JPS62166899A - アルカリ性ホスフアタ−ゼアツセイ用２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ−ル緩衝液中の基質組成物 - Google Patents
アルカリ性ホスフアタ−ゼアツセイ用２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ−ル緩衝液中の基質組成物Info
- Publication number
- JPS62166899A JPS62166899A JP61306696A JP30669686A JPS62166899A JP S62166899 A JPS62166899 A JP S62166899A JP 61306696 A JP61306696 A JP 61306696A JP 30669686 A JP30669686 A JP 30669686A JP S62166899 A JPS62166899 A JP S62166899A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- concentration
- substrate
- substrate composition
- alkaline phosphatase
- bcip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 86
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 58
- 229940058020 2-amino-2-methyl-1-propanol Drugs 0.000 title claims description 42
- CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N aminomethyl propanol Chemical compound CC(C)(N)CO CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 41
- 238000008940 Alkaline Phosphatase assay kit Methods 0.000 title claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 title description 3
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical group COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 27
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 claims description 8
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 claims description 8
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 1-propanol Substances CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 28
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 21
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 21
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 21
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 20
- 238000011161 development Methods 0.000 description 16
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- -1 3-indolyl Chemical group 0.000 description 4
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- VXTQMOSXLCOXRL-UHFFFAOYSA-N (4-chloro-1h-indol-3-yl) dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 VXTQMOSXLCOXRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZXIRKECXSYACFD-UHFFFAOYSA-N 1h-indol-2-yl dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC=C2NC(OP(O)(=O)O)=CC2=C1 ZXIRKECXSYACFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VCESGVLABVSDRO-UHFFFAOYSA-L 2-[4-[4-[3,5-bis(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-2-yl]-3-methoxyphenyl]-2-methoxyphenyl]-3,5-bis(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VCESGVLABVSDRO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241001474791 Proboscis Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 1
- 241000270666 Testudines Species 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000002249 anxiolytic agent Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- AWYNYGDVTNSMIS-UHFFFAOYSA-N ethanamine;ethanol Chemical compound CCN.CCO AWYNYGDVTNSMIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- YLJRCXSSKLWCDE-UHFFFAOYSA-N methyl ethanesulfonate Chemical compound CCS(=O)(=O)OC YLJRCXSSKLWCDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical group CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016776 visual perception Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
- C12Q2326/90—Developer
- C12Q2326/92—Nitro blue tetrazolium chloride, i.e. NBT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/50—Indoles
- C12Q2334/52—5-Bromo-4-chloro-3-indolyl, i.e. BCI
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/967—Standards, controls, materials, e.g. validation studies, buffer systems
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素アッセイ用基質絹成物、特にホスフェート
化インデイゴコゲナ−（ｃｏｇｅｎｅｒ ）およびテト
ラゾリウム塩を含むアルカリ性ホスファターゼアッセイ
用基質組成物に関する。
化インデイゴコゲナ−（ｃｏｇｅｎｅｒ ）およびテト
ラゾリウム塩を含むアルカリ性ホスファターゼアッセイ
用基質組成物に関する。
従来技術
少量存在する物質検出用アッセイは指示薬の使用による
。
。
生理学的アッセイにおける１種の指示薬には検出しよう
とする目標物質に選択的に結合するプループに付着する
酵素利用がある。目標物に結合すれば酵素は基質との反
応を接触して肉眼で又は機械によって容易に検出できる
生成物をつくりレポータ一群として働らく。
とする目標物質に選択的に結合するプループに付着する
酵素利用がある。目標物に結合すれば酵素は基質との反
応を接触して肉眼で又は機械によって容易に検出できる
生成物をつくりレポータ一群として働らく。
レポータ一群として役に立つ酵素の１例はアルカリ性ホ
スファターゼである。アルカリ性ホスファダーゼとは一
般にｐＨ約８，５乃至１０．５にわたシモノホスフォリ
ックエステルを加水分解する非特異性酵素群をいう。
スファターゼである。アルカリ性ホスファダーゼとは一
般にｐＨ約８，５乃至１０．５にわたシモノホスフォリ
ックエステルを加水分解する非特異性酵素群をいう。
多数の基質がアルカリ性ホスファターゼ酵素と反応しう
るが、インデイゴコゲナー、好ましくは５−プロモー４
−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）Ｏ
Ｓな３−インドリル７オスフエート塩は特に便利な信号
を与える。アルカリ性ホスファターゼはＢＣＩＰを有機
部分とホスフェートに分解する。有機部分はダイマー化
して青色生成物を生ずる。シん酸転換性緩衝液は酵素に
よってインデイゴコゲナーから移動したホスフェートを
除去するので酵素によるホスフェートの蓄積とつづいて
おこる酵素の抑制を避ける。この反応に便利なシん酸転
換性緩衝液には２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ
ール（２Ａ２ＭＩＰ）、ジェタノールアミン、エタンア
ミンエタノールおよび２−アミノ−２−メチル−１，３
−プロパンジオールがある。
るが、インデイゴコゲナー、好ましくは５−プロモー４
−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）Ｏ
Ｓな３−インドリル７オスフエート塩は特に便利な信号
を与える。アルカリ性ホスファターゼはＢＣＩＰを有機
部分とホスフェートに分解する。有機部分はダイマー化
して青色生成物を生ずる。シん酸転換性緩衝液は酵素に
よってインデイゴコゲナーから移動したホスフェートを
除去するので酵素によるホスフェートの蓄積とつづいて
おこる酵素の抑制を避ける。この反応に便利なシん酸転
換性緩衝液には２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ
ール（２Ａ２ＭＩＰ）、ジェタノールアミン、エタンア
ミンエタノールおよび２−アミノ−２−メチル−１，３
−プロパンジオールがある。
スタークウェザ−の米国特許第４，０３０，９９５号と
英国特許第１，２６３，２０２号を参照されたい。
英国特許第１，２６３，２０２号を参照されたい。
アルカリ性ホスファターゼとＢＣＩＰの反応増進はニト
ロ青テトラゾリウム（ＮＢＴ）の添加によってできる。
ロ青テトラゾリウム（ＮＢＴ）の添加によってできる。
アルカリ性ホスファターゼとＢＣＩＰの反応生成物はＮ
ＢＴを不溶性青色ジフオルマザンに還元し、それはＢＣ
ＩＰ反応生成物のみで生ずるよシも強い信号を発する。
ＢＴを不溶性青色ジフオルマザンに還元し、それはＢＣ
ＩＰ反応生成物のみで生ずるよシも強い信号を発する。
例えばペアレントらのＰｈｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
、 ６６．５３−５７（１９８５）を参照されたい。し
かし約２４時間の調整によりＢＣＩＰとＮＢＴ’ｉ含む
水性基質組成物中に沈澱が生ずる。この沈澱土ｙ、は活
性損失を伴なうので、アルカリ性ホスファターゼ基質組
成物製造用キット中でＮＢＴ、ＢＣＩＰおよび緩衝液の
別個の包装を必要とする。
、 ６６．５３−５７（１９８５）を参照されたい。し
かし約２４時間の調整によりＢＣＩＰとＮＢＴ’ｉ含む
水性基質組成物中に沈澱が生ずる。この沈澱土ｙ、は活
性損失を伴なうので、アルカリ性ホスファターゼ基質組
成物製造用キット中でＮＢＴ、ＢＣＩＰおよび緩衝液の
別個の包装を必要とする。
発明の概要
本発明はアルカリ性ホス７アターゼアツセイ用安定基質
組成物を提供するものであるうこの組成物は十分に安定
なのでＮＢＴ、ＢＣＩＰおよび緩衝剤は予め混合し１単
位として包装できる。組成物はホスフェート化インドー
ルコゲナー、これと反応して検知できる信号を与えるに
有効な濃度のテトラゾリウム塩および水溶液中上記イン
ドールコケナーとテトラゾリウム塩の反応を緩衝するに
有効な濃度の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノー
ルを反応を進行させるｐＨ範囲内の水溶液中に含む。
組成物を提供するものであるうこの組成物は十分に安定
なのでＮＢＴ、ＢＣＩＰおよび緩衝剤は予め混合し１単
位として包装できる。組成物はホスフェート化インドー
ルコゲナー、これと反応して検知できる信号を与えるに
有効な濃度のテトラゾリウム塩および水溶液中上記イン
ドールコケナーとテトラゾリウム塩の反応を緩衝するに
有効な濃度の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノー
ルを反応を進行させるｐＨ範囲内の水溶液中に含む。
本発明による基質組成物は約１．０乃至約１０ｍＭのす
度の５−プロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ
ート、約０．０５乃至約０．５ｍＭの濃度のニトロ青テ
トラゾリウムおよび約０．１乃至約１．０ Ｍの濃度の
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを含むこと
が好ましい。基質組成物はまた約１．０ｍＭの濃度のＭ
ｇＣｌ２を 含んでいてもよい。
度の５−プロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ
ート、約０．０５乃至約０．５ｍＭの濃度のニトロ青テ
トラゾリウムおよび約０．１乃至約１．０ Ｍの濃度の
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを含むこと
が好ましい。基質組成物はまた約１．０ｍＭの濃度のＭ
ｇＣｌ２を 含んでいてもよい。
本発明による基質組成物が濃度１．２ｒｎＭの５−プロ
モ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、濃Ｌ
０．１７ ｍＭのニトロ青テトラゾリウム、濃度１００
ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、濃
度１ミリＭのＭｇ Ｃ１゜および濃度０．０２％のナト
リウムアザイドを含むと特に好ましい、 具体的説明 ２Ａ２ＭＩＰはＮＢ’Ｉ’なしでなされたアルカリ性ホ
スファターゼアッセイ（上記スタークウェザ−）に便利
でありまたアルカリ性ホスファターゼ自体の貯蔵に便利
である〔マツクコプらのＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔａａｅ、 プレナムプレス、ニューヨーク、７
．５．７．３（１９７９）］が、本発明以前ＮＢＴｉ含
むアルカリ性ホスファターゼ基質組成物中に２Ａ２ＭＩ
Ｐの使用から特別利益が生ずると知られていなかったと
信じられる。結局２−アミノ−２（ヒドロキシメチル）
−１，３−プロパンジオール（トリス）緩衝剤は当然の
不便、高経費および不正確の可能性にもがかわらずこの
様な組成物に緩衝剤として一般に使われ、沈澱生成を避
けるため基質組成物の成分の分離包装を必要としている
。
モ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、濃Ｌ
０．１７ ｍＭのニトロ青テトラゾリウム、濃度１００
ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、濃
度１ミリＭのＭｇ Ｃ１゜および濃度０．０２％のナト
リウムアザイドを含むと特に好ましい、 具体的説明 ２Ａ２ＭＩＰはＮＢ’Ｉ’なしでなされたアルカリ性ホ
スファターゼアッセイ（上記スタークウェザ−）に便利
でありまたアルカリ性ホスファターゼ自体の貯蔵に便利
である〔マツクコプらのＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔａａｅ、 プレナムプレス、ニューヨーク、７
．５．７．３（１９７９）］が、本発明以前ＮＢＴｉ含
むアルカリ性ホスファターゼ基質組成物中に２Ａ２ＭＩ
Ｐの使用から特別利益が生ずると知られていなかったと
信じられる。結局２−アミノ−２（ヒドロキシメチル）
−１，３−プロパンジオール（トリス）緩衝剤は当然の
不便、高経費および不正確の可能性にもがかわらずこの
様な組成物に緩衝剤として一般に使われ、沈澱生成を避
けるため基質組成物の成分の分離包装を必要としている
。
実施例１において沈澱生成の原因を見つけるため基質組
成物を試験している。実施例２ではトリス緩衝剤変性型
の沈澱生成について検ぺている。実施例３において沈澱
生成抑制試験にトリスで緩衝した基質組成物に有機溶剤
を加えている。実施例４では多数の緩衝剤をしらべたが
トリスの代りとは思われなかった。２Ａ２ＭＩＰはアル
カリ性ホスファターゼアッセイに基質組成物安定化用に
特に適した緩衝剤と認められるう実施例５においてＢＣ
ＩＰ／ＮＢＴアッセイの色生成は２Ａ２ＭＩＰで緩衝さ
れた組成物およびトリスで緩衝された組成物と匹敵して
いる。実施例６においてはＢＣＩＰとＮＥＴの濃度の２
Ａ２Ｍｉ Ｐにおける信号強さと安定性への影響につい
て考えている。実施例７では２Ａ２ＭＩＰにおける長時
間安定性について穐々の基質製法を検べている。実施例
８においては２Ａ２ＭＩＰ緩衝剤使用の最適条件が検ぺ
られている。実施例９においては実施例８の好ましい基
質液の安定性が試験されている。
成物を試験している。実施例２ではトリス緩衝剤変性型
の沈澱生成について検ぺている。実施例３において沈澱
生成抑制試験にトリスで緩衝した基質組成物に有機溶剤
を加えている。実施例４では多数の緩衝剤をしらべたが
トリスの代りとは思われなかった。２Ａ２ＭＩＰはアル
カリ性ホスファターゼアッセイに基質組成物安定化用に
特に適した緩衝剤と認められるう実施例５においてＢＣ
ＩＰ／ＮＢＴアッセイの色生成は２Ａ２ＭＩＰで緩衝さ
れた組成物およびトリスで緩衝された組成物と匹敵して
いる。実施例６においてはＢＣＩＰとＮＥＴの濃度の２
Ａ２Ｍｉ Ｐにおける信号強さと安定性への影響につい
て考えている。実施例７では２Ａ２ＭＩＰにおける長時
間安定性について穐々の基質製法を検べている。実施例
８においては２Ａ２ＭＩＰ緩衝剤使用の最適条件が検ぺ
られている。実施例９においては実施例８の好ましい基
質液の安定性が試験されている。
実施例１０では２Ａ２ＭＩＰで緩衝された基質の生成物
とトリス緩衝された基質の生成物の分光光度比較がなさ
れている。実施例１１において本発明の固相アッセイへ
の使用が試みられている。実施例１２では本発明の酵素
と結合したイミュノンーベント（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ
ｅｎｔ ）アッセイ（ＥＬＩＳＡ）への使用が試みられ
ている。実施例１３では本発明のクエスターンプロット
アツセイへの使用が試みられている。
とトリス緩衝された基質の生成物の分光光度比較がなさ
れている。実施例１１において本発明の固相アッセイへ
の使用が試みられている。実施例１２では本発明の酵素
と結合したイミュノンーベント（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ
ｅｎｔ ）アッセイ（ＥＬＩＳＡ）への使用が試みられ
ている。実施例１３では本発明のクエスターンプロット
アツセイへの使用が試みられている。
実施例 １
沈澱の原因を検べるために０．１Ｍジェタノールアミン
（ｐＨ９，８）中にＮＢＴｉ含まぬ１．４ ｍＭ ＢＣ
Ｉ Ｐ ；ＢＣＩＰを含まぬ０．２４ ｍＭ ＮＢＴ
；又は１．４ｍＭＢＣＩＰおよび０．２４ｍＭＮＢＴ’
ｌ含む液をそれぞれつくった。この溶液の沈澱生成を室
温において観察した。
（ｐＨ９，８）中にＮＢＴｉ含まぬ１．４ ｍＭ ＢＣ
Ｉ Ｐ ；ＢＣＩＰを含まぬ０．２４ ｍＭ ＮＢＴ
；又は１．４ｍＭＢＣＩＰおよび０．２４ｍＭＮＢＴ’
ｌ含む液をそれぞれつくった。この溶液の沈澱生成を室
温において観察した。
ＮＢＴを含まぬ１．４ｍＭＢＣＩＰ溶液では沈澱は認め
られなかった。
られなかった。
ＢＣＩＰを含まぬ０．２４ｍＭＮＥＴ溶液では青色沈澱
が多量に認められた。
が多量に認められた。
１．４ｍＭＢＣＩＰと０．２４ｍＭＮＢＴの両方を含む
溶液においても青色沈澱が多量に認められた□したがっ
てＮＢＴの存在が不用の沈澱を生成すると結論した。
溶液においても青色沈澱が多量に認められた□したがっ
てＮＢＴの存在が不用の沈澱を生成すると結論した。
実施例 ２
変性型トリス緩衝剤がＢＣＩＰ／ＮＢＴアッセイにおい
て十分に働くかどうかまた更に貯蔵中沈澱生成の傾向が
ないかどうか検ぺるため次の実験を行なった。
て十分に働くかどうかまた更に貯蔵中沈澱生成の傾向が
ないかどうか検ぺるため次の実験を行なった。
標準アッセイの他の成分によって入るかもしれない異物
から基質組成物を分離するため試験管に酵素結合物と基
質を混合して基質組成物のアッセイを行なった。
から基質組成物を分離するため試験管に酵素結合物と基
質を混合して基質組成物のアッセイを行なった。
試験管アッセイにおいて２０μｔの結合物〔メリーラン
ド州ゲイタースバーグ、キルケガールドアンドペリーラ
ボラトリーズ社により０．５ｖ／−で供給されたアルカ
リ性ホスファターゼに結合した抗−人間抗体の１：１０
００稀釈液〕をクヴエット中で１．０−の基質と混合し
発色を波長５７５ ｎｍにおいて監視した。次式：（式
中人は５７５ ｕｍにおける吸収度であり、Ｘは試料採
取時点とする）から毎分の吸収度（ΔＡ／分）増加を計
算して反応速度の数的比較ができる。
ド州ゲイタースバーグ、キルケガールドアンドペリーラ
ボラトリーズ社により０．５ｖ／−で供給されたアルカ
リ性ホスファターゼに結合した抗−人間抗体の１：１０
００稀釈液〕をクヴエット中で１．０−の基質と混合し
発色を波長５７５ ｎｍにおいて監視した。次式：（式
中人は５７５ ｕｍにおける吸収度であり、Ｘは試料採
取時点とする）から毎分の吸収度（ΔＡ／分）増加を計
算して反応速度の数的比較ができる。
トリス緩衝基質の初めの組成は１．４ｍＭ ＢＣＩＰ
；０．２４ｍＭ ＮＢＴ； １００ｍＭ ）リスベース
（ｐＨ９，６） および５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含ん
でいた。種々のｐＨにおける溶液中のトリスの種々の濃
度を比較した。 ５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１．４ｍＭ
ＢＣＩＰおよび０．２４ｍＭＮＢＴｆ：含む１００ｍＭ
トリス緩衝液と１．４ｍＭＢＣＩＰおよび０．２４ｍＭ
ＮＢＴを含む１．０Ｊ＋Ｊス緩衝液の結果を表１に示し
ている。
；０．２４ｍＭ ＮＢＴ； １００ｍＭ ）リスベース
（ｐＨ９，６） および５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含ん
でいた。種々のｐＨにおける溶液中のトリスの種々の濃
度を比較した。 ５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１．４ｍＭ
ＢＣＩＰおよび０．２４ｍＭＮＢＴｆ：含む１００ｍＭ
トリス緩衝液と１．４ｍＭＢＣＩＰおよび０．２４ｍＭ
ＮＢＴを含む１．０Ｊ＋Ｊス緩衝液の結果を表１に示し
ている。
表 １
ΔＡ３７５／分
ｐＨＯ，１Ｍトリス １．０Ｍトリス９．０
０．０７１ ０．１５１９．２
０．１１５ ０．１７４９．４
０．１２６ ０．２２４９．
６ ０．１８０ ０．２６１９
．８ ０．１１８ ０．２５２
１０．０ 測定せず ０．２２２表
１からｐＨ９，６における１、０Ｍｌス液が元の組成物
よりも性能のよいことが決定された。しかしｐＨ９，６
においてトリス（ｐＫａ ＝ ８．０５ ）はその有効
緩衝範囲外である。故にトリスが有効緩衝剤であるｐＨ
値範囲内でトリス液が有用であると発見されなかった。
０．０７１ ０．１５１９．２
０．１１５ ０．１７４９．４
０．１２６ ０．２２４９．
６ ０．１８０ ０．２６１９
．８ ０．１１８ ０．２５２
１０．０ 測定せず ０．２２２表
１からｐＨ９，６における１、０Ｍｌス液が元の組成物
よりも性能のよいことが決定された。しかしｐＨ９，６
においてトリス（ｐＫａ ＝ ８．０５ ）はその有効
緩衝範囲外である。故にトリスが有効緩衝剤であるｐＨ
値範囲内でトリス液が有用であると発見されなかった。
実施例 ３
実施例２の溶液で認められた沈澱生成をさけるためトリ
ス緩衝した基質に有機溶媒を加えた。５０ｍＭエタノー
ル、５０ｍＭジメチルホルムアミド又は５０ｍＭジメテ
ルズルフオキシドの様な夕景の添加は沈澱生成を抑制す
るよりもそれを促進した。この結果は有機溶媒中の濃厚
液としてＢＣＩＰやＮＢＴを加えても沈澱問題を解決し
ないことを示している。
ス緩衝した基質に有機溶媒を加えた。５０ｍＭエタノー
ル、５０ｍＭジメチルホルムアミド又は５０ｍＭジメテ
ルズルフオキシドの様な夕景の添加は沈澱生成を抑制す
るよりもそれを促進した。この結果は有機溶媒中の濃厚
液としてＢＣＩＰやＮＢＴを加えても沈澱問題を解決し
ないことを示している。
実施例 ４
トリスに代る基質組成物の安定性を増す代替品をえるた
め徨々の緩衝剤をしらべた。
め徨々の緩衝剤をしらべた。
すべての緩衝剤を１００ｍＭ濃度でｐＨ９，５に調節し
１ｍＭ ＭｇＣｌ２を加えて試験した。緩衝液は４５℃
で培養した。各基質緩衝液のＢＣＩＰ濃度を１．４ｍＭ
としＮＢＴ濃度を０．２４ ｍＭとした。各緩衝剤の安
定試験と平行して各貯蔵液の効力をＨＣＧアッセイで試
験した。
１ｍＭ ＭｇＣｌ２を加えて試験した。緩衝液は４５℃
で培養した。各基質緩衝液のＢＣＩＰ濃度を１．４ｍＭ
としＮＢＴ濃度を０．２４ ｍＭとした。各緩衝剤の安
定試験と平行して各貯蔵液の効力をＨＣＧアッセイで試
験した。
固相アッセイにおいて平均直径約０．１乃至５ミクロン
をもつ多数の実質的球形固体粒子を繊維状物質の多孔性
マトリックス上に固定した。繊維状物質はガラス、ポリ
スチレン膜をもつガラス、セルロース、ナイロン又は粒
子と相互作用しそれらを固定すると知られている他の繊
維状物質から生成できる。粒子はポリスチレン、ポリメ
タクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリアク
リロニトリル、ポリカーボネート又は分析される物質を
保持できる表面をもつ同様の材料よシ成るものでもよい
。
をもつ多数の実質的球形固体粒子を繊維状物質の多孔性
マトリックス上に固定した。繊維状物質はガラス、ポリ
スチレン膜をもつガラス、セルロース、ナイロン又は粒
子と相互作用しそれらを固定すると知られている他の繊
維状物質から生成できる。粒子はポリスチレン、ポリメ
タクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリアク
リロニトリル、ポリカーボネート又は分析される物質を
保持できる表面をもつ同様の材料よシ成るものでもよい
。
人の絨毛膜ゴナトドロービン（ＨＣＧ）アッセイ用微粒
子は１，０−の５ｍＭメチルエチルスルホネート（ＭＥ
Ｓ）緩衝液（ｐＨ４，７５）と７５μｔの抗−ＨＣＧ抗
体溶液（２η／ｆＲｔ）中にカルボキシレート−変性ポ
リスチレン微粒子（インディアナ州、インジアナポリス
、セラゲンより市販）１００μｔｆ加えて製造した。溶
液を攪拌抜水１−に０．５■濃度の１−エチル−３（３
−ジメチルアミンプロピル）カルボジイミドＨＣＩ （
ＥＤＡＣ）１００ｍ１を加えた。溶Ｖを２−８℃で１夜
槽拌後微粒子を遠心分離し０．１チトウイーンー２０液
で洗いりん酸塩緩衝された塩溶液（０，０１Ｍ ＫＨｚ
Ｐ Ｏｓおよび０．１５Ｍ ＮａＣ１，ｐＨ７，２）
に懸濁させて０．１２５チ溶液とした。υん酸塩緩衝塩
溶液（ＰＢＳ）に再懸濁後粒子な次の使用まで２−８℃
で貯蔵した。
子は１，０−の５ｍＭメチルエチルスルホネート（ＭＥ
Ｓ）緩衝液（ｐＨ４，７５）と７５μｔの抗−ＨＣＧ抗
体溶液（２η／ｆＲｔ）中にカルボキシレート−変性ポ
リスチレン微粒子（インディアナ州、インジアナポリス
、セラゲンより市販）１００μｔｆ加えて製造した。溶
液を攪拌抜水１−に０．５■濃度の１−エチル−３（３
−ジメチルアミンプロピル）カルボジイミドＨＣＩ （
ＥＤＡＣ）１００ｍ１を加えた。溶Ｖを２−８℃で１夜
槽拌後微粒子を遠心分離し０．１チトウイーンー２０液
で洗いりん酸塩緩衝された塩溶液（０，０１Ｍ ＫＨｚ
Ｐ Ｏｓおよび０．１５Ｍ ＮａＣ１，ｐＨ７，２）
に懸濁させて０．１２５チ溶液とした。υん酸塩緩衝塩
溶液（ＰＢＳ）に再懸濁後粒子な次の使用まで２−８℃
で貯蔵した。
ホワットマンＧＦ／Ｄ ガラスフィルターの中心に抗体
被覆した粒子５０μｔを滴加した後豚血清１００μｔを
加え、フィルターと微粒子を室温の温室中で３０分培養
した。
被覆した粒子５０μｔを滴加した後豚血清１００μｔを
加え、フィルターと微粒子を室温の温室中で３０分培養
した。
次にフィルターを３００μｔのＰＢＳ緩衝液で３回洗っ
た０フイルターは使用まで浴室に貯蔵した。微粒子がフ
ィルターのガラス繊維上に不可逆的に付着又は凝集した
ことは電子顕微鏡検査によって確認された。
た０フイルターは使用まで浴室に貯蔵した。微粒子がフ
ィルターのガラス繊維上に不可逆的に付着又は凝集した
ことは電子顕微鏡検査によって確認された。
抗体−酵素結合物がねずみの抗−ＨＣＧモノクロナール
抗体からキャネイらのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 １２
３．１５４８（１９７９）の方法によって製造された。
抗体からキャネイらのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 １２
３．１５４８（１９７９）の方法によって製造された。
アルカリ性ホスフオターゼはインジアナ州インジアナポ
リス、ベーリンゲルマンノ・イム社からえられた。
リス、ベーリンゲルマンノ・イム社からえられた。
抗体が被覆された微粒子をもつガラスフィルター物質を
直径１２ＩＩＩＩＩの実質的円板に切りとり過剰の液体
を吸収させる様吸取紙と接触させた。次いで各マトリッ
クス上にあるプレフィルタ−をとおしてＨＣＧｏ、５０
又は１００ｍＩＵ／−量を含む人尿の標準試料（カリフ
ォルニア州、サンジエゴ、スフリップ研究所から市販）
５滴（約２８０μｔ）を加えた。次に抗体−酵素結合物
の３滴をプレフィルタ−をとおし各マトリックスに加え
、各マトリックスを室温で約２分培養した。プレフィル
タ−をとり除き、１．０−の洗浄液（シトレート、ホス
フェートおよびトウイーン２０を含む）を各マトリック
スに加えて過剰の抗体−酵素結合物を除去した。マトリ
ックスを再び吸取紙上におき、試験する基質緩衝液５滴
（約２５０μｔ）を各マトリックスに加えた。２分後に
１−の洗液を加え各マトリックスの色の発生を肉眼検査
した。ＨＣＧを含む試験試料の発色が認められた。発色
に対応する吸光度を普通の分光光度計を用いて測定した
。結果を４５℃における培養日数と不合格理由と共に表
２に示している。
直径１２ＩＩＩＩＩの実質的円板に切りとり過剰の液体
を吸収させる様吸取紙と接触させた。次いで各マトリッ
クス上にあるプレフィルタ−をとおしてＨＣＧｏ、５０
又は１００ｍＩＵ／−量を含む人尿の標準試料（カリフ
ォルニア州、サンジエゴ、スフリップ研究所から市販）
５滴（約２８０μｔ）を加えた。次に抗体−酵素結合物
の３滴をプレフィルタ−をとおし各マトリックスに加え
、各マトリックスを室温で約２分培養した。プレフィル
タ−をとり除き、１．０−の洗浄液（シトレート、ホス
フェートおよびトウイーン２０を含む）を各マトリック
スに加えて過剰の抗体−酵素結合物を除去した。マトリ
ックスを再び吸取紙上におき、試験する基質緩衝液５滴
（約２５０μｔ）を各マトリックスに加えた。２分後に
１−の洗液を加え各マトリックスの色の発生を肉眼検査
した。ＨＣＧを含む試験試料の発色が認められた。発色
に対応する吸光度を普通の分光光度計を用いて測定した
。結果を４５℃における培養日数と不合格理由と共に表
２に示している。
表 ２
ナトリウムボレイト ３ ３日後発色
なしナトリウムカーボネート ３．４．６．２０ ２
０日後発色僅かトリエタノールアミン ３．４．６，
２０ ２０日後粒子生成エタノールアミン ３．４．
６．２０ ２０日後粒子生成グリシン
３ ２０日後粒子生成フェノール
。 不溶性沈澱直ちに生成 ピペラジン ４ ４日以内に粒子生
成 ア、Ｆ ＝ ７ 。 ４日以
内に粒子生成 表２に示すとおりこれらの各緩衝剤は酵素を抑制するか
又はクロモーゲン沈澱を促進するかいづれかによυ不良
とわかった。フェノールとＣＨＥＳ中ＮＢＴは培養前年
溶性であった。（即ち０日であった。） 実施例２に記載の試験管アッセイにおいて０．１Ｍと１
．０ＭにおけるｐＨ９，６のトリス緩衝液’ｋｌ １．
４ｍＭ ＢＣＩＰと０．２４ｍＭＮＢＴ基質溶液中の１
．０Ｍジェタノールアミン（ｐＨ９，３）と０．１Ｍ
２Ａ２ＭＩＰ （ｐＨ９，８）と比較した。結果を表
３に示している。
なしナトリウムカーボネート ３．４．６．２０ ２
０日後発色僅かトリエタノールアミン ３．４．６，
２０ ２０日後粒子生成エタノールアミン ３．４．
６．２０ ２０日後粒子生成グリシン
３ ２０日後粒子生成フェノール
。 不溶性沈澱直ちに生成 ピペラジン ４ ４日以内に粒子生
成 ア、Ｆ ＝ ７ 。 ４日以
内に粒子生成 表２に示すとおりこれらの各緩衝剤は酵素を抑制するか
又はクロモーゲン沈澱を促進するかいづれかによυ不良
とわかった。フェノールとＣＨＥＳ中ＮＢＴは培養前年
溶性であった。（即ち０日であった。） 実施例２に記載の試験管アッセイにおいて０．１Ｍと１
．０ＭにおけるｐＨ９，６のトリス緩衝液’ｋｌ １．
４ｍＭ ＢＣＩＰと０．２４ｍＭＮＢＴ基質溶液中の１
．０Ｍジェタノールアミン（ｐＨ９，３）と０．１Ｍ
２Ａ２ＭＩＰ （ｐＨ９，８）と比較した。結果を表
３に示している。
表 ３
緩衝液 説 明
０．１Ｍトリス（ｐＨ９，６） 発色速度おそい（
ΔＡ３７５／分ＣＯ，１７）室温約７日後又は４５℃ ２４時間以内沈澱生成 １．０Ｍトリス（ｐＨ９，６） 発色速度良好（’
Ａ３７５／分＝０．３０）室温約３６後沈澱生成 ０．１Ｍジェタノールアミン 発色速度良好によい（Δ
Ａ３７５（ｐＨ９，３） ／分＝０．３
４）室温２４時間以内沈澱生成 ０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ 発色速度良好（ΔＡ３
７５／分＝（ｐＨ９，８） ０．３０
）室温で少なくも２ケ月安定、４５℃で約７日安定 表２において１．０Ｍト１，１スと１．０Ｍジェタノー
ルアミンは室温において２−３日で沈澱生成したため４
５℃で試験しなかった。
ΔＡ３７５／分ＣＯ，１７）室温約７日後又は４５℃ ２４時間以内沈澱生成 １．０Ｍトリス（ｐＨ９，６） 発色速度良好（’
Ａ３７５／分＝０．３０）室温約３６後沈澱生成 ０．１Ｍジェタノールアミン 発色速度良好によい（Δ
Ａ３７５（ｐＨ９，３） ／分＝０．３
４）室温２４時間以内沈澱生成 ０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ 発色速度良好（ΔＡ３
７５／分＝（ｐＨ９，８） ０．３０
）室温で少なくも２ケ月安定、４５℃で約７日安定 表２において１．０Ｍト１，１スと１．０Ｍジェタノー
ルアミンは室温において２−３日で沈澱生成したため４
５℃で試験しなかった。
したがって１．０ＭトＩＪス中で製造した基質は０．１
Ｍト！ｊス中でつくったものよシも容易に沈澱すると認
められた。
Ｍト！ｊス中でつくったものよシも容易に沈澱すると認
められた。
更に重要なことはこの実験で２Ａ２ＭＩＰは基質組成物
（クロモーゲン）の存在で効力と便利な貯蔵期間の両方
を示す唯一の緩衝剤であった。
（クロモーゲン）の存在で効力と便利な貯蔵期間の両方
を示す唯一の緩衝剤であった。
実施例 ５
他の一連の実験において２Ａ２ＭＩＰ中につくった基質
における発色速度がトリス中の同じ基質の発色速度に匹
敵した。各アッセイにおいて実施例２のとおり２０μｔ
の結合物を１．０−の基質組成物と混合し発色を吸光光
度計でしらべた。浴液は０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ （ｐ
Ｈ９，８）、１．４ｍＭＢ ＣＩ Ｐ、 ０．２４ ｍ
Ｍ ＮＢＴおよび１．ＯｍＭ ＭｇＣｌ４ ；と０、
Ｉ Ｍ ）リス（ｐ）Ｉ９．６）、１．４ｍＭ ＢＣＩ
Ｐ、０．２４ｍＭＮＢＴおよび５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２
であった。
における発色速度がトリス中の同じ基質の発色速度に匹
敵した。各アッセイにおいて実施例２のとおり２０μｔ
の結合物を１．０−の基質組成物と混合し発色を吸光光
度計でしらべた。浴液は０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ （ｐ
Ｈ９，８）、１．４ｍＭＢ ＣＩ Ｐ、 ０．２４ ｍ
Ｍ ＮＢＴおよび１．ＯｍＭ ＭｇＣｌ４ ；と０、
Ｉ Ｍ ）リス（ｐ）Ｉ９．６）、１．４ｍＭ ＢＣＩ
Ｐ、０．２４ｍＭＮＢＴおよび５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２
であった。
図１に示すとおり５７５ ｎｍにおける光学密度（０，
Ｄ、）対時間のプロットにおいて２Ａ２ＭＩＰの結果は
曲線Ａでまたトリスの結果は曲線Ｂで示されているが、
発色速度は２分後大体直線であると示されている。
Ｄ、）対時間のプロットにおいて２Ａ２ＭＩＰの結果は
曲線Ａでまたトリスの結果は曲線Ｂで示されているが、
発色速度は２分後大体直線であると示されている。
０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰについて式（１）を用いて０
、１ Ｍ ）リスについては 実施例 ６ 適当な色の強力信号と２Ａ２ＭＩＰにおける安定性増進
を与えるＢＣＩＰとＮＢＴの濃度をきめるため実験を行
なった。
、１ Ｍ ）リスについては 実施例 ６ 適当な色の強力信号と２Ａ２ＭＩＰにおける安定性増進
を与えるＢＣＩＰとＮＢＴの濃度をきめるため実験を行
なった。
この要求に適するＢＣＩＰとＮＢＴの濃度をきめるに１
、０ ｍＭ Ｍｇ Ｃ１２を含む０．１Ｍ ２Ａ２Ｍ
ＩＰ（ｐＨ９，８）中に９基質のマトリックスをつくっ
た。ＢＣＩＰＩＡ度は２ｈ３ ｍＭ、１．４ｍＭ又は１
．０ｍＭであった。またＮＥＴ濃度は０．２４ ｍＭ、
０．１０ｍＭ又は０．０５ｍＭであった。これらの基質
を実施例２による試験管アッセイおよび群Ａストレプト
コカスのアッセイによって試験した。試験管アッセイの
結果を表４にΔＡ３７５／分として示している。
、０ ｍＭ Ｍｇ Ｃ１２を含む０．１Ｍ ２Ａ２Ｍ
ＩＰ（ｐＨ９，８）中に９基質のマトリックスをつくっ
た。ＢＣＩＰＩＡ度は２ｈ３ ｍＭ、１．４ｍＭ又は１
．０ｍＭであった。またＮＥＴ濃度は０．２４ ｍＭ、
０．１０ｍＭ又は０．０５ｍＭであった。これらの基質
を実施例２による試験管アッセイおよび群Ａストレプト
コカスのアッセイによって試験した。試験管アッセイの
結果を表４にΔＡ３７５／分として示している。
表 ４
表４に対し比較基質緩衝液組成物（０，１Ｍ ） ＩＪ
ス（９，６）、５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１．４ｍＭＢ
ＣＩＰおよび０．２４ｍＭＮＢＴを含む）はΔＡ３７５
／分値０．１７４を示した。
ス（９，６）、５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１．４ｍＭＢ
ＣＩＰおよび０．２４ｍＭＮＢＴを含む）はΔＡ３７５
／分値０．１７４を示した。
を被覆したポリスチレン微粒子が結合しているマトリッ
クスにストレプトコツカルな抽出溶液（−当り５Ｘ１０
４細胞からの）３滴を加えた。次いでアルカリ性ホスフ
ァターゼが結合した兎抗一群Ａストレプトコッカス抗体
溶液３滴を加えた。マトリックスを洗い基質組成物を加
えると２分後に発色した。マトリックスを洗った後レフ
レフタンス測定機で色強度を測定した。結果を表５に示
しているが、低しフレクタンスは暗点を示し、またこれ
について比ｅ緩ｓ＝剤組成物（０，１Ｍ）リス（ｐＨ９
，６）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ４．１．４ｍＭＢＣＩＰお
よび０．２４ｍＭＮＢＴ：ｌはアッセイにおいてレフレ
フタンス３７．０を示した。
クスにストレプトコツカルな抽出溶液（−当り５Ｘ１０
４細胞からの）３滴を加えた。次いでアルカリ性ホスフ
ァターゼが結合した兎抗一群Ａストレプトコッカス抗体
溶液３滴を加えた。マトリックスを洗い基質組成物を加
えると２分後に発色した。マトリックスを洗った後レフ
レフタンス測定機で色強度を測定した。結果を表５に示
しているが、低しフレクタンスは暗点を示し、またこれ
について比ｅ緩ｓ＝剤組成物（０，１Ｍ）リス（ｐＨ９
，６）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ４．１．４ｍＭＢＣＩＰお
よび０．２４ｍＭＮＢＴ：ｌはアッセイにおいてレフレ
フタンス３７．０を示した。
」」−−し
表５に示すとおｆｉＮＢＴを０．０５ ｍＭに減少する
とマトリックス上の沈澱の色は紫から青に変った。レフ
レフタンス読みは僅かの差を認めただけであるが、青色
は匹敵するレフレフタンスをもつ素点の様に暗色である
と眼で認めなかった。３基質組成物は色の肉眼知覚と光
学レフレフタンス測定の両方で優秀な性能をもつと一貫
して選ばれた。これらは１．４ｍＭ ＢＣＩＰ、０．２
４ｍＭＮＢＴ；１．４ ｍＭＢ ＣＩ Ｐ、 ０．１０
ｍＭ ＮＢＴ ；および１．０ｍＭ ＢＣＩＰ。
とマトリックス上の沈澱の色は紫から青に変った。レフ
レフタンス読みは僅かの差を認めただけであるが、青色
は匹敵するレフレフタンスをもつ素点の様に暗色である
と眼で認めなかった。３基質組成物は色の肉眼知覚と光
学レフレフタンス測定の両方で優秀な性能をもつと一貫
して選ばれた。これらは１．４ｍＭ ＢＣＩＰ、０．２
４ｍＭＮＢＴ；１．４ ｍＭＢ ＣＩ Ｐ、 ０．１０
ｍＭ ＮＢＴ ；および１．０ｍＭ ＢＣＩＰ。
０．２４ｍＭＮＥＴ、であった。
実施例 ７
室温における長期間安定性の短時間表示をえるため基質
組成物を４５℃で培養した。
組成物を４５℃で培養した。
実施例４に記載したとおり、０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ
（ｐＨ９，８）、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ｐＨ９，８
中でつくシガラスびん中暗ＰＪ′ｒ４５℃で貯えた各基
質についてＨＣＧアッセイを行なった。
（ｐＨ９，８）、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ｐＨ９，８
中でつくシガラスびん中暗ＰＪ′ｒ４５℃で貯えた各基
質についてＨＣＧアッセイを行なった。
表６はＢＣＩＰ／ＮＥＴマトリックスから４５℃貯蔵に
よって基質中に沈澱が見えはじめた日数を示している。
よって基質中に沈澱が見えはじめた日数を示している。
表 ６
表６でわかるとおり０． Ｉ Ｍ Ｆリス、０．１Ｍ
２Ａ２ＭＩＰ。
２Ａ２ＭＩＰ。
および０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ中１．４ｍＭＢＣＩＰと
０．２４ｍＭ ＮＢＴｔ含む基質は４日間安定でいた。
０．２４ｍＭ ＮＢＴｔ含む基質は４日間安定でいた。
これらの同じ液にＭｇＣ１，’ｉ加えると１２日まで沈
澱が認められなかった。これによってＢＣＩＰとＮＢＴ
の濃度減少とＭｇＣ１２添加とによって沈澱生成をおく
らせうることがわかる。
澱が認められなかった。これによってＢＣＩＰとＮＢＴ
の濃度減少とＭｇＣ１２添加とによって沈澱生成をおく
らせうることがわかる。
実施例 ８
２Ａ２ＭＩＰ （ｐＫａ ９．３）を緩衝剤として使用
する最適条件をしらべた。
する最適条件をしらべた。
図２に示すとおり２Ａ２ＭＩＰ中に製造された基質の最
適ｐＨを定めた。基質を実施例２によって管アッセイ（
曲線Ａ）で、またルベラに対する高濃度抗体を含む高陽
性血ｆｌｔ（曲線Ｂ）と陰性試料（曲線Ｃ）を用いる）
ｂ＜５ビールスアツセイで試験した。０．１ Ｍ ）リ
ス（ｐＨ９，６）中につくった基質は対照として管アッ
セイにおいてＤｔ−１Ｂの様なルベラ高陽性アッセイに
おいてＥを、またルベラ陰性アッセイにおいてＦ’を含
んでいた。
適ｐＨを定めた。基質を実施例２によって管アッセイ（
曲線Ａ）で、またルベラに対する高濃度抗体を含む高陽
性血ｆｌｔ（曲線Ｂ）と陰性試料（曲線Ｃ）を用いる）
ｂ＜５ビールスアツセイで試験した。０．１ Ｍ ）リ
ス（ｐＨ９，６）中につくった基質は対照として管アッ
セイにおいてＤｔ−１Ｂの様なルベラ高陽性アッセイに
おいてＥを、またルベラ陰性アッセイにおいてＦ’を含
んでいた。
各組成物は１００１００ｍＭ２Ａ２中１．４ｍＭ ＢＣ
ＩＰ。
ＩＰ。
０．２４ｍＭＮＢＴ、および１．０ｍＭ ＭｇＣｈ’に
含んでいた。
含んでいた。
各溶液のｐＨを濃ＨＣＩを用い調節した。微粒子をと二
二ビールスで被覆し次いでルベラビールスに対する抗体
を含む人の血清にさらした後アルカリ性ホスファターゼ
結合兎抗−人間抗体にさらした。
二ビールスで被覆し次いでルベラビールスに対する抗体
を含む人の血清にさらした後アルカリ性ホスファターゼ
結合兎抗−人間抗体にさらした。
曲線ＡはちがったｐＨにおける２Ａ２ＭＩＰ中で緩衝さ
れた基質の試験管アッセイにおける発色速度を示してい
る。
れた基質の試験管アッセイにおける発色速度を示してい
る。
比較のため点りはトリス（０，１Ｍ、ｐＨ９，８，５０
ｍＭＭｇＣ１２含有）中緩衝された基質の発色速度を示
している。
ｍＭＭｇＣ１２含有）中緩衝された基質の発色速度を示
している。
各基質組成物をとゴ２アッセイを用いて分析した。、ｎ
ｐ＜２に対する高濃度抗体をもつ（高陽性）血清又はル
ベラに対する抗体に陰性な血清をマ） ＩＪソックスと
おした。このあと実施例４におけるとおり抗体に結合し
た抗−人間アルカリ性ホスファターゼによって処理した
。適当に洗い基質を加え２分間で発色した。水洗して過
剰の基質を除いて発色を停止しレフレフタンス読みとシ
によって色強度全測定した。曲線Ｂは高陽性試料によっ
て生じた信号を示しておシまた曲線Ｃは陰性試料によっ
て生じた信号を示している。
ｐ＜２に対する高濃度抗体をもつ（高陽性）血清又はル
ベラに対する抗体に陰性な血清をマ） ＩＪソックスと
おした。このあと実施例４におけるとおり抗体に結合し
た抗−人間アルカリ性ホスファターゼによって処理した
。適当に洗い基質を加え２分間で発色した。水洗して過
剰の基質を除いて発色を停止しレフレフタンス読みとシ
によって色強度全測定した。曲線Ｂは高陽性試料によっ
て生じた信号を示しておシまた曲線Ｃは陰性試料によっ
て生じた信号を示している。
点ＥとＦは０．１ Ｍ ）リス、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２
（ｐＨ９，６，１，４ｍＭ ＢＣＩＰ、０．２４ｍＭ
ＮＢＴ）中で緩衝された基質を用い生成した点のレフ
レフタンスを示している。
（ｐＨ９，６，１，４ｍＭ ＢＣＩＰ、０．２４ｍＭ
ＮＢＴ）中で緩衝された基質を用い生成した点のレフ
レフタンスを示している。
図２に示したとおり２Ａ２ＭＩＰで緩衝され九基質の最
適ｐＨは試験管アッセイことゴ２アッセイの双方におい
て０．１Ｍ溶液中で９．８であった。２Ａ２ＭＩＰ濃度
ｆ：１．０ Ｍに増しても追加信号は認められなかった
。
適ｐＨは試験管アッセイことゴ２アッセイの双方におい
て０．１Ｍ溶液中で９．８であった。２Ａ２ＭＩＰ濃度
ｆ：１．０ Ｍに増しても追加信号は認められなかった
。
本発明による基質組成物の成分はＢＣＩＰとＮＢＴのち
がった濃度において実施例２による試験管アッセイ（基
質１、０ ＋ｉ／結合物２０μｔ）で試験されている。
がった濃度において実施例２による試験管アッセイ（基
質１、０ ＋ｉ／結合物２０μｔ）で試験されている。
表７は０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ（ｐＨ９，８）、１．
０ｍＭＭｇＣ１２および０．２４ｍＭ ＮＢＴ中の徨
々の濃度のＢＣＩＰについての結果を示している。
０ｍＭＭｇＣ１２および０．２４ｍＭ ＮＢＴ中の徨
々の濃度のＢＣＩＰについての結果を示している。
表 ７
ＢＣＩＰ濃度 ΔＡ３７５／分１、Ｏ
ｍＭ Ｏ，１９２ ２，５ｍＭ Ｏ，２４４ ５，０ｍＭ Ｏ，２０９ １０，０ｍＭ Ｏ，０９８ 表８は０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ（ｐＨ９，８）、１．
０ｍＭＭｇＣ１！、および１３ｍＭＢｃＩＰ中の種々の
濃度のＮＢＴに対する結果をあられしている。
ｍＭ Ｏ，１９２ ２，５ｍＭ Ｏ，２４４ ５，０ｍＭ Ｏ，２０９ １０，０ｍＭ Ｏ，０９８ 表８は０．１Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ（ｐＨ９，８）、１．
０ｍＭＭｇＣ１！、および１３ｍＭＢｃＩＰ中の種々の
濃度のＮＢＴに対する結果をあられしている。
表 ８
ＢＣＩＰａ度 ΔＡ３７５／分０．０５
ｍＭ Ｏ，２６７ ０，１０ｍＭ Ｏ，３６０ ０，２５ｍＭ Ｏ，３８２ ０，５０ｒｎＭ ０．３４０ 表７に示すとおシ１．０乃至１０ｍＭ濃度のＢＣＩＰが
適当であることがわかった。表８に示すとおりＮＢＴ濃
度０．０５乃至０．５ｍＭも適当であるとわかった。２
Ａ２ＭＩＰはこれら実施例で０．１Ｍと１．０ Ｍにお
いてのみ使われたが、この緩衝剤は他の濃度においても
十分作用する。
ｍＭ Ｏ，２６７ ０，１０ｍＭ Ｏ，３６０ ０，２５ｍＭ Ｏ，３８２ ０，５０ｒｎＭ ０．３４０ 表７に示すとおシ１．０乃至１０ｍＭ濃度のＢＣＩＰが
適当であることがわかった。表８に示すとおりＮＢＴ濃
度０．０５乃至０．５ｍＭも適当であるとわかった。２
Ａ２ＭＩＰはこれら実施例で０．１Ｍと１．０ Ｍにお
いてのみ使われたが、この緩衝剤は他の濃度においても
十分作用する。
上記表１の条件のもとてその実験と平行して２Ａ２ＭＩ
Ｐの最適ｐＨ範囲をしらべて表９の結果をえた。
Ｐの最適ｐＨ範囲をしらべて表９の結果をえた。
表 ９
’Ａ３７５／分
ｐＨＯ，ＩＭ ２Ａ２ＭＩＰ
９．０ 測定せず９．２０．１
１４ ９．４ ０．１５２９．６
０．１８０９．８
０．２２１１０．０ ０．２
００表９に報告した結果に基づいて本発明の２Ａ２ＭＩ
Ｐ基質組成物は９．７乃至９．９のｐＨ範囲内に調節す
るとよい。
１４ ９．４ ０．１５２９．６
０．１８０９．８
０．２２１１０．０ ０．２
００表９に報告した結果に基づいて本発明の２Ａ２ＭＩ
Ｐ基質組成物は９．７乃至９．９のｐＨ範囲内に調節す
るとよい。
基質溶液中のマグネシウムの役割は決定されない。マグ
ネシウム塩は高ｐＨにおいて非常に溶解度小さく、ｐＨ
１０，３において約１．４ ｍＭである。微量（１０乃
至１０１０００ｐのマグネシウム添加はこれらの基質に
よって出る信号に影響をもたなかった。しかし１ｍＭ
Ｍｇ０１２の添加は基質が４５℃の高温とされたときク
ロモーゲン沈澱を抑制する０組成物の重要な問題は基質
の安定性である。２Ａ２ＭＩＰへの変更は安定性を増す
が、実施例７に報告された高温度研究ではＢＣＩＰとＮ
ＢＴの濃度減少が安定性増加を示している。したがって
現在では本発明による基質組成物にＢＣＩＰ １．２
ｍＭとＮＢＴ Ｏ，１７ｍＭの濃度の使用が好ましい
。
ネシウム塩は高ｐＨにおいて非常に溶解度小さく、ｐＨ
１０，３において約１．４ ｍＭである。微量（１０乃
至１０１０００ｐのマグネシウム添加はこれらの基質に
よって出る信号に影響をもたなかった。しかし１ｍＭ
Ｍｇ０１２の添加は基質が４５℃の高温とされたときク
ロモーゲン沈澱を抑制する０組成物の重要な問題は基質
の安定性である。２Ａ２ＭＩＰへの変更は安定性を増す
が、実施例７に報告された高温度研究ではＢＣＩＰとＮ
ＢＴの濃度減少が安定性増加を示している。したがって
現在では本発明による基質組成物にＢＣＩＰ １．２
ｍＭとＮＢＴ Ｏ，１７ｍＭの濃度の使用が好ましい
。
上記結果に基づいて本発明による好ましいアルカリ性ホ
スファターゼ基質組成物は１００ｍＭ ２Ａ２ＭＩＰ
（ｐＨ９，８）；１．２ｍＭ ＢＣＩＰ；０．１７ｍＭ
ＮＢＴ； １．ＯｍＭｍｇｃ１４ ；および０．０２
％ナトリウム アザイドを含む。
スファターゼ基質組成物は１００ｍＭ ２Ａ２ＭＩＰ
（ｐＨ９，８）；１．２ｍＭ ＢＣＩＰ；０．１７ｍＭ
ＮＢＴ； １．ＯｍＭｍｇｃ１４ ；および０．０２
％ナトリウム アザイドを含む。
１ｔの溶液に対し１４０岬ＮＢＴを約４７５ｍの蒸留水
と混合し暗所で３０分間攪拌し溶液Ａとする。次に撹拌
中の蒸留水４５０−に１０−が２Ａ２ＭＩＰを加え少な
くも５分間混合して溶液Ｂとする。溶液Ｂに５２０１９
のＢＣＩＰを加え暗所で少なくも２０分間撹拌する。溶
液ＢのｐＨを６．０ＮＨＣ１でｐＨ９，８（９，７乃至
９．９）に調節する。溶液ＡとＢをしづかに混合攪拌す
る。１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２水溶液１ｒＩＬｔ’に混合
物に加えた後２００■のナトリウムアザイトを加え固体
がすべてとけるまで攪拌する。水を加えて全容を１ｔと
し、０．２μｍナルゲンフィルターで濾過し２−８℃の
暗所に貯える。この基質製造でＮＢＴの ０．ＩＭ２Ａ
２ＭＩＰに不溶な問題を避けるため２Ａ２ＭＩＰを加え
る前蒸留水にとかす必要がある。
と混合し暗所で３０分間攪拌し溶液Ａとする。次に撹拌
中の蒸留水４５０−に１０−が２Ａ２ＭＩＰを加え少な
くも５分間混合して溶液Ｂとする。溶液Ｂに５２０１９
のＢＣＩＰを加え暗所で少なくも２０分間撹拌する。溶
液ＢのｐＨを６．０ＮＨＣ１でｐＨ９，８（９，７乃至
９．９）に調節する。溶液ＡとＢをしづかに混合攪拌す
る。１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２水溶液１ｒＩＬｔ’に混合
物に加えた後２００■のナトリウムアザイトを加え固体
がすべてとけるまで攪拌する。水を加えて全容を１ｔと
し、０．２μｍナルゲンフィルターで濾過し２−８℃の
暗所に貯える。この基質製造でＮＢＴの ０．ＩＭ２Ａ
２ＭＩＰに不溶な問題を避けるため２Ａ２ＭＩＰを加え
る前蒸留水にとかす必要がある。
実施例 ９
実施例８の再調製したアルカリ性ホスファターゼ基質溶
液の安定性を試験した。基質容液を大気温、２−８℃、
３７℃および４５℃で貯えた。表１０に示した日数貯蔵
後の試料を実施例４のＨＣＧアッセイによって検べた。
液の安定性を試験した。基質容液を大気温、２−８℃、
３７℃および４５℃で貯えた。表１０に示した日数貯蔵
後の試料を実施例４のＨＣＧアッセイによって検べた。
表１０
７ ２−８ ３ １００ １００ １００ 問
題なし７ 大気温 ３ １００ １００ １００１３
２−８ ３ １００ １００ １００ 問題
なし１３ 大気温 ３ Ｚｏｏ １００ １００
日 温度 Ｒｅｐｓ ０ ５０ ２５０
備 考―■−―■■■−喝鴫■■−一 −画一一
−−画一−−−画一一、 １．、．１．、、．１
１、．１１．。
題なし７ 大気温 ３ １００ １００ １００１３
２−８ ３ １００ １００ １００ 問題
なし１３ 大気温 ３ Ｚｏｏ １００ １００
日 温度 Ｒｅｐｓ ０ ５０ ２５０
備 考―■−―■■■−喝鴫■■−一 −画一一
−−画一−−−画一一、 １．、．１．、、．１
１、．１１．。
１９ ２−８ ３ １００ １００ １００ ３７と４
５の７１９ 大気温 ３ １００ １００ １００
）リックス上に１９ ３７ ３ １００ １
００ １００ 数斑点、４５℃１９ ４５ ３
１００ １００ １００ びん内に数斑点２１
２−８ ３ １００ １００ １００ ３７と４
５は他の２１ 大気温 ３ １００ １００ １００
２試料よシ少し２１ ３７ ３ １００ １０
０ １００ 明るく斑点２〜２１ ４５ ３
１００ １００ １００ ３あった２８ ２−８ ．
３ １００ １００ １００ ３７と４５は信号２８
大気温 ３ １００ １００ １００ 少なく斑
点がみ２８ ３７ ３ １００ １００ １００
られた３５ ２−８ ３ １００ ０１
００ 上の２８日と同じ３５ 大気温 ３
１００ ０１００ 高温はどマトリック３５
３７ ３ １００ ０１００ ス上とびん中
に沈澱３５ ４５ ３ １００ ０
１００ がより多く認められた４７ ２−８ ３
１００ ０１００ 上記と同じ４７ 大気温 ３
１００ ０１００４７ ４５ ３ Ｚ
ｏｏ ０１００日 温度 Ｒｅｐｓ Ｏ５
０２５０備 考７２ ２−８ ３ １００ ３
３ １００ 上の２８日と同じ高７２ 大気温
３ １００ ３３ １００ 温はどマトリック
ス７２ ３７ ３ １００ ０１０
０ 上とひス淵升ｑ尤源い；７２ ４５ ３
１００ ０１００ よシ多く認められた７７
２−８ ３ １００ １００ １００ ４
５と３７マトリツク７７ 大気温 ３ １００ １
００ １００ スは“きたない洗濯７７ ３７
３ １００ １００ １００ 吻状１であるが非７
７ ４５ ３ １００ １００ １００ 常に
効力がある９０ ２−８ ３ １００ １００ １
００ 上記に同じ９０ 大気温 ３ １００ １０
０ １００９８ ２−８ ３ １００ Ｚｏｏ
１００ 上記と同じ９８ 大気温 ３ １００
１００ １００１０７ ２−８ ３ １００ １０
０ １００ 上記と同じ１０７ 大気温 ３ １０
０ １００ １００日 温度 Ｒａｐｓ Ｏ５０
２５０備 考１１１ ２−８ ３ １００ １００
１００ ３７と４５は少し曇１１１ 大気温 ３
１００ １００ １００ り９徒る、２−８１１１
３７ ３ １００ １００ １００ と大気
温は優秀に１１１ ４５ ３ １００ １００ １
００ みえた実施例 １０ 本発明による２Ａ２ＭＩＰで緩衝された基質生成物とト
リスで緩衝された基質生成物との分光測光比較を図３に
示している。
５の７１９ 大気温 ３ １００ １００ １００
）リックス上に１９ ３７ ３ １００ １
００ １００ 数斑点、４５℃１９ ４５ ３
１００ １００ １００ びん内に数斑点２１
２−８ ３ １００ １００ １００ ３７と４
５は他の２１ 大気温 ３ １００ １００ １００
２試料よシ少し２１ ３７ ３ １００ １０
０ １００ 明るく斑点２〜２１ ４５ ３
１００ １００ １００ ３あった２８ ２−８ ．
３ １００ １００ １００ ３７と４５は信号２８
大気温 ３ １００ １００ １００ 少なく斑
点がみ２８ ３７ ３ １００ １００ １００
られた３５ ２−８ ３ １００ ０１
００ 上の２８日と同じ３５ 大気温 ３
１００ ０１００ 高温はどマトリック３５
３７ ３ １００ ０１００ ス上とびん中
に沈澱３５ ４５ ３ １００ ０
１００ がより多く認められた４７ ２−８ ３
１００ ０１００ 上記と同じ４７ 大気温 ３
１００ ０１００４７ ４５ ３ Ｚ
ｏｏ ０１００日 温度 Ｒｅｐｓ Ｏ５
０２５０備 考７２ ２−８ ３ １００ ３
３ １００ 上の２８日と同じ高７２ 大気温
３ １００ ３３ １００ 温はどマトリック
ス７２ ３７ ３ １００ ０１０
０ 上とひス淵升ｑ尤源い；７２ ４５ ３
１００ ０１００ よシ多く認められた７７
２−８ ３ １００ １００ １００ ４
５と３７マトリツク７７ 大気温 ３ １００ １
００ １００ スは“きたない洗濯７７ ３７
３ １００ １００ １００ 吻状１であるが非７
７ ４５ ３ １００ １００ １００ 常に
効力がある９０ ２−８ ３ １００ １００ １
００ 上記に同じ９０ 大気温 ３ １００ １０
０ １００９８ ２−８ ３ １００ Ｚｏｏ
１００ 上記と同じ９８ 大気温 ３ １００
１００ １００１０７ ２−８ ３ １００ １０
０ １００ 上記と同じ１０７ 大気温 ３ １０
０ １００ １００日 温度 Ｒａｐｓ Ｏ５０
２５０備 考１１１ ２−８ ３ １００ １００
１００ ３７と４５は少し曇１１１ 大気温 ３
１００ １００ １００ り９徒る、２−８１１１
３７ ３ １００ １００ １００ と大気
温は優秀に１１１ ４５ ３ １００ １００ １
００ みえた実施例 １０ 本発明による２Ａ２ＭＩＰで緩衝された基質生成物とト
リスで緩衝された基質生成物との分光測光比較を図３に
示している。
図３に基質とアルカリ性ホスファターゼの反応による生
成物の吸収スペクトルをあられしている。線Ａは１．２
ｍＭＢＣＩＰと０．１７ｍＭ ＮＢＴ’ｊｚ含む０．１
Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ（ｐＨ９，６）水溶液と１． Ｏｍ
Ｍ Ｍｇ Ｃｌ ｚ中につくられた基質の結果をあられ
している。線Ｔは１．４ｍＭＢＣＩＰと０．２４ｍＭＮ
ＢＴｔ含む０．１ Ｍ ）リス（ｐＨ９，６）と５０ｍ
Ｍ ＭｇＣ１ｚ中につくられた基質の結果を示している
０図３の結果が示すとおシ両組成物の生成物は本質的に
同じである。
成物の吸収スペクトルをあられしている。線Ａは１．２
ｍＭＢＣＩＰと０．１７ｍＭ ＮＢＴ’ｊｚ含む０．１
Ｍ ２Ａ２ＭＩＰ（ｐＨ９，６）水溶液と１． Ｏｍ
Ｍ Ｍｇ Ｃｌ ｚ中につくられた基質の結果をあられ
している。線Ｔは１．４ｍＭＢＣＩＰと０．２４ｍＭＮ
ＢＴｔ含む０．１ Ｍ ）リス（ｐＨ９，６）と５０ｍ
Ｍ ＭｇＣ１ｚ中につくられた基質の結果を示している
０図３の結果が示すとおシ両組成物の生成物は本質的に
同じである。
実施例 １１
本発明は固相アッセイにも使用できる。固相アッセイの
１例は実施例４に記載した程類であるが標準尿試料の代
りに未知試料を用いるＨＣＧのアッセイである。このア
ッセイの粒子はＨＣＧに特定の抗体で被覆されておシガ
ラス繊維マトリックスにとらえられる。患者からの尿試
料はマトリックスをとおされる。尿中にＨＣＧがあれば
ＨＣＧはＨＣＧに特定の抗体と結合する。
１例は実施例４に記載した程類であるが標準尿試料の代
りに未知試料を用いるＨＣＧのアッセイである。このア
ッセイの粒子はＨＣＧに特定の抗体で被覆されておシガ
ラス繊維マトリックスにとらえられる。患者からの尿試
料はマトリックスをとおされる。尿中にＨＣＧがあれば
ＨＣＧはＨＣＧに特定の抗体と結合する。
ＨＣＧに特定な第２抗体はアルカリ性ホスファターゼに
共役する。第２抗体溶液をマトリックスにとおすことに
よって第２抗体はそこにあるＨＣＧと結合する。
共役する。第２抗体溶液をマトリックスにとおすことに
よって第２抗体はそこにあるＨＣＧと結合する。
マ） ＩＪラックス洗い本発明による基質組成物と共に
培養した後マトリックスから過剰基質を洗浄して反応を
中止させる。
培養した後マトリックスから過剰基質を洗浄して反応を
中止させる。
ＨＣＧの存在でＨＣＧに結合したアルカリ性フォスファ
ターゼと共役した抗体は基質組成物と反応して暗緑黒点
を生ずる。ＨＣＧがなければ共役した抗体は洗い流され
て点を生成しない。
ターゼと共役した抗体は基質組成物と反応して暗緑黒点
を生ずる。ＨＣＧがなければ共役した抗体は洗い流され
て点を生成しない。
実施例 １２
本発明による基質組成物は血液試料中の抗体の存在を検
べるための酵素結合したインミュノンーペントアツセイ
に使用できる。このアッセイで特定抗ｙＡはニトロセル
ロース上につけられる。ニトロセルロースは患者試料と
培養され次いで人の抗体に対するアルカリ性ホスファタ
ーゼと共役した抗体と培養される。つづいて本発明によ
る基質組成物とニトロセルロースの培養は、試料中につ
けた抗原に特定の抗体があれば、青黒色点を生成する。
べるための酵素結合したインミュノンーペントアツセイ
に使用できる。このアッセイで特定抗ｙＡはニトロセル
ロース上につけられる。ニトロセルロースは患者試料と
培養され次いで人の抗体に対するアルカリ性ホスファタ
ーゼと共役した抗体と培養される。つづいて本発明によ
る基質組成物とニトロセルロースの培養は、試料中につ
けた抗原に特定の抗体があれば、青黒色点を生成する。
この抗体がなければ点はできない。
実施例 １３
本発明による基質組成物はウェスターンプロットアッセ
イに使用できる。この種のアッセイの蛋白質は電気泳動
性ケルカラニトロセルロースに移される。ニトロセルロ
ースをアルカリ性ホスファターゼと共役した特定蛋白質
に対する抗体と培養した後本発明による基質組成物と培
養することによって特定蛋白質についてしらべることか
できる。
イに使用できる。この種のアッセイの蛋白質は電気泳動
性ケルカラニトロセルロースに移される。ニトロセルロ
ースをアルカリ性ホスファターゼと共役した特定蛋白質
に対する抗体と培養した後本発明による基質組成物と培
養することによって特定蛋白質についてしらべることか
できる。
蛋白質があれば共役抗体はそれと結合してアルカリ性ホ
スファターゼと基質の反応生成物は蛋白質の位置に沈澱
する。
スファターゼと基質の反応生成物は蛋白質の位置に沈澱
する。
本発明による緩衝されたホスファターゼ基質は２目的：
第１の安定性増進と第２の信号又は信号対ノイズ比率の
向上を達成する。２Ａ２ＭＩＰの信号対ノイズ比率のト
リスよりも向上することは実施例５の試験管アッセイの
より高い信号と実施例８のルベラアッセイのより強い色
によって示されている。
第１の安定性増進と第２の信号又は信号対ノイズ比率の
向上を達成する。２Ａ２ＭＩＰの信号対ノイズ比率のト
リスよりも向上することは実施例５の試験管アッセイの
より高い信号と実施例８のルベラアッセイのより強い色
によって示されている。
トリスから微量のＭｇ＋＋ を使う２Ａ２ＭＩＰへの変
更は組成物安定性を向上している。更に２Ａ２ＭＩＰ中
につくられた基質は試験管アッセイにおいてより大きな
ΔＡ／分値とアッセイにおいて少なくもトリスで緩衝さ
れて基質に匹敵する信号をもっていた。
更は組成物安定性を向上している。更に２Ａ２ＭＩＰ中
につくられた基質は試験管アッセイにおいてより大きな
ΔＡ／分値とアッセイにおいて少なくもトリスで緩衝さ
れて基質に匹敵する信号をもっていた。
本発明を好ましい実施態様について記述しているが、修
正法や改良法は当業界の技術者に考えられるものである
。
正法や改良法は当業界の技術者に考えられるものである
。
例えばＢＣＩＰが好ましい実施態様に使われているが、
Ｋ３Ｆｅ （ＣＮ）ｓの様な適当な酸化剤が供給される
ならばインドリルホスフェートを含む他のインジゴコゲ
ナーが本発明に使用できると期待される。′！！た他の
テトラゾリウム塩も本発明に使用できると期待され、事
実テトラニトロ青テトラゾリウムは実施例４のＨＣＧア
ッセイに指示薬として便利に着色点を生ずることが認め
られた。したがって本発明の特許請求範囲は本発明の範
囲内にはいる様なすべての同様な変更法を包含するもの
と考える。
Ｋ３Ｆｅ （ＣＮ）ｓの様な適当な酸化剤が供給される
ならばインドリルホスフェートを含む他のインジゴコゲ
ナーが本発明に使用できると期待される。′！！た他の
テトラゾリウム塩も本発明に使用できると期待され、事
実テトラニトロ青テトラゾリウムは実施例４のＨＣＧア
ッセイに指示薬として便利に着色点を生ずることが認め
られた。したがって本発明の特許請求範囲は本発明の範
囲内にはいる様なすべての同様な変更法を包含するもの
と考える。
図１は２Ａ２ＭＩＰ緩衝液又はトリス緩衝液のいづれか
中で示された様なアルカリ性ホスファターゼアッセイに
おける基質色生成速度の図である。 図２は２Ａ２ＭＩＰ緩衝液中亀々のｐＨにおけるアッセ
イ結果の図である。 図３は２Ａ２ＭＩＰ緩衝液又はトリス緩衝液のいづれか
における基質とアルカリ性ホスファターゼの反応によシ
生成された生成物の吸収スペクトル図である。 特許出願人 アボット ラボラトリーズーー′−１＼ １ト、・ 代理人 弁理士 蒼藤武彦’：：’；ｌ ’ 、、。
中で示された様なアルカリ性ホスファターゼアッセイに
おける基質色生成速度の図である。 図２は２Ａ２ＭＩＰ緩衝液中亀々のｐＨにおけるアッセ
イ結果の図である。 図３は２Ａ２ＭＩＰ緩衝液又はトリス緩衝液のいづれか
における基質とアルカリ性ホスファターゼの反応によシ
生成された生成物の吸収スペクトル図である。 特許出願人 アボット ラボラトリーズーー′−１＼ １ト、・ 代理人 弁理士 蒼藤武彦’：：’；ｌ ’ 、、。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ホスフェート化したインジゴゴゲナー、上記インジ
ゴコゲナーと反応して検出しうる信号を与えるに有効な
濃度のテトラゾリウム塩および反応を促進するｐＨ範囲
内の水溶液中上記インジゴコゲナーと上記テトラゾリウ
ム塩の反応を緩衝するに有効な濃度をもつ２−アミノ−
２−メチル−１−プロパノールより成ることを特徴とす
るアルカリ性ホスフアターゼアツセイ用の基質組成物。 ２、上記ホスフェート化したインジゴコゲナーが５−プ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートである
特許請求の範囲第１項に記載の基質組成物。 ３、上記５−プロモ−４−クロロ−３−インドリルホス
フェートが約１．０乃至約１０ｍＭの濃度である特許請
求の範囲第２項に記載の基質組成物。 ４、上記テトラゾリウム塩がニトロ青テトラゾリウムで
ある特許請求の範囲第１項に記載の基質組成物。 ５、上記ニトロ青テトラゾリウムが約０．０５乃至約０
．５ｍＭの濃度である特許請求の範囲第４項に記載の基
質組成物。 ６、上記２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールが
約０．１乃至約１．０Ｍの濃度である特許請求の範囲第
１項に記載の基質組成物。 ７、濃度約１．０乃至約１０ｍＭをもつ５−プロモ−４
−クロロ−３−インドリルホスフェート；濃度約０．０
５乃至約０．５ｍＭをもつニトロ青テトラゾリウム；お
よび濃度約０．１乃至約１．０Ｍをもつ２−アミノ−２
−メチル−１−プロパノールより成ることを特徴とする
特許請求の範囲第１項に記載の基質組成物。 ８、更に約１．０ｍＭの濃度のＭｇＣｌ＿２を含む特許
請求の範囲第７項に記載の基質組成物。 ９、上記５−プロモ−４−クロロ−３−インドリルホス
フェートが濃度１．２ｍＭであり、上記ニトロ青テトラ
ゾリウムが濃度０．１７ｍＭであり、かつ上記２−アミ
ノ−２−メチル−１−プロパノールが濃度１００ｍＭで
ある特許請求の範囲第８項に記載の基質組成物。 １０、更に濃度０．０２％のナトリウムアザイドを含む
特許請求の範囲第９項に記載の基質組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/817,090 US4748115A (en) | 1986-01-08 | 1986-01-08 | Substrate formulation in 2-amino-2-methyl-1-propanol buffer for alkaline phosphatase assays |
| US817090 | 1986-01-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62166899A true JPS62166899A (ja) | 1987-07-23 |
| JPH0695958B2 JPH0695958B2 (ja) | 1994-11-30 |
Family
ID=25222331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61306696A Expired - Lifetime JPH0695958B2 (ja) | 1986-01-08 | 1986-12-24 | アルカリ性ホスフアタ−ゼアツセイ用２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ−ル緩衝液中の基質組成物 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4748115A (ja) |
| EP (1) | EP0228663B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0695958B2 (ja) |
| AT (1) | ATE79411T1 (ja) |
| AU (1) | AU595570B2 (ja) |
| CA (1) | CA1293677C (ja) |
| DE (1) | DE3686409T2 (ja) |
| ES (1) | ES2005545A6 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021510832A (ja) * | 2018-01-09 | 2021-04-30 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． | 生体試料中の分析物および／またはタンパク質を測定するための方法 |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5443958A (en) * | 1987-08-14 | 1995-08-22 | Director-General, National Institute Of Animal Industry | 2-acrylamine-2-methyl-1-propanesulfonic acid enhancement of alkaline phosphatase label detection |
| US4956302A (en) * | 1987-09-11 | 1990-09-11 | Abbott Laboratories | Lateral flow chromatographic binding assay device |
| US4892817A (en) * | 1987-09-21 | 1990-01-09 | Biogenex Laboratories | Stable phosphatase substrate composition |
| IL85018A0 (en) * | 1988-01-03 | 1988-06-30 | Orgenics Ltd | Stable chromogenic substrate mixture of indoxyl phosphate and tetrazolium salt,method of making and using same in biological and diagnostic assays |
| US5137804A (en) * | 1988-05-10 | 1992-08-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assay device and immunoassay |
| US5374524A (en) * | 1988-05-10 | 1994-12-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Solution sandwich hybridization, capture and detection of amplified nucleic acids |
| US5208143A (en) * | 1988-11-17 | 1993-05-04 | Becton, Dickinson And Company | Immunoassay on a preblocked solid surface |
| US5135847A (en) * | 1988-11-18 | 1992-08-04 | Becton, Dickinson And Company | Substrate composition for alkaline phosphatase and method for assay using same |
| CA2023850A1 (en) * | 1989-09-28 | 1991-03-29 | Randal A. Hoke | Stabilizing reagent for membrane immunoassay |
| KR910014706A (ko) * | 1990-01-10 | 1991-08-31 | 원본미기재 | 세척이 필요없는 개량된 이뮤노어세이(immunoassay)장치 |
| DE69328182T2 (de) * | 1992-07-02 | 2000-09-28 | Roche Diagnostics Corp., Indianapolis | Reagenz stabilisiert durch zweiwertige metallsalze |
| DE69327242T2 (de) * | 1992-07-02 | 2000-05-25 | Roche Diagnostics Corp., Indianapolis | Stabilisierung von tetrazoliumsalzen in einem reagenz |
| DE19639538A1 (de) * | 1996-09-26 | 1998-04-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Enzymatisches Verfahren zum Nachweis der Erhitzungsbehandlung von Milch |
| ES2143934B1 (es) * | 1998-01-23 | 2000-12-16 | Univ Oviedo | Cuantificacion amperometrica y voltamperometrica de azul de indigo para la determinacion de hidrolasas y desarrollo de biosensores. |
| DE19830478A1 (de) * | 1998-07-08 | 2000-01-13 | Friedrich Schiller Uni Jena Bu | Verfahren zum Nachweis von alkalischer Phosphatase und Phosphatasekonjugaten |
| US6099892A (en) * | 1998-10-01 | 2000-08-08 | Pumpkin Ltd. | Protective coating for decorative vegetable material |
| JP4336886B2 (ja) * | 2001-09-28 | 2009-09-30 | アークレイ株式会社 | テトラゾリウム化合物の保存方法、それに用いる安定化剤、および前記方法を用いたテトラゾリウム化合物試薬溶液 |
| DE60226066T2 (de) * | 2001-10-11 | 2009-05-14 | Arkray, Inc. | Natriumazid verwendendes messverfahren |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4030995A (en) * | 1976-07-13 | 1977-06-21 | Sigma Chemical Company | Alkaline phosphatase isoenzyme determination |
| US4563417A (en) * | 1984-08-31 | 1986-01-07 | Miles Laboratories, Inc. | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes |
-
1986
- 1986-01-08 US US06/817,090 patent/US4748115A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-18 AT AT86117629T patent/ATE79411T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-18 DE DE8686117629T patent/DE3686409T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-18 EP EP86117629A patent/EP0228663B1/en not_active Expired
- 1986-12-24 JP JP61306696A patent/JPH0695958B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-01-05 ES ES8700017A patent/ES2005545A6/es not_active Expired
- 1987-01-05 AU AU67133/87A patent/AU595570B2/en not_active Ceased
- 1987-01-07 CA CA000526888A patent/CA1293677C/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021510832A (ja) * | 2018-01-09 | 2021-04-30 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． | 生体試料中の分析物および／またはタンパク質を測定するための方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4748115A (en) | 1988-05-31 |
| AU6713387A (en) | 1987-07-09 |
| EP0228663A3 (en) | 1988-06-01 |
| CA1293677C (en) | 1991-12-31 |
| DE3686409D1 (de) | 1992-09-17 |
| DE3686409T2 (de) | 1993-02-18 |
| ES2005545A6 (es) | 1989-03-16 |
| EP0228663B1 (en) | 1992-08-12 |
| ATE79411T1 (de) | 1992-08-15 |
| JPH0695958B2 (ja) | 1994-11-30 |
| AU595570B2 (en) | 1990-04-05 |
| EP0228663A2 (en) | 1987-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS62166899A (ja) | アルカリ性ホスフアタ−ゼアツセイ用２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ−ル緩衝液中の基質組成物 | |
| US4931385A (en) | Enzyme immunoassays and immunologic reagents | |
| US4886761A (en) | Polysilicon binding assay support and methods | |
| US4503143A (en) | Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen | |
| US4487830A (en) | Enzyme/immunofluorescent assay for autoantibodies | |
| US4578361A (en) | Creatinine antibody | |
| JPS61292060A (ja) | 分析素子 | |
| McCoy Jr et al. | Enzyme-linked lectin assay (ELLA): II. Detection of carbohydrate groups on the surface of unfixed cells | |
| US4543325A (en) | Process and reagent for the determination of creatinine | |
| RU2102759C1 (ru) | Способ обнаружения или количественного определения аналита в образце | |
| EP0537830B1 (en) | Test kit and method for the detection of microorganisms associated with periodontal diseases using surfactant mixture as extraction composition | |
| CN120254254A (zh) | 一种人唾液胃蛋白酶荧光免疫层析试纸条及其制备方法 | |
| US5902727A (en) | Method for localization and quantitation of a substance in a biological sample | |
| JPH03251764A (ja) | 緩衝化洗浄組成物および試験キットならびに使用方法 | |
| CN117110603A (zh) | 联合检测抗mcv抗体、抗ccp抗体和rf的荧光免疫层析试纸条 | |
| JPS60205367A (ja) | 抗‐エプスタイン‐バールビールス抗体の酵素‐免疫螢光試験法 | |
| JP2001511820A (ja) | サイクロスポリン誘導体およびその使用 | |
| EP0210863A1 (en) | Immunoassay | |
| WO1990010232A1 (en) | Composition containing labeled streptococcal antibody, test kit and assay using same | |
| CN117147828B (en) | Diluent for drug fluorescence detection and preparation method and application thereof | |
| JP2577431B2 (ja) | 前立腺酸性ホスフアターゼの測定方法 | |
| JP2002082117A (ja) | 検査キット | |
| CN120703070A (zh) | 血管性血友病因子裂解酶13活性检测试剂盒及其制备和应用 | |
| JPS61249399A (ja) | ミクロペルオキシダーゼを用いる尿酸診断アッセイ | |
| CN117147828A (zh) | 一种用于毒品荧光检测的稀释液及其制备方法和应用 |