JPS6214781A - リパ−ゼの固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリパーゼの固定化方法に関するものである。詳
しくは、リパーゼ水懸濁液を両親媒性皮膜によりマイク
ロカプセル化し、ＰＣＲＰと混合して光重合開始剤の存
在下活性光線を照射する事に依り、リパーゼマイク、ロ
カプセルを疎水性光架橋性樹脂内に包括固定するリパー
ゼの固定化方法に関するものである。

（産業上の利用分野） リパーゼの固定化は、従来高温高圧下で行なわれてきた
油脂加工、即ち油脂の分解、グリセリドのエステル合成
及びエステル交換反応等に基づく操作を常温常圧下で行
ない、かつこれを工業化するために欠く可からざる重要
な技術であり、省エネルギー、省資源の観点からも期待
されるものである。

（従来の技術） 従来のリパーゼ固定化方法としては、ハンス・プランデ
ンベルガ−（Ｒａｎ　ｓ　、ＢＲＡＮＤＥＮＢＥＲＧＥ
Ｒ）がポリスチレン系イオン交換樹脂を用いた共有結合
法（Ｒｅｖ、Ｆｅｒｍｅｎｔ　。

Ｉｎｄ、Ａｌｉｍｅｎｔ、、１１，２３７．（１９５６
））を報告して以来、ポリスチレン、シリコーン、エチ
ルセルロース等の高分子から成るマイクロカプセル内に
リパーゼを包括する方法〔北島、宮野、近藤、工業化学
雑誌、Ｐ、４９３，２゜７２、（１９６９））、あるい
はポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール等の高分
子ゲル内にリパーゼを包括する方法〔特開　昭５０−１
２９７８９〕等、数多くの研究例が報告されている。

また、光架橋性樹脂を用いた包括固定化方法としては、
セライト等にリパーゼを吸着させ、その周囲をポリプロ
ピレンを主鎖とする疎水性光架橋性樹脂で包括するとい
う方法〔福井、日中、化学と生物、Ｐ６２０，１９，１
０．（１９８１））が報告されている。

（発明が解決しようとする問題点） リパーゼを水不溶性担体表面に共有結合、イオン結合、
あるいは分子吸着により固定した場合は、リパーゼが表
布している事から固定化時の活性収率は高く、反応速度
論的にも有意ではあるが、逆に温度、ｐＨ１基質濃度等
の外部環境の影響を直接的に受けるため、リパーゼの安
定性は低いものとなる。リパーゼを高分子体により包括
固定する場合は、リパーゼと基質の間に高分子膜、ある
いは高分子ゲルが介在するために外部環境の影響は緩和
され、安定性の高い固定化リパーゼが得られるが、基質
の高分子体に対する透過性に依存する速度論的反応率低
下が生じる事が多い。固定化酵素における工業的生産性
は活性収率と経時的活性低下（劣化）率、即ち安定性と
の積により表されるものであり、生産性の高いもの程、
優良な固定化酵素であると言える。この見地からすれば
、従来の固定化方法では、活性収率と安定性の両者を同
時に満足するものは限られており、特にリパーゼに関し
ては、その方法は見出されていない。また、従来のリパ
ーゼ固定法では、リパーゼを完全に活性化し得る水和条
件を維持する事ができないために、活性発現率が非常に
低いものとなっている。何故なら、担体内への基質透過
性を向上きせるためには、担体を疎水性度の高いものに
する必要があるが、疎水性基が数多く存在する場合には
、水和に必要な水は固定されたリパーゼ近傍に近寄す難
くなり、リパーゼを充分に活性化できないからである。

マイクロカプセル包括法においては、リパーゼに必要な
水は充分に維持する事ができるが、基質の透過性、マイ
クロカプセル皮膜の物理的強度の点で問題があり工業生
産化は困難である。

従来のリパーゼ固定化方法は、一般的に油脂の加水分解
を目的として開発きれたものが多く、トリグリセリドの
加水分解に対しては有効であるが、脂肪酸・グリセリン
を基質とするエステル合成反応に用いた場合は何れも反
応率が低く、エステル合成を目的とする反応には有効で
ない。何故なら、トリグリセリドの加水分解の場合は水
飽和のベンゼン、トルエン、ヘプタン等の低極性溶媒に
トリグリセリドを溶解し、基質を均質化する事が可能で
あるが、脂肪酸・グリセリンを基質とする場合には、両
者を乳化操作によりエマルジョンとして担体内へ透過さ
せなければならず、基質の供給が充分に行なわれなくな
るからである。

（問題を解決するための手段） 本発明者らは、リパーゼを固定化して、その活性を高く
、かつ長期間維持し、油脂の加水分解反応、エステル合
成反応、エステル交換反応等を工業的に行なう事を目的
として鋭意研究を重ねた結果、リパーゼ水懸液を両親媒
性皮膜によりマイクロカプセル化し、疎水性光架橋性樹
脂を用いてリパーゼマイクロカプセルを包括固定する事
により、リパーゼ活性が長期間維持きれ、油脂加工を工
業的に行なえる方法を発明した。即ち本発明は、リパー
ゼ水懸濁液を両親媒性物質を含む有機溶媒中にて両親媒
性皮膜によるマイクロカプセルとし、平均分子量２００
０〜２００００のＰＣＲＰと混合して、光重合開始剤の
存在下活性光線を照射し、リパーゼマイクロカプセルを
疎水性光架橋性樹脂内に包括固定する事を特徴とするリ
パーゼの固定化方法である。

本発明に用いるリパーゼは、動物内臓器及び微生物由来
の何れの物であっても良いが、工業生産化の見地から、
耐熱性があり、反応条件の広い微生物リパーゼを用いる
事が望ましい。微生物リパーゼとしては、リゾプス・デ
レマー（Ｒｈｉｚ。

ｐｕｓ　　ｄｅｌｅｍｅｒ）、シュウトモナス・フルオ
レスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆ’１ｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ）、カンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄ
ｉｄａ　　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）。

クロモバクテリウム・ビスコスム（Ｃｈ　ｒ　ｏｍ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｖｉｓｃｏｓｕｍ）等由来の物
が挙げられる。

本発明に用いるリパーゼ水懸濁液とは、リパーゼを緩衝
液中に懸濁した溶液であり、この溶液にはリパーゼ活性
維持の為の安定化剤として、各種の金属イオン、アルブ
ミン、グロブリン、カゼイン等の蛋白質、グリセリン、
プロピレングリコール等の多価アルコール化合物及びそ
のエステル化合物、水分散性リン脂質類等を添加する事
ができる。

本発明に用いる両親媒性物質とは、両親媒性皮膜を構成
する物質であり、皮膜形成物質と皮膜強化成分とに大別
される。動植物由来のレシチン。

エタノールアミンセファリン、セリンセファリン等のフ
オスフオグリヤリド類、イノシトールリンａｉ類、スフ
ィンゴミエリン等のフオスフオスフィンゴシド類、及び
これらの合成物、炭素数４〜３０のアルキルポリオキシ
エチレングリコールエーテル類、アルキルスルフィニル
アルコール類、アルキルグルフシド類、アルキルトリメ
チルアンモニウム塩類の一種あるいは二種以上の混合物
でミセル形成能の高いものが皮膜形成物質であり、これ
らは両親媒性皮膜の主構成分となり、単独でも両親媒性
皮膜を形成する事ができる。

皮膜強化成分としては、コレステロール、ビタミンＤ等
の動物性ステロイド及びそのエステル類、フィトステロ
ール等の植物性ステロイド及びそのエステル類、コール
酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、グルコ
コール酸、タウロコール酸等の胆汁酸及びその塩類、ジ
アシルリン酸化合物、蛋白質等が挙げられ、特にコレス
テロールは生体膜の構成成分として周知であり、両親媒
性皮膜の物理化学的性状の保持に有効である。これらの
強化成分は皮膜形成物質と併用する事により両親媒性皮
膜を強化すると共に化学的特性を付与する事が可能であ
る。

両親媒性物質の使用量は、有機溶媒溶液として０．１〜
３．０重量％である事が望ましい。

本発明に用いる有機溶媒としては、ヘキサン。

ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン等のＲ素数４〜２
０の詣肪族炭化水素化合物、クロロホルム。

トリクロロエチレン、四塩化炭素等の炭素数１〜４のハ
ロゲン化炭化水素化合物、カプロン酸、カプリル酸、オ
レイン酸等の炭素数２〜２０の脂肪酸及びそのエステル
類が挙げられ、光重合反応を阻害する共役二重結合を二
個以上台まない物が望ましい。また、これらの有機溶媒
は、単独での使用に限らず、二種以上を混合して用いて
も良い。

本発明に用いるＰＣＲＰは、ポリオキシエチレン・ポリ
オキシプロピレンブロックポリマーを主体とし、そのオ
キシエチレン／オキシプロピレン比率は、１／１０〜１
／３が望ましく、１／３より大きい場合は、ＰＣＲＰの
親水性塵が高まり、基質である油脂の透過性が著しく低
下する事と成り、１／１０よりノ」−さい場合は、リパ
ーゼマイクロカプセル表面を保護するオキシエチレン基
の作用が低下し、リパーゼマイクロカプセルを安定保持
できなくなる。

本発明の疎水性光架橋性樹脂は、平均分子量２０００〜
２００００のＰＣＲＰが光重合反応により三次元架橋構
造を形成して得られるものであり、ＰＣＲＰの平均分子
量が２０００より小さい場合は、リパーゼマイクロカプ
セルを包括するだけの空間を確保する事が難しくなり、
２００００より大きい場合は、リパーゼマイクロカプセ
ルが疎水性光架橋性樹脂内から脱離し易くなり、安定化
の点から好ましくない。

本発明に用いる光重合開始剤としては、ペンゾイン、ア
セトイン等のα−カルボニルアルコール類、ベンゾイン
メチルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾイ
ンプロピルエーテル、ピバロインエーテル等のアシロイ
ンエーテル類、ナフトール、ヒドロキシアントラセン等
の多環芳香族化合物類が望ましく、その量はＰＣＲＰ　
ｔ　ｏ　ｏ重量部に対して０，０１〜１０重量部を用い
る事が好ましい。

本発明に用いる活性光線とは、光重合反応を生じせしめ
る波長２２０〜７００　ｎｍ、好ましくは波長２５０〜
６００ｎｍの光であり、その光源としては、低圧水銀灯
、高圧水銀灯、螢光灯、キセノンランプ、ケミカルラン
プ等が用いられる。

（作用） 本発明では、リパーゼ水懸濁液を両親媒性皮膜によりマ
イクロカプセル化している。

本発明の両親媒性物質は、疎水基を外側にし、親木基を
内側とした単分子膜、あるいはリポソーム状の二重膜構
造を形成しており、包括されたリパーゼは両親媒性皮膜
中及び皮膜内表面に散在していると推測されるが、リパ
ーゼの安定性の点では二重膜構造である事が好ましい。

本発明において基質となる油脂は、疎水性光架橋性樹脂
の分子格子を通ってリパーゼマイクロカプセル表面に達
し、両親媒性皮膜内のリパーゼの作用を受けるが、両親
媒性皮膜における基質透過性は、従来の高分子膜マイク
ロカプセルの様に膜の細孔の大きさに依存するものでは
無く、膜成分に対する溶解性に依存しているため、基質
と反応生成物の極性が大きく変化するリパーゼ反応系に
おいては、目的とする物質に対して分子レベルでの選択
透過性を付与する事が可能である。

本発明におけるリパーゼは、充分に水和され、活性化さ
れた状態で包括されており、更に活性維持に必要とされ
る水分はマイクロカプセル内から随時補充されるため、
リパーゼ活性を長期間に渡・って維持する事ができる。

以上の様に、両親媒性皮膜によるリパーゼのマイクロカ
プセル化は、従来の固定化方法において不可避であった
活性収率の低下の問題を根本的に解決するものであるが
、両親媒性皮膜の物理的強度は非常に小さいため、工業
生産化に適したものとするためには、皮膜強化物質を添
加し、皮膜の周囲を高分子体で保護する必要があった。

本発明で用いる皮膜強化物質は、両親媒性物質間の疎水
性吸引力と極性基間反発力を高めて皮膜を強化するだけ
でなく、基質油脂の溶解性を調整する作用も持っている
。

本発明で用いるＰＣＲＰは、オキシエチレン／オキシプ
ロピレン比率を変える事により、基質透過性を任意に調
整するだけでなく、ポリオキシエチレン基により両親媒
性皮膜表面を保護する作用も持っており、耐熱性、耐溶
剤性の面からもリパーゼマイクロカプセルに物理的強度
を付与するに最適の物と言える。

即ち本発明は、両親媒性皮膜によるマイクロカプセル固
定化法と疎水性光架橋性樹脂による包括固定法を合わせ
た複合固定化法であり、両者の利点の相乗効果によりリ
パーゼ活性収率及び活性安定性は極めて高いものと成っ
た。

以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明
は、これらの実施例に限定されるものではない。

実施例　１ ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポ
リマー（プロノン　２０１２日本油詣■Ｍ）１．０モル
、　２　、４−　トリレンジイソシアナート２．０モル
、２−ヒドロキシエチルメタアクリルレート２．３モル
から成る疎水性光架橋性樹脂プレポリマー５０部をｎ−
ヘキサン５０部に加えて溶解させる。

クロモバクテリウム・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　　ｖｉｓｃｏｓｕｍ）由来のリパーゼ（
東洋醸造■製）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）
に懸濁させた酵素水溶液を、卵黄レシチン＝コレステロ
ール＝ジセチルリン酸混合物（７：２：１０）を３重量
％含むクロロホルム溶液中に注ぎ、これをロータリーエ
バポレーターに移した後、３７°Ｃ２窒素ガス通気下に
て回転混合する。得られた乳化液を、３７°Ｃにて３時
間装置した後、５°Ｃ２窒素ガス下にて超音波処理を行
ない、遠心分離にてリパーゼマイクロカプセルを回収す
る。リパーゼマイクロカプセル１０部をｎ−ヘキサン５
０部に加えて懸濁し、これを先に調製したＰＣＲＰ溶液
に加え、ベンゾイン２部と共に混合攪拌し、２−３ｍ径
の球状に成形した後、波長３６５　ｎｍの紫外線を１０
分間照射して固定化リパーゼを作成した。

実施例　２ 精製米油５００部、ｎ−ヘキサン５００部に対して実施
例１の固定化リパーゼ１０部をくわえて、３７°Ｃ１窒
素ガス通気下にて攪拌し、経時的に試料を分取してエバ
ポレーターにてｎ−ヘキサンを留去した後、酸価を測定
して分解反応率を求めた。

試料の組成分析は、プラム（Ｊ　、　Ｂ　ｌ　ｕｍ）ら
の方法（Ｌｉｐｉｄ、５，６０１．（１９７０））に従
い、試料の２．０ｍｇをピリジン１　、０ｍｌに溶解し
、ヘキサメチルジシラザン０．２ｍｌ、トリメチルクロ
ロシラン０．１ｍｌを加えてＴＭＳ化し、ガスクロマト
グラフィーにて行ない、図１の結果を得た。

７２時間後の最終反応率は９５．０％であった。

実施例　３ オレイン酸（エクストラオレイン　９０２日本油脂■製
）６００部、精製グリセリン（版本薬品工業■製）４０
０部に対してｎ−ヘキサン４００部を加えた基質溶液を
調製し、これに実施例１の固定化リパーゼ１０部を加え
、３７°Ｃ２窒素通気下にて攪拌し、経時的に試料を分
取してエバポレーターにてｎ−ヘキサンを留去した後、
酸価を測定して残存詣肪酸量及びエステル合成反応率を
求めた。反応生成物組成は、実施例２と同様の操作にて
ガスクロマトグラフィーにより求め、図２の結果を得た
。

６４時間後の最終反応率は７８．０％であった。

実施例　４ オレイン酸（エクストラオレイン　９０．オレイン酸９
２％２日本油脂■製）１４３２ｇ、精製グリセリン（版
本薬品工業■製）９２０ｇに対してｎ−ヘキサン１５０
０ｍｌを加えて基質溶液を調製し、これに実施例１の固
定化リパーゼ１０ｇを加え、３７℃、７２時間、窒素通
気化にて攪拌して、エステル合成反応を行なった。経時
的に試料ヲ分取してエバポレーターにてｎ−ヘキサンを
留去した後、酸価を測定して反応率を求め、反応生成物
組成は、実施例２と同様の操作にてガスクロマトグラフ
ィーにより求めて、表１の結果を得た。

以下余白 表１゜ 反応率　９５．０％ 実施例　５ ステアリン酸（ＮＡＡ−１８０，ステアリン酸９０％２
日本油脂■製）４３０ｇ、精製グリセリン（版本薬品工
業■製）４２０ｇに対してｎ−ヘキサン５００ｍ１を加
えて、基質溶液を調製し、これに実施例１の固定化リパ
ーゼ３ｇを添加し、６５°Ｃ２７２時間、窒素通気化に
て攪拌して、エステル合成反応を行なった。反応率及び
反応生成物組成は、実施例２と同様の操作にてガスクロ
マトゲラフイーにより求めた。

反応生成物組成は、表２に示す通りであった。

表２ 反応率　９０．５％ 反応終了後、回収した固定化リパーゼの残存活性を測定
したところ、９８．０％の活性が残っていた。

以下余白 （発明の効果） 本発明により得られた固定化リパーゼは、エステル合成
反応においても加水分解反応とほぼ同等の高反応率を呈
し、ステアリン酸等の高融点脂質を処理する場合でも、
その反応率には何ら遜色はなく、従来の固定化イコール
低活性の概念を払拭するものである。

本発明による固定化リパーゼの使用法は、実施例に記し
たバッチ法に限定されるものではなく、カラムに充填す
ることにより連続法にて反応を行なうことが可能であり
、工業生産化に際して、基質の性状に合わせた使用法を
選択する事ができる。

本発明を用いたエステル合成反応においては、従来の高
温高圧反応に比べて、反応に要する熱量は１／１５−１
１５となり、反応条件を維持するために繁雑な操作を行
なう必要が無い上、界面活性剤として有用なモノグリセ
リドの生成率も向上するという利点があり、固定化リパ
ーゼの高い活性安定性から見ても工業生産化に適してい
るといえる。

即ち、本発明は、省エネルギー、省資源型の油脂加工技
術を供するものであり、高収率、安価に油脂加工を行な
うことを可能とするものである。

【図面の簡単な説明】

図１は、精製米油の加水分解時における反応生成物組成
の変化をモル％で表わしたものである。 図２は、オレイン酸・グリセリン系でのエステル合成反
応時における反応生成物組成の変化をモル％で表わした
ものである。 ＴＧ・・・トリグリセリド ＤＧ・・・ジグリセリド ＭＧ・・・モノグリセリド ＦＡ・・・遊離脂肪酸

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）、一種又は二種以上の両親媒性物質を含む有機溶
   媒中において、リパーゼ水懸濁液を両親媒性皮膜により
   包括してリパーゼマイクロカプセルを調製し、得られた
   リパーゼマイクロカプセルと平均分子量２０００〜２０
   ０００の疎水性光架橋性樹脂プレポリマー（以下ＰＣＲ
   Ｐと略す）を混合して、光重合開始剤の存在下、活性光
   線を照射する事により、リパーゼマイクロカプセルを疎
   水性光架橋性樹脂内に包括固定することを特徴とするリ
   パーゼの固定化方法。
2. （２）、ＰＣＲＰが、ポリオキシエチレン・ポリオキシ
   プロピレンブロックポリマー系非イオン界面活性剤の両
   端に光重合性を持つエチレン性不飽和基を導入した平均
   分子量２０００〜２００００の不飽和ポリエステルであ
   る特許請求の範囲第（１）項記載のリパーゼの固定化方
   法。
3. （３）、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブ
   ロックポリマーが、オキシエチレン／オキシプロピレン
   比率１／１０〜１／３である特許請求の範囲第（１）及
   び（２）項記載のリパーゼの固定化方法。