマ／ｍｌ溶液により感作する
。

＋４℃で１８時間以上培養後、キャップをトゥイーン２
０（Ｔｗｅｅｎ　２０）　（ソルビマクロゴル　ラウレ
ートの商標名、セルヴｙ　（Ｓｅｒｖａ）、　　テビ５
（Ｔｅｂｕ）、　　７ランス）を０．０５％含む脱イオ
ン水で洗ってから直ちに裏返して乾燥する（洗浄）。次
いで、５９６の牛のアルブミンをｐＨ７，２，０，１５
Ｍの緩衝液ＰＢＳに溶かした溶液（ＰＢＳ）で３７℃で
２時間飽和させる（キャップ当り２００μり。

再び洗浄した後、抗原をＴｗｅｅｎ　２０を０．１％と
牛のアルブミンを１％含むＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ−Ａ）
中で１／１０に稀釈して抗原の免疫キャップチャーが作
られる。

この稀釈液２００μｌを各キャップに分けた後、プレー
トを＋４℃に１８時間放置する。

血清をさらに洗浄してＰＢＳ−Ｔ−Ａ　（ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ−アルブミン）で１／２００に稀釈した後、キャ
ップ当り２００μβの容積を取って、３７℃で２時間培
養する。

同じ洗浄を行ってから、ＰＢＳ−Ｔ−Ａで１／３０００
稀釈したパーオキシダーゼに結合された抗体グロブリン
（抗ヒトガンマ鎖山羊抗体）　（タボ、ビオソフ）　、
（Ｔａｇｏ、　Ｂｉｏｓｏｆｔ、）パリ）を沈澱させる
。抗体グロブリンはキャップ当り２００μｌである。３
７℃で９０分間培養後プレートを洗い各キャップに以下
の溶液を注いでオルソ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）
を酸化するとパーオキシダーゼが現れる。

クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５・・ｌＯｍｆオルソフェ
ニレンジアミン　　・・４ｍｇ過酸化水素水１１０■　
　　　　　・・１５μｌ（その場で調製） 室温で１０分間暗室培養後、各キャップに２Ｎ硫酸５０
μβを入れて酵素反応を止める。

各キャップの光学濃度を波長４９２ｎｍの光をプレート
を直接通過させて光度計（ディナラボ（ＤＹＮＡＬＡＢ
）社）により測定した。

ｆ）　効果の表現法 検討した各血清に対して測定された光学濃度（ＤＯ）は
、２つの対応するキャップの光学濃度の平均を取って、
ブランクの血清に対して同一条件で測定したバックグラ
ウンドノイズを差し引いたものである。このＤＯを□同
一プレート上に存在する基準血清のＤＯと比較した。

これにより得られたパーセントを用いて、培養基中にプ
ラスモジウム　ファルシパルムが分泌した５０ＫＤａ分
子のヒト特異抗体の投与ｌ効果を表現した。

２、結果 第１表に示す結果はプラスモジウム　ファルシパルムの
抗５０ＫＤａ抗体の、この寄生物に対する免疫性を調べ
るための、投与量の効果を示している。

第１表 ブランク被検者群は明らかにネガティブである。

マラリア発熱を有する２０被検者のグループは、数日前
に初期、感染して特異抗体が認められる患者のグループ
であるが、やはりネガティブである。

また、この結果は新生児のしん帯血中にも抗５０ＫＤａ
抗体が存在することを示しており、その値は出量時の母
親の値とほぼ同じである。

ＥＬＩＳＡで測定した５０ＫＤａ分子の特異抗体の年令
による変化はガボンのこの区域におけるマラリア免疫性
の変化と同じであり、３才から免疫性が出てくる。この
相関関係はナイジェリアの完全風土病区域に生れた７３
人の子供に対する最近の結果で再確認されている。

■、材料 ａ）　単クローン抗体 プラスモジウム　ファルシパルムが分泌り、、ｆ：５０
ＫＤａ抗体の投与量を求めるためにクローン２３Ｄ５２
Ｈ６を用いた。

′Ｄ）　基準抗原 免疫キャプチャーによる分子５０ＫＤａの投与量決定の
基準となる抗原はＦＣＲ−３株のプラスモジウムファル
シパルムの異時性培養の上澄液である。

培養条件は以下の通りである。

時間０： ヘマトクリット６％（ヒトの赤血球） 寄生物７％（ＦＣＲ−３株） 新しい培養基 ２４時間後に回収 次いで、この培養基を遠心分離（＋４℃で６００ｇで３
０分）し、得られた上澄液を等分し、使用時まで一８０
℃に凍結する。この培養基に対しては、１ｍｌ！当り５
０ＫＤａを１ユニツトの濃度とみなす（ＩＵ５０）。

Ｃ）　ヒトポリクロナール血清 単クローン抗体で免疫吸着された抗原の検出は前記のこ
の研究で基準となるヒト高度免疫血清によって行った。

ｄ）　酵素免疫法 プラスモジウム　ファルシパルムの５０ＫＤａ抗Ｊｉ９
の定量化は平底を有するマイクロ滴定プレート（ミクロ
　エライザ　ヌンク　ポリ　ラボ　ブロック（！ＪＩＣ
ＲＯＥＬＩＳＡ　ＮＵＮＣＰｏ１ｙ　１ａｂｏ　Ｂｌｏ
ｃｋ）　）で行った。

このプレートは予備処理せずに、ＰＢＳ援衝液（０，１
５Ｍ　、　ｐＨ５，６）の２３Ｄ５　２１（６ハイブリ
ド一マ精製ＩｇＧ　（１０ガンマ／ｒｄ）溶液によって
２００μβで感作する。＋４℃で１８時間以上培養後、
キャップをｐＨ７，２の０．１５ＭのＰＢＳ緩衝液（Ｐ
ＢＳ）で洗浄し、次いで５％の牛のアルブミンのＰＢＳ
溶液で飽和する（キャップ当り２００μり。

次いで、プレートをトヴイーン（Ｔｗｅｅｎ　２０）　
　（セルヴア（ＳＥＲＶＡ）　）の０．０５％脱イオン
水溶液で洗浄し、裏返して素早く乾燥させる（洗浄）。

１％のＴｗｅｅｎ　２０　（ＳＥＲＶＡ）と２％の牛ア
ルブミンを含むこのＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ−Ａ）の稀釈
範囲は基準抗原（稀釈度１／１０および１／１２８０’
）と各被検査培養基とから求めた。この希釈液２００μ
βを２つのキャップ（複製）に分けてテストした。こう
して注入したプレートを一晩＋４℃で培養した。

この培養後、プレートを洗浄し、基準血清をＰＢＳ−Ｔ
−Ａで稀釈して、その２００μｌを検査すべき各キャッ
プに入れ、プレートを＋３７℃に２時間放置する。

同じ洗浄を行った後、キヤ、ツブ当り２００μｌで、Ｐ
ＢＳ−Ｔ−Ａにより１／３０００に稀釈された、パーオ
キシダーゼと結合した抗グロブリン（抗ヒトガンマ鎖山
羊抗体）　（ＴＡＧＯ，ＢＩＯ３ＯＦＴ、　　パリ）を
沈澱させる。

３７℃で９０分培養後、プレートを洗浄した。各キャッ
プにその場で調製した下記溶液２００μβを注いでオル
ソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を酸化させるとパーオ
キシダーゼが出現する。

クエン酸塩−リン酸塩緩衝液ｐｌ（５・・１〇−オルソ
フェニレンジアミン　　　　・・４ｍｇ過酸化水素水１
１０■　　　　　　　　・・１５μ！暗室中で室温で１
０分間培養後、各キャップに２Ｎ−硫酸を５０μｌ加え
て酵素反応させた。

各キャップの光学濃度は波長４９２１ｍの光をプレート
を直接通過させて光度計（ＤＹＮＡＬＡＢ）で測定した
。

ｅ）　　プラスモジウム　ファルシパルムの５０ＫＤａ
分子の濃度定量化 検査した各稀釈物に対して互いに対応するｍ１間の光学
濃度（ＤＯ）の平均を計算し、その渣からネガティブな
ブランクの光学濃度を減算する。

種々濃度の基準培養基の稀釈物から、ＤＯとこの培養基
の５０ＫＤａ分子の濃度の対数との関係を示す較正曲線
を作った（アップル［ｅ　（Ａｐｐｌｅ　■ｅ）コンピ
ュータでプログラム化）。曲線の直線部分に対応する５
０ＫＤａ分子の濃度のみを考慮に入れた。

検査した培養基に対しても同様な曲線を作った。

プラスモジウム　ファルシパルムの５０にＤａ分子の濃
度の計算においては上記校正曲線と比較して、００曲線
と培養基の稀釈度の対数の関係の直線部分に対応する点
のみを考慮した。上記ブランク曲線と比較した。

測定した濃度は上記各点から測定した濃度の平均１直で
ある。

２）結果： この例では、ブランク範囲は１／１０〜１／６４０の基
準培養基の稀釈液から決めた。統計分析の結果、この範
囲内の稀釈液の対数とＤｏ（４９２ｎｍ）　との間で直
線関係（Ｐ＜０．１）が存在することが示された。この
関係はグラフ上の稀釈液の対数に対する光学密度の変化
により確認した。

プラスモジウム　ファルシパルムの培養は４日間続けた
。この培養基は正確な時間で交換し、この間寄生物を測
定した。上澄液を一８０℃で凍結し４つの稀釈液（１７
１０〜１／８０　）で同時に分析した。

第■表は培養時間と初期寄生物（６％一定量のへマドク
リット）を変えた場合の、インビトロでの培養基上澄液
中のプラスモジウム　ファルシパルムのＦＣＲ−３株か
ら単離した５０ＫＤａ分子濃度を示している。

こうして得られた結果から、この方法の極めて優れた再
現性、その感度および寄生物量と培養時間と培養基で生
じた５０ＫＤａ分子量との王者の間の関係がわかる。

一単位５０ＫＤａ　（Ｕ３Ｏ）はへマドクリット６％と
２４時間の間に放出される５０ＫＤａ分子の量として定
義することができる。

この場合、１２６ＫＤａの分子が培養基の上澄液中に痕
跡状態で存在し、単クローン抗体がその分子と５０ＫＤ
ａ分子を区別無く認識する限りは、５０ＫＯａ分子は、
１２６ＫＤａの前駆体の一部を成すものと考えられる。

第■表 この表から５０ＫＤａ分子の濃度は培養時間と初期寄生
物量に比例して増加することがわかる。

決定法 この投与量決定法は上記■と同じ手順で行ったが、分子
４７ＫＤａの特異単クローン抗体、例えば第１表に示し
たクローン３　Ｅ　９　／　ｌ　　ＡＩＬヲ用いた。

状況の研究 この研究は従来の抗マラリア剤（硫酸キニーネおよび塩
化キニーネ）で治療中の３人の患者について行った。血
清中投与は上記（Ｖまたは■）の培養基への場合と同じ
条件で行ったが、１／４ｏと１／１゜の血清稀釈液とし
たことが異なる。

患者の急性期中、患者の血清は１＋ｔｆ当り５０ＫＤａ
（Ｕ３Ｏ）を０．１〜０．３単位含んでいることが観察
された（単位に関しては、第Ｖ章で定義した）。

規則的に反復投与すると、患者の血清から５０ＫＤａの
分子が少しずつ消え、治療の４〜６日目には完全に消え
ることが確認された。

〜■０分子１２６ＫＤａと、この分子１２６ＫＤａと分
子５０ＫＤａ１、　１２６−５０ＫＤａ変換の様式 異時性培養基を３５３を含むメチオニンで６時間標識す
る。次いで、シゾントをメトリシアミドのマット上で遠
心分離する。このシゾントをさらに単独（、この場合に
は単にメロゾイトの放出のみが行われる）か健康な赤血
球と一緒に（この場合には再侵入が起る）標準培養条件
で１６時間再培養する。この培養の終了時に、培養基を
個々の免疫ＩｇＧまたは前記のようにして選別したクロ
ーンから得られる単クローン抗体によって免疫沈降させ
る。

これら２つのシゾントに対して異なった培養法を用いた
が、差は観察されなかった。従って、１２６−５６ＫＤ
ａの変換はモロゾイトの放出の結果であって赤血球の再
侵入ではない。

同じ実験中に、放射性元素で標識したシゾントの一部を
培養基中で凍結してから３７℃で１６時間培養した。５
０ＫＤａの分子はこの条件では現われないのに対して、
１２６ＫＤａは凍結時に培養基中に放出される。従って
、１２６−５０ＫＤａの変換にはモロゾイトの自発的放
出が必要とされるため、変換はこの培養基中の１２６Ｋ
Ｄａの単純なタンパク分解ではないと思われる。

２　、１２６ＫＤａ分子の生合成動力学異時性培養基の
一つを３５３を含むメチオニンで３０分間標識し、培養
基中に再懸濁させ、同一容積に８等分し、３７℃で培養
し、「トレース」の０゜５．６．７．８．９．１０およ
び１１時間後に順次取出した。可溶化した後、取出した
各細胞と培養基を前記の単クローン抗体で免疫沈降させ
た。

１２６ＫＤａタンパク質は標識終了時に赤血球中に現わ
れ、「トレース」の１０時間後まで存在する。５０ＫＤ
ａは「トレース」の６時間後から培養基中に現われる。

１２６−５０ＫＤａ変換はモロゾイトの放出−再侵入期
に起るので、生合成動力学の研究から１２６ＫＤａタン
パク質は約４時間、３２時間後から３６時間後に合成さ
れることが示される。赤血球内サイクルは４２時間をひ
とつの単位とする。この期間は増員生殖中の核増加期間
に対応する。

０．１％のサポニン溶液中での短時間培養（２０℃で５
分間）で赤血球は溶解するが寄生物は変化しない。特に
シゾントの表面に存在する１９５ＫＤａの主抗原は離れ
ない（参考文献１７）。

Ｉ５３を含むメチオニンで標識した寄生物感染赤血球（
異時性培養、３時間標識、２時間　「トレース」）を２
０℃で５分間、０．１％サポニンのＰＢＳ溶液で処理し
た。次いで寄生物と溶解上澄液を遠心分離で分離し、前
記の単クローン抗体で免疫沈降させ分析した。

１２６ＫＤａ分子はサポニン上澄液中に認められる。

これは空胞が局在化（すなわち寄生物親和空胞の膜内）
していることを示唆している。

ｂ）　電子顕微鏡 この方法でも単クローン抗体を使用すると、シゾントの
周囲、即ち寄生物親和空胞の所に１２６ＫＤａ分子を局
在化できる（パラホルムアルデヒド−グルタルアルデヒ
ドへの固定とサポニンへの浸透化後に、「間接免疫パー
オキシダーゼ」で検出）。

述べたようにして精製した１２６ＫＤａタンパク貿の約
１ｍｇをヴアイッカイチス（ＶＡＩＴＩＩＫＡＩＴＩＳ
）　（参考文献２０）の方法でウサギに注射し、回収し
た抗体を第１章の第１段落の５０にＤａ分子の発現時に
記載のようにしてメチオニンで標識した培養基の上澄液
の免疫沈降に用いた。この免疫沈降の結果、１２６ＫＤ
ａ分子に対してウサギの体内で作られたポリクローン血
清は還元状態で分子量が各々５０ＫＤａ、　　４７ＫＤ
ａおよび１８ＫＤａの３つのポリペブタイドを同定でき
ることが示された。このことは１２６ＫＤａ分子の変換
によってそれぞれ３つの成分５０．４７および１８ＫＤ
ａが生まれることを示している。さらに正確には非還元
状態で電気泳動で証明されている。この方法によると、
上記ポリクローン抗体は５０ＫＤａ分子と約６５ＫＤａ
分子とを同定することができ、後者は硫　　（）黄ブリ
ッジで結合された分子４７ＫＤａと１８ＫＤａとで　　
（１構成されていることがわかった。

“０ 参考文献 （１）　　　Ｊ、　Ｂ、　　Ｊｅｎｓｅｎ　と（す、　
　Ｔｒａｇｅｒ、　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　　　　　Ｑｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ　ａｎｄ　Ｈｙｇｉｅｎ　（１９７ｇ）　２７（
４）、　７４３〜６０ （２）　　　Ｇ、　　　巳、　　Ｍｏｏｒ６　　達、　
　　ＪＡ！、ＩＡ、　　　１９９．　　５１９　　（１
９６７）（３）　　Ｈ，Ｔｒａｇｅｒ　　とＪ、Ｂ、　
　Ｊｅｎｓｅｎ、　　５ｃｉｅｎｃｅ　１９３．　　　
　０６７３〜５　（１９７６）　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｃ□（４）　　Ａ、Ｖｅｒｎｅｓ達、　Ａｍ
、　　Ｊ、　Ｔｒａｐ、！、Ｉｅｄ、Ｈｙｇ、３３゜１
９７〜２（１３　（１９８４）　　　　　　　　　　　
　　　　（（５）　　Ａ、Ｈ９ＥｒｉｃｋｓｏｎとＧ、
Ｂｌｏｂｅｉ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　　　（１
日１１１７７１〜４　（１９７９）　　　　　　　　　
　　　　（（６）　　Ｊ、　５ａｉｎｔ　Ｂｌａｎｃａ
ｒｄ達、　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　　（（
１９８２）　ｐ、　３０５〜３１ ２（７）　　Ｃ，Ｄ、　　Ｄｅａｔｏｎ達、Ｃｌ１ｎ、
Ｃｈｅｍ、２２．１４６５〜７１　　　　（１）　　Ｕ
、　　Ｋ、　　Ｌａｅｍｍｌｉ、　　Ｎａｔｕｒｅ、２
２７．　６８０〜５　　（１９７０）リ　　Ｒ，Ａ、　
Ｌａ５ｋｅｙ達、　　Ｆｕｒ、　Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、５５　３３５〜ｌ　　Ｊ、　　Ａ、Ｇａｒｒｅｔｓ
、　　Ｊ、　　Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、　　２５４　７９
６１〜７９７７　　（１９７９） １）　　Ｐ、　　Ｈ，Ｏ’Ｆａｒｒｅｌ、　　Ｊ、　　
Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ　２５０　４００７〜４（１２
１　　（１９７５） ２１　　Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ達、　　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　
Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

６、　２９２　　（１９７６） ３）　　Ｇａ１ｆｒｅ達、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２２
６．　５５０　（１９７７）４）　　Ｆａｚｅｋａｓ　
ｄｅ　Ｓｔ、　Ｇｒｏｔｈ達、　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ！Ｊｅｔｈｏｄｓ、　　３５．　１
　　（１９８０）５Ｊ　　Ｒ，［１ｕｌｂｅｃｃｏ達、
　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　８．　３９６　（１９５９）ｅ
Ｊ　　Ｊ、Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ、　　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　１４５．　７０９　　（１９６４）７）　　Ｒ，Ｊ
、　　Ｈｏｗａｒｄ達、　！Ｊｏｌｅｃ、　Ｂｉｏｃｈ
、Ｐａｒａｓｉｔ、１１゜１１ＤＲｏｄｒｉｇｕｅｚ　
Ｄａ　５ｉｌｖａ達、Ｂｕｌｌ、　ＷＨＯ，６１，１０
５〜１１２　　（１９８３） ｊ９）　　マナオス（ブラジル）で単離され且つ米国、
ワシントンのｔすａｌｔｅｒ　Ｋｅｅｄ　Ａｒｍｙ　Ｉ
ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＲｅ５ｅａｒｃｈで発表された
ＩＴＵＸ−１株？Ｄ）　　Ｊ、　　Ｖａｉｔｕｋａｉｔ
ｉｓ達、　　Ｊ、　　ｏｆ　Ｃｌ１ｎ、　　Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ、！、Ｉｅｔａｂｏ１．３３．　９８８〜９
９１　　（１９７１）。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）￥プラスモジウム　ファルシパルム￥の赤血球内
   侵入期に単離できる抗原であって、 ａ）増員生殖中の核増加期間の間に合成され且つ寄生物
   担持空胞の所でシゾントの周囲に局在する１２６ＫＤａ
   のタンパク質と、 ｂ）￥プラスモジウム　ファルシパルム￥に感染した患
   者の血清中またはこの微生物培養基中に、この微生物の
   赤血球内侵入期に現われ且つａ）で定義した　１２６Ｋ
   Ｄａのタンパク質を前駆体として有する、等電点が５．
   ５の５０ＫＤａのタンパク質と、 ｃ）￥プラスモジウム　ファルシパルム￥に感染した患
   者の血清中またはこの微生物の培養基中に、その赤血球
   内侵入期に現われ且つａ）で定義した１２６ＫＤａを前
   駆体として有する、電気泳動によって等電点が約５．９
   と約６．１の２つの点に分離する４７ＫＤａのタンパク
   質とにより構成されることを特徴とする抗原。
2. （２）増員生殖中の核増加期間の間に合成され且つ寄生
   物担持空胞の所でシゾントの周囲に局在し且つ５．５の
   等電点を有する５０ＫＤａのタンパク質の前駆体である
   １２６ＫＤａのタンパク質と、￥プラスモジウム　ファ
   ルシパルム￥の培養基中およびこの微生物に感染した患
   者の血清中に現われ、電気泳動で等電点が約５．９と約
   ６．１の２つの点に分離する４７ＫＤａのタンパク質と
   で構成されることを特徴とする￥プラスモジウム　ファ
   ルシパルム￥の赤血球内侵入期に単離できる抗原。
3. （３）￥プラスモジウム　ファルシパルム￥に感染した
   患者の血清中またはこの微生物の培養基中にその赤血球
   内侵入期に現われ、等電点５．５を有する５０ＫＤａの
   タンパク質で構成されることを特徴とする￥プラスモジ
   ウム　ファルシパルム￥の赤血球内侵入期に単離できる
   抗原。
4. （４）￥プラスモジウム　ファルシパルム￥に感染した
   患者の血清中またはこの微生物の培養基中に、その赤血
   球内侵入期に現われ、電気泳動法により約５．９と約６
   ．１の２つの点に分離する４７ＫＤａのタンパク質によ
   って構成されることを特徴とする￥プラスモジウム　フ
   ァルシパルム￥の赤血球内抗原。
5. （５）ｄ）￥プラスモジウム　ファルシパルム￥に感染
   した患者の血清中またはこの微生物の培養基中に、その
   赤血球内侵入期に現われ且つａ）で定義したタンパク質
   を前駆体として有する１８ＫＤａのタンパク質をさらに
   含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   抗原。
6. （６）￥プラスモジウム　ファルシパルム￥に感染した
   患者の血清中またはこの微生物の培養基中に赤血球内侵
   入期に現われる１８ＫＤａのタンパク質によって構成さ
   れることを特徴とするプラスモジウムファルシパルムの
   赤血球内抗原。
7. （７）ｃ）で定義した４７ＫＤａのタンパク質とｄ）で
   定義した１８ＫＤａのタンパク質が合体して形成される
   約６５ＫＤａのタンパク質で構成されることを特徴とす
   る￥プラスモジウム　ファルシパルム￥の抗原。
8. （８）上記１２６ＫＤａのタンパク質の免疫化によって
   得られるポリクローン血清により同定されることを特徴
   とする特許請求の範囲第１〜７項いずれか一項に記載の
   抗原から得られる抗原。
9. （９）精製すべきタンパク質の特異モノクロナール抗体
   および／または特異ポリクロナール抗体を備えたアフィ
   ニティークロマトグラフィーのカラムに￥プラスモジウ
   ム　ファルシパルム￥の異時性培養基の上澄液を通過さ
   せ、次いでカラムから抗原を分離する工程から基本的に
   構成されることを特徴とする特許請求の範囲第３、４お
   よび６〜８項のいずれか一項に記載の抗原の精製方法。
10. （１０）１２６ＫＤａのタンパク質を共通の前駆体とし
    て有する５０、６５、４７および１８ＫＤａの抗原のう
    ちのひとつまたは２つの特異的モノクロナール抗体およ
    び／またはポリクローン抗体を備えたアフィニティーク
    ロマトグラフィーのカラムに￥プラスモジウム　ファル
    シパルム￥が寄生した赤血球を可溶化して得られる溶液
    を通し、次いでこのカラムから抗原を分離する工程から
    基本的に構成されることを特徴とする特許請求の範囲第
    ２、５および８項のいずれか一項に記載の抗原の精製方
    法。
11. （１１）特許請求の範囲第１〜８項いずれか一項に記載
    の少なくとも１つのタンパク質に対する抗体の投与量決
    定法であって、 ａ）投与すべき抗体に対応する分子（４７、１８、６５
    、５０および／または１２６ＫＤａ）の特異モノクロナ
    ール抗体を担体上に固定し、 ｂ）担体上に残った自由な部位を飽和させ、ｃ）￥プラ
    スモジウム　ファルシパルム￥の異時的培養の上澄液か
    ら得られる抗原を過剰に加えて反応させ、 ｄ）上記ｃ）段階で担体上に固定された抗原と被検査培
    養基とを反応させ、 ｅ）ｄ）までの全体を酵素で標識化した人間の抗免疫グ
    ロブリン抗体と反応させ、 ｆ）予め較正してある酵素の特異反応を用いて、ｅ）の
    段階で担体上に固定した酵素の量から検査培養基中に存
    在する特異抗体量を測定する、操作によって基本的に構
    成されることを特徴とする投与量決定法。
12. （１２）マラリアに冒された患者の血清中または￥プラ
    スモジウム　ファルシパルム￥の培養基中に、特許請求
    の範囲第３〜８項いずれか一項に記載の抗原を、または
    可溶化後の赤血球中に特許請求の範間第２項記載の抗原
    を投与する場合の投与量決定法であって、 ａ）担体上に被投与分子の特異モノクロナール抗体を固
    定し、 ｂ）担体上に残った自由サイトを飽和させ、ｃ）被投与
    抗体を含むことのできる培養基と反応させ、 ｄ）ｃ）までの全体を免疫被検者から取った基準血清と
    反応させ、 ｅ）酵素で標識化した人間の抗ＩｇＧ抗グロブリンと反
    応させ、 ｆ）予め較正してある酵素活性度を用いて被検査培養基
    中に存在する抗原量を求める、 操作によって基本的に構成されることを特徴とする投与
    量決定法。
13. （１３）活性主成分として、１８ＫＤａ、４７ＫＤａ、
    ６５ＫＤａ、５０ＫＤａおよび１２６ＫＤａのタンパク
    質の少なくとも一つを含み、好ましくはアジュバント、
    および好ましくは水酸化アルミニウムを存在させること
    を特徴とするマラリアに対するワクチン。
14. （１４）１３ＫＤａおよび／または５０ＫＤａおよび／
    または４７ＫＤａ、および／または６５ＫＤａおよび／
    または１２６ＫＤａのタンパク質を０．５〜１．５ｍｇ
    、好ましくは１ｍｇと、 水酸化アルミニウムを０．３〜２ｍｇ、好ましくは１ｍ
    ｇと、 必要量の緩衝性等張液と、 を含むことを特徴とする０．５ｍｌのワクチンの一投与
    量。