JPS62234113A - 生細胞レーザ穿孔装置の時分割光学調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、光学装置の焦点位置の調整方法に関する。

（従来の技術） レーザーパルスを生細胞に投射し、これによって生細胞
の一部を改変して周囲の異物例えばＤＮＡフラグメント
を取り込むようにした「生細胞内への物質移入法（特開
昭６０−８３５８４号）」が本出願人によって提案され
、このための具体的な装置として「生細胞レーザー穿孔
装置（特開昭６０−８３５８３号）」が同様にして提案
された。

この装置はモニターＴＶを備えており、生細胞の位置を
確認しつつレーザーパルスを投射できるように構成され
ている。この場合モニターに最高の光学調整とレーザー
光の照射に最高の焦点調整位置とが一致していると、レ
ーザーパルスの投射深さ位置での状態がモニターされて
好都合であると考えられる。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、鮮明な像が得られるのは生細胞表面にピ
ントが合っている場合であり、しかもモニター光学系と
レーザーパルス投射光学系の対物光学系は共通使用され
ているので、レーザー投射位置として好適な細胞内部位
置にピントが合わされると、像が不鮮明になってモニタ
ー観測が満足に行うことができなくなるという問題があ
ることが分かった。

（問題点を解決するための手段） 上述した問題点は試料の鮮明な映像を得るための第１の
光学系とレーザーを最適条件で照射させるための第２の
光学系とによって共有される対物光学系を用いながらも
、これと試料との間の距離を時分割的に変更するところ
の本願発明の時分割調整方法を用いることにより解決さ
れる。

本明細凹において「対物光学系」とは、試料物体に最も
近接する光学系のことを意味し、撮像系の対物レンズだ
けでなく、光投射系の集光レンズを含むものとする。

対物光学系と試料との間の距離は、対物光学系を、ある
いは試料を移動することことにより変更される。

（作用） 本発明においては、第１の光学系と第２の光学系の試料
に対する焦点深さ位置が時分割的に試料の所望位置に設
定される。

（発明の効果） 本発明によると、ある期間第１の光学系の焦点位置を試
料のある深さ位置に設定し、他の期間第２の光学系の焦
点位置を試料の別のある深さ位置に設定できる。また、
この二つの焦点位置設定を利用して互いに異なった波長
の光を試料の同一箇所に結ぶことができる。従って、例
えば、上述された生細胞穿孔装置においては、細胞観察
時に、顕微鏡の対物レンズの位置を、最も鮮明なモニタ
ー像が得られるように調整しておき、生細胞にレーザー
パルスを投射する際のみにレーザーパルスが試料の所望
の深さ位置に投射されるように対物レンズを好適な位置
に移動することができる。

（実施例） 以下、本発明の実施例を図面を参照しつつ詳細に説明す
る。

第１図は、本発明の第１実施例の概略図であり、レーザ
ー穿孔装置の一例を示している。第２図は本例における
信号のタイミング図である。レーザー穿孔装置本体１は
、試料２の像を拡大してＴＶカメラ３まで導く顕微鏡の
働き及びレーザー発振器４から放射されたレーザー光５
を集光して試料２に投射する集光装置の二つの機能を果
たす。レーザー光５の焦点及び逼像面の焦点位置は対物
レンズ１ａの上下動によって変化するが、この上下動は
対物レンズ１ａと装置本体ｌの鏡筒１ｂとの間に設けら
れた電歪素子６の歪変形によって行われる。レーザー光
５の投射タイミングはマスター信号発生器７から発生さ
れるマスター信号によって制御される。このマスター信
号は、一旦遅延トリガー回路８に人力されて、所定時間
（電歪素子が変形に要する時間）遅延された後レーザー
光発射指示信号として、レーザー発振器４に入力される
。マスター信号は、また電歪素子駆動装置９に入力して
、電歪素子６の駆動を制御する電歪素子駆動電圧を発生
する。従って、レーザー投射時には、対物レンズ１ａを
、レーザー光５が試料２の所梁の好適な位置に焦点を結
ぶように位置せしめ、それ以外の場合は、対物レンズ１
ａを、モニター観測に適した位置に位置せしめることが
できる。

具体的には、電歪素子に電圧を印加しない状態で、モニ
ター像が全体として最も鮮明に映し出されるように対物
レンズｌａを調整し、次に、レーザー光投射しようとし
ている対称物（例えば、細胞核）のみが鮮明に映し出さ
れるように、電歪素子に印加する電圧をあらかじめ設定
しておき、しかるのち、レーザー光投射時に、この設定
された値の電圧が電歪素子に印加されるようにすればよ
い。対物レンズｌａがモニター観測に適する位置以外に
位置する場合は、ＴＶカメラ３を介してモニターテレビ
１０に映し出される映像が不鮮明になるので、マスター
信号発生器７からの信号とタイミングを合わせて、シャ
ッター１１の開閉をシャッター駆動回路１２によって制
御するようにすると好ましい。このように構成された装
置において、試料２を移動ステージ１３によって移動し
つつ、マスター信号発生器７から所定の間隔でパルス信
号を発生すると、試料２の所定の深さ位置に繰り返し連
続的にレーザー光が投射されるとともに、鮮明なモニタ
ー像を連続して観察することができる。

試料像採取を妨げるためには、シャッター１１を使用す
る他に、試料の照明をＯＦＦにするにするようにしても
よい。シャッターとしては、電磁島区動の機械式シャッ
ターでもよく、またフィルターやポラライザーを利用し
た光学式シャッターでもよい。

第３図は、本発明の第２実施例の概略図であり、第１実
施例と同様なレーザー穿孔装置の一例である。第４図は
本例おける信号のタイミング図である。本実施例におい
ては、ライトペン１５の指示位置にレーザー光が投射さ
れるように構成されている。モニターＴＶＩＯにライト
ペン１５の指示を行うと、ライトペン１５から出力され
るパルス信号に基づいて位置制御信号発生器１６は、そ
の指示位置を算出するとともに、この算出された値に基
づいて制御信号を発生する。ガルバノメーターミラー等
からなるビーム偏向装置１７は、この制御を受けた偏向
装置駆動手段１８によって駆動され、レーザー光５がラ
イトペン１５の指示による指示位置に投射されるように
なる。ビーム偏向装置１７は、この制御信号を受けてガ
ルバノメーターミラー等を駆動して、レーザー光５がラ
イトペン１５の指示位置に投射さるよにする。ライトペ
ン１５からのパルス信号は時間制御信号発生器１９にも
同時に入力される０時間制御信号発生器１９はＴＶカメ
ラ３の走査周期毎に発生されるパルス信号を所望の間隔
の時間制御信号に変換する。

この時間制御信号は第１実施例と同様にして、電歪素子
６の駆動装置９に入力して、電歪素子６の駆動を制御す
る電歪素子駆動電圧を発生する。また、時間制御信号は
、顕微鏡本体ｌとレーザー発振器４との間に設けられた
レーザー光路シャッター１４の開閉を制御する。第４図
に示されるように、レーザー光路シャッター１４は過渡
期間を除いた電歪素子６の電圧印加期間中開放されて、
その期間（パルス状）レーザー光５が連続的に試料に投
射される。穿孔を行うレーザー光の焦点は、第１実施例
の場合と同様に、予め定められている電圧値が、レーザ
ー光５投射時に電歪素子６に加わるようにして設定して
もよい。しかしながら、このように常に所定の焦点面上
にレーザー光５が投射されると、必ずしも試料の好適な
位置にレーザー光５が投射されるとは限らない。本実施
例においては、レーザー光５の焦点深さ位置は、ライト
ペン１５によって指示された物体に自動的に設定される
。特開昭６０−８３５８３号明細書に記載されるように
、参照用レーザー光２１が常時試料に投射されている。

この投射によって試料２から反射された光は半透鏡２２
によって顕微鏡本体１から取り出される。取り出された
光は、レンズ２３．２４虹彩絞り１５を通した後、光電
変換素子２６によりピックアップされる。オシレーター
１７からは所定周期の振動電圧が常時発生されており、
スイッチ２８が閉じられている間この振動電圧が電歪素
子６に印加される。位相敏感検出器２９は光電変換２３
２６の出力とオシレーター２７の出力との位相差を電圧
値として出力する。電歪素子６に印加される電圧Ｖと、
即ち焦点面の位置と、光電変換器の出力■との関係は第
５図に示す通りであり、位相敏感検出器の出力■°は電
歪素子に印加される電圧の対して第６図のようになる。

従って、ライトペン１５の（２次元的）指示位置に対し
て、反射鏡が最大になる深さ位置にレーザー投射光学系
の焦点面が設定され、穿孔用レーザー光５が試料２に投
射される。過渡期間を含む電歪素子６の駆動期間中に、
不適正画面がモニターＴＶ上に映し出されることを防ぐ
ために、ＴＶカメラ３とモニターＴＶＩＯとの間に設け
られたゲートスイッチ２０の開閉を時間制御信号に基づ
いて行うようにすると良い。なお、ゲートスイッチ２０
が閉しられる直前の画像を、ゲートスイッチ２０の閉塞
時にモニターＴＶＩＯに映しだされるようにするとさら
に好ましい。本実施例の様に構成されていると、生細胞
の位置を的確に把握しつつ、生細胞の中心付近にレーザ
ー光を投射できるので、特開昭６０−８３５８４号公報
に記載される生細胞内への物質移入法に極めて好ましい
ものと考えられる。なお、本実施例の様に、レーザー光
それ自体を遮断することによってレーザー光の投射が制
御されるので、レーザー光としてパルス状のもの、連続
状のものいずれも使用できる。

第７図は本発明の第３実施例の概略図であり、前記各実
施例と同様なレーザー穿孔装置の一例である。本実施例
も第２実施例と同様にライトペンの指示位置にレーザー
光が投射されるが、ライトペンの押圧力に従ってレーザ
ー光５の試料２に対する焦点深さ位置が変化されるよう
に構成されている。本実施例において使用されるライト
ペンは第８図に示されるように、ライトペン本体１５ａ
の先端部分の空洞１５ｂ前後に移動可能に設けられた感
光部１５ｃを有しており、この導光部１５ｃを通してモ
ニターＴＶＩＯからの光が光検出器１５ｄまで導かれる
。この導光部１５ｃの後方には圧力検出素子１５ｅが設
けられている。この圧力検出素子１５ｅは導光部１５ｅ
とバネ１５ｄとに挟まれ、ライトペン本体１５ａと導光
部１５ｃとの間に加えられた圧力に応じた電圧値を対抗
面間に発生する。即ち、ライトペン１５でモニターＴＶ
ＩＯを指示した際のモニターＴＶＩＯへ（７）押圧力に
対応する値の信号が、電子ビーム走査時における螢光発
光の検出信号とともに発せられる。

押圧力に対応するライトペン１５から発せられた電圧信
号は焦点深さ位置側′ａ信号発生器３０に送られる。こ
の焦点深さ位置制御信号発生器３０からの信号は電歪素
子駆動装置９から発生される電歪素子駆動電圧を制御す
る。従って、ライトペン１５のモニターＴＶＩＯへの押
圧力に応じた、試料２に対する焦点深さ位置にレーザー
光ウェストが形成される。

本実施例においては、「メスの深さ」に対応する「レー
ザー焦点の深さ」の制御を加えて、３次元のコントロー
ルが可能となり、加工精度を飛躍的に上げることができ
る。細胞内部の特定の器官、例えば、細胞核に、特定の
深さで照準したレーザー照射や、生体膜の内面に照準し
た穿孔等、高精度の細胞手術が可能となる。

第９図は本発明の第４実施例の概略図である。

完全に同一の光学系を使用しても、波長が異なると異な
る深さ位置に焦点が結ばれることはよく知られている。

このような場合に本発明を使用すると、波長が異なって
も試料の同一箇所に光を集光することができる。レーザ
ー発振器３１．３２．３３からは互いに異なる波長のレ
ーザー光３４．３５．３６が放射されるが、試料２へは
シャッター３７．３８．３９によって、一種類のレーザ
ー光のみが投射されている。シャッター３７．３８．３
９の開閉は切換スイッチ４０によって制御される。この
切換スイッチは同時に電歪素子駆動装置９から発生され
る駆動電圧を、投射されるレーザー光の波長に応じて変
化し、試料２に対する焦点深さ位置をレーザー光波長に
よって変動しないようにする。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第１実施例の概略図、第２図は第１実
施例における信号のタイミング図、 第３図は本発明の第２実施例の概略図、第４図は第２実
施例における信号のタイミング図、 第５図は電歪素子に印加される電圧と、光電変換器の出
力との関係を示す図、 第６図は位相敏感検出器の出力と、電歪素子に印加され
る電圧との関係を示す図、 第７図は本発明の第３実施例の概略図、第８図は第３実
施例で使用されるライトペンの一実施例の断面図、 第９図は本発明の第４実施例の概略図。 ■・・・・・・ｎＨｋ鏡本体、１ａ・・・・・・対物レ
ンズｌｂ・・・・・・鏡筒、２・・・・・・試料、３・
・・・・・ＴＶカメラ４．３１，３２．３３・・・・・
・レーザー発振器５．３４，３５．３６・・・・・・レ
ーザー光６・・・・・・電歪素子、７・・・・・・マス
ター信号発生器８・・・・・・遅延トリガー回路 ９・・・・・・電歪素子駆動装置、１０・・・・・・モ
ニターＴＶ１１・・・・・・シャッター １２・・・・・・シャッター駆動回路 １３・・・・・・移動ステージ １４．３７．３８．３９・・・・・・レーザー光路シャ
ッター、１５・・・・・・ライトペン １６・・・・・・位置制御信号発生器 １７・・・・・・ビーム偏向器 １８・・・・・・偏向装置制御手段 １９・・・・・・時間制御信号発生器 ２０・・・・・・ゲートスイッチ ２１・・・・・・参照用レーザー光 ２６・・・・・・光電変換器、２７・・・・・・オシレ
ータ２９・・・・・・位相敏感検出器 ３０・・・・・・焦点深さ位置制御信号発生器４０・・
・・・・切換スイッチ。 第１図 第５図 劾 銅６図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 第１の光学系と第２の光学系とによって共有される対物
   光学系と試料との間の距離が時分割的に変更されること
   を特徴とする時分割光学調整方法。