JPS62222158A - 酵素センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、酵素の選択的な触媒作用を利用して、尿やバ
イオリアクター中などの糖、蛋白質などを簡便に測定す
ることができる酵素センサに関し、特にその検出部の構
造に関する。

災釆皮権 従来、尿中の糖や蛋白などの検出には、試験紙法がよく
用いられている。しかし、この方法は定性的であり、ま
た１判定の結果に熟練を要するなどの問題点があった。

また、この判定部分を機械化した装置も市販されている
が、高価なものであった。

一方、尿中の糖や蛋白などの分析方法として、固定化酵
素を利用し、酸素電極などと組み合わせて測定する方法
が知られている。糖を例に挙げて説明すると、グルコー
スオキシダーゼによりグルコースが酸化されてグルコン
酸と過酸化水素を生成する反応を利用し。

糖の分解のために必要な酸素の消費量を酸素電極により
、あるいは過酸化水素の生成量を過酸化水素電極により
定量する方法が一般的である。

しかし、この方法は微量の酸素または過酸化水素を測定
する必要があるため、精密な分析器機を必要とし、また
、これらの検出部は温度による影響を受けやすく、測定
環境を一定化するなどの処理が必要であり面倒であった
。

純水中での糖の検出方法としては、ｐｌ＋電極と糖分解
酵素とを組合せ、糖の分解により生成するグルコン酸を
ｐｌ＋電極で測定し、糖を定量することが報告されてい
る（「計装ＪｌＶｏｌ　２７．　（７）。

Ｐ３４−３９（１，９８４）　、前田ａ雄／花里善夫「
複合検出型バイオセンサ素子と応用の考え方」）。この
方法によれば、ｐＨ電極により測定が可能であるため取
扱いも簡便であり、また、測定装置自体も簡略化されて
安価なものとなる。

しかしながら、この方法により尿中の糖などを検出しよ
うとすると、尿に含まれるリン酸塩により妨害されて検
出が不可能であった。即ち、リン酸塩のもつｐＨ緩衝効
果のために、グルコースの分解によりグルコン酸が生成
しても、それをρ１１の変化として正確に検知できなか
った。この事情はバイオリアクターにおいても同様であ
る。バイオリアクターでは反応の進行にともなって最適
ρ１（値から逸脱しないように、リン酸塩などの日Ｉ緩
衝剤が添加されているのが通例である。

ρＩ＋の測定に先立って、リン酸塩を沈澱法やカラムに
よる吸着などにより除去すれば、グルコン酸の生成に伴
うｐＨの変化を測定することが可能となるが、これらの
前処理は極めて煩雑であり、実用的でない。

澄明の目的一 本発明は、リン酸塩などのアニオン性の妨害成分が共存
する場合でも、取扱いの簡単なｐＨ電極等を用い、糖や
蛋白などを簡便に検出、定量することのできる酵素セン
サを提供するものである。

２刃］（７［慮 本発明の酵素センサは、ｐｌ＋検出部と、これに近接し
て設けられた酵素固定化膜とを有し、該酵素固定化膜に
より被検出液中の特定の成分を他の物質に変換せしめ、
この変換に伴うｐＨの変化を前記ｐＨ検出部により検出
するようにした酵素センサであって、前記ｐＨ検出部と
酵素固定化膜とを被包するようにしてアニオン性膜が設
けられていることを特徴とする 以下、添付図面に沿って本発明をさらに詳細に説明する
。

第１図は、本発明の酵素センサの検出部近傍の構成例を
示す断面図である。ｐＨ検出部材１１の検出部１３の前
面には酵素固定化膜１５が設けられ、さらにその前面に
、検出部１３および酵素固定化膜１５を被包するように
アニオン性膜１７が設けられており、これらは○リング
２１を介して押え環２３によりｐＨ検出部材１１に固定
されている。ここで、「被包するようにして設けられる
」とは、　ＰＨ検出部を被検出液に浸漬したときに、酵
素固定化膜および検出部が直接液に曝されないように。

これらの前面にこれらを保護するようにしてアニオン性
膜が設けられていることを意味し、実際に包まれている
ことは問わない。

Ｐｉ＋検出部材１１としては、汎用品としてｐ＋＋ガラ
ス電極が知られておりこれが一般的であるが、半導体素
子を利用したｐＨ−ＩＳＦＥＴ［Ｉｏｎ　５ｅｎｓｉｔ
ｊ、ｖｅＦｅｉｌｄ　Ｅｆｆｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｉｓｔ
ｏｒの略（イオン感応性電界効果型トランジスタ）］な
ど、ｐｌ＋変化を検知しうるちのであれば、いずれもが
使用できる。

酵素固定化膜１５としては、たとえば、共有結合法、架
橋法、包括法などの手法で作成することができる。酵素
は、測定対象に応じて適宜選択され、変換によりρ１１
変化が生じるように、Ｋｌ’ｌ定対象を分解などにより
他の物質に変換する活性を有するものが用いられる。た
とえば、糖をｉ１１’ｌ定対象とす場合はグルコースオ
キシダーゼなどの糖分解酵素が用いられ、これによりグ
ルコースがグルコン酸に変化して、ｐＨ変化が生じる。

また、測定対象が蛋白質の場合は、酵素としてプロテア
ーゼもしくはペプシン等を使用することにより、蛋白質
がアミノ酸に変化し、ｐｏが変化する。ガラス繊維をベ
ースにグルコースオキシダーゼを共有結合させた膜が市
販されており、これを糖の検出に使用することもできる
。

アニオン性膜は、水中でアニオン性を帯び、リン酸イオ
ンのように同種の荷電を有するイオンの通過を阻害する
。一方、水中に溶解している糖や蛋白質などは殆どイオ
ン性がないので、アニオン性膜に妨害されることなく、
これをを通過することができる。糖や蛋白質などのイオ
ン的に中性な物質は、水を媒介としてアニオン性膜に拡
散、浸透するものと考えれる。

このようなアニオン性膜は、たとえば、膜材としてポリ
ビニルアルコールを用い、これにアニオン性界面活性剤
を添加することにより得られる。ここでアニオン界面活
性剤としては５直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（Ｌ
ＡＳ）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯ３）、アル
キル硫Ｍ塩（ＡＳ）、石けんなどが例示され、特にＣＡ
Ｓはリン酸塩に対して良好な遮蔽効果を示す。また、こ
れらの塩としては、ナトリウム塩が代表的である。（ａ
）膜材と（ｂ）アニオン界面活性剤との比率は、　（ａ
）／（ｂ）＝８／２−５１５（乾燥重量比）の範囲が好
ましい。アニオン界面活性剤の量を増加するほどリン酸
塩のアニオンの遮蔽効果が良好となるが、あまり多量に
配合しすぎると膜の強度が失われて好ましくない。

次にアニオン性膜の具体的な製造例について説明する。

エステル化度９０％以上のポリビニルアルコールを１０
νｔ％程度に水で希釈したものと、アニオン界面活性剤
とを混合し、ついで、水分が２５〜３５％程度になるま
で乾燥したのち、グルタルアルデヒドなどの架橋剤で架
橋する。架橋は、ポリビニルアルコールの溶解を抑える
ために食塩飽和下で行い、反応を開始するためにＰｌ＋
２〜３に調整し、４０℃以上の温度で５〜３０分行う。

この際、温度が高いほど架橋反応は早くなる。架橋反応
が進みすぎると、生成するアニオン性膜が硬化して脆く
なり、破れやすくなる。

第１図に示した検出部材１１を尿中に浸漬すると、リン
酸イオンはアニオン性膜１７により遮蔽されて、その内
部に浸透していかない。一方、糖はイオン的に中性であ
るので、アニオン性膜１７により遮蔽されることなく、
これを通過して酵素固定化膜１５に至る。このとき、ア
ニオン性膜は水を含んで膨潤状態にあり、この水を介し
て糖が酵素固定化膜１５に拡散していくと考えられる。

Ｎ（グルコース）は、酵素固定化膜１５のグルコースオ
キシダーゼにより、グルコン酸に分解され、この結果ｐ
Ｈ値が変化する。このとき、妨害成分であるリン酸塩が
アニオン性膜１７で遮断されて存在しないので、ｐＨ検
出部１３によりｐｌ＋変化を確実かつ正確に検出するこ
とができる。

尿中の糖の量は、酵素反応により生成したグルコン酸が
引き起こすｐＨ変化と、予めＮ濃度を変化させて作成し
ておいた検ｍ線とから求めることができる。人の尿はＰ
Ｈ５〜８の範囲が正常値とされているので、この範囲で
数種類の検量線を用意しておくことにより、Ｐｌｌの変
化値から尿中のＮａ度を求めることができる。実用上は
。

イニシャルρ１１を検出するための対照用ｐＨ検出部と
、Ｐｌ＋変化測定用のｐＨ検出部とを同時に尿中に浸漬
し、上記の手法で糖濃度に換算することが望ましい。

以上の説明では、尿中の糖濃度を測定する方法について
説明したが、尿中の蛋白質などの他の成分の場合も同様
であり、利用する酵素反応に応じて、適宜の酵素固定化
膜を採用すればよしへ　。

また、尿以外の被検出試料の場合も同様である。たとえ
ばバイオリアクターでは、Ｐｌｌを所定値に保つために
リン酸塩などの緩衝剤が添加されているが、本発明によ
ればこれらの妨害成分の影響を受けることなく、Ｎａ度
等を測定することができる。

発明の効果 本発明によれば、リン酸塩などの妨害成分の共存下でも
、比較的手軽に使用でき、しかも安価なρ１１検出装置
を利用して簡便に糖、蛋白質などの濃度を測定すること
ができる。よって、尿中の糖や蛋白質など健康管理に必
要なデータを手軽に測定することができ、特に家庭での
健康管理に有用である。また、従来の試験紙では定量で
きない程度の低濃度でも簡便に検出することができ、疾
病の早期発見にも役立つ。

さらに、バイオリアクター中の糖濃度なども簡便にａｌ
ｌ定することができるので、工業上も有用である。

実施例 ＰＶＡ（エステル化度９０％以上）７０重量部を含む１
０％水溶液に、３０重量部のＬ　Ａ　Ｓ　−Ｎ　ａを含
む５０％水溶液を添加し、ついで、水分が３０重量％程
度になるまで乾燥した。次に、グルタルアルデヒドを５
重量部添加し、５０℃で、１０分間加熱して架橋させ、
アニオン性膜を得た。

ｐＨガラス電極上に、グルコースオキシダーゼを固定化
した酵素固定化膜を重ね、さらにその上にアニオン性膜
を重ねてＯリングで固定し、第１図に示すような酵素セ
ンサを作成した。

この酵素センサ（測定用電極）と、対照用のｐＨガラス
電極とを試料尿中に浸漬したところ、イニシャルｐＨ値
は６．０であり、一方、酵素センサでは０．６のｐＨ変
化が測定された。これらの値から、予め作成しておいた
検量線により糖濃度を求めたところ、０．５ｇＩＱとな
った。

一方、アニオン性膜を用いない他は上記と全く同様にし
て比較例の酵素センサを作成し、尿中に浸漬したところ
、ＰＨの変化を検出できなかつた・ また、上記と同じ尿試料を、イオン交換樹脂（陰イオン
交換樹脂：ムロフック１−Ｘ８．室町化学工業＠製）を
充填したカラムに通してリン酸塩を除去したのち、アニ
オン成膜を有しない比較例の酵素センサを云試料中に浸
漬して測定したところ、０．１３のＰＨ変化が測定され
、上記の値とよく一致した さらに、グルコースオキシダーゼと酸素電極を組み合わ
せて、尿試料中の糖濃度を測定したところ、０．５ｇ／
　Ｑとなり、本発明の酵素センサによる測定値とよく一
致した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の酵素センサの構成例について、その
検出部近傍を示す断面図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ｐＨ検出部と、これに近接して設けられた酵素固定
   化膜とを有し、該酵素固定化膜により被検出液中の特定
   の成分を他の物質に変換せしめ、この変換に伴うｐＨの
   変化を前記ｐＨ検出部により検出するようにした酵素セ
   ンサであって、前記ｐＨ検出部と酵素固定化膜とを被包
   するようにしてアニオン性膜が設けられていることを特
   徴とする酵素センサ。