JPS62247247A - マルチエレクトロブロツテイング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は実験室等で行われる生化学的テスト及びスクリ
ーニング並びに生化学反応を行う場合に有用なマルチブ
ロッティング方法に関するものである。

（従来の技術及び問題点） 生化学研究では「組み換えスクリーニング」「ハイブリ
ッドスクリーニング」及び「各種イムノアッセイ」等を
目的として試料中の微量物質を検出、測定するため固相
法の一種であるマイクにプレート法が数多く利用され、
そのための装置も種々考案されている。特に微孔膜をウ
ェル底部に配置して実施する方式のものは、このウェル
に試料を置き、膜下部を減圧にして液体を強制的に微孔
膜を通して下方に通過させることによって目的物質を該
微孔膜に濾過吸着させるが、この方法は試料に対する微
孔膜の接触面積が大きいこと、濾過のみで残液を除ける
等の長所がある。

しかし、この方法には、尚、下記の様な欠点が認められ
る。

■　微孔膜に対する固定化、及び微孔膜に吸着した物質
と液相中の成分を反応させるのに屡々１時間以上の長時
間を要する。

■　濾過時にどうしてもウェルによる壁面効果が出るた
め、スポット周辺が濃＜、中央部が淡くなる「壁面効果
」が現われてスボ・ノドが不均一になり、透過光や反射
光等による濃度測定が不正確になり易い。

■　隣接しているウェルへの「わき洩れ」が生じやすい
。

例えば特開昭６０−４．３３７７号公報はこの「わき洩
れ」を改善するため、下段プレートの開口部が偏平突起
内にある様にしているが、実際にテストしてみた所、「
わき洩れｊ防止は尚、完全ではない。しかもスポットが
不均一である点および反応に長時間を要する点は何等改
善されていない。これに対して特開昭６０−１０００５
４号公報、特開昭５９−７６５１３号公報、特開昭５９
−１５３１７２号公報では上段プレート開口部下部に微
孔１１りを接着固着させであるため、「わき洩れ」の防
止は略々完全に出来るが、プレートと微孔膜が固着され
ているため、濃度測定時等に面倒なばかりか、−回毎に
膜と共々上部プレートも使い捨てになるため経済的でな
い。

しかも、これらの特許文献に示されているものは何れも
「スポット濃度が不均一であるｊ、「反応時間が長くか
かる」等については何等改善されていない。

（問題点を解決するための手段） これらの従来技法及び装置を改善するために、本発明者
らは鋭意研究した結果、従来のマルチ濾過技術に電気泳
動法を適用することによってこれらの欠点を完全に克服
しうろことを見出した。

本発明の方法によれば前述の諸欠点を克服し、微量物質
の測定に際しての正確さと共に迅速さを与えることが可
能である。

従来のマルチ濾過装置に電気泳動法を適用することによ
って荷電性物質を電気的に微孔膜に吸着し、又微孔膜に
吸着した物質と液相中の成分の反応を電気的に行い、反
応を短時間に完了せしめることが可能である。

本発明は、ゲル中の物質を電気的に微孔膜に転移させた
り、微孔膜に平行に電圧をかけて、微孔膜中の物質を移
動させるのではなく、直接に微孔膜が陰極及び陽極側の
電解液と接触し、且つこの微孔膜に対し垂直方向に物質
が移動する点に一つの特徴がある。このため、反応は、
数分〜十数骨という極めて短時間で終了する。

即ち、本発明は、表裏両側に開口する少なくとも１個の
開口部及び上部電極を有しかつ上側に電解液保持枠を備
えたトッププレートと、該トッププレートの下方に位置
して前記開口部を覆う微孔膜と、該微孔膜の下方に位置
して前記トッププレートの開口部と連通ずるごとく対応
した位置に開口部を有するセンタープレートと、該セン
タープレートの下方に位置して電解液溜用の凹部及び下
部電極を備えたボトムプレートとからなり、且つ電解液
充填したフィルター装置を用い、前記トッププレートの
開口部と前記微孔膜とにょうて形成されたウェル内に、
１種若しくは２種以上の液体試料を順次添加し、上部及
び下部電極を介しての通電下に、電気泳動的に前記試料
を前記ウェル内の微孔膜に吸着させ、かくして生成した
固定物の濃度を比較または測定することを特徴とするマ
ルチエレクトロブロッティング方法を要旨とするもので
ある。

本発明を実施する装置は次の様な構成よりなっている（
第１図および第２図参照）。

頂面及び底面を有しかつ両面部に開放する少くとも一つ
以上の開口部６を具備するトッププレー１−１を有する
。

このトッププレートのサイズは生化学でよく使われる９
６穴プラスチツク製マイクロプレートの寸法が好ましく
、開口部の数、サイズ、及び開口部同士の間隔等もこれ
と一致することが好ましい。

この開口部間隔又はこれと同様の開口部配列を採用すれ
ば、本発明の実施装置を現在市販の自動走査Ｆｆ度計等
と併用することが可能である。

代表的な開口部配列としては、８行×１２列の長方形配
列で９６ケの円形開口部を設け、開口部同士の中心間隔
を約９　ｍ／ｍとする。また、開口部の大きさは直径２
〜６ｍ／ｒｒｌ程度で通常は３〜４−ｍ／ｍである。そ
れぞれが相互に連っている開口を有する「だ円形４又は
「スリット形ｊの開口部を作ることも勿論可能である。

このトッププレートｌの厚さは１０ｍ／ｍ〜５０ｍ／ｍ
程度とするのが好ましい。又その頂面上部に電解液保持
槽７が連設され、その内部に電極８が張設される。電極
８の張り方はトッププレート１の各開口部に均一に電流
が流れる様に配慮すべきである。例えば液保持部の内側
四周にリング状に配列してもよいし、全体に膜状に張っ
てもよい。

更に上部の蓋に各開口部毎に針状に配線することも可能
である。特にリング状に配列することが均一な電流をも
たらす上で好ましい。

試料の添加される開口部の容積は３００μｐ〜６００μ
ｌ程度が通常であるが、場合によっては開口部の容積を
１ｍＪ程度にすると、本性の１つの特徴である稀薄試料
の測定に便利である。又その断面形状はストレート型又
は底部が小さくなるロート型が好ましい。

トッププレート１の下方には微孔膜２が配置される。微
孔膜としてはニトロセルロース、ナイロン７セルロース
アセテートポリテトラフルオロエチレン、ぶつ化ビニリ
デンその他があるがニトロセルロース、ナイロン、等の
蛋白吸着性のある膜が特に好ましい。孔径は３μ〜０．
２μ程度が一般である。場合によってはセルロース系、
或はガラス繊維系の濾紙が使われることもある。微孔膜
２の大きさはトッププレートｌの底面開口部全体を覆う
のに十分な広さを有するものが用いられるこの微孔膜２
の下方にはガスケット３　（後述）を介して微孔膜を支
え、且つトッププレート１の開口部６の数に対応する開
口部１１を有するセンタープレート４が配設される。こ
のセンタープレート４は微孔膜２を支え且つ各開口部を
独立させるだけの能力のある厚さ及び構造が必要である
。

又、電解液充填時、センタープレート４の開口部１１内
に空気が滞留するのを防ぐため、その構造は第３図に示
す様に微孔膜に接する方を小さく、反対側を大きくする
のが好ましい。

センタープレート４の下側には該センタープレートの開
口部１１を被覆するに十分な広さを有すると共にセンタ
ープレート４の下方を外部と遮断できる凹部１０を有す
るボトムプレート５が配設される。ボトムプレート５の
凹部１０内には電源に接続された下部電極９が張設され
ている。電極９の配列はトッププレート１の場合と同様
に各開口部１１に均一に電流がかかる様な形にする。例
えばボトムプレート５の凹部四周にリング状に配線して
もよく、又、開口１１に個別に配線してもよい。

ボトムプレート５には真空ポンプに連結される排出用バ
ルブ付きの給排出管１２及びプレート内に電解液を注入
する場合の空気抜き管１３が設けられている。

各プレート間のシールを完全にするため、センタープレ
ート４とボトムプレート５の間には０リング１４又は平
パツキンが設けられており、又、トッププレート１とセ
ンタープレート４の間には微孔膜を挟んでシリコン等か
らなるガスケット３が挿入され、このガスケット３には
センタープレート４の頂部開口１１と整合する互いに不
連続な孔行列が設けられている。

ガスケット３の厚さは十分なりッション効果があり、且
つシールの完全なものを使用する（厚さ２　ｍ／ｍ〜６
１１Ｉ／ｌｌ＋程度が好ましい。）。

本装置の組み立て時の締め付けは「ねじ締め」又は「ば
ね締め」で行なわれるが、必要によって開口部を各プレ
ート毎に整列させ、各部が正しく組立てられるためのガ
イドが設けられる。場合によっては装置全体を恒温状態
に保つ手段を付加する。電源は安定直流電源が通常であ
るが、パルス電圧による直流電流を使用することもでき
る。

更に第１図および第２図に示す装置による実際の操作法
を次に述べる。

先づ微孔膜２を電解液に浸漬して完全に湿潤させたもの
をセンタープレート４上に敷いたガスケット３の上に該
ガスケットの開口部を完全に被覆する如く置き、次いで
その上側にトッププレート１、下側にボトムプレート５
を積層して第１図、第２図に示す如く組立てる。ボトム
プレート５の給排出管１２をやや上に傾斜させてバルブ
を開き電解液をボトムプレート５内に徐々に注入する。

ボトムプレート５内の残留空気は空気抜き管１３から完
全に抜き、ボトムプレート内を電解液で充満させ、次い
で空気抜き管１３、及び給排出管１２を閉塞する。次い
でトッププレート１上の電解液保持槽７に電解液を注入
する。

トッププレートｌの開口部６（試料保持孔）に、蔗糖等
の不活性添加剤を加えて電解液より比重を増加させた蛋
白試料液５０μｍ−１０００μｌの一定量を加える。試
料液は第２図の様に微孔膜２上に滞留する。

電極８．９に一定時間直流電圧をかけて試料液中の蛋白
質成分を電気泳動させ微孔膜２に吸着させる。その後、
吸引濾過又は吸上げ法で電解液及び試料残液を装置から
除く。

次に装置を解体して微孔膜２を取り出し、アミドブラッ
ク等で染色し、洗條、乾燥後、デカリン等で透明化処理
し、透過光法で蛋白濃度を測定する。

又、本装置を使用し、微孔膜上でイムノアッセイを行う
場合は、抗原又は抗体液を開口部６に注入して、前記と
同様に処理し、次いでブロック剤検液、酵素標識抗体、
発色用基質等を順次に前記と同様に添加し処理し、乾燥
後場合によっては透明化処理して濃度測定する。

以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明する。

〔実施例〕

第１図、第２図に示す装置を用いて下記条件で蛋白質濃
度測定を行った。

■　試料として純水５０μβ中に１．０μｇのアルブミ
ンを溶解したものを９６ウエルの各々に添加（但し、蔗
糖を添加して電解液より比重を大きくした）。

■　電解液としてトリス、グリシン液（ｐｆｌ　８．２
　）をトッププレート及びボトムプレート、センタープ
レート：勺に充填。

■　使用多孔膜：東洋濾紙製ニトロセルロースメンブラ
ンフィルタ−（０，４５μｍ孔径）■　電気泳動条件：
　４８Ｖ、４０ｍＡ　（定電流）。

時間６分間。

電気泳動終了後、電解液及び試料残液を吸引除去し、微
孔膜を装置より取り外して金コロイド液アウロダイ　（
商標）〔製造ヤッセン（ベルギー）、販売、和光純薬（
日本）〕で染色、水洗、乾燥後、透過光でスポット部の
濃度測定を行った。その結果を第４図に示す。

〔比較例〕

実施例と同一の装置を用い、同一試料（但し、蔗糖は無
添加）の同一量を開口部に添加し電気泳動によらずにそ
のまま６分間静置後、吸引濾過し、同様の処理をしてス
ポットの濃度測定を行った。

結果は第４図に示すとおりである。

すなわち、第４図に示す如く、本発明の実施例の場合は
、スポットの濃度は均一であり、かつ９６ウエルの測定
値の標準偏差は１．６３５と僅少であったのに対して、
比較例の場合のスポットは中心が淡色で周囲が濃色とい
う不均一な濃度を示しかつ標準偏差は８．４０と著しく
高い値となり、測定値は著しいバラツキを示した。

（発明の効果） 以上の如く、本発明によれば実験室等で行われる各種生
化学的テスト及びスクリーニング並びに生化学反応等に
際して微量試料で正確、迅速に実施可能である。従って
本発明は例えば生物学的又は生化学的試験、研究に稗益
するところが極めて大である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を実施する装置の構成の一例を示す斜視
図、第２図は同上概略断面図、第３図はセンタープレー
トの開孔部の形状例を示す図、第４図は本発明例及び比
較例による蛋白質濃度測定試験結果を示す図である。 １ニドツブプレート、２：微孔膜、３：ガスケノト、４
：センタープレート、５：ボトムプレート、６：開口部
、７：電解液保持槽、８：上部電極、９：下部電極、１
ｏ：凹部、１１：開孔部、１２：給排出管、１３：空気
抜き管、１４：０リング。 特許出願人　東洋濾紙株式會社他１名 第１図 第２図 第３図 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 表裏両側に開口する少なくとも１個の開口部及び上部電
   極を有しかつ上側に電解液保持枠を備えたトッププレー
   トと、該トッププレートの下方に位置して前記開口部を
   覆う微孔膜と、該微孔膜の下方に位置して前記トッププ
   レートの開口部と連通するごとく対応した位置に開口部
   を有するセンタープレートと、該センタープレートの下
   方に位置して電解液溜用の凹部及び下部電極を備えたボ
   トムプレートとからなり、且つ電解液を充填したフィル
   ター装置を用い、前記トッププレートの開口部と前記微
   孔膜とによって形成されたウエル内に、１種若しくは２
   種以上の液体試料を順次添加し、上部及び下部電極を介
   しての通電下に、電気泳動的に前記試料を前記ウエル内
   の微孔膜に吸着させ、かくして生成した固定物の濃度を
   比較または測定することを特徴とするマルチエレクトロ
   ブロッティング方法。