JPS62208300A - 淋菌を検出するためのヌクレオチド配列組成物および方法，並びに遺伝上明確な群に対し特異的なヌクレオチド配列のスクリ−ニング方法 - Google Patents
淋菌を検出するためのヌクレオチド配列組成物および方法，並びに遺伝上明確な群に対し特異的なヌクレオチド配列のスクリ−ニング方法Info
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- JPS62208300A JPS62208300A JP62016328A JP1632887A JPS62208300A JP S62208300 A JPS62208300 A JP S62208300A JP 62016328 A JP62016328 A JP 62016328A JP 1632887 A JP1632887 A JP 1632887A JP S62208300 A JPS62208300 A JP S62208300A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は特異的な個々のヌクレオチド配列に関し、さら
に詳細には本発明は下記する淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ）に特異的な個々のヌクレ
オチド配列からなる組成物に関し、すなわち本発明の組
成物は淋菌染色体ＤＮＡおよびしたがって淋菌を検出す
るのに使用することができる。
に詳細には本発明は下記する淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ）に特異的な個々のヌクレ
オチド配列からなる組成物に関し、すなわち本発明の組
成物は淋菌染色体ＤＮＡおよびしたがって淋菌を検出す
るのに使用することができる。
人間において健康上の主問題として報告されている最も
多い細菌病の１ ｆｔである淋菌の永続性は多くの淋菌
検出方法の開発をもたらした。
多い細菌病の１ ｆｔである淋菌の永続性は多くの淋菌
検出方法の開発をもたらした。
淋菌感染を測定するための現在認められている方法は、
主として培養技術に基づくものである。典型的な培養技
術は、ジョージャ州アトランタ在の病気管理センターに
より出版された「淋病の診断に対する基準および技術」
と言う論文に記載された方法を包含する。この培養法に
おいては、たとえば尿道試料または頚管試料などの試料
を許容しうる培地（たとえばタイヤ−マーチン培地）に
載せる。これら培養物を３７℃にて５％二酸化炭素雰囲
気中で２４〜４８時間培養する。次いで、培養プレート
を淋菌コロニーの出現につき検査する。疑がわしいコロ
ニーをダラム染色して、オキシダーゼ活性につき試験す
る。一般に、男性における淋菌感染のｌｉｔ定的診断は
、タイヤ−マーチン培地上で培養した際にダラム陰性の
コーヒー豆状の双球菌のオキシダーゼ陽性コロニーを示
す尿道培養物を得ることによって決定される。女性の場
合、淋菌感染は、頚管培養物をタイヤ−マーチン培地上
で検査し、ダラム陰性双球菌のオキシダーゼ陽性コロニ
ーが出現することにより診断される。
主として培養技術に基づくものである。典型的な培養技
術は、ジョージャ州アトランタ在の病気管理センターに
より出版された「淋病の診断に対する基準および技術」
と言う論文に記載された方法を包含する。この培養法に
おいては、たとえば尿道試料または頚管試料などの試料
を許容しうる培地（たとえばタイヤ−マーチン培地）に
載せる。これら培養物を３７℃にて５％二酸化炭素雰囲
気中で２４〜４８時間培養する。次いで、培養プレート
を淋菌コロニーの出現につき検査する。疑がわしいコロ
ニーをダラム染色して、オキシダーゼ活性につき試験す
る。一般に、男性における淋菌感染のｌｉｔ定的診断は
、タイヤ−マーチン培地上で培養した際にダラム陰性の
コーヒー豆状の双球菌のオキシダーゼ陽性コロニーを示
す尿道培養物を得ることによって決定される。女性の場
合、淋菌感染は、頚管培養物をタイヤ−マーチン培地上
で検査し、ダラム陰性双球菌のオキシダーゼ陽性コロニ
ーが出現することにより診断される。
淋菌の推定的に同定されたコロニーから得られる微生物
は、しばしば糖発酵、螢光性抗体染色または共凝集によ
って確認される。しかしながら、この種の培養法は労力
を要しかつ時間がかかり、一般に「生細胞」の検出に制
限される。
は、しばしば糖発酵、螢光性抗体染色または共凝集によ
って確認される。しかしながら、この種の培養法は労力
を要しかつ時間がかかり、一般に「生細胞」の検出に制
限される。
培養法を利用する場合、試料は成る場所で採取されて一
般に他の場所に位置する実験室まで運ばれ、ここで微生
物を培養しかつ同定する。したがって、これらの培養法
は、〜結果が得られるまでに数日間を要する。さらに、
これら培養法から得られる結果は、細菌の保存、運搬お
よび培養に対するかなり正確な条件にしたがわなければ
不正確となる。
般に他の場所に位置する実験室まで運ばれ、ここで微生
物を培養しかつ同定する。したがって、これらの培養法
は、〜結果が得られるまでに数日間を要する。さらに、
これら培養法から得られる結果は、細菌の保存、運搬お
よび培養に対するかなり正確な条件にしたがわなければ
不正確となる。
たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡのような標的遺伝子材料
を検出しかつ同定する手段としては、核酸ハイブリッド
化分析が使用されている。核酸ハイブリッド化分析は、
標的遺伝子材料が特定のヌクレオチド配列を有すると言
う事実を前提とする４、検出されるのは、このヌクレオ
チド配列である。この種の検出および同定は特異的遺伝
子或いはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列またはその点突然変
異もしくは欠失に対するものである。この種の分析を行
なうには多数の技術が存在する〔メソッズ・イン・エン
チモロジー、第６８巻、Ｒ，Ｗｕ （ｔＩＭ） 、第３
７９−４６９頁（１９７９）；およびＡ、Ｒ，シュンお
よびＪ。
を検出しかつ同定する手段としては、核酸ハイブリッド
化分析が使用されている。核酸ハイブリッド化分析は、
標的遺伝子材料が特定のヌクレオチド配列を有すると言
う事実を前提とする４、検出されるのは、このヌクレオ
チド配列である。この種の検出および同定は特異的遺伝
子或いはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列またはその点突然変
異もしくは欠失に対するものである。この種の分析を行
なうには多数の技術が存在する〔メソッズ・イン・エン
チモロジー、第６８巻、Ｒ，Ｗｕ （ｔＩＭ） 、第３
７９−４６９頁（１９７９）；およびＡ、Ｒ，シュンお
よびＪ。
サムプルツク、メソッズ・イン・エンチモロジー、第６
５巻、第１部、第４６８−４７８頁（１９８０））。最
も広く使用されている方法の１つはサウザンプロット・
フィルタ・ハイブリッド化法と呼ばれる（Ｅ、サウザン
、ジャーナル・モレキエラ・バイオロジー、第９８巻、
第５０３頁（１９７５））。この方法は、一般にＤＮＡ
断片の混合物から電気泳動技術によって分離された特定
のＤＮＡ断片を同定するのに用いられる。この方法は一
般に、ＤＮＡの試料を成る種の微生物から分離すること
により行なわれる０分離したＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼ切断にかけ、かつゲル（アガロース、アクリルア
ミドなど）にて電気泳動にかける。分離されたＤＮＡ断
片を含有するゲルを適当なマトリックス（たとえばニト
ロセルロース濾紙またばジアゾ化した紙などの適当なマ
トリックス）。
５巻、第１部、第４６８−４７８頁（１９８０））。最
も広く使用されている方法の１つはサウザンプロット・
フィルタ・ハイブリッド化法と呼ばれる（Ｅ、サウザン
、ジャーナル・モレキエラ・バイオロジー、第９８巻、
第５０３頁（１９７５））。この方法は、一般にＤＮＡ
断片の混合物から電気泳動技術によって分離された特定
のＤＮＡ断片を同定するのに用いられる。この方法は一
般に、ＤＮＡの試料を成る種の微生物から分離すること
により行なわれる０分離したＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼ切断にかけ、かつゲル（アガロース、アクリルア
ミドなど）にて電気泳動にかける。分離されたＤＮＡ断
片を含有するゲルを適当なマトリックス（たとえばニト
ロセルロース濾紙またばジアゾ化した紙などの適当なマ
トリックス）。
に吸い取らせると、これら断片がマトリックスまで移動
して結合する。次いで、ＤＮＡ断片を含有するマトリッ
クスを加熱してＤＮＡを変性させる。この時点で、マト
リックスを変性標識ポリヌクレオチドプローブを含有す
る溶液で処理し、かつハイブリッド化を生ぜしめる。標
識されたポリヌクレオチドプローブは、検出することが
望ましいＤＮＡ断片に対し相補的であり、かつ検出可能
なマーカを結合しているヌクレオチド配列である。この
検出可能なマーカにより、検出することが望ましいＤＮ
Ａ断片に対しポリヌクレオチドプローブがハイブリッド
化したことを確認することができる。検出可能なマーカ
によってポリヌクレオチドプローブを標識する多くの技
術が知られている。たとえば、ヨーロッパ特許出願公開
第００６３８７３号および第００９７３７３号公報を参
照することができ、これらの開示を参考のためここに引
用する。次いで、ハイブリッド化されなかった標識ポリ
ヌクレオチドプローブを、検出することが望ましいＤＮ
Ａ断片に対しハイブリッド化した標識ポリヌクレオチド
プローブから分離する。この分離は一般に洗浄によって
行なわれる。ＤＮＡプローブの検出可能なマーカを次い
で検出する。
して結合する。次いで、ＤＮＡ断片を含有するマトリッ
クスを加熱してＤＮＡを変性させる。この時点で、マト
リックスを変性標識ポリヌクレオチドプローブを含有す
る溶液で処理し、かつハイブリッド化を生ぜしめる。標
識されたポリヌクレオチドプローブは、検出することが
望ましいＤＮＡ断片に対し相補的であり、かつ検出可能
なマーカを結合しているヌクレオチド配列である。この
検出可能なマーカにより、検出することが望ましいＤＮ
Ａ断片に対しポリヌクレオチドプローブがハイブリッド
化したことを確認することができる。検出可能なマーカ
によってポリヌクレオチドプローブを標識する多くの技
術が知られている。たとえば、ヨーロッパ特許出願公開
第００６３８７３号および第００９７３７３号公報を参
照することができ、これらの開示を参考のためここに引
用する。次いで、ハイブリッド化されなかった標識ポリ
ヌクレオチドプローブを、検出することが望ましいＤＮ
Ａ断片に対しハイブリッド化した標識ポリヌクレオチド
プローブから分離する。この分離は一般に洗浄によって
行なわれる。ＤＮＡプローブの検出可能なマーカを次い
で検出する。
淋菌を検出するには、ポリヌクレオチドプローブを得る
ことが有益である。淋菌の暗号プラスミドから誘導され
たヌクレオチド配列をポリヌクレオチドプローブとして
利用することにより淋菌を検出している。しかしながら
、この種のポリヌクレオチドプローブは、せいぜいプラ
スミドＤＮＡを含有するような種類の淋菌しか検出する
ことができない。淋菌菌株の約４０〜約９６％がその配
置に応じてプラスミドＤＮＡを含有すると思われる。こ
の種のポリヌクレオチドプローブはプラスミドＤＮＡを
含有するような種類の淋菌しか検出しえないので、この
種のポリヌクレオチドプローブは国際的に用途が制限さ
れている〔たとえば、［尿道炎を有するヒトにおける淋
菌検出のためのＤＮＡハイブリッド化技術」、ジャーナ
ル・インフェクチャス・ディシーズ、第１４８巻、第３
号、第４６２−４７１頁、１９８３年９月参照〕。した
がって、淋菌染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化しうる
ようなヌクレオチド配列をポリヌクレオチドプローブと
して利用するのが好適である。
ことが有益である。淋菌の暗号プラスミドから誘導され
たヌクレオチド配列をポリヌクレオチドプローブとして
利用することにより淋菌を検出している。しかしながら
、この種のポリヌクレオチドプローブは、せいぜいプラ
スミドＤＮＡを含有するような種類の淋菌しか検出する
ことができない。淋菌菌株の約４０〜約９６％がその配
置に応じてプラスミドＤＮＡを含有すると思われる。こ
の種のポリヌクレオチドプローブはプラスミドＤＮＡを
含有するような種類の淋菌しか検出しえないので、この
種のポリヌクレオチドプローブは国際的に用途が制限さ
れている〔たとえば、［尿道炎を有するヒトにおける淋
菌検出のためのＤＮＡハイブリッド化技術」、ジャーナ
ル・インフェクチャス・ディシーズ、第１４８巻、第３
号、第４６２−４７１頁、１９８３年９月参照〕。した
がって、淋菌染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化しうる
ようなヌクレオチド配列をポリヌクレオチドプローブと
して利用するのが好適である。
淋菌と髄膜炎菌（これら両者は尤イセリア属の種類であ
る）の染色体ＤＮＡには極めて高度のＤＮＡ同族性が存
在する。淋菌の成る菌株とＷｊＪ膜炎菌の成る菌株とは
約８０〜約９３％程度の染色体ＤＮＡ同族性を有すると
報告されている〔「ナイセリア属のデオキシリボ核酸同
族性」ジャーナル・オプ・バクテリオロジー、第９４巻
、第４号、１９６７年１０月、第８７０−８７４頁、並
びに「ナイセリアの分類学；デオキシリボ核酸塩基組成
、相互特異性形質転換、およびデオキシリボ核酸ハイブ
リッド化」、インターナショナル・ジャーナル・オブ・
システマテインク・バクテリオロジー、第３２巻、第１
号、１９８２年１月、第５７−６６頁〕。これは、特に
７０％程度に低いＤＮＡ同族性を有する微生物が同じサ
ブスペシース内に存在しうると言う事実に鑑み、極めて
高レベルのＤＮＡ同族性である〔バーシース・マニュア
ル・オブ・システマテインク・バクテリオロジー、第１
巻、第１１頁、ウィリアムおよびウイルキンスにより出
版（１９８４））。
る）の染色体ＤＮＡには極めて高度のＤＮＡ同族性が存
在する。淋菌の成る菌株とＷｊＪ膜炎菌の成る菌株とは
約８０〜約９３％程度の染色体ＤＮＡ同族性を有すると
報告されている〔「ナイセリア属のデオキシリボ核酸同
族性」ジャーナル・オプ・バクテリオロジー、第９４巻
、第４号、１９６７年１０月、第８７０−８７４頁、並
びに「ナイセリアの分類学；デオキシリボ核酸塩基組成
、相互特異性形質転換、およびデオキシリボ核酸ハイブ
リッド化」、インターナショナル・ジャーナル・オブ・
システマテインク・バクテリオロジー、第３２巻、第１
号、１９８２年１月、第５７−６６頁〕。これは、特に
７０％程度に低いＤＮＡ同族性を有する微生物が同じサ
ブスペシース内に存在しうると言う事実に鑑み、極めて
高レベルのＤＮＡ同族性である〔バーシース・マニュア
ル・オブ・システマテインク・バクテリオロジー、第１
巻、第１１頁、ウィリアムおよびウイルキンスにより出
版（１９８４））。
ざらに、それよりずっと高度のＤＮＡ同族性が成る種の
淋菌と多くの種類の髄膜炎菌の全体との間に存在すると
思われる。これは、髄膜炎菌の各菌株における染色体Ｄ
ＮＡに対し同族性である淋菌ゲノムの部分が同一でない
ことに基づいている。したがって、存在したとしても極
く低い割合の淋菌ゲノムが多くの種類の髄膜炎菌の全体
に対し非同族性である。他の技術的問題は、多くの種類
の髄膜炎菌全体に対し非同族性である淋菌染色体ＤＮＡ
の部分が個々のヌクレオチド配列として存在せずに、淋
菌ゲノム全体に分散した極く僅かのヌクレオチドのヌク
レオチド配列として存在することである。本発明の目的
で、「（ＩＩ々のヌクレオチド配列」は約１２個以上の
ヌクレオチドよりなるヌクレオチド配列である。
淋菌と多くの種類の髄膜炎菌の全体との間に存在すると
思われる。これは、髄膜炎菌の各菌株における染色体Ｄ
ＮＡに対し同族性である淋菌ゲノムの部分が同一でない
ことに基づいている。したがって、存在したとしても極
く低い割合の淋菌ゲノムが多くの種類の髄膜炎菌の全体
に対し非同族性である。他の技術的問題は、多くの種類
の髄膜炎菌全体に対し非同族性である淋菌染色体ＤＮＡ
の部分が個々のヌクレオチド配列として存在せずに、淋
菌ゲノム全体に分散した極く僅かのヌクレオチドのヌク
レオチド配列として存在することである。本発明の目的
で、「（ＩＩ々のヌクレオチド配列」は約１２個以上の
ヌクレオチドよりなるヌクレオチド配列である。
さらに、淋菌の個々のヌクレオチド配列が存在してこの
配列がこれから誘導された淋菌の菌株に対し特異性とな
って、この配列をポリヌクレオチドプローブとして使用
することができるとしても、これは他の淋菌の菌株につ
いても特異性であることが肝要である。さもないと、淋
菌暗号プラスミドから誘導されるポリヌクレオチドプロ
ーブの場合と同様に、この種のヌクレオチド配列自身も
極めて用途が制限されるであろう。
配列がこれから誘導された淋菌の菌株に対し特異性とな
って、この配列をポリヌクレオチドプローブとして使用
することができるとしても、これは他の淋菌の菌株につ
いても特異性であることが肝要である。さもないと、淋
菌暗号プラスミドから誘導されるポリヌクレオチドプロ
ーブの場合と同様に、この種のヌクレオチド配列自身も
極めて用途が制限されるであろう。
淋菌および髄膜炎菌の全ゆる菌株のゲノムはそれぞれ約
３，０００，０００１［［のヌクレオチドであることに
注目すべきである。当業者は、１ケ月当り約２，０００
ＩＩＩのヌクレオチドを配列決定することができる。
３，０００，０００１［［のヌクレオチドであることに
注目すべきである。当業者は、１ケ月当り約２，０００
ＩＩＩのヌクレオチドを配列決定することができる。
したがって、成る種の淋菌および成る種の髄膜炎菌のゲ
ノムを配列決定するには３．０００人の技術者で１ケ月
を要する。
ノムを配列決定するには３．０００人の技術者で１ケ月
を要する。
したがって、本発明の目的は、下記するような淋菌染色
体ＤＮＡに対し特異性である個々のヌクレオチド配列か
らなる組成物を提供するにある。
体ＤＮＡに対し特異性である個々のヌクレオチド配列か
らなる組成物を提供するにある。
さらに本発明の目的は、遺伝学上異なる群に対し特異的
な個々のヌクレオチド配列の取得方法を提供するにある
。
な個々のヌクレオチド配列の取得方法を提供するにある
。
上記目的を達成するため本発明は、少なくとも１種の個
々のヌクレオチド配列を含む淋菌に対し特異的な物質の
組成物において、次の６種の淋菌： １）ＡＴＣＣ５３４２０ ２）ＡＴＣＣ５３４２１ ３）ＡＴＣＣ５３４２２ ４）ＡＴＣＣ５３４２３ ５）ＡＴＣＣ５３４２４ ６）ＡＴＣＣ５３４２５ の精製染色体ＤＮＡにハイブリッド化された前記組成物
の平均量を前記６種の淋菌の精製染色体ＤＮＡの等量に
基準化した最低値と、次の６種の髄膜炎菌： １）ＡＴＣＣ５３４１４ ２）ＡＴＣＣ５３４１５ ３）ＡＴＣＣ５３４１６ ４）ＡＴＣＣ５３４１７ ５）ＡＴＣＣ５３４１８ ６）ＡＴＣＣ５３４１９ の精製染色体ＤＮＡにハイブリッド化した前記組成物の
平均量を前記６種の髄膜炎菌の精製染色体ＤＮＡの等量
に基準化した最高値との比が、約５より大であることを
特徴とする、淋菌に特異的な物質の組成物を提供する。
々のヌクレオチド配列を含む淋菌に対し特異的な物質の
組成物において、次の６種の淋菌： １）ＡＴＣＣ５３４２０ ２）ＡＴＣＣ５３４２１ ３）ＡＴＣＣ５３４２２ ４）ＡＴＣＣ５３４２３ ５）ＡＴＣＣ５３４２４ ６）ＡＴＣＣ５３４２５ の精製染色体ＤＮＡにハイブリッド化された前記組成物
の平均量を前記６種の淋菌の精製染色体ＤＮＡの等量に
基準化した最低値と、次の６種の髄膜炎菌： １）ＡＴＣＣ５３４１４ ２）ＡＴＣＣ５３４１５ ３）ＡＴＣＣ５３４１６ ４）ＡＴＣＣ５３４１７ ５）ＡＴＣＣ５３４１８ ６）ＡＴＣＣ５３４１９ の精製染色体ＤＮＡにハイブリッド化した前記組成物の
平均量を前記６種の髄膜炎菌の精製染色体ＤＮＡの等量
に基準化した最高値との比が、約５より大であることを
特徴とする、淋菌に特異的な物質の組成物を提供する。
さらに本発明は遺伝上明確な群に対し特異的なヌクレオ
チド配列をスクリーニングするに際し、 ａ、スクリーニングすべきヌクレオチド配列の各試料に
つき別々の試験ドツトをマトリックス上に形成し、各試
験ドツトは前記試験試料の１つから得られる一本鎖型の
精製ＤＮＡを含み、 ｂ、前記試験ドツトをハイブリッド化条件下で前記ヌク
レオチド配列と接触させ、前記ヌクレオチド配列はバク
テリオファージＤＮＡに ・おける−重鎖ヌクレオチ
ド配列挿入体であり、前記バクテリオファージはそのラ
イフサイクル中に一本鎖ＤＮＡ段階を有するバクテリオ
ファージであり、 Ｃ３前記試験ドツトにハイブリッド１ヒ゛シなかったヌ
クレオチド配列を前記試験ドツトにハイブリッド化した
ヌクレオチド配列から分離し、ｄ、前記試験ドツトをハ
イブリッド化条件下で前記バクテリオファージの変性二
重鎖ＤＮＡと接触させ、前記バクテリオファージの前記
変性二重鎖ＤＮＡはこれに結合した検出可能なマーカを
有し、 ｅ、前記試験ドツトにハイブリッド化したバクテリオフ
ァージの二１ｉｌＤＮＡを前記試験ドソトにハイブリッ
ド化しなかったバクテリオファージの二重鎖ＤＮＡから
分離し、かっｆ、ヌクレオチド配列を前記検出可能なマ
ーカによって検出する ことを特徴とするヌクレオチド配列のスクリーニング方
法をも提供する。
チド配列をスクリーニングするに際し、 ａ、スクリーニングすべきヌクレオチド配列の各試料に
つき別々の試験ドツトをマトリックス上に形成し、各試
験ドツトは前記試験試料の１つから得られる一本鎖型の
精製ＤＮＡを含み、 ｂ、前記試験ドツトをハイブリッド化条件下で前記ヌク
レオチド配列と接触させ、前記ヌクレオチド配列はバク
テリオファージＤＮＡに ・おける−重鎖ヌクレオチ
ド配列挿入体であり、前記バクテリオファージはそのラ
イフサイクル中に一本鎖ＤＮＡ段階を有するバクテリオ
ファージであり、 Ｃ３前記試験ドツトにハイブリッド１ヒ゛シなかったヌ
クレオチド配列を前記試験ドツトにハイブリッド化した
ヌクレオチド配列から分離し、ｄ、前記試験ドツトをハ
イブリッド化条件下で前記バクテリオファージの変性二
重鎖ＤＮＡと接触させ、前記バクテリオファージの前記
変性二重鎖ＤＮＡはこれに結合した検出可能なマーカを
有し、 ｅ、前記試験ドツトにハイブリッド化したバクテリオフ
ァージの二１ｉｌＤＮＡを前記試験ドソトにハイブリッ
ド化しなかったバクテリオファージの二重鎖ＤＮＡから
分離し、かっｆ、ヌクレオチド配列を前記検出可能なマ
ーカによって検出する ことを特徴とするヌクレオチド配列のスクリーニング方
法をも提供する。
下記する淋菌染色体ＤＮＡに対し特異性である本発明の
組成物における個々のヌクレオチド配列を同定する方法
は、はぼ全ゆるスクリーニング技術によって行なうこと
ができる。従来、この種の技術は一般的にコロニーハイ
ブリッド化と呼ばれているＣＭ、グルンスタイン等、「
コロニーハイブリッド化；特異性遺伝子を含有するクロ
ーン化ＤＮＡの単離方法」、プロシ−ディング・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第７２巻、第３
９６１頁（１９７５） ）。
組成物における個々のヌクレオチド配列を同定する方法
は、はぼ全ゆるスクリーニング技術によって行なうこと
ができる。従来、この種の技術は一般的にコロニーハイ
ブリッド化と呼ばれているＣＭ、グルンスタイン等、「
コロニーハイブリッド化；特異性遺伝子を含有するクロ
ーン化ＤＮＡの単離方法」、プロシ−ディング・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第７２巻、第３
９６１頁（１９７５） ）。
この種の他の技術は一般にプラークハイブリッド化と呼
ばれている〔ベントン等、「その場での単一プラークに
対するハイブリッド化にょるλｇｔ組換クローンのスク
リーニング」、サイエンス、第１９６巻、第ｉｓｏ頁（
１９７７）ｉウー、「組換ファージのための鋭敏かつ迅
速なスクリーニング方法」、メソッズ・イン・エンチモ
ロジー、第６８巻、第３８９頁（１９７９）ｉおよびウ
ー等、「オバルプミン遺伝子：天然遺伝子のクローン化
」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス、第７５巻、第３６８８頁（１９７８））
。さらに、スクリーニング技術を詳細に開示している優
れた文献は、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−により出版されたマニアチス等の「モレキュラ・
クローニング」である。
ばれている〔ベントン等、「その場での単一プラークに
対するハイブリッド化にょるλｇｔ組換クローンのスク
リーニング」、サイエンス、第１９６巻、第ｉｓｏ頁（
１９７７）ｉウー、「組換ファージのための鋭敏かつ迅
速なスクリーニング方法」、メソッズ・イン・エンチモ
ロジー、第６８巻、第３８９頁（１９７９）ｉおよびウ
ー等、「オバルプミン遺伝子：天然遺伝子のクローン化
」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス、第７５巻、第３６８８頁（１９７８））
。さらに、スクリーニング技術を詳細に開示している優
れた文献は、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−により出版されたマニアチス等の「モレキュラ・
クローニング」である。
本発明の方法は次の工程を使用する：
Ａ、プラスミドを含まない淋菌染色体ＤＮＡのｎ製およ
び切断。
び切断。
Ｂ８組換分子の形成。
ｃ、組換分子の形質転換。
Ｄ、宿主細胞のスクリーニング。
Ｅ０組換分子の増殖。
Ｆ、スクリーニング過程。
Ｇ１組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ドツト複合体
の検出。
の検出。
Ｈ，淋菌染色体ＤＮＡに対し特異性である個々のヌクレ
オチド配列を含有する組換バクテリオファージの同定。
オチド配列を含有する組換バクテリオファージの同定。
これらの工程のそれぞれは次のように行なうことができ
る： 淋菌染色体ＤＮＡに対し特異的な個々のヌクレオチド配
列をｆｌＬｌａＩするには、染色体ＤＮＡを細胞の残部
から分離せねばならない。これは、任意の淋菌の菌株を
採取し、これを適当な寒天培地（たとえば、タイヤ−マ
ーチンもしくはチョコレート寒天）に載せかつこの菌株
を５％ＣＯ□を含有する雰囲気内で培養して増殖させる
ことにより行なうことができる。約１６〜１８時間増殖
させた後、菌体を試験管中に集め、かつこれら菌体を溶
菌剤（たとえば洗剤）で溶菌させる。好適洗剤はドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、この結果、細胞残
骸から精製しろるように淋菌染色体ＤＮＡを得ることが
できる。
る： 淋菌染色体ＤＮＡに対し特異的な個々のヌクレオチド配
列をｆｌＬｌａＩするには、染色体ＤＮＡを細胞の残部
から分離せねばならない。これは、任意の淋菌の菌株を
採取し、これを適当な寒天培地（たとえば、タイヤ−マ
ーチンもしくはチョコレート寒天）に載せかつこの菌株
を５％ＣＯ□を含有する雰囲気内で培養して増殖させる
ことにより行なうことができる。約１６〜１８時間増殖
させた後、菌体を試験管中に集め、かつこれら菌体を溶
菌剤（たとえば洗剤）で溶菌させる。好適洗剤はドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、この結果、細胞残
骸から精製しろるように淋菌染色体ＤＮＡを得ることが
できる。
次いで、淋菌染色体ＤＮＡをその細胞残骸からネ青製す
る。これはたとえばフェノール抽出に続いてアルコール
沈澱させかつ遠心分離して塩化セシウム−臭化エチジウ
ム密度勾配にて平衡化させるような標準技術によって行
なうことができる。
る。これはたとえばフェノール抽出に続いてアルコール
沈澱させかつ遠心分離して塩化セシウム−臭化エチジウ
ム密度勾配にて平衡化させるような標準技術によって行
なうことができる。
使用する淋菌の菌株は、暗号プラスミドを含めいかなる
プラスミドをも含有しないことが好ましい。プラスミド
を含有する淋菌の菌株を使用する場合は、先ず最初にこ
のプラスミドを除去し、次いで淋菌染色体ＤＮＡを単離
することが必須である。プラスミドの除去は、塩化セシ
ウム−臭化エチジウム密度勾配または蔗糖密度勾配にお
ける遠心分離平衡化によって、或いはアガロースゲル電
気泳動によって行なうことができる。
プラスミドをも含有しないことが好ましい。プラスミド
を含有する淋菌の菌株を使用する場合は、先ず最初にこ
のプラスミドを除去し、次いで淋菌染色体ＤＮＡを単離
することが必須である。プラスミドの除去は、塩化セシ
ウム−臭化エチジウム密度勾配または蔗糖密度勾配にお
ける遠心分離平衡化によって、或いはアガロースゲル電
気泳動によって行なうことができる。
次いで、精製されたプラスミドを含まない淋閑染色体Ｄ
ＮＡを分解して断片にする。これは、淋菌染色体ＤＮＡ
を切断しうる任意の制限酵素を用いて行なうことができ
る。この目的で使用しうる適する制限酵素はＭｂｏ Ｉ
、Ｔａｑ ＩおよびＨｉ ｎ ｄ Ｉ［［を包含する。
ＮＡを分解して断片にする。これは、淋菌染色体ＤＮＡ
を切断しうる任意の制限酵素を用いて行なうことができ
る。この目的で使用しうる適する制限酵素はＭｂｏ Ｉ
、Ｔａｑ ＩおよびＨｉ ｎ ｄ Ｉ［［を包含する。
しかしながら、たとえばＭｂｏｌのように４種の塩基の
みを識別する酵素を使用するのが好適である。４種の塩
基のみを識別する酵素を使用するのが好適である理由は
、より少ない塩基対を含有するＤＮＡ断片が得られるか
らである。淋菌染色体ＤＮＡと髄膜炎菌ＤＮＡとの間の
高度の同族性に鑑み、ＤＮＡ断片が小さい程、このＤＮ
ＡｌＦｒ片はｆｆＪｌ膜炎菌に対しハイブリッド化しう
るヌクレオチド配列を含有する程度が低くなる。理論的
に、Ｍｂｏｌ切断は平均して約２５６塩基対を含有する
ＤＮＡ断片を生成する。これらＤＮＡ断片は約１２（［
１よりなるヌクレオチドより大きいことが必須であるこ
とに注目すべきである。約１２個より少ないヌクレオチ
ドを含有するＤＮＡ断片は、所定の生物に対し特異性と
なるには充分な複雑性を持たなくなる。
みを識別する酵素を使用するのが好適である。４種の塩
基のみを識別する酵素を使用するのが好適である理由は
、より少ない塩基対を含有するＤＮＡ断片が得られるか
らである。淋菌染色体ＤＮＡと髄膜炎菌ＤＮＡとの間の
高度の同族性に鑑み、ＤＮＡ断片が小さい程、このＤＮ
ＡｌＦｒ片はｆｆＪｌ膜炎菌に対しハイブリッド化しう
るヌクレオチド配列を含有する程度が低くなる。理論的
に、Ｍｂｏｌ切断は平均して約２５６塩基対を含有する
ＤＮＡ断片を生成する。これらＤＮＡ断片は約１２（［
１よりなるヌクレオチドより大きいことが必須であるこ
とに注目すべきである。約１２個より少ないヌクレオチ
ドを含有するＤＮＡ断片は、所定の生物に対し特異性と
なるには充分な複雑性を持たなくなる。
下記するように）杏当なベクター中へのクローン化に対
し切断が充分に進行したかどうかを証明するため、アガ
ロースゲル電気泳動技術を用いてＤＮＡ断片の寸法を測
定することができる。
し切断が充分に進行したかどうかを証明するため、アガ
ロースゲル電気泳動技術を用いてＤＮＡ断片の寸法を測
定することができる。
Ｂ１組換分子の生成
淋菌染色体ＤＮＡ断片のそれぞれを次いでベクター中へ
挿入して、組換分子を形成させることができる。本発明
のスクリーニング法には、ベクターとしてバクテリオフ
ァージＤＮＡを使用しかつさらにライフサイクルにて一
本鎖ＤＮＡ段階を有するようなバクテリオファージを使
用することが必須である。
挿入して、組換分子を形成させることができる。本発明
のスクリーニング法には、ベクターとしてバクテリオフ
ァージＤＮＡを使用しかつさらにライフサイクルにて一
本鎖ＤＮＡ段階を有するようなバクテリオファージを使
用することが必須である。
バクテリオファージは、このバクテリオファージで感染
した細菌の増殖に際しバクテリオファージが細菌から排
出されると言う利点を与える。すなわち、バクテリオフ
ァージを宿主細菌から容易に精製することができる。精
製り、ＮＡは、ＤＮＡを効率的に標識しかつＤＮＡをそ
の標的ＤＮＡへ効果的にハイブリッド化させるのに必須
である。さらに、未精１１ＤＮＡ中に存在する細胞残骸
は非特異性結合を生せしめる。非特異性結合は誤信号を
もたらす。さらに、バクテリオファージは細菌から排出
されるので、必然的にバクテリオファージは細菌から自
然に精製され、さもなければこれは極めて時間のかかる
ものとなる。
した細菌の増殖に際しバクテリオファージが細菌から排
出されると言う利点を与える。すなわち、バクテリオフ
ァージを宿主細菌から容易に精製することができる。精
製り、ＮＡは、ＤＮＡを効率的に標識しかつＤＮＡをそ
の標的ＤＮＡへ効果的にハイブリッド化させるのに必須
である。さらに、未精１１ＤＮＡ中に存在する細胞残骸
は非特異性結合を生せしめる。非特異性結合は誤信号を
もたらす。さらに、バクテリオファージは細菌から排出
されるので、必然的にバクテリオファージは細菌から自
然に精製され、さもなければこれは極めて時間のかかる
ものとなる。
ライフサイクルに一本鎖ＤＮＡ段階を有するバクテリオ
ファージを使用すれば、−重鎖ＤＮＡとのハイブリッド
化はこの種のＤＮＡが標的ＤＮＡに対してでなくそれ自
体で融合すると言う可能性を排除する利点が得られる。
ファージを使用すれば、−重鎖ＤＮＡとのハイブリッド
化はこの種のＤＮＡが標的ＤＮＡに対してでなくそれ自
体で融合すると言う可能性を排除する利点が得られる。
すなわち、より大きい割合の一本鎖ｔ）ＮＡが標的ＤＮ
Ａにハイブリッド化して、感受性を増大させることがで
きる。適するバクテリオファージはｆ１バクテリオファ
ージ、ｆｄバクテリオファージ。
Ａにハイブリッド化して、感受性を増大させることがで
きる。適するバクテリオファージはｆ１バクテリオファ
ージ、ｆｄバクテリオファージ。
Ｍ１３バクテリオファージおよびそれらの誘導体、たと
えばＭ１３バクテリオファージのｍｐシリーズを包含す
る。
えばＭ１３バクテリオファージのｍｐシリーズを包含す
る。
組換分子を作成するため、円形である二重鎖複製型（Ｒ
Ｆ）のバクテリオファージＤＮＡを線状化させる。これ
は、適当な制限酵素で行なわれる。制限酵素の選択は、
淋菌染色体ＤＮＡ断片を線状化されたＲＦバクテリオフ
ァージＤＮＡに結合させうるようなものとすべきである
。この結合は平滑端結合または凝集端結合によって行な
うことができ、これら両技術は標準技術である〔マニア
チス等、［モレキュラー・クローニング」、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−出版〕。Ｍ ｂ
ｏ Ｉ淋菌染色体ＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐベクターのＢ
ａｍＨ１部位に挿入するのが好適である。
Ｆ）のバクテリオファージＤＮＡを線状化させる。これ
は、適当な制限酵素で行なわれる。制限酵素の選択は、
淋菌染色体ＤＮＡ断片を線状化されたＲＦバクテリオフ
ァージＤＮＡに結合させうるようなものとすべきである
。この結合は平滑端結合または凝集端結合によって行な
うことができ、これら両技術は標準技術である〔マニア
チス等、［モレキュラー・クローニング」、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−出版〕。Ｍ ｂ
ｏ Ｉ淋菌染色体ＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐベクターのＢ
ａｍＨ１部位に挿入するのが好適である。
ｃ、組換分子の形質転換
適する宿主細胞への組換分子の形質転換を次。
いで行なうことができる。任意の宿主細胞を使用しうる
と思われるが、宿主細胞は雄（ｍａｌｅ）イー・コリと
するのが好適である。雄イー・コリが好適である理由は
、組換分子を作成するのに使用される本発明のベクター
が雄の特定バクテリオファージから誘導されるからであ
る。すなわち、下記するように組換バクテリオファージ
を雄イー・コリにて増殖させる際、生成されたバクテリ
オファージは雄イー・コリに再感染し、かくして雄イー
・コリの増殖を阻止し、プラークの形成を生ぜしめるこ
とができる。プラークは肉眼確認することができる。し
たがって、雄イー・コリの集団から形質転換した雄イー
・コリを容易に選択することができる。
と思われるが、宿主細胞は雄（ｍａｌｅ）イー・コリと
するのが好適である。雄イー・コリが好適である理由は
、組換分子を作成するのに使用される本発明のベクター
が雄の特定バクテリオファージから誘導されるからであ
る。すなわち、下記するように組換バクテリオファージ
を雄イー・コリにて増殖させる際、生成されたバクテリ
オファージは雄イー・コリに再感染し、かくして雄イー
・コリの増殖を阻止し、プラークの形成を生ぜしめるこ
とができる。プラークは肉眼確認することができる。し
たがって、雄イー・コリの集団から形質転換した雄イー
・コリを容易に選択することができる。
雄イー・コリは、ベクターのみ（たとえばＪＭ１０３お
よびＪＭＩ ０５）を含有するプラークから組換分子を
含有するプラークを容易に区別しうるような雄イー・コ
リよりなる群から選択するのが好適である。ＪＭ１０３
およびＪＭ１０５によってイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ
−ガラクトピラノシドプレート上に生成されるプラーク
は、Ｍ−１３バクテリオフアージを使用したと仮定すれ
ば組換分子が生存する場合白色となり、かつベクターの
みが存在する場合は青色となる。
よびＪＭＩ ０５）を含有するプラークから組換分子を
含有するプラークを容易に区別しうるような雄イー・コ
リよりなる群から選択するのが好適である。ＪＭ１０３
およびＪＭ１０５によってイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ
−ガラクトピラノシドプレート上に生成されるプラーク
は、Ｍ−１３バクテリオフアージを使用したと仮定すれ
ば組換分子が生存する場合白色となり、かつベクターの
みが存在する場合は青色となる。
形質転換を行ないうる幾つかの方法が存在する。たとえ
ば、形質転換は塩化カルシウム法または塩化カルシウム
／塩化ルビジウム法によって行なうことができる。これ
らの方法は標準技術である〔マニアチス参照〕。
ば、形質転換は塩化カルシウム法または塩化カルシウム
／塩化ルビジウム法によって行なうことができる。これ
らの方法は標準技術である〔マニアチス参照〕。
Ｄ、宿主細胞のスクリーニング
次いで、形質変換されてない宿主から形質転換されてい
る宿主を区別する宿主細胞のスクリーニングを行なうこ
とができる。この種のスクリーニング過程は、任意の標
準技術で行なうことができる。好適技術は次の通りであ
る：使用前に新たに次の試薬を作成する。
る宿主を区別する宿主細胞のスクリーニングを行なうこ
とができる。この種のスクリーニング過程は、任意の標
準技術で行なうことができる。好適技術は次の通りであ
る：使用前に新たに次の試薬を作成する。
１、Ｉ ＰＴＧ （１００ｍＭ）
ＩＰＴＧはイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ−ガラクトピラ
ノシド（Ｈ２０中１００ｍＭである）。
ノシド（Ｈ２０中１００ｍＭである）。
２、Ｘ−ｇａｌ（ジメチルホルムアミド中２％）Ｘ−Ｇ
ＡＬは５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル−Ｂ−
ガラクトシドである。
ＡＬは５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル−Ｂ−
ガラクトシドである。
３、新たな２００μ！バツチの宿主細胞を作成する。
ＩＰＴＯとＸ−ｇａｌと宿主細胞とをバッチで作成する
ことができる。Ｘ−ｇａｌおよびＩ ＰＴＯは新たに作
成して氷上で保存すべきである。宿主細胞は、宿主細胞
の１晩培養物の１滴を２０ｍ１の新たな２ｘＴＹ（１４
２当り１６ｇのバクトドリプトン、１０ｇの酵母抽出物
、５ｇのＮａｃｌ）へ添加して宿主細胞を作成するのが
好適である。
ことができる。Ｘ−ｇａｌおよびＩ ＰＴＯは新たに作
成して氷上で保存すべきである。宿主細胞は、宿主細胞
の１晩培養物の１滴を２０ｍ１の新たな２ｘＴＹ（１４
２当り１６ｇのバクトドリプトン、１０ｇの酵母抽出物
、５ｇのＮａｃｌ）へ添加して宿主細胞を作成するのが
好適である。
２１０ａｌｌの宿主細胞／Ｘ−ｇａｌ／ＩＰＴＧ混合物
を形質転換体細胞のチューブへ添加する。
を形質転換体細胞のチューブへ添加する。
３ｍｌの溶融Ｈ頂部寒天（１ｊ２当り１０ｇのバクトド
リプトン、８ｇのＮａｃ、，８ｇの寒天）を添加し、４
２℃に保つ。転勤によって混合し、直ちに予備加温（３
７℃）のＨプレート（１１当りＬｏｇのバクトドリプト
ン、８ｇのＮａｃ、，１２ｇの寒天）の上に注ぎ込む。
リプトン、８ｇのＮａｃ、，８ｇの寒天）を添加し、４
２℃に保つ。転勤によって混合し、直ちに予備加温（３
７℃）のＨプレート（１１当りＬｏｇのバクトドリプト
ン、８ｇのＮａｃ、，１２ｇの寒天）の上に注ぎ込む。
室温で放置して固化させる。プレートを裏返して、３７
℃にて１晩培養する。
℃にて１晩培養する。
１晩増殖した後、すなわち約１２〜約１８時間増殖させ
た後、形質転換細胞はプラークを形成し、雄イー・コリ
の場合には阻止された増殖の領域となる。次いで、どの
プラークが組換分子を含有するかを決定せねばならない
。
た後、形質転換細胞はプラークを形成し、雄イー・コリ
の場合には阻止された増殖の領域となる。次いで、どの
プラークが組換分子を含有するかを決定せねばならない
。
この決定は、宿主細胞がそれ自身で組換分子を含有する
プラークをベクターのみ（たとえばＪＭ１０３およびＪ
Ｍ１０５）を含有するものから肉眼区別しうるようなも
のであれば容易に行なうことができる。宿主細胞がこの
決定を容易に肉眼でなしえないものであれば、この決定
はｐ３２標識された淋菌ゲノムＤＮＡをプローブとして
用いるハイブリッド化〔マニアチス参照〕でのプラーク
のスクリーニングによって行なうことができる。このプ
ローブは、クローン化用に用いられているものと同じ淋
菌菌株から誘導すべきである。
プラークをベクターのみ（たとえばＪＭ１０３およびＪ
Ｍ１０５）を含有するものから肉眼区別しうるようなも
のであれば容易に行なうことができる。宿主細胞がこの
決定を容易に肉眼でなしえないものであれば、この決定
はｐ３２標識された淋菌ゲノムＤＮＡをプローブとして
用いるハイブリッド化〔マニアチス参照〕でのプラーク
のスクリーニングによって行なうことができる。このプ
ローブは、クローン化用に用いられているものと同じ淋
菌菌株から誘導すべきである。
Ｅ３組換分子の増殖
宿主細胞における組換分子の増殖を次いで行なうことが
できる。増殖の目的は組換分子の個数を増加させること
であり、任意の標準技術で行なうことができる。好適技
術は次の通りである： 組換分子を含有するプラークを釣り上げ、かつ宿主細胞
を含有する容器（たとえばエソペンドルフチューブ）に
おいて培養することができる。この容器を１晩中振とう
しながら３７℃にて培養する。この培養の結果、バクテ
リオファージが増殖する。培養期間中、成熟したバクテ
リオファージが宿主細胞から排出する。遠心分離を用い
て、排出されたバクテリオファージを宿主細胞から分離
することができる。上澄液はバクテリオファージを含有
し、これを用いて下記するようにスクリーニングするこ
とができる。
できる。増殖の目的は組換分子の個数を増加させること
であり、任意の標準技術で行なうことができる。好適技
術は次の通りである： 組換分子を含有するプラークを釣り上げ、かつ宿主細胞
を含有する容器（たとえばエソペンドルフチューブ）に
おいて培養することができる。この容器を１晩中振とう
しながら３７℃にて培養する。この培養の結果、バクテ
リオファージが増殖する。培養期間中、成熟したバクテ
リオファージが宿主細胞から排出する。遠心分離を用い
て、排出されたバクテリオファージを宿主細胞から分離
することができる。上澄液はバクテリオファージを含有
し、これを用いて下記するようにスクリーニングするこ
とができる。
Ｆ、スクリーニング工程
次いで、排出されたバクテリオファージを用いてスクリ
ーニングすることができる。排出されたバクテリオファ
ージを試験ドツトに対してスクリーニングする。試験ド
ツトは、適当なマトリックスに結合した変性の精製染色
体ＤＮＡである。
ーニングすることができる。排出されたバクテリオファ
ージを試験ドツトに対してスクリーニングする。試験ド
ツトは、適当なマトリックスに結合した変性の精製染色
体ＤＮＡである。
試験ドツトのそれぞれは変性された精製染色体ＤＮＡで
構成され、この染色体ＤＮＡは１９８６年１月８日付け
でそれぞれ寄託されてアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）受託番号によって次のよう
に示される淋菌および髄膜炎菌の菌株の１種から単離さ
れる。ＡＴＣＣはミズウリ州、ロックビル在、１２３０
１パークローン ドライブに所在する：髄膜炎菌
農」 １、 ５３４１４ １． ５３４２０２
、 ５３４１５ ２． ５３４２１３、
５３４１６ ３． ５３４２２４、
５３４１７ ４． ５３４２３５、
５３４１８ ５． ５３４２４６、 ５
３４１９ ６． ５３４２５試験ドツトは
次のように作成することができる： ＡＴＣＣは、菌株の試料を凍結乾燥状態で供給する。こ
の試料を適当な培地中で増殖させて、細菌菌体の個数を
増大させる。次いで、染色体ＤＮＡを、たとえば洗剤（
たとえば５ＤＳ）を用いて菌体を溶菌させ、ＲＮアーゼ
を用いてＲＮＡを切断し、かつ次いでフェノール抽出に
よって染色体ＤＮＡを精製するような標準技術により、
細菌菌体から分離する。精製した染色体ＤＮＡをアルカ
リ、たとえばＮａＯＨまたは熱によって変性させる。こ
の変性した精製染色体ＤＮＡをＩＭ ＮＨ４Ａｃ、，
０２Ｎ ＮａＯＨの添加によりｐＨを約７．８〜約８
．０となるように調整する〔ヌクレイツク・アシド・リ
サーチ、第７＠、第１５４１頁（１９７９）、カファド
ス等〕。次いで、この溶液を適当なマトリックス、たと
えばニトロセルロースフィルタに打点する。かくして、
染色体ＤＮＡが一本鎖型としてマトリックスに結合し、
これが試験ドツトを構成する。各試験ドツトは約１．０
μｇの変性した精製染色体ＤＮＡを含有すべきである。
構成され、この染色体ＤＮＡは１９８６年１月８日付け
でそれぞれ寄託されてアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）受託番号によって次のよう
に示される淋菌および髄膜炎菌の菌株の１種から単離さ
れる。ＡＴＣＣはミズウリ州、ロックビル在、１２３０
１パークローン ドライブに所在する：髄膜炎菌
農」 １、 ５３４１４ １． ５３４２０２
、 ５３４１５ ２． ５３４２１３、
５３４１６ ３． ５３４２２４、
５３４１７ ４． ５３４２３５、
５３４１８ ５． ５３４２４６、 ５
３４１９ ６． ５３４２５試験ドツトは
次のように作成することができる： ＡＴＣＣは、菌株の試料を凍結乾燥状態で供給する。こ
の試料を適当な培地中で増殖させて、細菌菌体の個数を
増大させる。次いで、染色体ＤＮＡを、たとえば洗剤（
たとえば５ＤＳ）を用いて菌体を溶菌させ、ＲＮアーゼ
を用いてＲＮＡを切断し、かつ次いでフェノール抽出に
よって染色体ＤＮＡを精製するような標準技術により、
細菌菌体から分離する。精製した染色体ＤＮＡをアルカ
リ、たとえばＮａＯＨまたは熱によって変性させる。こ
の変性した精製染色体ＤＮＡをＩＭ ＮＨ４Ａｃ、，
０２Ｎ ＮａＯＨの添加によりｐＨを約７．８〜約８
．０となるように調整する〔ヌクレイツク・アシド・リ
サーチ、第７＠、第１５４１頁（１９７９）、カファド
ス等〕。次いで、この溶液を適当なマトリックス、たと
えばニトロセルロースフィルタに打点する。かくして、
染色体ＤＮＡが一本鎖型としてマトリックスに結合し、
これが試験ドツトを構成する。各試験ドツトは約１．０
μｇの変性した精製染色体ＤＮＡを含有すべきである。
１２個の試験ドツトのそれぞれが同一マトリックス上に
存在する。
存在する。
次いで、これら試験ドツトをマトリックスに固定させか
つ封鎖することができる。固定を行なって試験ドツトを
安定化することにより、変性した精製染色体ＤＮＡが次
のハイブリッド化／洗浄工程の際にマトリックスから洗
浄除去されるのを防止すると共に、封鎖を行なって組換
バクテリオファージＤＮＡおよび標識プローブによるマ
トリックスへの非特異的結合を防止する。固定は、マト
リックスを減圧下に８０℃にて約２時間放置して行なう
ことができる。封鎖はマトリックスを任意の標準ハイブ
リッド化溶液（たとえば２ＸＳＳｃ、５×デンハルト溶
液、０．１％ＳＤＳおよび２００μｇ／…ｌの音波処理
した熱変性中胸腺ＤＮＡ）中で約６５℃にて少なくとも
約２時間培養して行なうことができる。
つ封鎖することができる。固定を行なって試験ドツトを
安定化することにより、変性した精製染色体ＤＮＡが次
のハイブリッド化／洗浄工程の際にマトリックスから洗
浄除去されるのを防止すると共に、封鎖を行なって組換
バクテリオファージＤＮＡおよび標識プローブによるマ
トリックスへの非特異的結合を防止する。固定は、マト
リックスを減圧下に８０℃にて約２時間放置して行なう
ことができる。封鎖はマトリックスを任意の標準ハイブ
リッド化溶液（たとえば２ＸＳＳｃ、５×デンハルト溶
液、０．１％ＳＤＳおよび２００μｇ／…ｌの音波処理
した熱変性中胸腺ＤＮＡ）中で約６５℃にて少なくとも
約２時間培養して行なうことができる。
このハイブリッド化溶液を捨て、かつ試験ドツトを含有
するマトリックスを組換バクテリオファージによって容
易にスクリーニングすることができる。
するマトリックスを組換バクテリオファージによって容
易にスクリーニングすることができる。
次いで、マトリックスを２ｘＳＳｃ、５×デンハルト溶
液および０．１％ＳＤＳ並びに２００μｇ／ｍｌの音波
処理した加熱変性牛胸腺ＤＮＡよりなる新たなハイブリ
ッド化溶液に入れ、これに組換バクテリオファージを含
有する上澄液を添加する。かくして、組換バクテリオフ
ァージＤＮＡにおける淋菌挿入体は、バクテリオファー
ジＤＮＡをマトリックスに対し６５℃にて約１６〜約２
０時間にわたり接触させ続けることにより試験ドツトに
ハイブリッド化することができる。６５℃におけるハイ
ブリッド化はさらに組換バクテリオファージＤＮＡの蛋
白被覆を破壊することも注目すべきである。次いで、ハ
イブリッド化溶液を除去し、かつマトリックスをそれぞ
れ２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにてそれぞれ約３０分間
づつ２回洗浄し、次いでさらに０．２ＸＳＳＣＯ，１％
ＳＤＳ （全て６５℃にて）３０分間づつ２回洗浄し、
これら４回の洗浄のそれぞれに際し緩和に振とうする。
液および０．１％ＳＤＳ並びに２００μｇ／ｍｌの音波
処理した加熱変性牛胸腺ＤＮＡよりなる新たなハイブリ
ッド化溶液に入れ、これに組換バクテリオファージを含
有する上澄液を添加する。かくして、組換バクテリオフ
ァージＤＮＡにおける淋菌挿入体は、バクテリオファー
ジＤＮＡをマトリックスに対し６５℃にて約１６〜約２
０時間にわたり接触させ続けることにより試験ドツトに
ハイブリッド化することができる。６５℃におけるハイ
ブリッド化はさらに組換バクテリオファージＤＮＡの蛋
白被覆を破壊することも注目すべきである。次いで、ハ
イブリッド化溶液を除去し、かつマトリックスをそれぞ
れ２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにてそれぞれ約３０分間
づつ２回洗浄し、次いでさらに０．２ＸＳＳＣＯ，１％
ＳＤＳ （全て６５℃にて）３０分間づつ２回洗浄し、
これら４回の洗浄のそれぞれに際し緩和に振とうする。
各組換バクテリオファージをスクリーニングするには、
各組換バクテリオファージを１２１［１ａの試験ドツト
を含有する適当なマトリックスに対し別々にスクリーニ
ングせねばならないことに注目すべきである。
各組換バクテリオファージを１２１［１ａの試験ドツト
を含有する適当なマトリックスに対し別々にスクリーニ
ングせねばならないことに注目すべきである。
６種の淋菌の菌株および６種の髄膜炎菌の菌株のそれぞ
れに対し組換バクテリオファージをスクリーニングする
代りに、淋菌の菌株の１種および髄膜炎菌の菌株の１種
についてのみスクリーニングしうろことも注目すべきで
ある。何故なら、これらナイセリア属の各菌株のＤＮＡ
にハイブリッド化するほぼ全ての組換バクテリオファー
ジは、ナイセリア属の他の苗株にもハイブリッド化する
からである。ハイブリッド化しない組換バクテリオファ
ージは、工程Ｈで除去される。これらナイセリア属にお
ける１種のみの菌株のスクリーニングは、このスクリー
ニング工程を極めて短時間で行なうことを可能にする。
れに対し組換バクテリオファージをスクリーニングする
代りに、淋菌の菌株の１種および髄膜炎菌の菌株の１種
についてのみスクリーニングしうろことも注目すべきで
ある。何故なら、これらナイセリア属の各菌株のＤＮＡ
にハイブリッド化するほぼ全ての組換バクテリオファー
ジは、ナイセリア属の他の苗株にもハイブリッド化する
からである。ハイブリッド化しない組換バクテリオファ
ージは、工程Ｈで除去される。これらナイセリア属にお
ける１種のみの菌株のスクリーニングは、このスクリー
ニング工程を極めて短時間で行なうことを可能にする。
組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ドツト複合体のそ
れぞれを次いで検出することができる。この検出は、二
重鎖複製型（ＲＦ）の環バクテリオファージを標識プロ
ーブとして用いて行なう・ことができる。このＲＦ
ＤＮＡは、組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ドツト
複合体のベクタ一部分にハイブリッド化して、試験ドツ
トにハイブリッド化される組換バクテリオファージＤＮ
Ａに対しハイブリッド化したＲＦＤＮＡよりなる架橋を
形成することができる。
れぞれを次いで検出することができる。この検出は、二
重鎖複製型（ＲＦ）の環バクテリオファージを標識プロ
ーブとして用いて行なう・ことができる。このＲＦ
ＤＮＡは、組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ドツト
複合体のベクタ一部分にハイブリッド化して、試験ドツ
トにハイブリッド化される組換バクテリオファージＤＮ
Ａに対しハイブリッド化したＲＦＤＮＡよりなる架橋を
形成することができる。
次いで、この架橋をＲＦ ＤＮＡの標識によって検出
する。
する。
複合体のこの検出方法は多くの利点を与える。
第１に、この方法は１つの標識工程、すなわちＲＦ
ＤＮＡの標識しか必要としない。この標識されたＲＦ
ＤＮＡを用いて全ての組換バクテリオファージを検出
することができる。さもなければ、各組換バクテリオフ
ァージを別々に標識せねばならず、これは極めて時間が
かかりかつ労力を要する工程となる。第２に、この検出
方法によれば、さらに全ての組換バクテリオファージＤ
ＮＡ試験ドツト複合体を同時に検出することができる。
ＤＮＡの標識しか必要としない。この標識されたＲＦ
ＤＮＡを用いて全ての組換バクテリオファージを検出
することができる。さもなければ、各組換バクテリオフ
ァージを別々に標識せねばならず、これは極めて時間が
かかりかつ労力を要する工程となる。第２に、この検出
方法によれば、さらに全ての組換バクテリオファージＤ
ＮＡ試験ドツト複合体を同時に検出することができる。
これは、検出工程の時間を著しく節約する。最後に、こ
の検出方法は、組換バクテリオファージを標識せねばな
らない場合に比べて感度の増大をもたらす。これは、ニ
ック翻訳反応がベクターを多数のＤＮＡ断片に切断する
と言う事実に基づいている。したがって、ニック翻訳に
より組換バクテリオファージを標識する場合には、淋菌
を含有するＤＮＡ断片のみが信号に寄与するであろう。
の検出方法は、組換バクテリオファージを標識せねばな
らない場合に比べて感度の増大をもたらす。これは、ニ
ック翻訳反応がベクターを多数のＤＮＡ断片に切断する
と言う事実に基づいている。したがって、ニック翻訳に
より組換バクテリオファージを標識する場合には、淋菌
を含有するＤＮＡ断片のみが信号に寄与するであろう。
しかしながら、ＲＦ ＤＮＡをニック翻訳によって標
識すれば、全ての得られるＤＮＡ断片が組換バクテリオ
ファージのベクタ一部分にハイブリッド化して、感度の
増大を与えることができる。
識すれば、全ての得られるＤＮＡ断片が組換バクテリオ
ファージのベクタ一部分にハイブリッド化して、感度の
増大を与えることができる。
原バタテリオファージのＲＦ ＤＮＡをたとえばニッ
ク翻訳によってｐ３２で標識し、かつこれをプローブと
して使用することにより組換バクテリオファージ／試験
ドツト複合体を検出する。ｐ３２標識したＲＦ ＤＮ
Ａの作成は標準技術によって行なうことができる〔リグ
ビー等、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー（１９
７７）、第１１３巻、第２３７−２５１頁〕。次いで、
ｐ３２標識したＲＦ ＤＮＡを用いて組換バクテリオ
ファージ／試験ドツト複合体を検出することができる。
ク翻訳によってｐ３２で標識し、かつこれをプローブと
して使用することにより組換バクテリオファージ／試験
ドツト複合体を検出する。ｐ３２標識したＲＦ ＤＮ
Ａの作成は標準技術によって行なうことができる〔リグ
ビー等、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー（１９
７７）、第１１３巻、第２３７−２５１頁〕。次いで、
ｐ３２標識したＲＦ ＤＮＡを用いて組換バクテリオ
ファージ／試験ドツト複合体を検出することができる。
これは次のようにして行なうことができる：
ｐ３２標識したＲＦ ＤＮＡを、たとえば水中で煮沸
して変性させる。変性したｐ３２標織のＲＦ ＤＮＡ
を２ｘｓｓｃと５×デンハルト溶液と０．１％ＳＤＳと
２００μｇ／ｍｌの音波処理した熱変性中胸腺ＤＮＡと
よりなるハイブリッド化溶液に添加して混合物を作成し
、次いでこれを組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ド
ツト複合体を含有するマトリックスと６５℃にて約１２
〜１６時間接触させる。この結果、Ｐ″′′標識たＲＦ
ＤＮＡが組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ドツ
ト複合体のベクタ一部分にハイブリッド化して、Ｐ３２
標識されたＲＦ ＤＮＡ／組換バクテリオファージＤ
ＮＡ／試験ドツト架橋を形成する。次いで、このマトリ
ックスをそれぞれ２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにて約３
０分間２回洗浄し、次いで０．２ＸＳＳｃ、０，１％Ｓ
ＤＳにてさらに２回３０分間洗浄しくこれらは全て６５
゛Ｃにて行なう）、これら４回の各洗浄に際し緩やかに
振とうする。次いで、マトリックスを風乾する。
して変性させる。変性したｐ３２標織のＲＦ ＤＮＡ
を２ｘｓｓｃと５×デンハルト溶液と０．１％ＳＤＳと
２００μｇ／ｍｌの音波処理した熱変性中胸腺ＤＮＡと
よりなるハイブリッド化溶液に添加して混合物を作成し
、次いでこれを組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ド
ツト複合体を含有するマトリックスと６５℃にて約１２
〜１６時間接触させる。この結果、Ｐ″′′標識たＲＦ
ＤＮＡが組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ドツ
ト複合体のベクタ一部分にハイブリッド化して、Ｐ３２
標識されたＲＦ ＤＮＡ／組換バクテリオファージＤ
ＮＡ／試験ドツト架橋を形成する。次いで、このマトリ
ックスをそれぞれ２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにて約３
０分間２回洗浄し、次いで０．２ＸＳＳｃ、０，１％Ｓ
ＤＳにてさらに２回３０分間洗浄しくこれらは全て６５
゛Ｃにて行なう）、これら４回の各洗浄に際し緩やかに
振とうする。次いで、マトリックスを風乾する。
次いで、架橋におけるｐ３２の放射能を定量化する。こ
れはマトリックスをＸ線フィルムに露出して行なうこと
ができる。Ｘ線フィルムを基準マーカとして使用し、そ
の際Ｐ３２染料マーカを基準点として使用することによ
りマトリックス上に載せて、フィルム上の信号ドツトを
対応の試験ドツトと整列させ、かくして試験ドツトをマ
トリックス上に配置することができる。
れはマトリックスをＸ線フィルムに露出して行なうこと
ができる。Ｘ線フィルムを基準マーカとして使用し、そ
の際Ｐ３２染料マーカを基準点として使用することによ
りマトリックス上に載せて、フィルム上の信号ドツトを
対応の試験ドツトと整列させ、かくして試験ドツトをマ
トリックス上に配置することができる。
次いで、各試験ドツトをマトリックスから切除しかつシ
ンチレーション流体を含有する小壜に入れる。
ンチレーション流体を含有する小壜に入れる。
次いで、この小壜をシンチレーションカウンタに入れ、
架橋の放射能を定量化する。マトリックスのバックグラ
ンドを引算した後、各淋菌試験ドツトおよび各髄膜炎菌
試験ドツトの毎分のカウント数を各組換バクテリオファ
ージＤＮＡにつき計算する。各組換バクテリオファージ
ＤＮＡにつき、毎分の最小カウント数を有する淋菌菌株
の毎分のカウント数を毎分の最大カウント数を有する髄
膜炎菌の菌株の毎分のカウント数と比較し、かつ毎分の
カウント数に基づき淋菌：髄膜炎菌の比が約５より大と
なるような組換バクテリオファージＤＮＡを次の工程に
使用する。
架橋の放射能を定量化する。マトリックスのバックグラ
ンドを引算した後、各淋菌試験ドツトおよび各髄膜炎菌
試験ドツトの毎分のカウント数を各組換バクテリオファ
ージＤＮＡにつき計算する。各組換バクテリオファージ
ＤＮＡにつき、毎分の最小カウント数を有する淋菌菌株
の毎分のカウント数を毎分の最大カウント数を有する髄
膜炎菌の菌株の毎分のカウント数と比較し、かつ毎分の
カウント数に基づき淋菌：髄膜炎菌の比が約５より大と
なるような組換バクテリオファージＤＮＡを次の工程に
使用する。
次いで、約５より大きい淋菌：髄膜炎菌の比を与えるよ
うな組換バクテリオファージをさらに分析する。この分
析は、これら組換バクテリオファージのＲＦ ＤＮＡ
の直接的標識化を利用する。これら組換バグテリオファ
ージのＲＦＤＮＡの直接的標識化は、淋菌：髄膜炎菌の
上記比を一層正確に定量すること”を可能にし、したが
って淋菌染色体ＤＮＡに対し特異性の個々のヌクレオチ
ド配列を持った組換バクテリオファージを正確に同定し
、かくして本発明の組成物を規定することを可能にする
。
うな組換バクテリオファージをさらに分析する。この分
析は、これら組換バクテリオファージのＲＦ ＤＮＡ
の直接的標識化を利用する。これら組換バグテリオファ
ージのＲＦＤＮＡの直接的標識化は、淋菌：髄膜炎菌の
上記比を一層正確に定量すること”を可能にし、したが
って淋菌染色体ＤＮＡに対し特異性の個々のヌクレオチ
ド配列を持った組換バクテリオファージを正確に同定し
、かくして本発明の組成物を規定することを可能にする
。
この分析は次のように行なうことができる：約５より大
きい淋菌：髄膜炎菌の比を与える各組換バクテリオファ
ージの１部を、たとえば２ＸＴＹ培地またはＬＢ培地の
ような増殖培地中へ未感染の宿主細胞と共に接種し、か
つ３７℃にて約５時間培養する。この結果、組換バクテ
リオファージが増殖する。ここで新たに感染した宿主細
胞を遠心分離しかつ淋菌染色体ＤＮＡ断片を含有するＲ
Ｆ ＤＮＡを標準技術によって単離する〔マニアチス
参照〕。１００ｍ１の培養物は約４０〜５０μｇのＲＦ
ＤＮＡを生成する。
きい淋菌：髄膜炎菌の比を与える各組換バクテリオファ
ージの１部を、たとえば２ＸＴＹ培地またはＬＢ培地の
ような増殖培地中へ未感染の宿主細胞と共に接種し、か
つ３７℃にて約５時間培養する。この結果、組換バクテ
リオファージが増殖する。ここで新たに感染した宿主細
胞を遠心分離しかつ淋菌染色体ＤＮＡ断片を含有するＲ
Ｆ ＤＮＡを標準技術によって単離する〔マニアチス
参照〕。１００ｍ１の培養物は約４０〜５０μｇのＲＦ
ＤＮＡを生成する。
次いで、ＲＦ ＤＮＡを、たとえば二ツク翻訳により
ｐ’Ｊ２で標識する。次いで、ｐ３２標織されたＲＦ
ＤＮＡをプローブとして使用することにより、下記の
変性された精製染色体ＤＮＡからなる試験ドツトに対し
てスクリーニングし、前記染色体ＤＮＡは上記で使用し
たと同じ菌株の淋菌および髄膜炎菌から誘導され、次の
ＡＴＣＣ受託番号によって示される：ＷＩ７ＪｌｌＩ炎
菌 淋菌１、 ５３４１４ １．
５３４２０２．５３４１５ ．２．５３４２１
３、 ５３４１６ ３． ５３４２２４、 ５３
４１７ ４． ５３４２３５、 ５３４１８
５． ５３４２４６、 ５３４１９ ６．
５３４２５試験ドツトは上記のように作成される。しか
しながら、淋菌および髄膜炎菌の各菌株は６（１１の試
験ドツトを持たねばならず、各菌株に対する各試験ドツ
トは１／１０のファクターでシリーズとして希釈し、か
くして６１１１ｉｉの試験ドツトは次の量の変性された
精製染色体ＤＮＡを含有する：５００ｎｇ（ナノグラム
）、５０ｎｇ。
ｐ’Ｊ２で標識する。次いで、ｐ３２標織されたＲＦ
ＤＮＡをプローブとして使用することにより、下記の
変性された精製染色体ＤＮＡからなる試験ドツトに対し
てスクリーニングし、前記染色体ＤＮＡは上記で使用し
たと同じ菌株の淋菌および髄膜炎菌から誘導され、次の
ＡＴＣＣ受託番号によって示される：ＷＩ７ＪｌｌＩ炎
菌 淋菌１、 ５３４１４ １．
５３４２０２．５３４１５ ．２．５３４２１
３、 ５３４１６ ３． ５３４２２４、 ５３
４１７ ４． ５３４２３５、 ５３４１８
５． ５３４２４６、 ５３４１９ ６．
５３４２５試験ドツトは上記のように作成される。しか
しながら、淋菌および髄膜炎菌の各菌株は６（１１の試
験ドツトを持たねばならず、各菌株に対する各試験ドツ
トは１／１０のファクターでシリーズとして希釈し、か
くして６１１１ｉｉの試験ドツトは次の量の変性された
精製染色体ＤＮＡを含有する：５００ｎｇ（ナノグラム
）、５０ｎｇ。
５ｎｇ、０．５ ｎｇ 、５０ｐｇ （ピコグラム）お
よび５１）ｇｏかくして、スクリーニングすべき各組換
バクテリオファージにつき全部で７２個の試験ドツトを
与える６個の試験ドツトが各菌株につき存在する。全部
で７２個の試験ドツトは同じマトリックス上に存在させ
、ハイブリッド化をｐ３２標識ＲＦ ＤＮＡで行なっ
た際に、このＤＮＡが同一条件下で試験ドツトにハイブ
リッド化するようにするのが好適である。
よび５１）ｇｏかくして、スクリーニングすべき各組換
バクテリオファージにつき全部で７２個の試験ドツトを
与える６個の試験ドツトが各菌株につき存在する。全部
で７２個の試験ドツトは同じマトリックス上に存在させ
、ハイブリッド化をｐ３２標識ＲＦ ＤＮＡで行なっ
た際に、このＤＮＡが同一条件下で試験ドツトにハイブ
リッド化するようにするのが好適である。
次いで、ｐ３２標識されたＲＦ ＤＮＡを利用して、
試験ドツトにハイブリッド化させる。
試験ドツトにハイブリッド化させる。
これは次のように行なうことができる：ｐ３２標識、さ
れたＲＦ ＤＮＡを、たとえば水中で需沸することに
より変性させる。変性したｐ３２標識ＲＦ ＤＮＡを
２ｘｓｓｃと５×デンハルト溶液と０．１％ＳＤＳと２
００μｇ／ｍｌの音波処理された熱変性中胸腺ＤＮＡと
よりなるハイブリッド化溶液へ添加して混合物を生成さ
せ、これを次いで試験ドツトを含有する７トリツクスに
対し６５℃にて約１２〜１６時間接触させる。この結果
、ｐｆｆ２標織ＲＦ ＤＮＡは試験ドツトにハイブリ
ッド化し、ただし、この場合試験ドツトはｐ３２標織Ｒ
Ｆ ＤＮＡ中に含有された淋菌染色体ＤＮＡ断片に対
し実質的に相補的なりＮＡ配列を含有してハイブリッド
を形成しうるちのとする。次いで、このマトリックスを
それぞれ２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにて約３０分間に
わたり２回洗浄し、次いで０．２ｘＳＳＣ，０，１％Ｓ
ＤＳにて３０分間づつさらに２回洗浄し、これら４回の
洗浄はそれぞれ全て緩やかに攪拌しながら６５℃にて行
なった。
れたＲＦ ＤＮＡを、たとえば水中で需沸することに
より変性させる。変性したｐ３２標識ＲＦ ＤＮＡを
２ｘｓｓｃと５×デンハルト溶液と０．１％ＳＤＳと２
００μｇ／ｍｌの音波処理された熱変性中胸腺ＤＮＡと
よりなるハイブリッド化溶液へ添加して混合物を生成さ
せ、これを次いで試験ドツトを含有する７トリツクスに
対し６５℃にて約１２〜１６時間接触させる。この結果
、ｐｆｆ２標織ＲＦ ＤＮＡは試験ドツトにハイブリ
ッド化し、ただし、この場合試験ドツトはｐ３２標織Ｒ
Ｆ ＤＮＡ中に含有された淋菌染色体ＤＮＡ断片に対
し実質的に相補的なりＮＡ配列を含有してハイブリッド
を形成しうるちのとする。次いで、このマトリックスを
それぞれ２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにて約３０分間に
わたり２回洗浄し、次いで０．２ｘＳＳＣ，０，１％Ｓ
ＤＳにて３０分間づつさらに２回洗浄し、これら４回の
洗浄はそれぞれ全て緩やかに攪拌しながら６５℃にて行
なった。
次いで、このマトリックスを風乾する。このハイブリッ
ド化および洗浄は、上記の温度および塩濃度で行なうこ
とが必須である。
ド化および洗浄は、上記の温度および塩濃度で行なうこ
とが必須である。
次いで、ハイブリッドにおけるｐ３２の放射能を定量化
する。これはマトリックスをＸ線フィルムに露出させて
行なうことができる。Ｘ線フィルムは基準マーカとして
使用され、その際基準点としてＰ３２染料マーカを用い
ることによりマトリックス上に載置し、フィルム上の信
号ドツトを対応の試験ドツトと整列させることにより行
なわれる。次いで、各試験ドツトをマトリックスから切
除し、これをシンチレーション流体を含有する小壜中に
入れる。
する。これはマトリックスをＸ線フィルムに露出させて
行なうことができる。Ｘ線フィルムは基準マーカとして
使用され、その際基準点としてＰ３２染料マーカを用い
ることによりマトリックス上に載置し、フィルム上の信
号ドツトを対応の試験ドツトと整列させることにより行
なわれる。次いで、各試験ドツトをマトリックスから切
除し、これをシンチレーション流体を含有する小壜中に
入れる。
次いで、この小壜をシンチレーションカウンターに入れ
て、ハイブリッドにおけるｐｍ２の放射能を定量化する
。各組換バクテリオファージＤＮＡにつき、各淋菌試験
ドツトにおける毎分のカウント数および各髄膜炎菌試験
ドツトにおける毎分のカウント数を計算しかつ比較する
。
て、ハイブリッドにおけるｐｍ２の放射能を定量化する
。各組換バクテリオファージＤＮＡにつき、各淋菌試験
ドツトにおける毎分のカウント数および各髄膜炎菌試験
ドツトにおける毎分のカウント数を計算しかつ比較する
。
この計算は次のように行なわれる：マトリックスのバッ
クグランドを引算した後、各淋菌および髄膜炎菌の菌株
における６個の試験ドツトのそれぞれにつき５００ｎｇ
の試験ドツトの精製染色体ＤＮＡを用いて毎分のカウン
ト数を計算し、すなわち試験ドツトの精製染色体ＤＮＡ
の等量（５００ｎｇ）に基準化した試験ドツトに対しハ
イブリッド化した淋菌ＤＮＡの量を計算する。勿論、５
００ｎｇ以外の数値を使用することもでき、毎分のカウ
ント数を基準化することのみが必須である。次いで、淋
菌および髄膜炎菌の各菌株における６個の試験ドツトの
それぞれにつき各数値のうちの２ ＩｒＭを採用し、こ
れらは：（１）殆んど同一であワて直線関係に最も近い
ものであり、かつ（２）これら試験ドツトにおける精製
染色体ＤＮＡの量はファクター１０で相違しかつその平
均値、すなわち所定菌株の淋菌もしくは髄膜炎菌の精製
染色体ＤＮＡの等量に基準化された所定菌株の淋菌もし
くは髄膜炎菌の精製染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化
した淋菌ＤＮＡの平均量を計算する。各組換バクテリオ
ファージＤＮＡにつき、６種の菌株の各淋菌における精
製染色体ＤＮＡの等量に対し基準化した６種の各淋菌菌
株における精製染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化した
淋菌ＤＮＡの平均量の最低値を、６種の髄膜炎菌菌株の
それぞれにおける精製染色体ＤＮＡの等量に対し基準化
した６種の髄膜炎菌の各菌株における精製染色体ＤＮＡ
にハイブリッド化した淋菌ＤＮＡの最高平均値とを取り
、これら最低平均値と最高平均値との比を計算する。
クグランドを引算した後、各淋菌および髄膜炎菌の菌株
における６個の試験ドツトのそれぞれにつき５００ｎｇ
の試験ドツトの精製染色体ＤＮＡを用いて毎分のカウン
ト数を計算し、すなわち試験ドツトの精製染色体ＤＮＡ
の等量（５００ｎｇ）に基準化した試験ドツトに対しハ
イブリッド化した淋菌ＤＮＡの量を計算する。勿論、５
００ｎｇ以外の数値を使用することもでき、毎分のカウ
ント数を基準化することのみが必須である。次いで、淋
菌および髄膜炎菌の各菌株における６個の試験ドツトの
それぞれにつき各数値のうちの２ ＩｒＭを採用し、こ
れらは：（１）殆んど同一であワて直線関係に最も近い
ものであり、かつ（２）これら試験ドツトにおける精製
染色体ＤＮＡの量はファクター１０で相違しかつその平
均値、すなわち所定菌株の淋菌もしくは髄膜炎菌の精製
染色体ＤＮＡの等量に基準化された所定菌株の淋菌もし
くは髄膜炎菌の精製染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化
した淋菌ＤＮＡの平均量を計算する。各組換バクテリオ
ファージＤＮＡにつき、６種の菌株の各淋菌における精
製染色体ＤＮＡの等量に対し基準化した６種の各淋菌菌
株における精製染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化した
淋菌ＤＮＡの平均量の最低値を、６種の髄膜炎菌菌株の
それぞれにおける精製染色体ＤＮＡの等量に対し基準化
した６種の髄膜炎菌の各菌株における精製染色体ＤＮＡ
にハイブリッド化した淋菌ＤＮＡの最高平均値とを取り
、これら最低平均値と最高平均値との比を計算する。
約５より大きい淋菌：髄膜炎菌の比を与えるような個々
のヌクレオチド配列からなる組成物は、淋菌染色体ＤＮ
Ａ （したがって淋菌そのもの）に対し特異性である個
々のヌクレオチド配列からなる組成物を規定し、かくし
て本発明の組成物を構成する。本発明の目的で「個々の
ヌクレオチド配列」と言う用語は、約１２１１より多い
ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を意味する。好
適具体例において、本発明の組成物は約２５以上、より
好ましくは約５０以上の淋菌：髄膜炎菌の比を与えるよ
うな個々のヌクレオチド配列で構成される。個々のヌク
レオチド配列が約５より大きい淋菌：髄膜炎菌の比を与
えれば、この種の個々のヌクレオチド配列はほぼ全ての
淋菌の菌株に対しハイブリッド化するが、髄膜炎菌の菌
株にはハイブリッド化しないと思われる。
のヌクレオチド配列からなる組成物は、淋菌染色体ＤＮ
Ａ （したがって淋菌そのもの）に対し特異性である個
々のヌクレオチド配列からなる組成物を規定し、かくし
て本発明の組成物を構成する。本発明の目的で「個々の
ヌクレオチド配列」と言う用語は、約１２１１より多い
ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を意味する。好
適具体例において、本発明の組成物は約２５以上、より
好ましくは約５０以上の淋菌：髄膜炎菌の比を与えるよ
うな個々のヌクレオチド配列で構成される。個々のヌク
レオチド配列が約５より大きい淋菌：髄膜炎菌の比を与
えれば、この種の個々のヌクレオチド配列はほぼ全ての
淋菌の菌株に対しハイブリッド化するが、髄膜炎菌の菌
株にはハイブリッド化しないと思われる。
本発明の組成物は、淋菌に対し特異性の個々のヌクレオ
チド配列以外の成分、たとえば非ナイセリアＤＮＡ、細
胞残骸などを含有することがあり、ただしこれらの成分
は本発明の組成物を無効にするものでない。さらに、本
発明の個々のヌクレオチド配列は、個々のヌクレオチド
配列の１部として、適切でない他のヌクレオチド配列（
たとえばベクタ−０ヌクレオチド配列またはたとえば酵
素標識された末端であるヌクレオチド配列）をも含有し
うろことは勿論である。
チド配列以外の成分、たとえば非ナイセリアＤＮＡ、細
胞残骸などを含有することがあり、ただしこれらの成分
は本発明の組成物を無効にするものでない。さらに、本
発明の個々のヌクレオチド配列は、個々のヌクレオチド
配列の１部として、適切でない他のヌクレオチド配列（
たとえばベクタ−０ヌクレオチド配列またはたとえば酵
素標識された末端であるヌクレオチド配列）をも含有し
うろことは勿論である。
約５０より大きい淋菌：髄膜炎菌の比を与えるような３
種の個々のヌクレオチド配列を１９８６年１月９日付け
でＡＴＣＣに寄託し、かつＡＴＣＣ受託番号５３４０９
．５３４１０および５３４１１を得た。これらの個々の
ヌクレオチド配列は、淋菌の臨床試料から得られ、上記
の方法により制限酵素ＭｂｏＩで切断された約３０，０
００種の組換バクテリオファージをスクリーニングした
後に同定された。この場合、使用したベクターはＭ１３
ｍｐ８ベクターとし、かつ使用した宿主ベクターはイー
・コリＪＭ１０３とした。これら３種の個々のヌクレオ
チド配列を、さらに約２０種の淋菌および１０種の髄膜
炎菌、並びに２０種の淋菌の染色体ＤＮＡにハイブリッ
ド化したが１０種の髄膜炎菌の染色体ＤＮＡにはハイブ
リッド化しなかった３種の個々のヌクレオチド配列につ
き試験した。
種の個々のヌクレオチド配列を１９８６年１月９日付け
でＡＴＣＣに寄託し、かつＡＴＣＣ受託番号５３４０９
．５３４１０および５３４１１を得た。これらの個々の
ヌクレオチド配列は、淋菌の臨床試料から得られ、上記
の方法により制限酵素ＭｂｏＩで切断された約３０，０
００種の組換バクテリオファージをスクリーニングした
後に同定された。この場合、使用したベクターはＭ１３
ｍｐ８ベクターとし、かつ使用した宿主ベクターはイー
・コリＪＭ１０３とした。これら３種の個々のヌクレオ
チド配列を、さらに約２０種の淋菌および１０種の髄膜
炎菌、並びに２０種の淋菌の染色体ＤＮＡにハイブリッ
ド化したが１０種の髄膜炎菌の染色体ＤＮＡにはハイブ
リッド化しなかった３種の個々のヌクレオチド配列につ
き試験した。
これら３種の個々のヌクレオチド配列をＭ１３ｍｐ３ベ
クター（この組換分子は細菌宿主イー・コリＪＭ１０３
に形質転換させた）のＢａｍＨＩ部位に別々に捕大した
組換ＤＮＡ分子として寄託した。個々のヌクレオチド配
列挿入体を所望に応じ適当な制限酵素の使用によってＭ
１３ｍｐ８ベクターから分離することができる。制限酵
素５ａｕ３Ａを使用して個々のヌクレオチド配列挿入体
を分離することができる。
クター（この組換分子は細菌宿主イー・コリＪＭ１０３
に形質転換させた）のＢａｍＨＩ部位に別々に捕大した
組換ＤＮＡ分子として寄託した。個々のヌクレオチド配
列挿入体を所望に応じ適当な制限酵素の使用によってＭ
１３ｍｐ８ベクターから分離することができる。制限酵
素５ａｕ３Ａを使用して個々のヌクレオチド配列挿入体
を分離することができる。
この酵素は、Ｍ１３ｍｐ８ベクターを次の寸法の７個の
ＤＮＡ断片に切断する： ４，０１４ ｂｐ。
ＤＮＡ断片に切断する： ４，０１４ ｂｐ。
１．６９６ ｂｐ、 ５０７ ｂｐ、 ４３４ ｂｐ、
３３２ ｂｐ、 １４９ ｂｐおよび９６ ｂｐ
、さらに、この挿入体をベクターの部分を含有しない１
種の個別ヌクレオチド配列として切断する。代案として
、制限酵素Ｅｃ、ＲＩおよび５ａｌｌを組合せて用いる
ことにより、ベクターを切断することもできる。この切
断は２個のみの断片を与え、一方は約８ｋｂでありかつ
他方は個々のヌクレオチド配列挿入体とさらに約２０ｂ
ｐのベクターＤＮＡを含有する。
３３２ ｂｐ、 １４９ ｂｐおよび９６ ｂｐ
、さらに、この挿入体をベクターの部分を含有しない１
種の個別ヌクレオチド配列として切断する。代案として
、制限酵素Ｅｃ、ＲＩおよび５ａｌｌを組合せて用いる
ことにより、ベクターを切断することもできる。この切
断は２個のみの断片を与え、一方は約８ｋｂでありかつ
他方は個々のヌクレオチド配列挿入体とさらに約２０ｂ
ｐのベクターＤＮＡを含有する。
ＡＴＣＣ５３４０９およびＡＴＣＣ５３４１１の個々の
ヌクレオチド配列挿入体はそれぞれ約８５０ ｂｐであ
り、またＡＴＣＣ５３４１０のものは約１，３００ ｂ
ｐである。適当な制限酵素で切断した後、個々のヌクレ
オチド配列挿入体は、ＤＮＡ断片を寸法により分離する
ゲル電気泳動技術によって単離することができる。制限
＃ｌＩ素Ｅｃ、ＲＩおよび５ａｌｌを用いることにより
、この切断が２ ＩＩＩのみのＤＮＡ断片を与えるため
個々のヌクレオチド配列挿入体を分離するのが一層容易
となることに注目すべきである。さらに、個々のヌクレ
オチド配列挿入体を含有するＤＮＡｌｌｉ片は、ベクタ
ーの約２０ｂｐを含有し、ただしこの２０ｂρは個々の
ヌクレオチド配列挿入体の特異性を阻害しない。
ヌクレオチド配列挿入体はそれぞれ約８５０ ｂｐであ
り、またＡＴＣＣ５３４１０のものは約１，３００ ｂ
ｐである。適当な制限酵素で切断した後、個々のヌクレ
オチド配列挿入体は、ＤＮＡ断片を寸法により分離する
ゲル電気泳動技術によって単離することができる。制限
＃ｌＩ素Ｅｃ、ＲＩおよび５ａｌｌを用いることにより
、この切断が２ ＩＩＩのみのＤＮＡ断片を与えるため
個々のヌクレオチド配列挿入体を分離するのが一層容易
となることに注目すべきである。さらに、個々のヌクレ
オチド配列挿入体を含有するＤＮＡｌｌｉ片は、ベクタ
ーの約２０ｂｐを含有し、ただしこの２０ｂρは個々の
ヌクレオチド配列挿入体の特異性を阻害しない。
本発明は、さらに淋菌に対し特異性である寄託した個々
のヌクレオチド配列を有する、淋菌に対し特異的な個々
の整列ヌクレオチド配列をも含む。本発明の目的で、淋
菌に対し特異性の寄託された個々のヌクレオチド配列の
整列ヌクレオチド配列は、淋菌に対し特異性である寄託
した個々のヌクレオチド配列がハイブリッド化する個々
のヌクレオチド配列に対し直接隣接する淋菌の６種の寄
託菌株全てにおける淋菌染色体ＤＮＡのヌクレオチド配
列である。整列ヌクレオチド配列の少なくとも１部は淋
菌に対し特異性であると思われる。淋菌に対し特異性で
ある個々の整列ヌクレオチド配列は、後記実施例■に記
載する手順で得ることができる。
のヌクレオチド配列を有する、淋菌に対し特異的な個々
の整列ヌクレオチド配列をも含む。本発明の目的で、淋
菌に対し特異性の寄託された個々のヌクレオチド配列の
整列ヌクレオチド配列は、淋菌に対し特異性である寄託
した個々のヌクレオチド配列がハイブリッド化する個々
のヌクレオチド配列に対し直接隣接する淋菌の６種の寄
託菌株全てにおける淋菌染色体ＤＮＡのヌクレオチド配
列である。整列ヌクレオチド配列の少なくとも１部は淋
菌に対し特異性であると思われる。淋菌に対し特異性で
ある個々の整列ヌクレオチド配列は、後記実施例■に記
載する手順で得ることができる。
さらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特異性である寄
託した個々のヌクレオチド配列における個々のサブ配列
、並びに上記淋菌に対し特異性である個々の整列ヌクレ
オチド配列のサブ配列も包含される。これらの個々のサ
ブ配列は、寄託された個々のヌクレオチド配列にハイブ
リッド化することができる。
託した個々のヌクレオチド配列における個々のサブ配列
、並びに上記淋菌に対し特異性である個々の整列ヌクレ
オチド配列のサブ配列も包含される。これらの個々のサ
ブ配列は、寄託された個々のヌクレオチド配列にハイブ
リッド化することができる。
さらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特異性である寄
託した個々のヌクレオチド配列の突然変異から誘導され
る個々のヌクレオチド配列、淋菌に対し特異性であるそ
の個々の整列ヌクレオチド配列並びに淋菌に対し特異性
であるそのサブ配列も包含され、ただしこれらの突然変
異した個々のヌクレオチド配列は上記したように淋菌に
対し特異性であるものとする。さらに、本発明は上記淋
菌に対し特異性でありかつ淋菌に対し特異性の寄託した
個々のヌクレオチド配列に対しハイブリッド化しうるよ
うな個々のヌクレオチド配列、或いは淋菌に対し特異性
である個々の整列ヌクレオチド配列をも包含する。
託した個々のヌクレオチド配列の突然変異から誘導され
る個々のヌクレオチド配列、淋菌に対し特異性であるそ
の個々の整列ヌクレオチド配列並びに淋菌に対し特異性
であるそのサブ配列も包含され、ただしこれらの突然変
異した個々のヌクレオチド配列は上記したように淋菌に
対し特異性であるものとする。さらに、本発明は上記淋
菌に対し特異性でありかつ淋菌に対し特異性の寄託した
個々のヌクレオチド配列に対しハイブリッド化しうるよ
うな個々のヌクレオチド配列、或いは淋菌に対し特異性
である個々の整列ヌクレオチド配列をも包含する。
淋菌に対し特異性である寄託した個々のヌクレオチド配
列、並びに淋菌に対し特異性であるその個々の整列ヌク
レオチド配列をプローブとして使用することにより、淋
菌に対し特異性とな’／）ウルＩＥ々のヌクレオチド配
列を迅速にスクリーニングすることができる。淋菌に対
し特異性である寄託した個々のヌクレオチド配列、或い
は淋菌に対し特異性であるその個々の整列ヌクレオチド
配列に対しハイブリッド化する個々のヌクレオチド配列
を試験して、これらが淋菌に対し特異性であるかどうか
を決定せねばならない。
列、並びに淋菌に対し特異性であるその個々の整列ヌク
レオチド配列をプローブとして使用することにより、淋
菌に対し特異性とな’／）ウルＩＥ々のヌクレオチド配
列を迅速にスクリーニングすることができる。淋菌に対
し特異性である寄託した個々のヌクレオチド配列、或い
は淋菌に対し特異性であるその個々の整列ヌクレオチド
配列に対しハイブリッド化する個々のヌクレオチド配列
を試験して、これらが淋菌に対し特異性であるかどうか
を決定せねばならない。
さらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特異性である個
々の整列ヌクレオチド配列、または淋菌に対し特異性で
ある個々のヌクレオチド配列であって淋菌に対し特異性
の寄託した個々のヌクレオチド配列或いは淋菌に対し特
異性であるその個々の整列ヌクレオチド配列に対しハイ
ブリッド化しうるちのも包含される。これらの整列ヌク
レオチド配列は、淋菌に対し特異性である個々のヌクレ
オチド配列の染色体ＤＮＡに直接隣接した個々のヌクレ
オチド配列であり、これらは淋菌に対し特異性の寄託し
た個々のヌクレオチド配列または淋菌に対し特異性であ
るその個々の整列ヌクレオチド配列に対しハイブリッド
化することができる。これら個々の整列ヌクレオチド配
列は、後記実施例■に記載する手順で得ることができる
。
々の整列ヌクレオチド配列、または淋菌に対し特異性で
ある個々のヌクレオチド配列であって淋菌に対し特異性
の寄託した個々のヌクレオチド配列或いは淋菌に対し特
異性であるその個々の整列ヌクレオチド配列に対しハイ
ブリッド化しうるちのも包含される。これらの整列ヌク
レオチド配列は、淋菌に対し特異性である個々のヌクレ
オチド配列の染色体ＤＮＡに直接隣接した個々のヌクレ
オチド配列であり、これらは淋菌に対し特異性の寄託し
た個々のヌクレオチド配列または淋菌に対し特異性であ
るその個々の整列ヌクレオチド配列に対しハイブリッド
化することができる。これら個々の整列ヌクレオチド配
列は、後記実施例■に記載する手順で得ることができる
。
ざらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特異性である個
々のヌクレオチド配列における淋菌に対し特異性の個々
のサブ配列、並びに淋菌に対し特異性でありかつこの淋
菌に対し特異性の寄託した個々のヌクレオチド配列に対
しハイブリッド化しうる個々の整列ヌクレオチド配列、
或いは淋菌に特異性の個々の整列ヌクレオチド配列をも
包含する。
々のヌクレオチド配列における淋菌に対し特異性の個々
のサブ配列、並びに淋菌に対し特異性でありかつこの淋
菌に対し特異性の寄託した個々のヌクレオチド配列に対
しハイブリッド化しうる個々の整列ヌクレオチド配列、
或いは淋菌に特異性の個々の整列ヌクレオチド配列をも
包含する。
さらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特異性でありか
つ次の突然変異から生ずる個々のヌクレオチド配列をも
包含する：（１）淋菌に対し特異性でありかつ淋菌に対
し特異性の寄託した個々のヌクレオチド配列または淋菌
に対し特異性のその個々の整列ヌクレオチド配列に対し
ハイブリッド化しうる個々のヌクレオチド配列、（２）
淋菌に対し特異性である上記（１）の個々の整列ヌクレ
オチド配列、および（３）淋菌に対し特異性である上記
（１）および（２）の個々のヌクレオチドサブ配列。
つ次の突然変異から生ずる個々のヌクレオチド配列をも
包含する：（１）淋菌に対し特異性でありかつ淋菌に対
し特異性の寄託した個々のヌクレオチド配列または淋菌
に対し特異性のその個々の整列ヌクレオチド配列に対し
ハイブリッド化しうる個々のヌクレオチド配列、（２）
淋菌に対し特異性である上記（１）の個々の整列ヌクレ
オチド配列、および（３）淋菌に対し特異性である上記
（１）および（２）の個々のヌクレオチドサブ配列。
」二記のスクリーニング法を用いて、ＡＴＣＣに寄託し
た以外の淋菌に対し特異性である個々のヌクレオチド配
列を同定することができる。
た以外の淋菌に対し特異性である個々のヌクレオチド配
列を同定することができる。
この種の他の個々のヌクレオチド配列も本発明の範囲内
に含まれる。これら他の個々のヌクレオチド配列は、次
のパラメータの１つもしくはそれ以上を変化させて同定
することができる：１゜より多数の組換バクテリオファ
ージ分子をスクリーニングすることができる。より多数
の組換バクテリオファージ分子をスクリーニングする程
、淋菌に対し特異性の個々のヌクレオチド配列をより容
易に同定することができる。
に含まれる。これら他の個々のヌクレオチド配列は、次
のパラメータの１つもしくはそれ以上を変化させて同定
することができる：１゜より多数の組換バクテリオファ
ージ分子をスクリーニングすることができる。より多数
の組換バクテリオファージ分子をスクリーニングする程
、淋菌に対し特異性の個々のヌクレオチド配列をより容
易に同定することができる。
２、淋菌ゲノムを切断しうるＭ ｂ ｏ Ｉ以外の制限
酵素を使用することができる。異なる制限酵素は異なる
淋菌ＤＮＡ断片をもたらす。さらに、２種以上の制限酵
素を用いて淋菌ゲノムを切断することもできる。これは
、より小さい淋菌ゲノムのＤＮＡ断片を生成し、したが
ってこれらＤＮＡ断片は髄膜炎菌菌株のＤＮＡにハイブ
リッド化しないと思われる。
酵素を使用することができる。異なる制限酵素は異なる
淋菌ＤＮＡ断片をもたらす。さらに、２種以上の制限酵
素を用いて淋菌ゲノムを切断することもできる。これは
、より小さい淋菌ゲノムのＤＮＡ断片を生成し、したが
ってこれらＤＮＡ断片は髄膜炎菌菌株のＤＮＡにハイブ
リッド化しないと思われる。
３、淋菌ＤＮＡを制限酵素で切断するのでなく、たとえ
ば音波処理によってゲノムのランダム剪断によりゲノム
を断片に破壊することもできる。これは制限酵素での切
断によっては生成されずしかも淋菌に対し特異性である
個々のヌクレオチド配列となるような淋菌ＤＮＡ断片を
生成することができる。
ば音波処理によってゲノムのランダム剪断によりゲノム
を断片に破壊することもできる。これは制限酵素での切
断によっては生成されずしかも淋菌に対し特異性である
個々のヌクレオチド配列となるような淋菌ＤＮＡ断片を
生成することができる。
４、使用する淋菌の菌株を変えて、淋菌ＤＮＡ断片を作
成することもできる。
成することもできる。
さらに、本発明による組成物の要件を満たす任意の組成
物も、これら組成物がどのように得られるかとは無関係
に本発明の範囲内に含まれることを特記すべきである。
物も、これら組成物がどのように得られるかとは無関係
に本発明の範囲内に含まれることを特記すべきである。
すなわち、たとえ組成物が上記スクリーニング法以外の
方法で得られたとしても、これは本発明に包含される。
方法で得られたとしても、これは本発明に包含される。
組成物が本発明に含まれるかどうかを決定する工程ｒＨ
Ｊで記載した試験は、組成物が主として個々のオリゴヌ
クレオチド配列、すなわち約５０個未満の塩基対の個々
のヌクレオチド配列よりなる場合には若干変更せねばな
らない。
Ｊで記載した試験は、組成物が主として個々のオリゴヌ
クレオチド配列、すなわち約５０個未満の塩基対の個々
のヌクレオチド配列よりなる場合には若干変更せねばな
らない。
個々のオリゴヌクレオチド配列につきハイブリッド化お
よび洗浄温度を変化させる必要がある。
よび洗浄温度を変化させる必要がある。
６５℃においてオリゴヌクレオチド配列は、ハイブリッ
ド化反応の後に殆んどハイブリッド化しない状態に保た
れる。ハイブリッド化および洗浄を行′なう温度が個々
のオリゴヌクレオチド配列を含有する組成物のＴｍ （
”Ｃ） −３０℃であれば、この決定を２ＸＳＳＣの塩
濃度を有する溶液で行ない、かつＴｍは個々のオリゴヌ
クレオチド配列の変性温度である０組成物のＴｍは、標
準技術によって計算しまたは決定することができる。個
々のオリゴヌクレオチド配列を合成する場合、この種の
オリゴマー相補配列を合成してＴｍを決定せねばならな
い。さらに本発明の目的には、末端結合した非淋菌ポリ
ヌクレオチド（たとえばポリＡ）を有する１固々のオリ
ゴヌクレオチド配列を、個々のオリゴヌクレオチド配列
と考えねばならないことに注目すべきである。
ド化反応の後に殆んどハイブリッド化しない状態に保た
れる。ハイブリッド化および洗浄を行′なう温度が個々
のオリゴヌクレオチド配列を含有する組成物のＴｍ （
”Ｃ） −３０℃であれば、この決定を２ＸＳＳＣの塩
濃度を有する溶液で行ない、かつＴｍは個々のオリゴヌ
クレオチド配列の変性温度である０組成物のＴｍは、標
準技術によって計算しまたは決定することができる。個
々のオリゴヌクレオチド配列を合成する場合、この種の
オリゴマー相補配列を合成してＴｍを決定せねばならな
い。さらに本発明の目的には、末端結合した非淋菌ポリ
ヌクレオチド（たとえばポリＡ）を有する１固々のオリ
ゴヌクレオチド配列を、個々のオリゴヌクレオチド配列
と考えねばならないことに注目すべきである。
本発明の組成物は１（ｌＩの分離したヌクレオチド配列
或いは多数の個々のヌクレオチド配列で構成しうろこと
に注目すべきである。すなわち、本発明の組成物が多数
の個々のヌクレオチド配列からなる場合、個々の各ヌク
レオチド配列は淋菌に対し特異性であってはならないが
、この組成物は淋菌に対し特異性である。これは、各個
々のヌクレオチド配列が６種の髄膜炎菌のいずれかにお
ける髄膜炎菌ＤＮＡに対しハイブリッド化することがで
きず、また６種の淋菌菌株の全てにおける淋菌ＤＮＡに
対してもハイブリッド化しえないと言う事実に基づいて
いる。多数の個々のヌクレオチド配列からなる本発明の
組成物は、２種以上の組換バクテリオファージＤＮＡか
ら誘導される個々のヌクレオチド配列の混合物、或いは
ヌクレオチド配列挿入体を多数の個々のヌクレオチド配
列まで、たとえば二ツク翻訳の結果として切断する１個
の組換バクテリオファージＤＮＡのいずれかによって得
ることができる。
或いは多数の個々のヌクレオチド配列で構成しうろこと
に注目すべきである。すなわち、本発明の組成物が多数
の個々のヌクレオチド配列からなる場合、個々の各ヌク
レオチド配列は淋菌に対し特異性であってはならないが
、この組成物は淋菌に対し特異性である。これは、各個
々のヌクレオチド配列が６種の髄膜炎菌のいずれかにお
ける髄膜炎菌ＤＮＡに対しハイブリッド化することがで
きず、また６種の淋菌菌株の全てにおける淋菌ＤＮＡに
対してもハイブリッド化しえないと言う事実に基づいて
いる。多数の個々のヌクレオチド配列からなる本発明の
組成物は、２種以上の組換バクテリオファージＤＮＡか
ら誘導される個々のヌクレオチド配列の混合物、或いは
ヌクレオチド配列挿入体を多数の個々のヌクレオチド配
列まで、たとえば二ツク翻訳の結果として切断する１個
の組換バクテリオファージＤＮＡのいずれかによって得
ることができる。
２個以上の組換バクテリオファージＤＮＡから誘導され
る本発明の組成物は、毎分の最大カウント数を与える淋
菌の菌株と毎分の最大カウント数を与えるＷ！１膜炎菌
の菌株との比が約５より大であるような組換バクテリオ
ファージＤＮＡを工程Ｉ］の手順で使用しうる工程Ｇで
得ることができる。すなわち、これらの組換バクテリオ
ファージＤＮＡは、淋菌の菌株の全部ではないが少なく
とも１種を同定することができる。さらに、これらは約
５より大きい比を有する他の組換バクテリオファージＤ
ＮＡと組合せて使用することもでき、この種の「カクテ
ル」も本発明の組成物を与える。
る本発明の組成物は、毎分の最大カウント数を与える淋
菌の菌株と毎分の最大カウント数を与えるＷ！１膜炎菌
の菌株との比が約５より大であるような組換バクテリオ
ファージＤＮＡを工程Ｉ］の手順で使用しうる工程Ｇで
得ることができる。すなわち、これらの組換バクテリオ
ファージＤＮＡは、淋菌の菌株の全部ではないが少なく
とも１種を同定することができる。さらに、これらは約
５より大きい比を有する他の組換バクテリオファージＤ
ＮＡと組合せて使用することもでき、この種の「カクテ
ル」も本発明の組成物を与える。
淋菌の検出方法
本発明の他の面は、淋菌を検出するためのハイブリッド
化分析に本発明の組成物を使用する方法である。現在公
知または将来開発されるであろう全てのハイブリッド化
法を本発明に使用することができる〔たとえばファルコ
ン等に係る米国特許第４．４５８．５３５号、その開示
を参考のためここに引用する〕。
化分析に本発明の組成物を使用する方法である。現在公
知または将来開発されるであろう全てのハイブリッド化
法を本発明に使用することができる〔たとえばファルコ
ン等に係る米国特許第４．４５８．５３５号、その開示
を参考のためここに引用する〕。
本発明の組成物をハイブリッド化分析で使用するに先立
ち、この組成物は検出可能なマーカ（たとえば放射同位
元素、酵素など）で標識せねばならない。ハイブリッド
化分析は一般に、限定はしないが、淋菌試料または本発
明の組成物のいすかをマトリックスに固定化させ、かっ
このマトリックスを処理してマトリックスに対する本発
明の組成物の非特異的結合を阻止することからなってい
る。次いで、本発明の標識された組成物を用いて、ハイ
ブリッド化条件下でマトリックス上の試料と接触させる
。淋菌試料に対し特異的にハイブリッド化しなかった成
分を、たとえばマトリックスの洗浄によって除去・する
。次いで、組成物の標識を検出し、かつ標識が存在すれ
ば淋菌が存在する。
ち、この組成物は検出可能なマーカ（たとえば放射同位
元素、酵素など）で標識せねばならない。ハイブリッド
化分析は一般に、限定はしないが、淋菌試料または本発
明の組成物のいすかをマトリックスに固定化させ、かっ
このマトリックスを処理してマトリックスに対する本発
明の組成物の非特異的結合を阻止することからなってい
る。次いで、本発明の標識された組成物を用いて、ハイ
ブリッド化条件下でマトリックス上の試料と接触させる
。淋菌試料に対し特異的にハイブリッド化しなかった成
分を、たとえばマトリックスの洗浄によって除去・する
。次いで、組成物の標識を検出し、かつ標識が存在すれ
ば淋菌が存在する。
遺伝学上明確な群の検出方法
本発明のさらに他の局面において、上記スクリーニング
方法は、遺伝学上明確な群（たとえば淋菌）に対し特異
的なヌクレオチド配列をスクリーニングするための極め
て便利な方法を提供する。
方法は、遺伝学上明確な群（たとえば淋菌）に対し特異
的なヌクレオチド配列をスクリーニングするための極め
て便利な方法を提供する。
この方法は次の工程からなっている：
すなわち遺伝学上明確な群に対し特異的なヌクレオチド
配列をスクリーニングする方法は、ａ、スクリーニング
すべきヌクレオチド配列の各試料につき別々の試験ドツ
トをマトリックス上に形成し、各試験ドツトは前記試料
の１つから得られる一本鎖型の精製ＤＮＡを含み、ｂ、
前記試験ドツトをハイブリッド化条件下で前記ヌクレオ
チド配列と接触させ、前記ヌクレオチド配列はバクテリ
オファージＤＮＡにおける一本鎖ヌクレオチド配列挿入
体であり、前記バクテリオファージはそのライフサイク
ル中に一本鎖ＤＮＡ段階を有するバクテリオファージで
あり、 ｃ、前記試験ドツトにハイブリッド化しなかったヌクレ
オチド配列を前記試験ドツトにハイブリッド化したヌク
レオチド配列から分離し、ｄ、前記試験ドツトをハイブ
リッド化条件下で前記バクテリオファージと変性二重鎖
ＤＮＡと接触させ、前記バクテリオファージの前記変性
二重鎖ＤＮＡはこれに結合した検出可能なマーカを有し
、 ｃ、前記試験ドツトにハイブリッド化したバクテリオフ
ァージの二重鎖ＤＮＡを前記試験ドツトにハイブリッド
化しなかったバクテリオファージの二重鎖ＤＮＡから分
離し、かつｆ、ヌクレオチド配列を前記検出可能なマー
カによって検出する ことを特徴とする。
配列をスクリーニングする方法は、ａ、スクリーニング
すべきヌクレオチド配列の各試料につき別々の試験ドツ
トをマトリックス上に形成し、各試験ドツトは前記試料
の１つから得られる一本鎖型の精製ＤＮＡを含み、ｂ、
前記試験ドツトをハイブリッド化条件下で前記ヌクレオ
チド配列と接触させ、前記ヌクレオチド配列はバクテリ
オファージＤＮＡにおける一本鎖ヌクレオチド配列挿入
体であり、前記バクテリオファージはそのライフサイク
ル中に一本鎖ＤＮＡ段階を有するバクテリオファージで
あり、 ｃ、前記試験ドツトにハイブリッド化しなかったヌクレ
オチド配列を前記試験ドツトにハイブリッド化したヌク
レオチド配列から分離し、ｄ、前記試験ドツトをハイブ
リッド化条件下で前記バクテリオファージと変性二重鎖
ＤＮＡと接触させ、前記バクテリオファージの前記変性
二重鎖ＤＮＡはこれに結合した検出可能なマーカを有し
、 ｃ、前記試験ドツトにハイブリッド化したバクテリオフ
ァージの二重鎖ＤＮＡを前記試験ドツトにハイブリッド
化しなかったバクテリオファージの二重鎖ＤＮＡから分
離し、かつｆ、ヌクレオチド配列を前記検出可能なマー
カによって検出する ことを特徴とする。
以下、実施例により限定せずに本発明を例示の目的でさ
らに説明する。
らに説明する。
実施例■
ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣ
Ｃ５３４１１の淋菌挿入物における整列ヌクレオチド配
列の同定および分離方法（これは、一般に化学文献にお
いて「クロモソマル・ウオーキング」と言われる）。
Ｃ５３４１１の淋菌挿入物における整列ヌクレオチド配
列の同定および分離方法（これは、一般に化学文献にお
いて「クロモソマル・ウオーキング」と言われる）。
この方法は、ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０
およびＡＴＣＣ５３４１１の淋菌挿入体における整列ヌ
クレオチド配列を有するクローンを分離し、次いでこれ
ら配列の特異性をその淋菌および髄膜炎菌ＤＮＡに対す
る反応性につき検査することによって行われる。この方
法は、さらに淋菌に対し特異性である個々の整列ヌクレ
オチド配列の寸法をも明らかにする。
およびＡＴＣＣ５３４１１の淋菌挿入体における整列ヌ
クレオチド配列を有するクローンを分離し、次いでこれ
ら配列の特異性をその淋菌および髄膜炎菌ＤＮＡに対す
る反応性につき検査することによって行われる。この方
法は、さらに淋菌に対し特異性である個々の整列ヌクレ
オチド配列の寸法をも明らかにする。
（Ａ）クローン化：
ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣ
Ｃ５３４１１の１固々のヌクレオチド配列挿入体の寸法
は約０．８５〜約１．３ｋｂの範囲である。ＡＴＣＣ５
３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１
１の整列ヌクレオチド配列を有する淋菌ＤＮＡの大きい
断片を得るため、バクテリオファージスクローン化系を
用いる。ＥＭＢＬ３およびＥＭＢＬ ４は、９〜２３ｋ
ｂのクローン化能力を有するλベクターである（Ａ、フ
リシャラフ等＜１９８３）、ジャーナル・モレキュラ・
バイオロジー、第１７０巻、第８２７−８４２頁〕。先
ず最初に、６ｆ！！の寄託した淋菌菌株のいずれかから
得られた淋菌ＤＮＡをＢａｍＨＩにより部分切断して、
約１５ｋｂの平均寸法を得る。次いで、これら断片を使
用して、Ｂ ａ ｍ ＨＩ切断されたＥＭＢ Ｌ３ベク
ターを含むライブラリーを作成する。これら断片は、さ
らに脱燐酸化して、各λクローンが１個のみのＢａｍ切
断ＤＮＡを含有するよう確保せねばならない〔マニアチ
ス等〕。結合後、ＤＮＡにはベクター・クローニング・
システム社〔サン・ジエゴ、カリホルニア州（ＧＰｌｏ
）〕から得られる「ギガバック」充填混合物を充議する
。
Ｃ５３４１１の１固々のヌクレオチド配列挿入体の寸法
は約０．８５〜約１．３ｋｂの範囲である。ＡＴＣＣ５
３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１
１の整列ヌクレオチド配列を有する淋菌ＤＮＡの大きい
断片を得るため、バクテリオファージスクローン化系を
用いる。ＥＭＢＬ３およびＥＭＢＬ ４は、９〜２３ｋ
ｂのクローン化能力を有するλベクターである（Ａ、フ
リシャラフ等＜１９８３）、ジャーナル・モレキュラ・
バイオロジー、第１７０巻、第８２７−８４２頁〕。先
ず最初に、６ｆ！！の寄託した淋菌菌株のいずれかから
得られた淋菌ＤＮＡをＢａｍＨＩにより部分切断して、
約１５ｋｂの平均寸法を得る。次いで、これら断片を使
用して、Ｂ ａ ｍ ＨＩ切断されたＥＭＢ Ｌ３ベク
ターを含むライブラリーを作成する。これら断片は、さ
らに脱燐酸化して、各λクローンが１個のみのＢａｍ切
断ＤＮＡを含有するよう確保せねばならない〔マニアチ
ス等〕。結合後、ＤＮＡにはベクター・クローニング・
システム社〔サン・ジエゴ、カリホルニア州（ＧＰｌｏ
）〕から得られる「ギガバック」充填混合物を充議する
。
（Ｂ）インビトロ充填＝
ベクター・クローニング・システム社から得られる「ギ
ガバック」インビトロ充填キットは、音波処理された凍
結／解凍抽出物のセットを含有する。準備ができたら、
適当な個数のセットを一８０’Ｃの凍結装置から取り出
して氷上に載置する。凍結／解凍抽出物を、丁度解凍す
るまで指の間で転がし、これを氷へ戻す。同様に、音波
処理した抽出物も解凍する。ＤＮＡを凍結／解凍チュー
ブに加え、氷へ戻す。１５μｌの音波処理抽出物をＤＮ
Ａ／凍結／解凍混合物へ添加し、かつ充分混合する。こ
の反応物を２２℃にて２時間培養する。その後、０．５
ｍｌのバクテリオファージ希釈緩衝液（５，８ｇのＮ
ａ ｃ、゜２ｇのＭｇ５Ｏ＋ ・７Ｈ２０，５０ｍｌ
のＩＭＦリスＣｌ （ｐＨ７，５） 、 ５ ｍｌ
の２％ゼラチン／ｇ）と２Ｑμｌのクロロホルム（ポリ
スチレンチューブにはクロロホルムを加えず、反応物を
ポリプロピレンチューブ中に入れねばならない）を加え
て緩和に混合する。この溶液を次いでバクテリオファー
ジ保存物として処理する。バタテリオファージ希釈ｔａ
ｔＦ液における１／１０の４種の連続希釈物（最終希釈
物は１０−５希釈である）を作成し、各チューブからの
１０μｌを塗抹する。３７℃で１２時間培養した後にプ
ラークが出現する。充填抽出物は、抽出物に加えられた
ＤＮＡの１ｇｇ毎に１０４〜１０８１固のプラークを与
える。
ガバック」インビトロ充填キットは、音波処理された凍
結／解凍抽出物のセットを含有する。準備ができたら、
適当な個数のセットを一８０’Ｃの凍結装置から取り出
して氷上に載置する。凍結／解凍抽出物を、丁度解凍す
るまで指の間で転がし、これを氷へ戻す。同様に、音波
処理した抽出物も解凍する。ＤＮＡを凍結／解凍チュー
ブに加え、氷へ戻す。１５μｌの音波処理抽出物をＤＮ
Ａ／凍結／解凍混合物へ添加し、かつ充分混合する。こ
の反応物を２２℃にて２時間培養する。その後、０．５
ｍｌのバクテリオファージ希釈緩衝液（５，８ｇのＮ
ａ ｃ、゜２ｇのＭｇ５Ｏ＋ ・７Ｈ２０，５０ｍｌ
のＩＭＦリスＣｌ （ｐＨ７，５） 、 ５ ｍｌ
の２％ゼラチン／ｇ）と２Ｑμｌのクロロホルム（ポリ
スチレンチューブにはクロロホルムを加えず、反応物を
ポリプロピレンチューブ中に入れねばならない）を加え
て緩和に混合する。この溶液を次いでバクテリオファー
ジ保存物として処理する。バタテリオファージ希釈ｔａ
ｔＦ液における１／１０の４種の連続希釈物（最終希釈
物は１０−５希釈である）を作成し、各チューブからの
１０μｌを塗抹する。３７℃で１２時間培養した後にプ
ラークが出現する。充填抽出物は、抽出物に加えられた
ＤＮＡの１ｇｇ毎に１０４〜１０８１固のプラークを与
える。
（Ｃ） 且 バクテリオファージの塗抹：宿主として
使用したイー・コリの菌株はＮＭ５３９、すなわち組換
λバクテリオファージのみを感染させうるバクテリオフ
ァージＰ１リソゲンである。宿主細菌の培養物を１晩増
殖させた後、ＴＢ培地（１０ｇのバクトートリプトン（
ディフコ社）と５ｇのＮａｃｔ／ｍイオン水１１、ｐｌ
＋７．４．１０ｍＭのＭ ｇ Ｓ Ｏ＋と０．２％マル
トースとがオートクレーブ処理後に充填されたもの）に
充填した。Ｉ Ｍ Ｍ ｇ Ｓ Ｏ＋と２０％マルト
ースの保存溶液を濾過滅菌した。 ＮＭ５３９培養物を
３０℃の振とう水浴内で２０゜ｒｐｍにて１晩培養した
。より低い温度は、バクテリアの過大増殖を防止する。
使用したイー・コリの菌株はＮＭ５３９、すなわち組換
λバクテリオファージのみを感染させうるバクテリオフ
ァージＰ１リソゲンである。宿主細菌の培養物を１晩増
殖させた後、ＴＢ培地（１０ｇのバクトートリプトン（
ディフコ社）と５ｇのＮａｃｔ／ｍイオン水１１、ｐｌ
＋７．４．１０ｍＭのＭ ｇ Ｓ Ｏ＋と０．２％マル
トースとがオートクレーブ処理後に充填されたもの）に
充填した。Ｉ Ｍ Ｍ ｇ Ｓ Ｏ＋と２０％マルト
ースの保存溶液を濾過滅菌した。 ＮＭ５３９培養物を
３０℃の振とう水浴内で２０゜ｒｐｍにて１晩培養した
。より低い温度は、バクテリアの過大増殖を防止する。
翌日、細菌を２５００ｒｐｍにて１０分間ペレット化さ
せ、かつ１０ｍＭのＭｇ５Ｏ，中へ初期培養容積の０．
４倍の容積で再懸濁させた。光学密度を６００ｎｍにて
読み取った。光学密度０．５に調整した０、２ ｍｌの
細菌（１ｍｌ当り約３Ｘ１０”の細菌）を無菌バタテリ
オファージ希釈緩衝液および３ｍｌのトップアガロース
（ＮＺＹ培地における０、７％低ＥＥＤアガロース）と
共に使用した。細菌学プレートにＮＺＹ寒天を注ぎ入れ
た（ＮＺＹ培地＋１．５％バクト寒天： ＮＺＹ培地は
１０ＨのＮＺアミン（ＩＣＮファーマスーチカル社）と
５ｇのＮａｃ、と５ｇのイースト抽出物と２ｇのＭｇ５
ｏや・７Ｈ２０／１６であり、Ｎａ ＯＨによりｐＨ７
，５に調整〕。これらプレートを室温にて１晩乾燥させ
、かつバクテリオファージを塗抹する前に３７℃まで加
温する。各プレートにおけるプラークの最適数は約２０
０〜３００１固のプラークである。
せ、かつ１０ｍＭのＭｇ５Ｏ，中へ初期培養容積の０．
４倍の容積で再懸濁させた。光学密度を６００ｎｍにて
読み取った。光学密度０．５に調整した０、２ ｍｌの
細菌（１ｍｌ当り約３Ｘ１０”の細菌）を無菌バタテリ
オファージ希釈緩衝液および３ｍｌのトップアガロース
（ＮＺＹ培地における０、７％低ＥＥＤアガロース）と
共に使用した。細菌学プレートにＮＺＹ寒天を注ぎ入れ
た（ＮＺＹ培地＋１．５％バクト寒天： ＮＺＹ培地は
１０ＨのＮＺアミン（ＩＣＮファーマスーチカル社）と
５ｇのＮａｃ、と５ｇのイースト抽出物と２ｇのＭｇ５
ｏや・７Ｈ２０／１６であり、Ｎａ ＯＨによりｐＨ７
，５に調整〕。これらプレートを室温にて１晩乾燥させ
、かつバクテリオファージを塗抹する前に３７℃まで加
温する。各プレートにおけるプラークの最適数は約２０
０〜３００１固のプラークである。
（Ｄ）フィルタの作成：
ナイロン膜フィルタ（ポール・ウルトラファイン・フィ
ルトレージョン・コーポレーション社）をプレート上へ
３０秒間載置する。これにより、幾分かのバクテリオフ
ァージがプラークから膜へ移動してプレートの「レプリ
カ」を形成する。プレートおよび膜のそれぞれは、予め
各膜がその後に適当なプレートと整合しうるようかつプ
レート上のフィルタの物理的配向をも決定しうるようマ
ークする。
ルトレージョン・コーポレーション社）をプレート上へ
３０秒間載置する。これにより、幾分かのバクテリオフ
ァージがプラークから膜へ移動してプレートの「レプリ
カ」を形成する。プレートおよび膜のそれぞれは、予め
各膜がその後に適当なプレートと整合しうるようかつプ
レート上のフィルタの物理的配向をも決定しうるようマ
ークする。
次いで、各膜を予め１．５ Ｍ Ｎａ Ｃｌ １０．
５Ｍ ＮａＯＨにて１分間飽和させたワットマンＩｔ
３の紙へ載せることによって処理する。次いで、これ
らフィルタをｉ、５ Ｍ Ｎａ Ｃｌ １０．５Ｍ
トリス−ＣＩ （ｐｆ（８，０）で飽和された紙へ５
分間移し、次いで２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ
Ｎａｃ、，０，０１５Ｍ Ｎａ、クエン酸）へ５
分間移動させる。これらフィルタを風乾し、次いで減圧
下に８０℃にて１時間焼成する。
５Ｍ ＮａＯＨにて１分間飽和させたワットマンＩｔ
３の紙へ載せることによって処理する。次いで、これ
らフィルタをｉ、５ Ｍ Ｎａ Ｃｌ １０．５Ｍ
トリス−ＣＩ （ｐｆ（８，０）で飽和された紙へ５
分間移し、次いで２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ
Ｎａｃ、，０，０１５Ｍ Ｎａ、クエン酸）へ５
分間移動させる。これらフィルタを風乾し、次いで減圧
下に８０℃にて１時間焼成する。
（Ｅ）予備ハイブリッド化：
焼成したフィルタを６ＸＳＳＣの表面上へ、下側から完
全に濡れるまで（約５分間）浮遊させる。次いで、フィ
ルタを１００ｍ１の予備洗浄溶液（５０ｍｌ）リス−Ｃ
Ｉ （ｐＨ１８，０） 、Ｉ ＭＮａＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡおよび０．１％５Ｏ３）を含有するプラスチ
ック袋（たとえばジ−ルーア−ミール袋）へ移して、緩
和に攪拌しながら４２℃にて１〜２時間培養する。フィ
ルタを取り出しかつ排液した後、これを予備ハイブリッ
ド化熔液（５ｘＳＳＣ，５ｘデンハルト溶液。
全に濡れるまで（約５分間）浮遊させる。次いで、フィ
ルタを１００ｍ１の予備洗浄溶液（５０ｍｌ）リス−Ｃ
Ｉ （ｐＨ１８，０） 、Ｉ ＭＮａＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡおよび０．１％５Ｏ３）を含有するプラスチ
ック袋（たとえばジ−ルーア−ミール袋）へ移して、緩
和に攪拌しながら４２℃にて１〜２時間培養する。フィ
ルタを取り出しかつ排液した後、これを予備ハイブリッ
ド化熔液（５ｘＳＳＣ，５ｘデンハルト溶液。
０．１％ＳＤＳ、１００．ｕｇ／ｍｌの音波処理された
熱変性中胸腺ＤＮＡ）を含有する袋に入れる。
熱変性中胸腺ＤＮＡ）を含有する袋に入れる。
予備ハイブリッド化は、５０ｒｐｍに設定された振とう
水浴中にて６５℃で２〜４時間行われる。
水浴中にて６５℃で２〜４時間行われる。
（Ｆ）ハイブリッド化：
ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０またはＡＴＣ
Ｃ５３４１１からのＤＮＡをニック翻訳によってＰ３２
で標識し、かつプローブとして使用する。使用する準備
ができた際プローブを、このプローブを含有するチュー
ブを煮沸水中へ５分間浸漬し２次いで氷水中で急冷する
ことにより変性させる。予備ハイプリント化した後、こ
の予備ハイブリッド化溶液を絞り出しかつハイブリッド
化薄液（予備ハイブリッド化溶液＋１００μｇ／ｍｌの
酵母ｔＲＮＡおよび上記したような熱変性されたＰ３２
標識プローブ）で置換する。ハイブリッド化は、緩和に
攪拌しながら水浴中で６５℃にて４０〜４８時間行なう
。
Ｃ５３４１１からのＤＮＡをニック翻訳によってＰ３２
で標識し、かつプローブとして使用する。使用する準備
ができた際プローブを、このプローブを含有するチュー
ブを煮沸水中へ５分間浸漬し２次いで氷水中で急冷する
ことにより変性させる。予備ハイプリント化した後、こ
の予備ハイブリッド化溶液を絞り出しかつハイブリッド
化薄液（予備ハイブリッド化溶液＋１００μｇ／ｍｌの
酵母ｔＲＮＡおよび上記したような熱変性されたＰ３２
標識プローブ）で置換する。ハイブリッド化は、緩和に
攪拌しながら水浴中で６５℃にて４０〜４８時間行なう
。
（Ｇ）赫：
ハイブリッド化した後、これらの膜をプラスチック袋か
ら取り出し、かつプラスチック箱中に入れる。これら膜
を次いでゆっくり攪拌しながら６５℃にて２ＸＳＳＣ，
０，１％ＳＤＳにてそれぞれ３０分間づつ３回洗浄する
。
ら取り出し、かつプラスチック箱中に入れる。これら膜
を次いでゆっくり攪拌しながら６５℃にて２ＸＳＳＣ，
０，１％ＳＤＳにてそれぞれ３０分間づつ３回洗浄する
。
（Ｈ）自動放射能写真：
洗浄した膜を風乾しかつコダックＸＲＰ−５のＸ線フィ
ルムに露出させる。プローブに対しハイブリッド化した
これらのプラークは、フィルム上に黒い斑点を生ずる。
ルムに露出させる。プローブに対しハイブリッド化した
これらのプラークは、フィルム上に黒い斑点を生ずる。
（Ｉ）プラークの証明二
次いで、プローブとハイブリッド化しうる能力によって
候補であると確認されたプラークを釣り上げ、かつ各プ
ラークから新たな宿主細菌を含有するＴＬＡの上層を有
するＮＺＹ寒天プレート上へ穿刺して再検査する。この
手順を（Ｃ）から（Ｈ） まで反復する。
候補であると確認されたプラークを釣り上げ、かつ各プ
ラークから新たな宿主細菌を含有するＴＬＡの上層を有
するＮＺＹ寒天プレート上へ穿刺して再検査する。この
手順を（Ｃ）から（Ｈ） まで反復する。
ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０またはＡＴＣ
Ｃ５３４１１に対し同族性の個々のヌクレオチド配列を
有すると積極的に確認されたプラークを用いて、プラー
クから新たな増殖宿主細菌へ刺通することにより保存物
を増殖させる。これらの保存物を必要に応じて拡大する
ことができる。
Ｃ５３４１１に対し同族性の個々のヌクレオチド配列を
有すると積極的に確認されたプラークを用いて、プラー
クから新たな増殖宿主細菌へ刺通することにより保存物
を増殖させる。これらの保存物を必要に応じて拡大する
ことができる。
（Ｋ）工程Ａ−Ｊの結果：
この時点でＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０も
しくはＡＴＣＣ５３４１１の淋菌挿入体に対する同族性
に基づいてプラークを選択する。したがって、これらは
ＡＴＣＣ５３４０９、ＡＴＣＣ５３４１０もしくはＡＴ
ＣＣ５３４１１の淋菌挿入体の全部または１部を含有す
る淋菌から得られた大きい範囲のＤＮＡを有する。
しくはＡＴＣＣ５３４１１の淋菌挿入体に対する同族性
に基づいてプラークを選択する。したがって、これらは
ＡＴＣＣ５３４０９、ＡＴＣＣ５３４１０もしくはＡＴ
ＣＣ５３４１１の淋菌挿入体の全部または１部を含有す
る淋菌から得られた大きい範囲のＤＮＡを有する。
（Ｌ）ファージ ｆ からのＤＮＡの乍 ：ファージ保
存物１．５ ｍｌを１０ｍＭのＭ ｇ Ｓ Ｏ＊の存在
下に１０μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ■ （
シグマ・ケミカル・カンパニー社）により２５〜３０°
Ｃ（室温）で２時間切断する。
存物１．５ ｍｌを１０ｍＭのＭ ｇ Ｓ Ｏ＊の存在
下に１０μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ■ （
シグマ・ケミカル・カンパニー社）により２５〜３０°
Ｃ（室温）で２時間切断する。
この工程は宿主細胞の溶解後にバクテリオファージ保存
物に存在する全ての染色体ＤＮＡを切断する一方、バク
テリオファージ粒子の内部に存在するＤＮＡはバクテリ
オファージコート蛋白によって保護される。次いで、Ｔ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ）リス−ｃ、、ｐｎｓ、ｏ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）で平衡化した等容量のフェノールをバクテリ
オファージ粒子に添加しかつ激しく攪拌する。高速度遠
心分ｍ器（またはその均等物）にて９０００ｒｐｍにて
５分間遠心分離すると、界面に蛋白質が存在する２相の
分離をもたらす。
物に存在する全ての染色体ＤＮＡを切断する一方、バク
テリオファージ粒子の内部に存在するＤＮＡはバクテリ
オファージコート蛋白によって保護される。次いで、Ｔ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ）リス−ｃ、、ｐｎｓ、ｏ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）で平衡化した等容量のフェノールをバクテリ
オファージ粒子に添加しかつ激しく攪拌する。高速度遠
心分ｍ器（またはその均等物）にて９０００ｒｐｍにて
５分間遠心分離すると、界面に蛋白質が存在する２相の
分離をもたらす。
ＤＮＡを含有する上層（水性）を慎重に採取し、かつ１
／１０容積の３Ｍ Ｎａ０Ａｃと２容量の９５％ＥＴ
ＯＨを添加し、次いでドライアイス／ＥＴＯＨ浴内で冷
却することによりＤＮＡを沈澱させる。上澄液を９００
Ｏｒｐｍでの１゜分間の遠心分離により除去し、７０％
ＥＴＯｆ（／３０％Ｈ２０の溶液で迅速に洗浄する。次
いで、このペレットを凍結乾燥機で乾燥させ、かつ０．
１ ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁させる。
／１０容積の３Ｍ Ｎａ０Ａｃと２容量の９５％ＥＴ
ＯＨを添加し、次いでドライアイス／ＥＴＯＨ浴内で冷
却することによりＤＮＡを沈澱させる。上澄液を９００
Ｏｒｐｍでの１゜分間の遠心分離により除去し、７０％
ＥＴＯｆ（／３０％Ｈ２０の溶液で迅速に洗浄する。次
いで、このペレットを凍結乾燥機で乾燥させ、かつ０．
１ ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁させる。
（Ｍ）置型ｌすＵ匿：
次いで、５μβを種々の制限酵素の単独または組合せで
切断し、かつ得られた断片をゲル電気泳動によってＴＨ
Ｅ緩衝液（０，０８９Ｍ ｌ−リス−硼酸、０．８９Ｍ
硼酸、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）における０、７〜２
．０％アガロースゲルでの電気泳動によって分離する。
切断し、かつ得られた断片をゲル電気泳動によってＴＨ
Ｅ緩衝液（０，０８９Ｍ ｌ−リス−硼酸、０．８９Ｍ
硼酸、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）における０、７〜２
．０％アガロースゲルでの電気泳動によって分離する。
これらゲルを、５■／ｎｉ１の臭化エチジウム中に浸漬
し次いで２４０〜３４０ｎＭ波長の紫外線照射によって
ゲルを染色する。この時点で、全切断生成物（または多
過ぎる）を可使化するのに充分なりＮＡが存在するかど
うか、および切断が完全であったかどうかを決定すべき
である。ＤＮＡおよび制限酵素の量を変化させて、次の
切断に際し調整を行なうことができる。これら切断の各
生成物の分析は、各クローンにおける制限酵素部位の位
置に関する直線地図を与える。この糧の分析から、各種
のクローン間の重複領域を確認することができる。さら
に、これはサブクローン化のためどの酵素を使用すべき
かの選択を可能にする。
し次いで２４０〜３４０ｎＭ波長の紫外線照射によって
ゲルを染色する。この時点で、全切断生成物（または多
過ぎる）を可使化するのに充分なりＮＡが存在するかど
うか、および切断が完全であったかどうかを決定すべき
である。ＤＮＡおよび制限酵素の量を変化させて、次の
切断に際し調整を行なうことができる。これら切断の各
生成物の分析は、各クローンにおける制限酵素部位の位
置に関する直線地図を与える。この糧の分析から、各種
のクローン間の重複領域を確認することができる。さら
に、これはサブクローン化のためどの酵素を使用すべき
かの選択を可能にする。
サウザンプロットは、種々の制限酵素切断物を含有する
ゲルで構成することができ、ＡＴＣＣ５３４０９，５３
４１０もしくは５３４１１からの挿入物の位置を制限酵
素地図上に位置決定することができる。この時点で、こ
れら挿入体に直接隣接して切断する制限酵素を選択する
ことができ、かくして挿入体に直接隣接しかつ整列ヌク
レオチド配列となる配列をサブクローン１ヒさせかつ特
異性につき試験する。
ゲルで構成することができ、ＡＴＣＣ５３４０９，５３
４１０もしくは５３４１１からの挿入物の位置を制限酵
素地図上に位置決定することができる。この時点で、こ
れら挿入体に直接隣接して切断する制限酵素を選択する
ことができ、かくして挿入体に直接隣接しかつ整列ヌク
レオチド配列となる配列をサブクローン１ヒさせかつ特
異性につき試験する。
（Ｎ ）断片のサブクローン化：
バクテリオファージの保存物を拡大し、かつＤＮＡを作
成しく上記Ｋに記載したように）、各クローンにつきＤ
ＮＡの充分な供給量を得ることができる。ＤＮＡを、上
記工程で決定した適当な酵素により切断し、対応部位を
有するベクターをも切断する。この工程に対する適当な
ベクターは、サブクローン化用に使用する制限酵素の選
択によって決定される。有用と思われる１種のベクター
はｐｌＢＩ７６である。何故なら、これは多くの一般的
に使用される制限部位の人工的に作成した列の「ポリリ
ンカ」を有するからである。さらに、このベクターは、
ベクターと挿入ＤＮＡとの結合混合物で形質転換させた
後にクローンをアンピシリン耐性によるベクターの存在
につきかつまたＭ１３クローンにつき上記したように青
色対白色表現型によるベクター中の挿入体の存在につき
選択することができ、この場合白色プラークの代りに白
色コロニーを探す点で相違している。次いで、クローン
を釣り上げ、増殖させかつマニアチスにより記載された
標準法によってプラスミドＤＮＡを分離する。次いで、
これらクローンをｐ３２標識でニック翻訳し、かつ淋菌
に対し特異性であるクローンの同定を工程Ｉ（において
上記したと同様に行なうことができる。ＡＴＣＣ５３４
０９，５３４１０もしくは５３４１１からの淋菌挿入体
の整列ヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列から得
られたＤＮＡのクローンが上記したように淋菌に対し特
異性であると証明されれば、これら整列ヌクレオチド配
列に直接隣接したヌクレオチド配列をもクローン化させ
てその特異性につき試験することができる。
成しく上記Ｋに記載したように）、各クローンにつきＤ
ＮＡの充分な供給量を得ることができる。ＤＮＡを、上
記工程で決定した適当な酵素により切断し、対応部位を
有するベクターをも切断する。この工程に対する適当な
ベクターは、サブクローン化用に使用する制限酵素の選
択によって決定される。有用と思われる１種のベクター
はｐｌＢＩ７６である。何故なら、これは多くの一般的
に使用される制限部位の人工的に作成した列の「ポリリ
ンカ」を有するからである。さらに、このベクターは、
ベクターと挿入ＤＮＡとの結合混合物で形質転換させた
後にクローンをアンピシリン耐性によるベクターの存在
につきかつまたＭ１３クローンにつき上記したように青
色対白色表現型によるベクター中の挿入体の存在につき
選択することができ、この場合白色プラークの代りに白
色コロニーを探す点で相違している。次いで、クローン
を釣り上げ、増殖させかつマニアチスにより記載された
標準法によってプラスミドＤＮＡを分離する。次いで、
これらクローンをｐ３２標識でニック翻訳し、かつ淋菌
に対し特異性であるクローンの同定を工程Ｉ（において
上記したと同様に行なうことができる。ＡＴＣＣ５３４
０９，５３４１０もしくは５３４１１からの淋菌挿入体
の整列ヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列から得
られたＤＮＡのクローンが上記したように淋菌に対し特
異性であると証明されれば、これら整列ヌクレオチド配
列に直接隣接したヌクレオチド配列をもクローン化させ
てその特異性につき試験することができる。
これは、初期挿入体からもはや淋菌に対し特異性でなく
なるまで離間したクローンを釣り上げて反復することが
でき、ゲノム上のこの点を越える全てのヌクレオチド配
列は整列ヌクレオチド配列でなく、したがって本発明の
範囲内でない。淋菌に対し特異性である各クローンのＤ
ＮＡ挿入物はＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０
およびＡＴＣＣ５３４１１の各側における個々の整列ヌ
クレオチド配列を規定し、したがって本発明の範囲内で
ある。
なるまで離間したクローンを釣り上げて反復することが
でき、ゲノム上のこの点を越える全てのヌクレオチド配
列は整列ヌクレオチド配列でなく、したがって本発明の
範囲内でない。淋菌に対し特異性である各クローンのＤ
ＮＡ挿入物はＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０
およびＡＴＣＣ５３４１１の各側における個々の整列ヌ
クレオチド配列を規定し、したがって本発明の範囲内で
ある。
、１九ｌ
この実施例は、個々のヌクレオチド配列が本発明の組成
物であるかどうかを決定する。
物であるかどうかを決定する。
試験ドツトの作成
下記のＡＴＣＣ受託番号を有する６種の髄膜炎菌および
６種の淋菌を用いて試験ドツトを作成した： ＩｉＩ膜炎菌 淋菌 １、 ５３４１４ １． ５３４２０２、 ５３
４１５ ２． ５３４２１３、 ５３４１６
３． ５３４２２４、 ５３４１７ ４．
５３４２３５、 ５３４１８ ５． ５３４２４
６、 ５３４１９ ６． ５３４２５ＡＴＣＣは
、上記菌株の試料を凍結状態で供給する。１２種の菌株
のそれぞれを、４〜６枚のチョコレート寒天プレート上
にて培養物を綿棒で塗抹することにより増殖させた。Ｃ
ｏ２培養器（１０％ｃ、２）中にて１晩培養した後、菌
体を綿棒上に集めて収穫し、かつこれらをＴＥ緩衝液（
１０ｍＭ）リス−Ｃｌ 、 ｐＨ８，０，１ｍＭＥＤＴ
Ａ）で再懸濁させた。各プレートにつき１ｍｌのＴＥ緩
衝液を用いた。ナイセリアの染色体ＤＮＡを、ＳＤＳ
（最終濃度０．１％）で菌体を溶菌することにより単離
した。ＤＮＡを隘２２の注射器針に３〜４回通過させて
剪断し、次いでＲＮアーゼで切断しく１０μｇ／ｍｌ最
終濃度の室温にて３０分間の培養）かつフェノール抽出
（Ｔ’Ｅ飽和フェノールで３回）を行なった。酢酸ナト
リウム（ｐＨ７，４）を最終濃度０．３Ｍまで添加し、
次いで２倍容積の９５％エタノールを添加した。次いで
、染色体ＤＮＡをバッスールピペットを用いて集め、そ
の際沈澱ＤＮＡをエタノール溶液から吸い上げた。ＤＮ
Ａｕｉ維を試験管に移し、かつ７５％エタノール（２５
％ＴＦ、緩衝液）で２回洗浄した。残留するエタノール
を除去し、その際試験管をスピードバンク遠心分離器に
入れかつ減圧下で数分間操作した。次いで、ＤＮＡを小
容積のＴＥ＠衝液（培養物６枚につき約１ ｍｌ）を加
えて熔解させ、かつ時々緩和に攪拌しながら４℃にて１
晩静置させた。ＤＮＡの純度を、アガロースゲル電気泳
動によりかつ２６０ ｎｍおよび２８０ ｎｍにおける
光学密度の比を比較して検査した（ＤＮＡの良好な調製
物は１．８より高い比を有する筈である）。次いで、精
製された染色体ＤＮＡを０．２ＮＮａＯＨ（最終濃度）
にて室温で１０分間変性させ、かつｐＨをＮ ＨやＡｃ
の添加により約７．８に調整し、Ｉ Ｍ Ｎ Ｈ＋
Ａ ｃ ０．０２ＮＮ ａ ＯＨの最終濃度にした。
６種の淋菌を用いて試験ドツトを作成した： ＩｉＩ膜炎菌 淋菌 １、 ５３４１４ １． ５３４２０２、 ５３
４１５ ２． ５３４２１３、 ５３４１６
３． ５３４２２４、 ５３４１７ ４．
５３４２３５、 ５３４１８ ５． ５３４２４
６、 ５３４１９ ６． ５３４２５ＡＴＣＣは
、上記菌株の試料を凍結状態で供給する。１２種の菌株
のそれぞれを、４〜６枚のチョコレート寒天プレート上
にて培養物を綿棒で塗抹することにより増殖させた。Ｃ
ｏ２培養器（１０％ｃ、２）中にて１晩培養した後、菌
体を綿棒上に集めて収穫し、かつこれらをＴＥ緩衝液（
１０ｍＭ）リス−Ｃｌ 、 ｐＨ８，０，１ｍＭＥＤＴ
Ａ）で再懸濁させた。各プレートにつき１ｍｌのＴＥ緩
衝液を用いた。ナイセリアの染色体ＤＮＡを、ＳＤＳ
（最終濃度０．１％）で菌体を溶菌することにより単離
した。ＤＮＡを隘２２の注射器針に３〜４回通過させて
剪断し、次いでＲＮアーゼで切断しく１０μｇ／ｍｌ最
終濃度の室温にて３０分間の培養）かつフェノール抽出
（Ｔ’Ｅ飽和フェノールで３回）を行なった。酢酸ナト
リウム（ｐＨ７，４）を最終濃度０．３Ｍまで添加し、
次いで２倍容積の９５％エタノールを添加した。次いで
、染色体ＤＮＡをバッスールピペットを用いて集め、そ
の際沈澱ＤＮＡをエタノール溶液から吸い上げた。ＤＮ
Ａｕｉ維を試験管に移し、かつ７５％エタノール（２５
％ＴＦ、緩衝液）で２回洗浄した。残留するエタノール
を除去し、その際試験管をスピードバンク遠心分離器に
入れかつ減圧下で数分間操作した。次いで、ＤＮＡを小
容積のＴＥ＠衝液（培養物６枚につき約１ ｍｌ）を加
えて熔解させ、かつ時々緩和に攪拌しながら４℃にて１
晩静置させた。ＤＮＡの純度を、アガロースゲル電気泳
動によりかつ２６０ ｎｍおよび２８０ ｎｍにおける
光学密度の比を比較して検査した（ＤＮＡの良好な調製
物は１．８より高い比を有する筈である）。次いで、精
製された染色体ＤＮＡを０．２ＮＮａＯＨ（最終濃度）
にて室温で１０分間変性させ、かつｐＨをＮ ＨやＡｃ
の添加により約７．８に調整し、Ｉ Ｍ Ｎ Ｈ＋
Ａ ｃ ０．０２ＮＮ ａ ＯＨの最終濃度にした。
１２種の変性した精製染色体ＤＮＡのそれぞれにつき、
６個の試験ドツトを作成した。６個の試験ドツトのそれ
ぞれを１／１０のファクターによりＩ Ｍ Ｎ Ｈ＋
ＯＡ ｃでシリーズ希釈して、６個の試験ドツトが次
の量の変性した精製染色体ＤＮＡを含有するようにした
：５００ｎｇ。
６個の試験ドツトを作成した。６個の試験ドツトのそれ
ぞれを１／１０のファクターによりＩ Ｍ Ｎ Ｈ＋
ＯＡ ｃでシリーズ希釈して、６個の試験ドツトが次
の量の変性した精製染色体ＤＮＡを含有するようにした
：５００ｎｇ。
５０ｎｇ、５ｎｇ、０．５ｎｇ、５０ｐｇおよび５μｇ
、かくして、各菌株には全部で７２試験ドツトをもたら
すような６個の試験ドツトが存在した。
、かくして、各菌株には全部で７２試験ドツトをもたら
すような６個の試験ドツトが存在した。
式、ＤＮＡド・・ トの
適当量のＤＮＡを含有する１００〜２００μＥのＩＭＮ
ＨやＯＡｃを、３６個の試料マニホールドを有するドツ
ト吸取装置により１０インチＨｇの減圧下でニトロセル
ロース膜へ施こした。各試料をＬＭ ＮＨ＊ ＯＡｃ
および４×ＳＳＣで洗浄した。次いで、ニトロセルロー
ス膜を風乾し、かつ減圧オーブン内で８０℃にて減圧下
に１時間焼成した。このニトロセルロース膜は、乾燥剤
を入れた気密なプラスチック袋内に１ケ月程度の長い期
間にわたり使用前に貯蔵することができる。
ＨやＯＡｃを、３６個の試料マニホールドを有するドツ
ト吸取装置により１０インチＨｇの減圧下でニトロセル
ロース膜へ施こした。各試料をＬＭ ＮＨ＊ ＯＡｃ
および４×ＳＳＣで洗浄した。次いで、ニトロセルロー
ス膜を風乾し、かつ減圧オーブン内で８０℃にて減圧下
に１時間焼成した。このニトロセルロース膜は、乾燥剤
を入れた気密なプラスチック袋内に１ケ月程度の長い期
間にわたり使用前に貯蔵することができる。
試験ドツトに対するハイブリッド化
ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣ
Ｃ５３４１１の各組換ＤＮＡ分子のＲＦ ＤＮＡを、
そのイー・コリ宿主から分離した。それぞれは、Ｍ１３
バクテリオファージから得られたベクター中へ挿入した
淋菌ＤＮＡよりなる組換ＤＮＡ分子を含有する。次いで
、これら組換ＤＮＡ分子を、標準プラスミドＤＮＡ製造
法〔マニアチス参照〕を用いて細菌からＲＦ型として分
離する。
Ｃ５３４１１の各組換ＤＮＡ分子のＲＦ ＤＮＡを、
そのイー・コリ宿主から分離した。それぞれは、Ｍ１３
バクテリオファージから得られたベクター中へ挿入した
淋菌ＤＮＡよりなる組換ＤＮＡ分子を含有する。次いで
、これら組換ＤＮＡ分子を、標準プラスミドＤＮＡ製造
法〔マニアチス参照〕を用いて細菌からＲＦ型として分
離する。
次いで、ＲＦ ＤＮＡを標準技術〔マニアチス参照〕
によりニック翻訳でｐ３２標識して、ｐ３２標識の比活
性を１０’ 〜１０” ｃｐｍ／ＤＮＡμｇにした。
によりニック翻訳でｐ３２標識して、ｐ３２標識の比活
性を１０’ 〜１０” ｃｐｍ／ＤＮＡμｇにした。
次いで、ｐ！？標識したＲＦ ＤＮＡを用いて、下記
するように試験ドツトにハイブリッド化させた： ハイブリッド化前に、ニトロセルロース膜をプラスチッ
ク袋（たとえばシール・ア・ミール袋）内に入れ、この
袋は２ＸＳＳＣと５×デンハルト溶液と０．１％ＳＤＳ
と１００μｇ／ｍｌの音波処理した変性中胸腺ＤＮＡと
を含有し、このニトロセルロース膜をゆっくり振とうし
ながら６５℃にて２時間培養した。この予備ハイブリッ
ド化工程を用いて、マトリックス上に位置する或いはニ
トロセルロース膜上にまたは試験ＤＮＡドツトに位置す
る全ての非特異性結合部位を封鎖する。
するように試験ドツトにハイブリッド化させた： ハイブリッド化前に、ニトロセルロース膜をプラスチッ
ク袋（たとえばシール・ア・ミール袋）内に入れ、この
袋は２ＸＳＳＣと５×デンハルト溶液と０．１％ＳＤＳ
と１００μｇ／ｍｌの音波処理した変性中胸腺ＤＮＡと
を含有し、このニトロセルロース膜をゆっくり振とうし
ながら６５℃にて２時間培養した。この予備ハイブリッ
ド化工程を用いて、マトリックス上に位置する或いはニ
トロセルロース膜上にまたは試験ＤＮＡドツトに位置す
る全ての非特異性結合部位を封鎖する。
ｐ３２標識ＲＦ ＤＮＡを、水浴中で１０分間煮沸す
ることにより変性させた。この変性したｐ３２標ｉＲＦ
ＤＮＡを氷水中で急速冷却させ、次いで２ＸＳＳＣ
と５×デンハルト溶液と０．１％ＳＤＳと１００μｇ／
ｍｌの音波処理した熱変性中胸腺ＤＮＡと１００■／ｍ
ｌの酵母子ｔＲＮＡとよりなるハイブリッド化溶液に添
加した。次いで、この混合物を１枚もしくは数枚のニト
ロセルロース濾紙を含むプラスチック袋内に入れ、フィ
ルタのそれぞれは試験ドツトを含み、これをゆっくり攪
拌しながら６５℃にて約４０時装置いた。ハイブリッド
比の後、ニトロセルロース膜を袋から取り出し、かつそ
れぞれ予備加温した２ＸＳＳＣＳＯ，１％ＳＤＳで約３
０分間にわたり２回洗浄し、次いで０．２×ＳＳＣ，０
，１％ＳＤＳにてそれぞれ３０分間づつ２回洗浄し、こ
れら４回の洗浄は全てゆっくり攪拌しながら６５℃にて
行なった。次いで、この混合物を風乾した。
ることにより変性させた。この変性したｐ３２標ｉＲＦ
ＤＮＡを氷水中で急速冷却させ、次いで２ＸＳＳＣ
と５×デンハルト溶液と０．１％ＳＤＳと１００μｇ／
ｍｌの音波処理した熱変性中胸腺ＤＮＡと１００■／ｍ
ｌの酵母子ｔＲＮＡとよりなるハイブリッド化溶液に添
加した。次いで、この混合物を１枚もしくは数枚のニト
ロセルロース濾紙を含むプラスチック袋内に入れ、フィ
ルタのそれぞれは試験ドツトを含み、これをゆっくり攪
拌しながら６５℃にて約４０時装置いた。ハイブリッド
比の後、ニトロセルロース膜を袋から取り出し、かつそ
れぞれ予備加温した２ＸＳＳＣＳＯ，１％ＳＤＳで約３
０分間にわたり２回洗浄し、次いで０．２×ＳＳＣ，０
，１％ＳＤＳにてそれぞれ３０分間づつ２回洗浄し、こ
れら４回の洗浄は全てゆっくり攪拌しながら６５℃にて
行なった。次いで、この混合物を風乾した。
ハイブリッドにおけるｐ１２の放射能の定量次いで、ニ
トロセルロース濾紙をＸＩ、ＩＩフィルムに露出した。
トロセルロース濾紙をＸＩ、ＩＩフィルムに露出した。
次いで、現像したＸ線フィルムを基準マーカとして使用
し、その際これをフィルタ上へ載置して各試験ドツトを
フィルタから切除すると共に、シンチレーション流体を
含有する小壜内に入れた。
し、その際これをフィルタ上へ載置して各試験ドツトを
フィルタから切除すると共に、シンチレーション流体を
含有する小壜内に入れた。
次いで、各小壜をシンチレーションカウンタに入れ、か
つハイブリッドにおけるｐ３２の放射能を定量化した。
つハイブリッドにおけるｐ３２の放射能を定量化した。
ただし、ＰＩ３の放射能（ここで試験ドツトにおける変
性した精製染色体ＤＮＡの量は０．５ｎ、ｇ、５０ｐｇ
およびｓｐｇであった）は定量化しなかった。何故なら
、０．５ ｎ ｇにおけるカウント数／毎分は、マトリ
ックスのバックグランドにおけるよりも少ないカウント
数／毎分を与えるからである。毎分のカウント数として
マトリックスバックグランドを引算した後に得られる結
果を示せば次の通りである： 第１表 試験ドツトにおける変性した １１Δｌ床 精製染色体ＤＮＡの量 ５００ｎｇ ５０ｎｇ 反ＡＴＣＣ５３４
２０３７７５３８７３３＾ＴＣＣ５３４２１２０６９９
２３６２２７１＾ＴＣＣ５３４２２４３４９４４６６３
＾ＴＣＣ５３４２３１９０１０２４５５３０４ＡＴＣＣ
５３４２４１５９４２１７２７１８１八ＴＣ：Ｃ５３４
２５１９４７９２１４９２１７瞳膳速１１目１制 ＾ＴＣＣ５３４１４０００ 八ＴＣＣ５３４１５００６ 八ＴＣＣ５３４１６０００ 八ＴＣＣ５３４１７０００ ＾ＴＣＣ５３４１８０００ 八ＴＣＣ５３４１９００６３ 試験ドツトにおける変性した 液乳ｑ１床 精製染色体ＤＮＡの量 皿勤Ｌ 」艶Ｌ ｎＬ 八ＴＣＣ５３４２０５０９５１０ 八ＴＣＣ５３４２１７１９０８５４５４ＡＴＣＣ５３４
２２９３１８１６３１１０５ＡＴＣＣ５３４２３８０２
２７０ ＡＴＣＣ５３４２４８３３７００ ＡＴＣＣ５３４２５２２９６２１２０ 髄膜炎菌の菌株 ＡＴＣＣ５３４１４５６００ ＡＴＣＣ５３４１５２６００ ＡＴＣＣ５３４１６０００ ＡＴＣＣ５３４１７０００ ＡＴＣＣ５３４１８０００ 八ＴＣＣ５３４１９０００ 試験ドツトにおける変性した 淋ＩＩ目１株−精製染色体ＤＮＡのｍ ５００ｎｇ ５０ｎｇ ５ｎｇＡＴＣＣ５
３４２０９１１１３３０ ＡＴＣＣ５３４２１７９６４９８８１０８八ＴＣＣ５３
４２２９１２５２５９２２５６ＡＴＣＣ５３４２３２６
１７３２５０ ΔＴＣＣ５３４２４１４４８１３００ 八ＴＣＣ５３４２５４２０４５２１− 髄膜炎菌の菌株 八ＴＣＣ５３４１４０００ ＡＴＣＣ５３４１５６００ 八ＴＣＣ５３４１６０００ 八ＴＣＣ５３４１７０００ ＾ＴＣＣ５３４１８０００ ＡＴＣＣ５３４１９０４０ 試験ドツトの精製染色体ＤＮＡ５００ｎｇによるカウン
ト数／ｎ＋ｉｎ、すなわち試験ドツトの精製染色体ＤＮ
Ａの等量（５００ｎｇ）に基準化された試験ドツトにハ
イブリッド化する淋菌ＤＮＡの量を次いでＡＴＣＣ５３
４０９゜ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１
につき計算した。
性した精製染色体ＤＮＡの量は０．５ｎ、ｇ、５０ｐｇ
およびｓｐｇであった）は定量化しなかった。何故なら
、０．５ ｎ ｇにおけるカウント数／毎分は、マトリ
ックスのバックグランドにおけるよりも少ないカウント
数／毎分を与えるからである。毎分のカウント数として
マトリックスバックグランドを引算した後に得られる結
果を示せば次の通りである： 第１表 試験ドツトにおける変性した １１Δｌ床 精製染色体ＤＮＡの量 ５００ｎｇ ５０ｎｇ 反ＡＴＣＣ５３４
２０３７７５３８７３３＾ＴＣＣ５３４２１２０６９９
２３６２２７１＾ＴＣＣ５３４２２４３４９４４６６３
＾ＴＣＣ５３４２３１９０１０２４５５３０４ＡＴＣＣ
５３４２４１５９４２１７２７１８１八ＴＣ：Ｃ５３４
２５１９４７９２１４９２１７瞳膳速１１目１制 ＾ＴＣＣ５３４１４０００ 八ＴＣＣ５３４１５００６ 八ＴＣＣ５３４１６０００ 八ＴＣＣ５３４１７０００ ＾ＴＣＣ５３４１８０００ 八ＴＣＣ５３４１９００６３ 試験ドツトにおける変性した 液乳ｑ１床 精製染色体ＤＮＡの量 皿勤Ｌ 」艶Ｌ ｎＬ 八ＴＣＣ５３４２０５０９５１０ 八ＴＣＣ５３４２１７１９０８５４５４ＡＴＣＣ５３４
２２９３１８１６３１１０５ＡＴＣＣ５３４２３８０２
２７０ ＡＴＣＣ５３４２４８３３７００ ＡＴＣＣ５３４２５２２９６２１２０ 髄膜炎菌の菌株 ＡＴＣＣ５３４１４５６００ ＡＴＣＣ５３４１５２６００ ＡＴＣＣ５３４１６０００ ＡＴＣＣ５３４１７０００ ＡＴＣＣ５３４１８０００ 八ＴＣＣ５３４１９０００ 試験ドツトにおける変性した 淋ＩＩ目１株−精製染色体ＤＮＡのｍ ５００ｎｇ ５０ｎｇ ５ｎｇＡＴＣＣ５
３４２０９１１１３３０ ＡＴＣＣ５３４２１７９６４９８８１０８八ＴＣＣ５３
４２２９１２５２５９２２５６ＡＴＣＣ５３４２３２６
１７３２５０ ΔＴＣＣ５３４２４１４４８１３００ 八ＴＣＣ５３４２５４２０４５２１− 髄膜炎菌の菌株 八ＴＣＣ５３４１４０００ ＡＴＣＣ５３４１５６００ 八ＴＣＣ５３４１６０００ 八ＴＣＣ５３４１７０００ ＾ＴＣＣ５３４１８０００ ＡＴＣＣ５３４１９０４０ 試験ドツトの精製染色体ＤＮＡ５００ｎｇによるカウン
ト数／ｎ＋ｉｎ、すなわち試験ドツトの精製染色体ＤＮ
Ａの等量（５００ｎｇ）に基準化された試験ドツトにハ
イブリッド化する淋菌ＤＮＡの量を次いでＡＴＣＣ５３
４０９゜ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１
につき計算した。
第■表
試験ドツトにおける変性した
淋菌の菌株 精製染色体ＤＮＡの量
５００ｎｇ ５０ｎｇ 担−ＡＴＣＣ５３
４２０３７７５３８７０３３００ΔＴＣＣ５３４２１２
０６９９２３６２０２７１００＾ＴＣＣ５３４２２４３
４９４４８０６３００ＡＴＣＣ５３４２３１９０１０２
４５５０３０４００ＡＴＣＣ５３４２４１５９４２１７
２７０１８１００＾ＴＣＣ５３４２５１９４７９２１４
９０２１７０ＯｒｇＡ膜炎菌の菌株 ＡＴＣＣ５３４１４０００ ＾ＴＣＣ５３４１５００６００ ＡＴＣＣ５３４１６０００ ＡＴＣＣ５３４１７０００ ＡＴＣＣ５３４１８０００ ＾ＴＣＣ５３４１９００８３００ 試験ドツトにおける変性した 淋菌の菌株 精製染色体ＤＮＡの量 ５００ｎｇ ５０ｎｇ ５ｎｇＡＴＣＣ５
３４２０５０９５１００ 八ＴＣＣ５３４２１７１９０８５４０５４００ＡＴＣＣ
５３４２２９３１８１６３１０１０５００＾ＴＣＣ５３
４２３８０２２７００ ＡＴＣＣ５３４２４８３３７０００ ＡＴＣＣ５３４２５２２９６２１２００髄膜炎菌の菌株 ＾ＴＣＣ５３４１４５６００ ＡＴＣＣ５３４１５２６００ ＡＴＣＣ５３４１６０００ 八ＴＣＣ５３４１７０００ ＡＴＣＣ５３４１８０００ ＡＴＣＣ５３４１９０００ 試験ドツトにおける変性した 淋菌の菌株 精製染色体ＤＮＡの量 ５００ｎｇ ５０ｎｇ ５ｎｇ＾↑ＣＣ５
３４２０９１１１３３００ 八ＴＣＣ５３４２１７９６４９８８０１０８００ＡＴＣ
Ｃ５３４２２９１２５２５９２０２５６００ＡＴＣＣ５
３４２３２６１７３２５００＾ＴＣＣ５３４２４１４４
８１３０００＾ＴＣＣ５３４２５４２０４５２１０−ｌ
艮え１Δｌ床 ＡＴＣＣ５３４１４０００ ＾ＴＣＣ５３４１５６００ ＡＴＣＣ５３４１６０００ 八ＴＣＣ５３４１７０００ ＡＴＣＣ５３４１８０００ ＾ＴＣＣ５３４１９０４００ 試験ド、ットの精製染色体ＤＮＡの等量（５００ｎｇ）
に基準化したドツトに対しハイブリッド化する淋菌ＤＮ
Ａの平均量を次いで第■表のデータを用いて計算し、淋
菌およびＷ、ｆｌ膜炎菌の各菌株における６（１の試験
ドツトにつきそれぞれ計算した。これらは（１）殆んど
同一であるもの、および（２）の１０のファクタだけ異
なる試験ドツトの精製染色体ＤＮＡの量によって平均を
計算する。それらの結果は次の通りであった：ｍｉｎ
） 淋菌の菌株 八ＴＣＣ５３４２０３８２２ ＡＴＣＣ５３４２１２２１６０ 八ＴＣＣ５３４２２４４０５ ＡＴＣＣ５３４２３２１７８０ 八ＴＣＣ５３４２４１７６８５ 八ＴＣＣ５３４２５２１５９５ （ａｉ膜炎菌の菌株 ＾ＴＣＣ５３４１４０ ＡＴＣＣ５３４１５０ 八ＴＣＣ５３４１６０ 八ＴＣＣ５３４１７０ ＡＴＣＣ５３４１８０ ＡＴＣＣ５３４１９０ ｍ１ｎ ） 淋菌の菌株 八ＴＣＣ５３４２０５１０ 八ＴＣＣ５３４２１７８６５ 八ＴＣＣ５３４２２１３４０５ ＾ＴＣＣ５３４２３５３６ 八ＴＣＣ５３４２４７６７ ＡＴＣＣ５３４２５２２０Ｂ １１夫乳Δｉ床 八ＴＣＣ５３４１４０ ＡＴＣＣ５３４１５０ ＾ＴＣＣ５３４１６０ ＡＴＣＣ５３４１７０ ＾ＴＣＣ５３４１８Ｇ ＡＴＣＣ５３４１９０ ｍ１ｎ ） 淋菌の菌株 八ＴＣＣ５３４２０１１２１ ＡＴＣＣ５３４２１１０３４０ 八ＴＣＣ５３４２２２５７６０ ＡＴＣＣ５３４２３２９３４ ＡＴＣＣ５３４２４１３７４ ＡＴＣＣ５３４２５４７０７ ｋ」夫匠Δｌ隨 ＡＴＣＣ５３４１４０ ＡＴＣＣ５３４１５０ ＾ＴＣＣ５３４１６０ ＡＴＣＣ５３４１７０ ＡＴＣＣ５３４１８０ ＡＴＣＣ５３４１９２０ ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣ
Ｃ５３４１１につき淋菌に関する第■表のデータにおけ
るカウント数／ｌｌｌ１ｎの最低数、およびＡＴＣＣ５
３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１
１につき髄模炎菌に関する第■表のカウント数／ｍｉｎ
の最高数を次いで計算した。それらの結果は次の通りで
あった： 第■表 八ＴＣＣ５３４０９３８２２ 八ＴＣＣ５３４１０５１０ ＾ＴＣＣ５３４１１１１２１ 八ＴＣＣ５３４０９０ 八ＴＣＣ５３４１００ ＡＴＣＣ５３４１１２０ −かくして、淋菌の６種の各菌株における精製染色体Ｄ
ＮＡの等量に基準化した６種の淋菌の各菌株における精
製染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化した淋菌ＤＮＡの
平均量の最低値と、髄膜炎菌の６種の各菌株における精
製染色体ＤＮＡの等量に基準化した６種の髄膜炎菌の各
菌株における精製染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化し
た淋菌ＤＮＡの最高平均量との比は次の通りである： ＡＴＣＣ５３４０９−３８２２：０ ＾ＴＣＣ５３４１０−ｓｔｏ：。
４２０３７７５３８７０３３００ΔＴＣＣ５３４２１２
０６９９２３６２０２７１００＾ＴＣＣ５３４２２４３
４９４４８０６３００ＡＴＣＣ５３４２３１９０１０２
４５５０３０４００ＡＴＣＣ５３４２４１５９４２１７
２７０１８１００＾ＴＣＣ５３４２５１９４７９２１４
９０２１７０ＯｒｇＡ膜炎菌の菌株 ＡＴＣＣ５３４１４０００ ＾ＴＣＣ５３４１５００６００ ＡＴＣＣ５３４１６０００ ＡＴＣＣ５３４１７０００ ＡＴＣＣ５３４１８０００ ＾ＴＣＣ５３４１９００８３００ 試験ドツトにおける変性した 淋菌の菌株 精製染色体ＤＮＡの量 ５００ｎｇ ５０ｎｇ ５ｎｇＡＴＣＣ５
３４２０５０９５１００ 八ＴＣＣ５３４２１７１９０８５４０５４００ＡＴＣＣ
５３４２２９３１８１６３１０１０５００＾ＴＣＣ５３
４２３８０２２７００ ＡＴＣＣ５３４２４８３３７０００ ＡＴＣＣ５３４２５２２９６２１２００髄膜炎菌の菌株 ＾ＴＣＣ５３４１４５６００ ＡＴＣＣ５３４１５２６００ ＡＴＣＣ５３４１６０００ 八ＴＣＣ５３４１７０００ ＡＴＣＣ５３４１８０００ ＡＴＣＣ５３４１９０００ 試験ドツトにおける変性した 淋菌の菌株 精製染色体ＤＮＡの量 ５００ｎｇ ５０ｎｇ ５ｎｇ＾↑ＣＣ５
３４２０９１１１３３００ 八ＴＣＣ５３４２１７９６４９８８０１０８００ＡＴＣ
Ｃ５３４２２９１２５２５９２０２５６００ＡＴＣＣ５
３４２３２６１７３２５００＾ＴＣＣ５３４２４１４４
８１３０００＾ＴＣＣ５３４２５４２０４５２１０−ｌ
艮え１Δｌ床 ＡＴＣＣ５３４１４０００ ＾ＴＣＣ５３４１５６００ ＡＴＣＣ５３４１６０００ 八ＴＣＣ５３４１７０００ ＡＴＣＣ５３４１８０００ ＾ＴＣＣ５３４１９０４００ 試験ド、ットの精製染色体ＤＮＡの等量（５００ｎｇ）
に基準化したドツトに対しハイブリッド化する淋菌ＤＮ
Ａの平均量を次いで第■表のデータを用いて計算し、淋
菌およびＷ、ｆｌ膜炎菌の各菌株における６（１の試験
ドツトにつきそれぞれ計算した。これらは（１）殆んど
同一であるもの、および（２）の１０のファクタだけ異
なる試験ドツトの精製染色体ＤＮＡの量によって平均を
計算する。それらの結果は次の通りであった：ｍｉｎ
） 淋菌の菌株 八ＴＣＣ５３４２０３８２２ ＡＴＣＣ５３４２１２２１６０ 八ＴＣＣ５３４２２４４０５ ＡＴＣＣ５３４２３２１７８０ 八ＴＣＣ５３４２４１７６８５ 八ＴＣＣ５３４２５２１５９５ （ａｉ膜炎菌の菌株 ＾ＴＣＣ５３４１４０ ＡＴＣＣ５３４１５０ 八ＴＣＣ５３４１６０ 八ＴＣＣ５３４１７０ ＡＴＣＣ５３４１８０ ＡＴＣＣ５３４１９０ ｍ１ｎ ） 淋菌の菌株 八ＴＣＣ５３４２０５１０ 八ＴＣＣ５３４２１７８６５ 八ＴＣＣ５３４２２１３４０５ ＾ＴＣＣ５３４２３５３６ 八ＴＣＣ５３４２４７６７ ＡＴＣＣ５３４２５２２０Ｂ １１夫乳Δｉ床 八ＴＣＣ５３４１４０ ＡＴＣＣ５３４１５０ ＾ＴＣＣ５３４１６０ ＡＴＣＣ５３４１７０ ＾ＴＣＣ５３４１８Ｇ ＡＴＣＣ５３４１９０ ｍ１ｎ ） 淋菌の菌株 八ＴＣＣ５３４２０１１２１ ＡＴＣＣ５３４２１１０３４０ 八ＴＣＣ５３４２２２５７６０ ＡＴＣＣ５３４２３２９３４ ＡＴＣＣ５３４２４１３７４ ＡＴＣＣ５３４２５４７０７ ｋ」夫匠Δｌ隨 ＡＴＣＣ５３４１４０ ＡＴＣＣ５３４１５０ ＾ＴＣＣ５３４１６０ ＡＴＣＣ５３４１７０ ＡＴＣＣ５３４１８０ ＡＴＣＣ５３４１９２０ ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣ
Ｃ５３４１１につき淋菌に関する第■表のデータにおけ
るカウント数／ｌｌｌ１ｎの最低数、およびＡＴＣＣ５
３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１
１につき髄模炎菌に関する第■表のカウント数／ｍｉｎ
の最高数を次いで計算した。それらの結果は次の通りで
あった： 第■表 八ＴＣＣ５３４０９３８２２ 八ＴＣＣ５３４１０５１０ ＾ＴＣＣ５３４１１１１２１ 八ＴＣＣ５３４０９０ 八ＴＣＣ５３４１００ ＡＴＣＣ５３４１１２０ −かくして、淋菌の６種の各菌株における精製染色体Ｄ
ＮＡの等量に基準化した６種の淋菌の各菌株における精
製染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化した淋菌ＤＮＡの
平均量の最低値と、髄膜炎菌の６種の各菌株における精
製染色体ＤＮＡの等量に基準化した６種の髄膜炎菌の各
菌株における精製染色体ＤＮＡに対しハイブリッド化し
た淋菌ＤＮＡの最高平均量との比は次の通りである： ＡＴＣＣ５３４０９−３８２２：０ ＾ＴＣＣ５３４１０−ｓｔｏ：。
八ＴＣＣ５３４１１−１１２１＝ ２０したがって、こ
の比は約５より大であるため、ＡＴＣＣ５３４０９，Ａ
ＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１の淋菌ＤＮ
Ａ挿入体はそれぞれ本発明の組成物となる。
の比は約５より大であるため、ＡＴＣＣ５３４０９，Ａ
ＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１の淋菌ＤＮ
Ａ挿入体はそれぞれ本発明の組成物となる。
Claims (9)
- （１）少なくとも１種の個々のヌクレオチド配列を含む
淋菌に対し特異的な物質の組成物において、次の６種の
淋菌： １）ＡＴＣＣ５３４２０ ２）ＡＴＣＣ５３４２１ ３）ＡＴＣＣ５３４２２ ４）ＡＴＣＣ５３４２３ ５）ＡＴＣＣ５３４２４ ６）ＡＴＣＣ５３４２５ の精製染色体ＤＮＡにハイブリッド化された前記組成物
の平均量を前記６種の淋菌の精製染色体ＤＮＡの等量に
基準化した最低値と、次の６種の髄膜炎菌： １）ＡＴＣＣ５３４１４ ２）ＡＴＣＣ５３４１５ ３）ＡＴＣＣ５３４１６ ４）ＡＴＣＣ５３４１７ ５）ＡＴＣＣ５３４１８ ６）ＡＴＣＣ５３４１９ の精製染色体ＤＮＡにハイブリッド化した前記組成物の
平均量を前記６種の髄膜炎菌の精製染色体ＤＮＡの等量
に基準化した最高値との比が、約５より大であることを
特徴とする淋菌に特異的な物質の組成物。 - （２）比が約２５より大である特許請求の範囲第１項記
載の組成物。 - （３）比が約５０より大である特許請求の範囲第２項記
載の組成物。 - （４）個々のヌクレオチド配列が ａ、ＡＴＣＣ５３４０９、 ＡＴＣＣ ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１の 淋菌ＤＮＡ挿入体並びにその個々のヌクレ オチドサブ配列、 ｂ、ＡＴＣＣ５３４０９、ＡＴＣＣ ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１の 淋菌ＤＮＡ挿入体における個々の整列 （ｆｌａｎｋｉｎｇ）ヌクレオチド配列、並びにその個
々のヌクレオチドサブ配列、 ｃ、前記挿入体、サブ配列および配列のいずれかにおけ
る突然変異した個々のヌクレオ チド配列、並びに ｄ、その混合物 よりなる群から選択される特許請求の範囲第１項記載の
組成物。 - （５）個々のヌクレオチド配列が ａ、特許請求の範囲第４項記載の個々のヌクレオチド配
列にハイブリッド化しうる個々 のヌクレオチド配列、 ｂ、前記個々のヌクレオチド配列のいずれかにおける個
々の整列ヌクレオチド配列、 ｃ、前記個々のヌクレオチド配列および個々の整列ヌク
レオチド配列のいずれかの個々 のヌクレオチド配列、および ｄ、前記個々のヌクレオチド配列、個々の整列ヌクレオ
チド配列および個々のヌクレオ チドサブ配列のいずれかにおける突然変異 した個々のヌクレオチド配列 よりなる群から選択される特許請求の範囲第１項記載の
組成物。 - （６）主として ａ、ＡＴＣＣ５３４０９、ＡＴＣＣ ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１の 淋菌ＤＮＡ挿入体およびその個々のヌクレ オチドサブ配列、 ｂ、ＡＴＣＣ５３４０９、ＡＴＣＣ ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１の 淋菌ＤＮＡ挿入体における個々の整列ヌク レオチド配列およびその個々のヌクレオチ ドサブ配列、並びに ｃ、前記挿入体、サブ配列および配列のいずれかにおけ
る突然変異した個々のヌクレオ チド配列 よりなる群から選択されるヌクレオチド配列よりなるこ
とを特徴とするヌクレオチド配列。 - （７）ポリヌクレオチドプローブを用いて淋菌を検出す
るための核酸ハイブリッド化分析法において、前記ポリ
ヌクレオチドプローブとして特許請求の範囲第１項記載
の組成物よりなる群から選択される組成物を使用し、こ
の組成物が検出可能なマーカによって標識されているこ
とを特徴とする核酸ハイブリッド化分析法。 - （８）ポリヌクレオチドプローブが特許請求の範囲第４
項記載の組成物よりなる群から選択される組成物である
特許請求の範囲第７項記載の方法。 - （９）遺伝上明確な群に対し特異的なヌクレオチド配列
をスクリーニングするに際し、 ａ、スクリーニングすべきヌクレオチド配列の各試料に
つき別々の試験ドットをマトリ ックス上に形成し、各試験ドットは前記試 料の１つから得られる一本鎖型の精製ＤＮＡを含み、 ｂ、前記試験ドットをハイブリッド化条件下で前記ヌク
レオチド配列と接触させ、前記 ヌクレオチド配列はバクテリオファージ ＤＮＡにおける一本鎖ヌクレオチド配列挿 入体であり、前記バクテリオファージはそ のライフサイクル中に一本鎖ＤＮＡ段階を 有するバクテリオファージであり、 ｃ、前記試験ドットにハイブリッド化しなかったヌクレ
オチド配列を前記試験ドットに ハイブリッド化したヌクレオチド配列から 分離し、 ｄ、前記試験ドットをハイブリッド化条件下で前記バク
テリオファージの変性二重鎖 ＤＮＡと接触させ、前記バクテリオファー ジの前記変性二重鎖ＤＮＡはこれに結合し た検出可能なマーカを有し、 ｅ、前記試験ドットにハイブリッド化したバクテリオフ
ァージの二重鎖ＤＮＡを前記試 験ドットにハイブリッド化しなかったバク テリオファージの二重鎖ＤＮＡから分離し、かつ ｆ、ヌクレオチド配列を前記検出可能なマーカによって
検出する ことを特徴とするヌクレオチド配列のスクリーニング方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/823,921 US4900659A (en) | 1986-01-30 | 1986-01-30 | Nucleotide sequence composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae and method for screening for a nucleotide sequence that is specific for a genetically distinct group |
| US823921 | 1986-01-30 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8294218A Division JP2820675B2 (ja) | 1986-01-30 | 1996-11-06 | 遺伝上明確な群に対する特異的なヌクレオチド配列するヌクレオチド配列のスクリーニング方法 |
| JP29421796A Division JP3532045B2 (ja) | 1986-01-30 | 1996-11-06 | 淋菌を検出するためのヌクレオチド配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62208300A true JPS62208300A (ja) | 1987-09-12 |
Family
ID=25240126
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62016328A Pending JPS62208300A (ja) | 1986-01-30 | 1987-01-28 | 淋菌を検出するためのヌクレオチド配列組成物および方法，並びに遺伝上明確な群に対し特異的なヌクレオチド配列のスクリ−ニング方法 |
| JP29421796A Expired - Lifetime JP3532045B2 (ja) | 1986-01-30 | 1996-11-06 | 淋菌を検出するためのヌクレオチド配列 |
| JP8294218A Expired - Lifetime JP2820675B2 (ja) | 1986-01-30 | 1996-11-06 | 遺伝上明確な群に対する特異的なヌクレオチド配列するヌクレオチド配列のスクリーニング方法 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29421796A Expired - Lifetime JP3532045B2 (ja) | 1986-01-30 | 1996-11-06 | 淋菌を検出するためのヌクレオチド配列 |
| JP8294218A Expired - Lifetime JP2820675B2 (ja) | 1986-01-30 | 1996-11-06 | 遺伝上明確な群に対する特異的なヌクレオチド配列するヌクレオチド配列のスクリーニング方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4900659A (ja) |
| EP (1) | EP0237737B1 (ja) |
| JP (3) | JPS62208300A (ja) |
| CA (1) | CA1299073C (ja) |
| DE (1) | DE3787299T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JPH0799998A (ja) * | 1993-06-23 | 1995-04-18 | F Hoffmann La Roche Ag | ナイセリア・ゴノレエの検出方法、並びにそのための試薬およびキット |
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