JPS6216637B2 - - Google Patents

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JPS6216637B2
JPS6216637B2 JP57199862A JP19986282A JPS6216637B2 JP S6216637 B2 JPS6216637 B2 JP S6216637B2 JP 57199862 A JP57199862 A JP 57199862A JP 19986282 A JP19986282 A JP 19986282A JP S6216637 B2 JPS6216637 B2 JP S6216637B2
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JP
Japan
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enzyme
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glutaraldehyde
chitosan
activity
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JP57199862A
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JPS5889185A (ja
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Rui Ryuba Jan
Furatsusheru Aauin
Renken Arubeeru
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Purodeyui Netsusuru SA Soc
Original Assignee
Purodeyui Netsusuru SA Soc
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Filing date
Publication date
Application filed by Purodeyui Netsusuru SA Soc filed Critical Purodeyui Netsusuru SA Soc
Publication of JPS5889185A publication Critical patent/JPS5889185A/ja
Publication of JPS6216637B2 publication Critical patent/JPS6216637B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/1203—Addition of, or treatment with, enzymes or microorganisms other than lactobacteriaceae
    • A23C9/1206—Lactose hydrolysing enzymes, e.g. lactase, beta-galactosidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C2220/00—Biochemical treatment
    • A23C2220/10—Enzymatic treatment
    • A23C2220/104—Enzymatic treatment with immobilised enzymes

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  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
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  • General Engineering & Computer Science (AREA)
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  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、水性媒体に不溶で流動床式あるいは
固定床式反応槽の使用に特に適した酵素活性を有
する生物触媒の製造方法に関する。
工業的規模で酵素反応を実行することから、水
性媒体に不溶の生物触媒が登場した。この理由
は、酵素は一度使用しただけで活性を失なつては
いけないため、その結果酵素は不活性の支持体に
結合すなわち「固定化」することにより、処理す
べき物質すなわち「基質」から物理的に分離でき
るようにさせたからである。
酵素を支持体に結合さる方法がいくつか報告さ
れている。
― 酵素をセラミツクス、ガラス、シリカなどの
無機質に直接吸着させる。酵素の支持体への結
合は非常に弱いので得られる生産物は不安定で
あるという短所がある。
― 酵素は、ジアルデヒドなどの２官能性試薬、
あるいはカルボジイミドなどの１官能性試薬に
より、合成高分子（たとえば英国特許第
1357317号明細書のアミノエチルセルロース）
あるいは天然高分子（たとえば米国特許第
4094743号明細書のキトーサン）などの有機支
持体に化合的に結合している。合成支持体に固
定化された酵素は食品における使用に必要な性
質を有していない。一方有機支持体は圧縮され
易く比較的低密度のため工業的方法にはあまり
適していない。またこのために有機支持体は、
大量処理用の流動床式あるいは固定床式反応槽
に使用することは不可能ではないにしても困難
である。
さらに酵素と、変換されるべき物質すなわち基
質を充分接触させることが必要である。すなわち
酵素は不活性支持体組織の小孔中にあるのではな
く、外表面に固定化されていることが好ましい。
反応液が粘性を持つていたり、コロイドや固形
物質すなわち不純物を含有している場合は、実際
の応用に影響する上記の問題や制限条件はさらに
厳しくなる。これらの問題は食品工業が現在直面
しているものである。
本発明者は食品工業での使用に適し、上記のい
かなる問題も存在しない有効な酵素固定化方法を
見出した。
本発明は硬くて密な無機質の粒子をキトーサン
の層で被覆し、被覆した粒子を２官能性試薬で安
定化させ、このように処理した支持体に酵素を結
合させることより成る、水性溶液に不溶で特に流
動床式あるいは固定床式反応槽の使用に適した酵
素活性を有する生物触媒の製造方法に関する。
使用すべき中心核の無機質は、好ましくはたと
えばシリカゲルの微小孔粒子あるいはTiO2や
ZrO2のような金属酸化物あるいはセラミツクス
などの、多孔性表面を有する硬くて化学的に不活
性な無機質より選ばれる。粒子の径はふつう0.05
から５mmで0.1から0.25mmが好ましい。
中心核は、キチンを高温でアルカリ溶液中で脱
アセチル化することにより得られる天然高分子で
あるキトーサンで被覆される。キトーサンは硫酸
以外の酸が存在する場合を除くと水に不溶であ
る。
キチンは無脊椎動物の保護外皮（甲殻類動物の
甲殻あるいは昆虫の外皮）の主要有機成分であ
り、これはまたある種の低級植物（たとえばキノ
コ）の骨格壁にも見られる。これは高分子量（約
200000）でβ（１―４）結合に特徴づけられる、
Ｎ―アセチル―Ｄ―グルコサミンの直線状高分子
である。Ｎ―アセチル基の除去は困難であり、市
販品の脱アセチル化は決して完全ではなくふつう
50から85％である。キトーサンという名前で知ら
れているのはこれらの物質である。
無機質粒子の表面をキトーサンで被覆するため
の第１段階は、たとえば濃酢酸（10から80重量
％、好ましくは30から60重量％）のような酸の中
に、１から30ｇ／（好ましくは４から10ｇ／
）のキトーサンを含有する水溶液を準備するこ
とである。次にこの溶液に、１につき10から
500ｇの固形物濃度になるまで、撹拌しながら無
機質粒子を加える。次に真空中で混合物のガスを
抜き、浮遊液を数時間静置し、デカントしてから
被覆粒子を過により回収する。このようにして
回収した粒子を次に水洗し真空中で乾燥する。こ
のようにして得られた支持体は無機質支持体とほ
とんど同じ密度を持ち、たとえばシリカゲルの場
合は0.33ｇ／mlであり、キトーサン（0.24ｇ／
ml）よりも大きい。これはキトーサンのみと比較
すると、工業的応用という観点から明白な長所を
有する。すなわち ― これはグラム乾燥重量あたりの酵素単位はふ
つうキトーサンのみの場合と同様の活性を有し
ている。これはキトーサンの活性部位は粒子の
表面全体に分布しているため充分に利用される
という事実により説明できる。密度が高いため
に同じ重量あるいは同じ活性あたりに占めるカ
ラム中の容積はキトーサンだけの場合より小さ
い。
― 中心核の無機質がこの触媒をより固くしてい
るためキトーサンよりも圧縮されにくい。
― この触媒は、工業的応用に適合する流動床に
使用するのに適している。流動化処理中、基質
は大量処理で変換される。生物学的流体（たと
えば乳汁やホエイなど）あるいは浮遊コロイド
を含む流体の処理では、固定床型の処理に比べ
カラムの詰まる危険性がずつと少なくなる。キ
トーサンを流動化する試みもなされているがう
まくいつていない。凝集がおきてキトーサンに
接しないで流れる液も出てくる。固定床にキト
ーサンを使用することも問題がある。キトーサ
ンは低密度のため、処理量が増加すると浮いて
きてカラムのの出口に集まるようになり易い。
内圧が増加し反応工程に負担がかかつてくる結
果、処理量が減少しカラムが詰まつてくる。流
動化のもうひとつの長所は、触媒粒子は基質中
でたえず撹拌されている状態にあるということ
である。このため分散の問題は小さくなり酵素
活性は最大になる。
― キトーサンよりも取り扱いがはるかに容易で
ある。
キトーサンで被覆した粒子は、好ましくは線状
のジアルデヒドより選んだ２官能性試薬で安定化
される。２官能性試薬にはたとえばマロンアルデ
ヒド、コハク酸アルデヒド、グルタールアルデヒ
ド、およびアジピン酸アルデヒドなどがある。グ
ルタールアルデヒドが市販品として入手し易いと
いう点から好んで使用される。この操作の目的
は、キトーサンを中心核無機質に結合されるため
に、および中心核無機質がはがれて来るのを防ぐ
ために、キトーサンを「安定化」しおよび／ある
いはキトーサン層のまわりに高分子網を形成する
ことである。
酵素がグルタールアルデヒドによつて影響を受
けない時、すなわちグルタールアルデヒドが存在
しても触媒活性を失わない場合に用いられる方法
の最初の実施態様として、25重量％までの濃度の
グルタールアルデヒドの水溶液の中へ支持体を導
入する。グルタールアルデヒドによつて影響を受
けない酵素には、活性部位にチオール基を持たな
いものがある。この処理は好ましくは室温におい
て、好ましくは緩衝液中でPH２から８の範囲で実
施する。処理時間はグルタールアルデヒドの濃度
に依存するが、ふつう31分から数時間である。全
反応物は好ましくは空気のないところ、たとえば
真空中で反応させ、過剰のグルタールアルデヒド
は水洗により除去する。濃度と反応時間は、支持
体の表面がそこに化学的に結合したアルデヒド基
に覆われるようになるべきものであり、たとえば
支持体がシリカゲルの場合は固定されたグルター
ルアルデヒドは支持体重量の0.5から５％を占め
る。
たとえばリジン結合の有する遊離のアミノ基の
ように、安定化された支持体の遊離のアミノ基と
反応することができる官能基を有する酵素の水溶
液を活性化された支持体と接触させて、酵素を結
合させる。酵素溶液のPHはたとえば適当な緩衝液
を用いて、使用する酵素の安定域に維持しなけれ
ばならない。反応は通常室温で行ない、影響を受
け易い酵素の場合にのみ低い温度を維持する。次
に結合しなかつた酵素は緩衝液で洗浄して除去す
る。流動床型で触媒を使用する時に好ましい、特
別安定な触媒を得るために、すでに酵素の結合し
た支持体を好ましくはグルタールアルデヒドのよ
うな２官能性試薬のたとえば25重量％までの濃度
の水溶液でさらに処理してもよい。この追加処理
は触媒を架橋させ、また酵素と支持体間の結合を
強化する効果がある。
この方法の２番目の実施態様は、たとえば酸化
剤により影響を受けるチオール基を含有する酵母
のラクターゼのように、グルタールアルデヒドの
存在下で触媒活性を失なう酵素の場合に行なう。
前記のようにキトーサンで被覆し架橋された支持
体は、0.01から１重量％のグルタールアルデヒド
を含有する溶液中へ添加し、その遊離のアルデヒ
ド基にグリシン、アスパラギンあるいはリジンの
ようなアミノ基を含む化合物を反応させるか、あ
るいはその遊離のアルデヒド基をたとえば水素化
ホウ素ナトリウムで還元させることにより処理す
る。アルデヒド基を不活性化してから、あらかじ
めたとえば反応溶液中の濃度が20から50mg／mlの
ガラクトノ―γ―ラクトンまたはグルコノ―γ―
ラクトンのような競合的阻害化合物で活性部位を
保護しておいたたとえば酵母ラクターゼのような
酵素を支持体に接触させる。この保護性の糖は酵
素の支持体への吸着に影響を与えず、過剰のラク
トースにより分離させられる。この処理は適当な
緩衝液中でふつうは低温（たとえば２から10℃の
範囲）で30分間から24時間行なわれ、過剰の酵素
は緩衝液により洗浄そしてつぎに水洗により除去
される。
酵素の安定性を増大させるために、たとえばカ
ルボジイミドあるいはウツドワード試薬、３―
（２―エチル―５―イソキサゾロ）―ベンゼンス
ルフオネートのような、酵素のカルボキシル基を
活性化しキトーサンの遊離のアミノ基と反応させ
ることのできるカツプリング剤により、酵素はキ
トーサンに化学的に結合していることが好まし
い。反応は１から48時間にわたつて２から25℃の
温度でPHを４から6.5に維持して反応溶液１mlあ
たり10から50mgのカルボジイミドを用いて行な
う。反応終了後直ちに過剰の試薬と、反応により
生成する尿素を、適当な緩衝液による洗いと次に
水洗により除去する。もうひとつの方法として
は、段階的に反応させるかわりに支持体、阻害化
合物、酵素そしてカルボジイミドを一回で同時に
接触させてもよい。
本発明の方法により得られる生産物は、対応す
る遊離の酵素の活性に近い酵素活性を有してい
る。これは従来の結合方法ではめつたに保持でき
ない性質である。さらにこの生産物は数か月間安
定で、対応する遊離酵素よりも高い不活性化温度
を有している。
前記したように本発明の方法により得られる生
産物は、対応する遊離酵素のかわりに固定床（カ
ラム）型あるいは好ましくは流動床型で酵素反応
に使用できる。キトーサンは天然有機物のため食
品産業において使用しても問題は起きないはずで
ある。
本発明による方法を以下の例において説明す
る。ここで特に指示がなければ量やパーセントは
重量で示してある。
例 １ 支持体へのキトーサンの結合 キトーサン８ｇを濃酢酸300mlと水400mlに溶か
す。混合液を40℃で１時間撹拌し、次に布の紙
（106μｍ）を用いて溶解していない残渣を除去す
る。キトーサン溶液をデシケータ中に入れ、シリ
カゲル（粒子径dp100―125μｍ，孔体積1.2ml／
ｇ，比表面積320m2／ｇ）120ｇを加え静かに撹拌
する（少し泡が出る）。泡が消えるまで、生成し
た浮遊液を真空中に放置する。混合液を一晩放置
してから、液体をデカントしキトーサンで被覆し
たシリカゲルを過により回収する。シリカゲル
を水で静かに洗つてから、支持体を真空下で70℃
の炉で一晩乾燥させる。
安定化した固定化支持体の調製 上記支持体（キトーサン被覆シリカゲル）120
ｇを、25％グルタールアルデヒド200mlを含有す
る水溶液1600mlのはいつたデシケーター中に加え
る。浮遊液を静かに撹拌し次に真空中に置く。ガ
スを除去した後浮遊液を２時間大気圧中に静置
し、その間定期的に静かに撹拌する。このように
して支持体は活性化されるが、これは色が白から
黄橙色にかわるという色の変化に現われる。
支持体は過により回収し次に注意深く水洗す
る。
転化酵素の安定化支持体への固定化 水100mlに15mgの転化酵素
（Maxinvert200000，Gist―Brocades社（ネバダ
州）の製品）溶液を調製し0.1MHCl溶液でPHを４
に調整する。この溶液30mlに、前記した方法で調
製した湿つた活性化支持体３ｇを混合する。浮遊
液を２時間静かに撹拌してから、過により触媒
を回収する。活性酵素の量は蔗糖に対する加水分
解能を測定して求める。最初の溶液30mlは転化酵
素を4.5mg、結合後の液は0.48mgおよび触媒は
4.02mgを含む。固定化収率は89％であり、この操
作中活性の損失は全く認められない。
例 ２ 転化酵素の再処理 例１の方法で調製し、活性転化酵素16mgを含む
湿つた触媒15ｇをグルタールアルデヒドの１％溶
液で２時間静かに撹拌しながら処理し、過によ
り触媒を回収する。洗浄後例１の方法で測定した
触媒活性は、活性転化酵素14mgに対応し、収率は
87％である。
例 ３ 菌類ラクターゼの安定化支持体への固定化 例１の方法に従い活性化した湿つた支持体28ｇ
を、直径2.5cmおよび高さ20cmのガラスカラムに
添加する。カラムは、調節可能なペリスタポンプ
とその内容物を磁気撹拌子で撹拌する容器を備え
た循環装置の一部を成す。ポンプの入り口は容器
に接続しており、出口はカラムの底に位置してい
る。カラムの上部にある出口は溶液を容器にもど
す。この装置にはPH４の酸性水溶液120mlがはい
つている。支持体がカラム中で最大15cmの高さに
なるまでポンプを調節する。Aspergillus niger
のラクターゼ（フランスのRapidase社、200000
単位／ｇ）0.6ｇを、循環装置を運転中の容器の
中へ溶解し、支持体を２時間流動化状態に保つ。
例１の方法により活性を測定すると、過および
触媒の水洗後、活性の72％は支持体上に存在し20
％は液に存在する。
例 ４ 固定化菌類ラクターゼの再処理 例３に従い調製した湿つたラクターゼ触媒10ｇ
に、５％グルタールアルデヒドを含む水溶液50ml
を混合しPHを４に合わせる。混合液を定期的に撹
拌し、２時間後過により触媒を回収する。再処
埋前の（ラクトースの加水分解による）触媒の活
性は湿つた触媒１ｇあたりラクターゼ（フランス
のRapidase社、200000単位／ｇ）21mgに相当
し、再処理後は湿つた触媒１ｇあたり19mgに相当
している。。これは活性が90％保持されているこ
とに相当する。
例 ５ トリプシンの安定化支持体への固定化 （例１のように）キトーサンで被覆したシリカ
ゲル１ｇを20mlの酢酸ナトリウム緩衝液
（0.5M；PH6.0）に浮遊させる。次に、前もつて
同じ緩衝液で１：１に希釈したグルタールアルデ
ヒド（25％水溶液）を５ml加える。この活性化処
理は室温（25℃）で静かに撹拌しながら30分間続
ける。このように活性化した後蒸留水で数回洗い
残存するグルタールアルデヒドを除去する。牛の
結晶トリプシン（メルク）50mgを、塩化カルシウ
ム（20mM）を含むホウ酸ナトリウム緩衝液
（0.1M；PH8.0）20mlに溶解させる。次にこのト
リプシン溶液を先に調製したキトーサン被覆シリ
カゲルに加える。混合物全体を４℃で一晩静かに
撹拌（ロータリ―シエーカー）する。次に遠心分
離あるいは過により酵素被覆支持体を溶液より
分離し、洗浄水の280nm（UV分光光度計）での
吸光度がゼロになるまで、ａ 塩化ナトリウム
（0.15M）を含むホウ酸ナトリウム緩衝液
（0.1M；PH8.0）、ｂ ホウ酸ナトリウム緩衝液
（0.1M；PH8.0）およびｃ 蒸留水の順で数回洗
う。（トリス―ヒドロキシメチル―アミノメタ
ン）―HCl緩衝液（50mM；PH8.0）中1mM濃度
の塩酸Ｎ―α―ベンゾイル―Ｌ―アルギニン―ニ
トロアニリド（Ｌ―BANA）を基質として25℃で
可溶性トリプシンの酵素活性を測定する。酵素加
水分解により放出されるｐ―ニトロアニリンを
405nmでUV分光光度計で定量する。１単位のト
リプシン活性（1IU）は、ふつうの条件で１分間
につき１マイクロモルのｐ―ニトロアニリンを放
出させる酵素の量に相当する。固定化トリプシン
の活性は、「Methods in Enzymology」44，344
―345（1976）に記載のものと類似の断続的測定
装置を用い、撹拌床中で前記と同様の方法で定量
する。支持体に結合した酵素の量は、Folin―
Lowry法（J.Biol.Chem.，193，265，1951）で求
めたたん白量を基準にして、はじめに加えた酵素
量と結合せずに残つている酵素量の差を計算する
ことにより間接的に求められる。調製された物質
は支持体１ｇあたり35.2mgのトリプシンを含有
し、支持体１ｇあたり72国際単位（IU）の酵素
活性を有する。結合収率は63.7％になる。固定化
トリプシンの比活性は固定酵素１mgあたり2.04IU
となり、一方可溶性酵素の比活性は2.26IU／mgと
なる。
例 ６ グルタールアルデヒドにより影響を受ける酵素
の固定化のための支持体の安定化 例１の方法に従いキトーサンで被覆した支持体
40ｇをリン酸カリウム緩衝液（50mM；PH6.5）
150mlに分散させる。1.5mlのグルタールアルデヒ
ド（25％水溶液、Fluka社、化学用）を加え、混
合液を室温で30分静かに回転撹拌して反応させ
る。次に過（50μｍメツシユの金属性の網）あ
るいは遠心分離により支持体を溶液から分離し、
次に蒸留水で何度も洗う。支持体を再び上記の緩
衝液150mlに浮遊させる。固体の水素化ホウ素ナ
トリウム500mgを何回かにわけて加える。次にこ
の溶液を同様の条件で30分間反応させる。支持体
を過により回収し、蒸留水で洗い、遠心分離を
し、そして次に例７と例８（下記）に記載したよ
うに酵素の固定化に用いる。
例 ７ 中性酵母ラクターゼの吸着による固定化 例６の方法に従い安定化させた支持体40ｇを、
0.1mMの塩化マンガンと0.02％アジ化ナトリウム
を含むリン酸カリウム緩衝液（50mM；PH6.5）
150mlに分散させる。Ｄ―ガラクトノ―γ―ラク
トン（Koch―Light Lab.社）を最終濃度が0.1M
になるように加える。必要であれば溶液のPHを
6.5に調整する。次に酵母ラクターゼ（Maxilact
LX5000，Gist―Brocades社（ネバダ州）の製
品）溶液を６ml加え、その後酵素と支持体を含む
溶液を16時間撹拌する。過により支持体を溶液
より分離し、次にリン酸カリウム緩衝液
（50mM；PH6.5）と0.1mM塩化マンガン500ml、
塩化カリウム50mM余分に含む同じ緩衝液500
ml、そして蒸留水（３×500ml）で順番に洗う。
ラクターゼ活性を有する支持体をはじめに述べた
緩衝液（リン酸―マンガン―アジド）に保存す
る。
5mMのｏ―ニトロフエニル―β―ガラクトピ
ラノシド（ONPG）溶液を基質として用い30℃で
UV吸光光度計で、可溶性および固定化酵素の活
性を測定する。酵素により放出されるｏ―ニトロ
フエノールを405nm（PH6.5でεNθNP：1097M-1
cm-1）で定量する。上記の基質を用い例５に記載
した方法で、固定化酵素の活性を測定する。ラク
ターゼ活性の１国際単位（IU）は、ここに示し
た条件下で１分間当り１マイクロモルのｏ―ニト
ロフエノールの放出に相当する。固定化されたラ
クターゼは乾燥支持体１ｇあたり423IUの活性を
有する。
例 ８ 中性酵母ラクターゼの共有結合による固定化 例７の方法に従い吸着させた酵素は、さらにカ
ルボジイミドで処理すればもつと強固に支持体に
結合させることができる。ラクターゼとその支持
体を例７に記載した条件で30分間接触させた後、
PHを6.5に維持して最初の２時間は室温で次の16
時間は４℃で、カルボジイミド（メト―ｐ―メル
イジンスルホン酸の１―シクロヘキシル―３―
（２―モルホリノエチル）―カルボジイミド）（シ
グマケミカル社）2.5ｇを撹拌（ロータリ―シエ
ーカー）しながら少量ずつ加える。次に例７と同
じ方法で洗浄する。例５と同じ方法で測定した支
持体のラクターゼ活性は乾燥支持体１ｇあたり
285IUとなる。
例 ９ 乳清の加水分解 除たん白したホエイを50℃で、例４の方法で再
処理した触媒を充填した例３のカラムに通してポ
ンで上方へ上げる。最初の12時間で触媒活性の18
％の低下が見られる。この初期の活性低下のの
ち、１週間後の測定で上記の処理条件下では触媒
活性は安定であることがわかつた。
例 10 脱脂乳の連続加水分解 例８の生物触媒浮遊液90mlを直径2.5mlのカラ
ムに供給する。酵素床の高さは18.3cmである。滅
菌（超高温）した脱脂乳を１時間180mlの速度で
ポンプでカラムのところまで上げる。この条件下
で酵素床は流動下され25.5cmの高さに達する。装
置の温度は6.2℃に保つ。ラクトースの加水分解
度は92％に達する。275時間の連続運転（２、３
日おきに適当な洗剤で数時間洗浄することを除
く）の後、触媒の残存活性は初期の活性の85％で
ある。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 硬くて密な無機質の粒子をキトーサンの層で
    被覆し、被覆した粒子をグルタールアルデヒドで
    安定化させ、このように処理した支持体に酵素を
    結合させることを特徴とする、水性媒体に不溶で
    特に流動床式あるいは固定床式反応槽の使用に適
    した酵素活性を有する生物触媒の製造方法。 ２ 無機質はシリカゲル、金属酸化物あるいはセ
    ラミツクスの多孔性粒子である、特許請求の範囲
    第１項に記載の方法。 ３ 硬くて密な無機質の粒子をキトーサンの層で
    被覆し、被覆した粒子をグルタールアルデヒドで
    活性化させ、このように処理した支持体にグルタ
    ールアルデヒドにより影響を受けない酵素を結合
    させて遊離のアルデヒド基と酵素のもつ遊離アミ
    ノ基間で化学結合することを特徴とする、水性媒
    体に不溶で特に流動床式あるいは固定床式反応槽
    の使用に適した酵素活性を有する生物触媒の製造
    方法。 ４ 酵素を結合させた後、支持体をグルタールア
    ルデヒドで再処理して安定性を増大させる、特許
    請求の範囲第３項に記載の方法。 ５ 酵素がグルタールアルデヒドに対して影響を
    受け、グルタールアルデヒドで安定化させた触媒
    を還元剤で処理し、酵素を支持体に吸着させる、
    特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ６ 還元剤は水素化ホウ素ナトリウムである、特
    許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７ 吸着した酵素はカルボジイミドあるいはウツ
    ドワード試薬などのカツプリング剤により支持体
    に化学的に結合している、特許請求の範囲第５項
    に記載の方法。 ８ 酵素の活性部位が競合阻害剤の添加により保
    護されている、特許請求の範囲第７項に記載の方
    法。 ９ 競合阻害剤がグルコノ―γ―ラクトンあるい
    はガラクトノ―γ―ラクトンである、特許請求の
    範囲第８項に記載の方法。
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