JPS6214785A - 熱誘発性プラスミド - Google Patents
熱誘発性プラスミドInfo
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- JPS6214785A JPS6214785A JP61153945A JP15394586A JPS6214785A JP S6214785 A JPS6214785 A JP S6214785A JP 61153945 A JP61153945 A JP 61153945A JP 15394586 A JP15394586 A JP 15394586A JP S6214785 A JPS6214785 A JP S6214785A
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- replicon
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- pkg
- approximately
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規熱誘発性（ｔｈｅｒｍｏｉｎｄｕｃｉｂｌ
ｅ ） キメラプラスミド、特にｐＢＲ３２２由来で
はあるが、そのレプリコンｂ１熱誘発性レプリコンに変
えられたプラスミド、とりわけｐＫＧ−２と命名さ４た
プラスミドに関する。
ｅ ） キメラプラスミド、特にｐＢＲ３２２由来で
はあるが、そのレプリコンｂ１熱誘発性レプリコンに変
えられたプラスミド、とりわけｐＫＧ−２と命名さ４た
プラスミドに関する。
プラスミドｐＫＧ−２は族プラスミドＣｌｏＤＦ −１
５由来のミニプラスミド ＶｔＪ２０８の一部を周知の
プラスミドｐＢＲ３２２の一部で置換することによって
作成される。
５由来のミニプラスミド ＶｔＪ２０８の一部を周知の
プラスミドｐＢＲ３２２の一部で置換することによって
作成される。
目的の性質を有する既知のプラスミドの部分を組み合せ
て新しいプラスミドを調製する場合のように、遺伝子工
学におけるクローニングベクターとしてのプラスミドの
有用性は十分に確立されている。また遺伝子産物の過剰
生産のための熱誘発性または“ランナウェイ（ｒｕｎ
−ａｗａｙ ）”プラスミドの使用は公知文献によく記
載されている。例えばウーリｙ （Ｕｈｌｉｎ 、Ｂ、
Ｅ、 ）らのＧｅｎｅ 、第６巻。
て新しいプラスミドを調製する場合のように、遺伝子工
学におけるクローニングベクターとしてのプラスミドの
有用性は十分に確立されている。また遺伝子産物の過剰
生産のための熱誘発性または“ランナウェイ（ｒｕｎ
−ａｗａｙ ）”プラスミドの使用は公知文献によく記
載されている。例えばウーリｙ （Ｕｈｌｉｎ 、Ｂ、
Ｅ、 ）らのＧｅｎｅ 、第６巻。
第９１〜１０６頁（１９７９年）およびアメリカ特許第
４．４８７，８５５号、４，４９５，２８７号および４
．４９９，１８９号を参照されたい。
４．４８７，８５５号、４，４９５，２８７号および４
．４９９，１８９号を参照されたい。
０ＢＲ３２２は最も一般的に使用されるプラスミドベク
ターのうちのひとつである。その全塩基配列は解明され
ており〔サトクリフ（５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ。
ターのうちのひとつである。その全塩基配列は解明され
ており〔サトクリフ（５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ。
Ｇ、）、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ、Ｓｙｍ
ｏ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ 、、 第４５巻、第７７〜
９０頁（１９７８年）を参照〕。
ｏ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ 、、 第４５巻、第７７〜
９０頁（１９７８年）を参照〕。
アンピシリンとテトラサイクリン歇耐性である。
本発明はプラスミド。ＢＲ３２２のＤＮＡ配列の実質的
な部分を有するが、このプラスミドのレプリコンを欠き
、熱誘発性レプリコンを含むランナクエイフラスミドを
提供する。この新しいプラスミドは比較的低温、例えば
約５０’Ｃではコピー数が制御されているが、高温では
制御されないコピー数を持つ。例えば５４〜６５℃でラ
ンチウェイ性を示し始め、６７〜４０℃で著しいランチ
ウェイ性を示す。
な部分を有するが、このプラスミドのレプリコンを欠き
、熱誘発性レプリコンを含むランナクエイフラスミドを
提供する。この新しいプラスミドは比較的低温、例えば
約５０’Ｃではコピー数が制御されているが、高温では
制御されないコピー数を持つ。例えば５４〜６５℃でラ
ンチウェイ性を示し始め、６７〜４０℃で著しいランチ
ウェイ性を示す。
コノフラスミドは複製条件下で安定である。すなわち失
われない。
われない。
熱誘発性プラスミドに関する多（の研究はＲ１由来のプ
ラスミドを基本としているｂ″−１実質的な努力はＣＩ
ｏＤＦ−１５由来のプラスミドに関してなされてきた。
ラスミドを基本としているｂ″−１実質的な努力はＣＩ
ｏＤＦ−１５由来のプラスミドに関してなされてきた。
例えばニジカンブ（Ｎｉ ｊｋａｍｐ 、 Ｈ。
Ｊ、Ｊ、）らのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉ ｔｙ ａｎｄＥｃｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｌａｓｍｉｄｓ 、
レグイ（Ｌｅｖｙ。
Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉ ｔｙ ａｎｄＥｃｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｌａｓｍｉｄｓ 、
レグイ（Ｌｅｖｙ。
Ｓ、）編、にューヨーク： Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ。
ｓｈｅｒｓ。
１９８１年）、第２４７−２５８頁、ストウイトジエ（
５ｔｕｉｔｊｅ、Ａ、Ｒ，）Ｉ−ＩのＮａｔｕｒｅ第２
９０巻、第２６４−２６７頁、（１９８１年）を参照の
こと。
５ｔｕｉｔｊｅ、Ａ、Ｒ，）Ｉ−ＩのＮａｔｕｒｅ第２
９０巻、第２６４−２６７頁、（１９８１年）を参照の
こと。
ＣＩｏＤＦ−１３は元来エンテロバクチル・クロカニ（
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ’ｊｌｏａｃａｅ ）から
単離さｊたｂ″−、エシエリンア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） 中で維持されている。（ベ
ルトカンブ（Ｖｅｌｔｋａｍｐ 、Ｅ、 ）ら、Ｂ、Ｂ
、Ａ、 、第４２５巻、第６５６−５６７頁（１９７６
年）参照）セしてＣｏｌ Ｅ＋タイプのプラスミドと多
くの性質ｂ″−−共通る。ＣＩｏＤＦ−１５は非接合的
でほとんど移動しないので、クローニングベクターとし
ての使用によ（適している。プラスミドの複製に必須な
領域の完全なヌクレオチド配列が発表されており、プラ
スミドのコピー数り″一温度感受性を示す一連の特異的
な変異株についても記載されている。前出のストウイト
ジエ（５ｔｕｉｔｊｅ ） Ｉ−１の文献を参照サレタ
イ。
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ’ｊｌｏａｃａｅ ）から
単離さｊたｂ″−、エシエリンア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） 中で維持されている。（ベ
ルトカンブ（Ｖｅｌｔｋａｍｐ 、Ｅ、 ）ら、Ｂ、Ｂ
、Ａ、 、第４２５巻、第６５６−５６７頁（１９７６
年）参照）セしてＣｏｌ Ｅ＋タイプのプラスミドと多
くの性質ｂ″−−共通る。ＣＩｏＤＦ−１５は非接合的
でほとんど移動しないので、クローニングベクターとし
ての使用によ（適している。プラスミドの複製に必須な
領域の完全なヌクレオチド配列が発表されており、プラ
スミドのコピー数り″一温度感受性を示す一連の特異的
な変異株についても記載されている。前出のストウイト
ジエ（５ｔｕｉｔｊｅ ） Ｉ−１の文献を参照サレタ
イ。
出発レプリコンとして使用されたＣ１ｏ ＤＦ −１３
ミニプラスミド。ｖＵ２０８（ハラカート（Ｈａｋｋａ
ａｒ ｔ 。
ミニプラスミド。ｖＵ２０８（ハラカート（Ｈａｋｋａ
ａｒ ｔ 。
Ｍ、Ｊ、 ） ｆ、 Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、
第１８５巻、第５２６−５３２頁、１９８１年参照）
は、組み込まｈだアンビノリントランスポゾン（Ｔｈ９
０１）を含み、Ｃ１ｏ 、 Ｉｍｍ およびマイトマ
インンＣ感受性で、ＢａｍＨＩ切断部位から２０５ｂｐ
下流の位置でのＧ−）Ａの塩基置換の結果としてｃｏｐ
ｌ 温度感受性表現型を示す。このｃｏｏ、１表現
型は約６０℃で適度のプラスミドコピー数を許容し、約
５５℃以とではプラスミドのコピー数り″−非常に増加
する。
第１８５巻、第５２６−５３２頁、１９８１年参照）
は、組み込まｈだアンビノリントランスポゾン（Ｔｈ９
０１）を含み、Ｃ１ｏ 、 Ｉｍｍ およびマイトマ
インンＣ感受性で、ＢａｍＨＩ切断部位から２０５ｂｐ
下流の位置でのＧ−）Ａの塩基置換の結果としてｃｏｐ
ｌ 温度感受性表現型を示す。このｃｏｏ、１表現
型は約６０℃で適度のプラスミドコピー数を許容し、約
５５℃以とではプラスミドのコピー数り″−非常に増加
する。
本発明のプラスミドは熱誘発性レプリコンとして（６ｓ
されたＣ１ｏレプリコン、特にプラスミドｐＶ０２０８
のレプリコンを有していることｂ−好ましい。（、ＣＩ
ｏレプリコンはＣＩｏＤＦ−１３のようなりロアシン（
ｃｌｏａｃｉｎ ）プラスミド由来でアヘ）本発明の好
ましい態様を添付図面中の第１図と関連させて以下に説
明する。第１図は、ｐＢＲ３２２と ＶＵ２０８の制限
エンドヌクレアーゼ切断地図を示すことにより、ＤＫ
Ｇ−２の作成を図示するものである、Ａｍｐ とＴｃ
はそれぞれアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性を
担う遺伝子を示し、ｒｅｐは自律的な複製のための複製
起点を示す。図示さねた制限エンドヌクレアーゼ切断部
位は以下に説明される。
されたＣ１ｏレプリコン、特にプラスミドｐＶ０２０８
のレプリコンを有していることｂ−好ましい。（、ＣＩ
ｏレプリコンはＣＩｏＤＦ−１３のようなりロアシン（
ｃｌｏａｃｉｎ ）プラスミド由来でアヘ）本発明の好
ましい態様を添付図面中の第１図と関連させて以下に説
明する。第１図は、ｐＢＲ３２２と ＶＵ２０８の制限
エンドヌクレアーゼ切断地図を示すことにより、ＤＫ
Ｇ−２の作成を図示するものである、Ａｍｐ とＴｃ
はそれぞれアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性を
担う遺伝子を示し、ｒｅｐは自律的な複製のための複製
起点を示す。図示さねた制限エンドヌクレアーゼ切断部
位は以下に説明される。
プラスミド、）ＫＧ−２は第１図に示すように、０ＶＵ
２０８プラスミドの必須でない約１．９Ｋｂ領域を、テ
トラサイクリン耐性オペロンとアンピシリン耐性を再構
成するのに必要なβ−ラクタマーゼ遺伝子部分とを含む
ＤＢＲろ２２の２．２ Ｋｂ ＰｓｔＩ−ＡｖａＩ断片
で置換することによって作成される。
２０８プラスミドの必須でない約１．９Ｋｂ領域を、テ
トラサイクリン耐性オペロンとアンピシリン耐性を再構
成するのに必要なβ−ラクタマーゼ遺伝子部分とを含む
ＤＢＲろ２２の２．２ Ｋｂ ＰｓｔＩ−ＡｖａＩ断片
で置換することによって作成される。
換言すれば、約１．４ ＫｂのｐＶＵ２０８のレプリコ
ンを含むＰ ｓｔ Ｉ −Ａｖａ Ｉ断片が、約２．２
ＫｂのｐＢＲ３２２のレプリコンを含まないＰ ｓｔ
Ｉ −ＡｖａＩ断片に連結されたものである。この新た
に作成された３、６Ｋｂのプラスミドは、。ＢＲ３２２
に見らｔする特異的なりローニング及び挿入不活性化部
位の配列と同様に、親レプリコンの熱訪発性の性質すべ
てを示す。プラスミド、ＫＧ−２は著しく安定であり、
所定の細酌宿主内で予測された様式で複製する。
ンを含むＰ ｓｔ Ｉ −Ａｖａ Ｉ断片が、約２．２
ＫｂのｐＢＲ３２２のレプリコンを含まないＰ ｓｔ
Ｉ −ＡｖａＩ断片に連結されたものである。この新た
に作成された３、６Ｋｂのプラスミドは、。ＢＲ３２２
に見らｔする特異的なりローニング及び挿入不活性化部
位の配列と同様に、親レプリコンの熱訪発性の性質すべ
てを示す。プラスミド、ＫＧ−２は著しく安定であり、
所定の細酌宿主内で予測された様式で複製する。
０ＫＧ−２の１Ｉｉｌｌ限エンドヌクレアーゼに対する
単一切断部位を以下に示す。
単一切断部位を以下に示す。
制限酵素 切断部位の数
ＢａｍＨＩ １
ＰｓｔＩ Ｉ
ＥｃｏＲＩ Ｉ
ＡｖａＩ １
ＢａｍＨＩ＆’Ｌバシルス・アミロリフファシェンス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ４ａｃｉｅｎ
ｓ ）より、ＰｓｔＩはプロピデンンア・ストウアーテ
ィ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａｓｔｕａｒｔｉｉ ）より
、ＥｃｏＲＩはエンエリンア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）より、ＡｖａＩはアナバエナ・″リ
アビリス（Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ）
より、それぞれ単離された。プラスミドｐＫＧ−２はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅ
ｒ １ｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） ；米国、メリーランド州、ｏ
ｙクビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ）〕Ｋ１９８５年６月
１６日付で寄託さねている。寄託奇岩はＡＴＣＣ５，５
１４８である。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ４ａｃｉｅｎ
ｓ ）より、ＰｓｔＩはプロピデンンア・ストウアーテ
ィ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａｓｔｕａｒｔｉｉ ）より
、ＥｃｏＲＩはエンエリンア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）より、ＡｖａＩはアナバエナ・″リ
アビリス（Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ）
より、それぞれ単離された。プラスミドｐＫＧ−２はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅ
ｒ １ｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） ；米国、メリーランド州、ｏ
ｙクビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ）〕Ｋ１９８５年６月
１６日付で寄託さねている。寄託奇岩はＡＴＣＣ５，５
１４８である。
ｐＫＧ−２のような多コピープラスミドは、目的とする
遺伝子を含む外来ＤＮＡ断片を適当な調節配列と共にプ
ラスミドにクローニングし、そのプラスミドで宿主（ｆ
なわち細菌）細胞を形質転換することにより、細菌細胞
に所定の）゛伝子産物を過剰生産させるのに使用でるこ
とができる、慣用手段によって宿主細胞は培養され、求
めろ遺伝子産物が採収される。特にｐＫＧ−２プラスミ
ドは細菌（特にエシエリンア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ：Ｅ、ｃｏｌｉ））内で、真核細胞
の多くの重要な遺伝子を挿入して、その真核細胞遺伝子
や遺伝子産物すなわちタンパク質の産生を増大させるた
めのベクターとして使用されている。例えば第１表は適
当なバクテリアのプロモーター、リボンーム結合部位及
び６′下流非翻訳領域を有する数種のインターフェロン
遺伝子を ＢＲ３２２由来の親プラスミドより切り出し
ｐＫＧ−２内に導入した際に得らね、る遺伝子産物の増
加を示すものである。各々の場合において、親プラスミ
ドの１２−５０倍のインターフェロンの力価の増加が観
察された。この過剰生産は、宿主細菌、培地、項番時間
、最終細胞密度すらびにインターフェロンの調節領域ｂ
″−一定あるので、単に、ランチウェイ表現型に関連し
たプラスミドのコピー数の増加によるものである。
遺伝子を含む外来ＤＮＡ断片を適当な調節配列と共にプ
ラスミドにクローニングし、そのプラスミドで宿主（ｆ
なわち細菌）細胞を形質転換することにより、細菌細胞
に所定の）゛伝子産物を過剰生産させるのに使用でるこ
とができる、慣用手段によって宿主細胞は培養され、求
めろ遺伝子産物が採収される。特にｐＫＧ−２プラスミ
ドは細菌（特にエシエリンア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ：Ｅ、ｃｏｌｉ））内で、真核細胞
の多くの重要な遺伝子を挿入して、その真核細胞遺伝子
や遺伝子産物すなわちタンパク質の産生を増大させるた
めのベクターとして使用されている。例えば第１表は適
当なバクテリアのプロモーター、リボンーム結合部位及
び６′下流非翻訳領域を有する数種のインターフェロン
遺伝子を ＢＲ３２２由来の親プラスミドより切り出し
ｐＫＧ−２内に導入した際に得らね、る遺伝子産物の増
加を示すものである。各々の場合において、親プラスミ
ドの１２−５０倍のインターフェロンの力価の増加が観
察された。この過剰生産は、宿主細菌、培地、項番時間
、最終細胞密度すらびにインターフェロンの調節領域ｂ
″−一定あるので、単に、ランチウェイ表現型に関連し
たプラスミドのコピー数の増加によるものである。
１１） 細菌宿主Ｃｌ−５１株はエンエリ７ア・コリ
（Ｅ、ｃｏｌｉ ）Ｋ−１２ＤＳ−４１０由来のミニ
セル産生株である。（ドウガン（Ｄｏｕｇａｎ、 Ｇ、
）と７エラツト（５ｈｅｒｒａｔｔ、 Ｄ、 ） 、
Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ 。
（Ｅ、ｃｏｌｉ ）Ｋ−１２ＤＳ−４１０由来のミニ
セル産生株である。（ドウガン（Ｄｏｕｇａｎ、 Ｇ、
）と７エラツト（５ｈｅｒｒａｔｔ、 Ｄ、 ） 、
Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ 。
第１５１巻、第１５１−１６０頁、１９７７年を参照）
（２）相対活性は、ＥＭＣウィルスとヒト包皮細胞を用
いる細胞変性効果１別置アッセイにより決めｈｈだ。Ｎ
Ｉ Ｈ／ＷＨＯ天然型白血球インターフェロン基準と
して用いて、アッセイは、基本的にはファミレッティ（
Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ 、 Ｐ、Ｃ，） ｃ−１の°イ
ンターフェロンの便利かつ迅速な細胞変性効果＋ｓＩ：
！害アッセイ″（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ。
いる細胞変性効果１別置アッセイにより決めｈｈだ。Ｎ
Ｉ Ｈ／ＷＨＯ天然型白血球インターフェロン基準と
して用いて、アッセイは、基本的にはファミレッティ（
Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ 、 Ｐ、Ｃ，） ｃ−１の°イ
ンターフェロンの便利かつ迅速な細胞変性効果＋ｓＩ：
！害アッセイ″（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ。
ペスカ（Ｐｅ５ｋａ、 Ｓ 、 ）編、にューヨーク：
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 １９８０年）第３８
７−５９４頁）に記載の方法で行なった。
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 １９８０年）第３８
７−５９４頁）に記載の方法で行なった。
（３） 増殖中の培養液は、一定時間、例えは約２時
間、５０℃から４１℃に上昇し、次いで一定時間、例え
ば２−５時間４１℃から３０ ’Ｃに下げた。各々の例
において、培養０．は、１ｔあたりトリプトン２０５４
、酵母抽出物１０ｙ′、塩化す） ＩＩウム５５１−、
テトラサイクリン１０ｍ９よりなる。
間、５０℃から４１℃に上昇し、次いで一定時間、例え
ば２−５時間４１℃から３０ ’Ｃに下げた。各々の例
において、培養０．は、１ｔあたりトリプトン２０５４
、酵母抽出物１０ｙ′、塩化す） ＩＩウム５５１−、
テトラサイクリン１０ｍ９よりなる。
下記のポリペプチドもとりわけ、種々のエンエリシア・
コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主内で、プラスミド、ＫＧ−２
あるいはその誘導体により過剰産生されたｎｆなわち不
ズミインターロイキン２．ネズミインターロイキン３．
ネズミ、ヒトＧ／Ｍ−Ｃ３Ｆ（顆粒球、マクロファージ
コロニー形成刺激因子；ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａ
ｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｎｇ ｆ、＋ｃｔｏｒ）およびヒトｒ−インターフェロ
ンＡでする。
コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主内で、プラスミド、ＫＧ−２
あるいはその誘導体により過剰産生されたｎｆなわち不
ズミインターロイキン２．ネズミインターロイキン３．
ネズミ、ヒトＧ／Ｍ−Ｃ３Ｆ（顆粒球、マクロファージ
コロニー形成刺激因子；ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａ
ｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｎｇ ｆ、＋ｃｔｏｒ）およびヒトｒ−インターフェロ
ンＡでする。
プラスミドｐＫ Ｇ −２は分子生物学でよ（知られを
慣用手段によって単離し、次に既知の方法で組み換えら
れる。例えば、各プラスミドを適当な制限酵素で消化し
、それぞれの切断の結果生じた混合物を分離し、目的と
する断片を単離し、そしてその断片を連結した後、適切
な宿主細胞を形質転換し、最後に、宿主を増殖させ、ｐ
ＫＧ−２プラスミドを単離するという方法である。
慣用手段によって単離し、次に既知の方法で組み換えら
れる。例えば、各プラスミドを適当な制限酵素で消化し
、それぞれの切断の結果生じた混合物を分離し、目的と
する断片を単離し、そしてその断片を連結した後、適切
な宿主細胞を形質転換し、最後に、宿主を増殖させ、ｐ
ＫＧ−２プラスミドを単離するという方法である。
当業者は、プラスミドの作成には数多くの方法ｂ″−あ
ることを認めるであろう。本発明のプラスミド、 Ｉ）
ＫＧ−２，０作成方法は、例えば、以下に示すとおりで
ある。各出発プラスミドを１ｔあたりトリプトン２０Ｐ
、酵母抽出物１ｏｚおよび塩化ナトリウム５ｙ−を含む
２０−１０−５として知られる培地中で、回転震とう器
上毎分６００回転、５０℃の条件下で、エンエリシア・
コ’］ （Ｅ、 ｃｏｌ ｉ ）内で孜通し増殖する。
ることを認めるであろう。本発明のプラスミド、 Ｉ）
ＫＧ−２，０作成方法は、例えば、以下に示すとおりで
ある。各出発プラスミドを１ｔあたりトリプトン２０Ｐ
、酵母抽出物１ｏｚおよび塩化ナトリウム５ｙ−を含む
２０−１０−５として知られる培地中で、回転震とう器
上毎分６００回転、５０℃の条件下で、エンエリシア・
コ’］ （Ｅ、 ｃｏｌ ｉ ）内で孜通し増殖する。
得１−Ｉｆ′Ｌるプラスミドをクリアート・ライゼート
（ｃｌｅａｒｅｄ １ｙｓａｔｅ ）法により定常状態
の培養液より単離し、次いで、塩化セシウム−臭化エチ
ジウム浮遊密度勾配遠心法に付す。
（ｃｌｅａｒｅｄ １ｙｓａｔｅ ）法により定常状態
の培養液より単離し、次いで、塩化セシウム−臭化エチ
ジウム浮遊密度勾配遠心法に付す。
臭化エチジウムを、塩化セシウム飽和インプロパツール
でプラスミドより除去し、そしてプラスミドをエタノー
ルで二度沈澱させ、ｐＨ８のＴＥ緩ｔｒ液（１０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／塩酸、０．
５ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸に１η／ １ ｍｌ
の濃度で再懸濁する。
でプラスミドより除去し、そしてプラスミドをエタノー
ルで二度沈澱させ、ｐＨ８のＴＥ緩ｔｒ液（１０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／塩酸、０．
５ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸に１η／ １ ｍｌ
の濃度で再懸濁する。
ｐＶＵ２０８プラスミドを次に制限エンドヌクレアーゼ
Ｐｓｔ ＩおよびＡｖａＩで消化し、生成物を０、７％
アガロースゲル上で電気泳動に付す、、複製のランナク
エイ起点とアンピアリン遺伝子の一部分を含む約１．４
Ｋ ｂの断片を切り出し、電気泳動により溶出させた
後にエタノールで沈澱させ、保持する。２．２Ｋｂのテ
トラサイクリン遺伝子とアンピンリン遺伝子の残りの部
分を含む断片を単離するために、ＤＢＲ３２２も同様に
処理する。単離された２つの断片は、周知の手順に従い
、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ存在下で連結され、連結混合物
で、ダガード（Ｄａｇｅｒｔ ）とエールリッヒ（Ｅｈ
ｒｌｉｃｈ ）により記述された塩化カルシウム法（Ｇ
ｅｎｅ、第６巻、第２３−２８頁、１９７９年参照）を
用いてエシエリンア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ ）２９４を
形質転換した。形質転換混合物はテトラサイクリン（１
０ｍｃＰ／ｍｌ ） とアンビシリフ （４０ｍｃＪ
／ｍｌ ）を含む２０−１０−５寒天プレートに植え込
まれた。慣用手段によって、生じたコロニーを小規模で
調製し、目的とする構成すなわちｐＫＧ−２の構造を持
つプラスミドを単離する。プラスミドの単離、精製。
Ｐｓｔ ＩおよびＡｖａＩで消化し、生成物を０、７％
アガロースゲル上で電気泳動に付す、、複製のランナク
エイ起点とアンピアリン遺伝子の一部分を含む約１．４
Ｋ ｂの断片を切り出し、電気泳動により溶出させた
後にエタノールで沈澱させ、保持する。２．２Ｋｂのテ
トラサイクリン遺伝子とアンピンリン遺伝子の残りの部
分を含む断片を単離するために、ＤＢＲ３２２も同様に
処理する。単離された２つの断片は、周知の手順に従い
、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ存在下で連結され、連結混合物
で、ダガード（Ｄａｇｅｒｔ ）とエールリッヒ（Ｅｈ
ｒｌｉｃｈ ）により記述された塩化カルシウム法（Ｇ
ｅｎｅ、第６巻、第２３−２８頁、１９７９年参照）を
用いてエシエリンア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ ）２９４を
形質転換した。形質転換混合物はテトラサイクリン（１
０ｍｃＰ／ｍｌ ） とアンビシリフ （４０ｍｃＪ
／ｍｌ ）を含む２０−１０−５寒天プレートに植え込
まれた。慣用手段によって、生じたコロニーを小規模で
調製し、目的とする構成すなわちｐＫＧ−２の構造を持
つプラスミドを単離する。プラスミドの単離、精製。
形質転換１選択のその他の方法は多くの出版物に記載さ
れている。例えは、マニアテイス（Ｔ。
れている。例えは、マニアテイス（Ｔ。
Ｍａｎｉａｔｉｓ ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ （Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
； Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ ＋ １９８２年）を参照されたい。
ｏｎｉｎｇ （Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
； Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ ＋ １９８２年）を参照されたい。
Ｗ：１図はプラスミドｐＫＧ−２の作成を示す図である
。 （外５名）
。 （外５名）
Claims (8)
- （１）ブラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ配列の実質的部
分を有すが、このプラスミドのレプリコンを欠き、熱誘
発性レプリコンを含むランナウエイプラスミド。 - （２）熱誘発性レプリコンが修飾Ｃｌｏレプリコン、好
ましくはプラスミドｐＶＵ２０８のレプリコンである特
許請求の範囲第１項に記載のプラスミド。 - （３）ｐＶＵ２０８の約１．４キロベース（Ｋｂ）のＰ
ｓｔＩ−ＡｖａＩ断片（レプリコンを含む）と、ｐＢＲ
３２２の約２．２ＫｂのＰｓｔＩ−ＡｖａＩ断片（レプ
リコンを含まない）とから成り、約３．６Ｋｂの分子の
大きさを有するｐＫＧ−２と命名された特許請求の範囲
第２項に記載のプラスミド。 - （４）特許請求の範囲第１〜第３項のいずれか１項に記
載のプラスミドのＤＮＡ配列と、そのプラスミドの制限
部位に挿入されたポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ
断片および好ましくは調節配列とを有する組換えプラス
ミド。 - （５）プラスミドｐＫＧ−２を有する細菌、好ましくは
エシエリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）を培養培地中で培養し、それより細胞を採収し、そ
の細胞からプラスミドｐＫＧ−２を回収することからな
るプラスミドｐＫＧ−２の生産方法。 - （６）目的とする遺伝子を含む外来ＤＮＡ断片をプラス
ミドｐＫＧ−２にクローニングし、そのプラスミドで宿
主細胞を形質転換し、宿主細胞を培養し遺伝子産物を採
収することからなる遺伝子産物の産生を増加する方法。 - （７）プラスミドｐＢＲ３２２のレプリコンを欠失させ
、そのかわりに熱誘発性レプリコン、特にＣｌｏレプリ
コン、とりわけプラスミドｐＶＵ２０８のレプリコンを
挿入することから成る特許請求の範囲第１項に記載のプ
ラスミドの作成方法。 - （８）プラスミドｐＢＲ３２２およびｐＶＵ２０８をＰ
ｓｔＩおよびＡｖａＩで切断し、ｐＢＲ３２２の約２．
２Ｋｂ断片とｐＶＵ２０８の約１．４Ｋｂ断片とを連結
することから成るプラスミドｐＫＧ−２の作成方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75169785A | 1985-07-03 | 1985-07-03 | |
| US751697 | 1985-07-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6214785A true JPS6214785A (ja) | 1987-01-23 |
Family
ID=25023100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61153945A Pending JPS6214785A (ja) | 1985-07-03 | 1986-06-30 | 熱誘発性プラスミド |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0207770A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6214785A (ja) |
| AU (1) | AU5946886A (ja) |
| IL (1) | IL79281A0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02166991A (ja) * | 1988-12-21 | 1990-06-27 | Nippon Hoso Kyokai <Nhk> | テレビジョン信号位相同期回路 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8203716A (nl) * | 1982-09-24 | 1984-04-16 | Tno | Dna en plasmiden. |
-
1986
- 1986-06-27 EP EP86305055A patent/EP0207770A1/en not_active Withdrawn
- 1986-06-30 IL IL79281A patent/IL79281A0/xx unknown
- 1986-06-30 JP JP61153945A patent/JPS6214785A/ja active Pending
- 1986-06-30 AU AU59468/86A patent/AU5946886A/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02166991A (ja) * | 1988-12-21 | 1990-06-27 | Nippon Hoso Kyokai <Nhk> | テレビジョン信号位相同期回路 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL79281A0 (en) | 1986-09-30 |
| EP0207770A1 (en) | 1987-01-07 |
| AU5946886A (en) | 1987-01-08 |
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