JPS6224743B2 - - Google Patents
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Description
本発明はエストリオール―３―グルクロナイド
の免疫学的測定用抗原およびその製造法に関する
ものである。 さらに詳しくは、エストリオール―３―グルク
ロナイドの特異抗血清を得るためのハプテン―蛋
白結合抗原の新規合成法に関する。 エストリオールはエストロゲンの一種であり、
遊離型、抱合型等が知られている。このうち遊離
型は血中には存在するが尿中には通常出現せず、
グルクロン酸抱合型、あるいは硫酸抱合型として
排せつされる。 なかでも、グルクロン酸抱合型については、近
時、その生理的意義が注目されるようになり、妊
婦の血中および尿中に出現するエストリオール―
３―グルクロナイドとエストリオール―16−グル
クロナイドを分画測定することにより、胎児胎盤
機能を、より適確にとらえることの必要性が指摘
されている。 従来、体液中のエストリオールは結合型エスト
リオールを加水分解して、遊離型としたのち、抽
出後、コーバー反応を利用した比色法、または蛍
光法あるいは免疫測定法等を組合せて測定されて
きた。しかしながら水解操作を必要とするこれら
の測定法は、操作が煩雑であり、総エストリオー
ル量から遊離エリトリオール量を差引くことによ
つて抱合型と蛋白結合型の総量を一応求めること
は出来るが、グルクロン酸抱合型と硫酸抱合型の
分画測定並びにグルクロン酸抱合型のうち、エス
トリオール―３―グルクロナイドとエストリオー
ル―16―グルクロナイドの分画測定はほとんど不
可能であつた。 本発明は体液中のエストリオール―３―グルク
ロナイドを免疫学的に測定する時に必要な特異抗
体を作製するためのハプテン―蛋白結合抗原の新
規な合成法に関するものであり、該抗原を用いて
作製された抗体を使用することにより、体液中の
エストリオール―３―グルクロナイドを共存する
類似物質の影響を受けることなく、特異的に測定
することが可能となる。 近時、体液中のホルモンの測定法として注目さ
れているラジオイムノアツセイは放射性核種で標
識したホルモンと該ホルモンに対する抗体の結合
比が反応液中に加えられた抗原、即ち非標識ホル
モンの量によつて変化することを利用した方法で
あり、感度が高く、多数検体の測定が可能である
ことから、臨床検査室に於いて賞用されている。 しかしながら、その特異性に関しては議論の多
いところである。即ち、一般に体液中には測定対
象物質と類似の構造を有する物質が多数存在して
いるので、測定に用いる抗体は測定対象物質との
み反応するもの、即ち特異性が高く、交叉反応性
の低いものが要求される。測定対象物質との結合
定数が大で、かつ、特異性の高い抗体が用意され
れば該対象物質を測定するためのラジオイムノア
ツセイは、ほぼ確立したことになる。 前述の如く、体液中のエストリオールを従来法
で測定する場合、一般的には水解操作が必要にな
るがラジオイムノアツセイにおいては、エストリ
オールグルクロナイドと特異的に結合する抗体が
用意されれば、水解操作が不要となり、特異的、
かつ高感度な測定が可能となるので、今日ではエ
ストリオールグルクロナイドに限らず、各種のス
テロイドホルモンの抱合体を水解せずに免疫学的
に測定するための特異抗体の製造法、即ち、特異
抗体を製造するための抗原として、どのような物
質を使用すればよいかという点に免疫学的な測定
法を確立するための研究が進められている。 その一つの例として、エストロゲン―３―グル
クロナイドのグルクロン酸部分のカルボキシル基
にBSAを結合させた、いわゆるハプテン―蛋白
結合抗原が合成され、該抗原を用いて作製された
抗体を用いて、エストロゲン―３―グルクロナイ
ドを測定する方法が報告されているが、該抗体は
特異性が低く、遊離エストロゲンおよびエストロ
ゲン―16―グルクロナイド等に対して交叉反応性
を示すので、満足出来る結果を与えていない。
（P.Samarajeewa et al：Biochem.J.151，369〜
376，1975年） また、カルボキシフエニルアゾエストリオール
―16―グルクロナイドのC2位またはC4位にカー
ボジイミド法を用いてBSAを結合させたハプテ
ン―蛋白結合抗原の場合、該抗原を用いて作製さ
れた抗体は、遊離エストロゲンに対し2.2％以下
という比較的低い交叉反応性を示し、改良された
特異性を示したが、なお不充分であり、この不充
分な特異性はベンゾイル基にBSAを結合させる
際に同時にグルクロン酸部分のカルボン酸にも
BSAが結合するためであると推定されている。
（J.R.Soares et al：FEBS Lett，61，263〜
266，1976年） また、エストロンサルフエートのC6位にBSA
を結合させる方法（T.Nambara et al：J.Steroid
Biochem.13，1075〜1079，1980年）、エストロゲ
ンＤ環グルクロナイドのC2またはC4位にBSAを
結合させる方法（T.Nambara et al：J.Steroid
Biochem.９，785〜790，1978年、J.Pharm.Dyn.
１，55〜59，1978年）の場合、ハプテン―蛋白結
合抗原を用いて作製された抗体は、いずれもハプ
テンに対して高い特異性を示すことから、ハプテ
ンとBSAの結合部位から離れているハプテン分
子の一部分が、抗原性決定部位となつているこ
と、抗体の特異性は該抗原性決定部位に向けられ
ていることが理解される。 このことはエストロゲン―３―グルクロナイド
の場合、Ａ環C3位に近隣するC2あるいはC4位に
担体蛋白を結合させた抗原よりも、Ｂ環C6位に
担体蛋白を結合させた抗原の方がＡ環の構造を良
好に認識する抗体を産生させる上で有利であるこ
とを示している。 しかしながら、目下のところ、エストリオール
―３―グルクロナイドのC6位にBSAを結合させ
ることにより、エストリオール―３―グルクロナ
イドに対する特異抗血清を得るためのハプテン―
蛋白結合抗原の合成法についての報告はない。 このような観点から、本発明者等は、エストリ
オール―３―グルクロナイドを免疫学的に測定す
る時に使用出来る特異性の高い抗体を作製するこ
とを目的として、ハプテン―BSA結合体を鋭意
検索した結果、本発明を完成するに至つたもので
ある。 本発明は、エストリオール―３―グルクロナイ
ドのＡ環グルクロン酸部位にBSAが結合しない
ようにしながら、ステロイド骨格Ｂ環のC6位に
BSAを結合させたハプテン―BSA結合体の合成
法に関する。 本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第
１項に記載されている物質、すなわち、６―オキ
ソエストリオール―３―グルクロナイド―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
を用いて作製された抗体は、すでに公知の方法で
得られたエストリオール―３―グルクロナイド―
BSA結合体を用いて作製された抗体に比較して
ステロイドのＡ環構造の認識性が特に優れてお
り、特異性においてもさらに向上することが明り
ようとなり、本発明を完成した。 本発明に基づいて作製された抗体は、エストリ
オール―３―グルクロナイドのラジオイムノアツ
セイ用として特に好適であるが、ラジオイムノア
ツセイに限らず、羊赤血球またはポリスチレンラ
テツクス粒子を担体とする凝集反応および凝集阻
止反応に用いることも可能である。 本発明は、特許請求の範囲第２項イ〜ニに記載
した工程に基づいて６―オキソエストリオール―
３―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシム―BSA結合体を合成する方法に関
するものであるが、本発明のさらに加わつた特徴
の一つとして、エストリオール―３―グルクロナ
イドのグルクロン酸部分の保護基を合成工程の最
終段階、すなわち、特許請求の範囲第２項ニに記
載した工程において脱離させることにある。 本発明に基づくエストリオール―３―グルクロ
ナイド測定用の抗原として用いられる新規ステロ
イド化合物は、化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―３―グル
クロナイド―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキ
シム―BSA結合体である。 本発明による新規ステロイド化合物は下記の構
成、すなわち、イ化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテートをメチル（２，３，４―トリ―Ｏ―
アセチル―１α―ブロモ―１―デオキシ―Ｄ―グ
ルコピラノシド）ウロネートと反応させ６―オキ
ソエストリオール―16，17―ジアセテート―３―
グルクロナイド―トリアセテートメチルエステル
（）とする工程、ロ化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテート―３―グルクロナイドトリアセテー
トメチルエステルを酢酸ナトリウムの存在下、Ｏ
―カルボキシメチルヒドロキシルアミン塩酸塩と
反応させ６―オキソエストリオール―16，17―ジ
アセテート―３―グルクロナイド―トリアセテー
トメチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシム（）とする工程、）化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテート―３―グルクロナイド―トリアセテ
ートメチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシムをBSAと反応させ６―オキソエス
トリオール―16，17―ジアセテート―３―グルク
ロナイド―トリアセテートメチルエステル―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
とする工程、ニ化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテート―３―グルクロナイド―トリアセテ
ートメチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシム―BSA結合体（）を部分的に加
水分解する工程、以上のイ、ロ、ハ、ニの各工程
を組合せることによつて製造されるものである。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 化学構造式（）で示される市販の化合物、６
―オキソエストリオール―16，17―ジアセテート
300mgをトルエン50mlに溶解後、炭酸カドミウム
300mgを加え、ケタール化装置により脱水後、メ
チル（２，３，４―トリ―Ｏ―アセチル―１α―
ブロモ―１―デオキシ―Ｄ―グルコピラノシド）
ウロネート300mgを加え、14時間還流後、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフイー（ヘキサン／酢酸
エチル１：１）に付す。次いで分取TLC（ヘキ
サン／酢酸エチル３：２）に付し、Rf値0.23の画
分を酢酸エチルで溶出後、減圧濃縮した後、メタ
ノールから再結晶すると、化合物（）105mgが
無色針状結晶として得られた。 無色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 230゜〜231.5゜ 〔α〕２５ Ｄ −55.9゜（Ｃ＝0.47，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：59.70、Ｈ：6.14 化学式C35H42O15に対する計算値 Ｃ：59.83、Ｈ：5.98 NMR（CDCl3） 0.87 （3H，ｓ，18―CH3） 2.04，2.10 （12H，3H，eachs，16―，17−，
2′―，3′―，4′―OCOCH3） 3.72 （3H，ｓ，COOCH3） 4.25 （1H，ｍ，5′―Ｈ） 4.95 （1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 5.30 （5H，ｍ，16β―，17α―，2′―，3′―，
4′―Ｈ） 7.22 （2H，ｍ，aromatic Ｈ） 7.60 （1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４―Ｈ） 無色針状結晶性化合物（）80mgをメタノー
ル／酢酸エチル（５：１）18mlに溶解し、Ｏ―カ
ルボキシメチルヒドロキシルアミン塩酸塩190mg
および10％酢酸ナトリウム溶液1.0mlを加え、35
℃で12時間撹拌後、反応液に水を加え、酢酸エチ
ルで抽出する。抽出液を水洗乾燥後、溶媒を留去
し、残査をエーテルから再結晶すると化合物
（）60mgが無色針状結晶として得られた。 無色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 183゜〜185゜ 〔α〕２０ Ｄ −58.6゜（Ｃ＝0.47，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：55.29、Ｈ：5.69、Ｎ：1.89 化学式C37H45O17N・１１／２H2Oに対する計算値 Ｃ：55.36、Ｈ：6.03、Ｎ：1.74 NMR（CDCl3） 0.82 （3H，ｓ，18―CH3） 2.02 （15H，ｍ，16―，17―，2′―，3′―4′―
OCOCH3） 3.75 （3H，ｓ，COOCH3） 4.20 （1H，ｍ，5′―Ｈ） 4.70 （2H，ｓ，＝NOCH2―） 4.95 （1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 5.05〜5.40 （5H，ｍ，16β―，17α―，2′―，
3′―，4′―Ｈ） 6.95 （1H，dd，Ｊ＝８，２Hz，２―Ｈ） 7.20 （1H，ｄ，Ｊ＝８Hz，１―Ｈ） 7.50 （1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４―Ｈ） 無色針状結晶性化合物（）60mgをジメチルホ
ルムアミド（以下DMFと略称す）2.4mlに溶解
し、氷冷下、トリ―ｎ―ブチルアミン80μｌおよ
びイソブチルクロロフオルメート18μｌを添加し
30分後、氷冷下、BSA192mgを含有する含水DMF
のアルカリ溶液（H2O3.6ml―DMF4.8ml―1N
NaOH0.2ml）を加え、PH7.0〜7.5に調整後、４℃
で15時間撹拌し、得られた反応液を冷水にて23時
間透析後、凍結乾燥に付し、ハプテン―BSA結
合体（）275mgを得た。 ハプテン―BSA結合体（）275mgを水50ml溶
解後、5N NaOHにてPH12.0〜12.5に調整した液
を25℃で18時間撹拌する。次に冷水で22時間透析
後、凍結乾燥し、化合物（）232mgを得た。 化合物（）、すなわち６―オキソエストリオ
ール―３―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキ
シメチル）オキシム―BSA結合体のBSA1モル当
りのハプテン結合モル数をUV法により求めたと
ころ34モルであつた。 実施例 ２ 抗体の作成（ウサギの免疫） 体重2.5〜3.0Kgの在来種白色ウサギ３羽に６―
オキソエストリオール―３―グルクロナイド―６
―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結
合体抗原を以下の如く免疫した。 すなわち、抗原２mgを滅菌生理食塩液0.5mlに
溶解させ、これをフロイント・コンプリート・ア
ジユバンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエ
マルジヨンをウサギの肩甲部および足蹠数ケ所に
皮下投与した。以後２ケ月にわたつて２週間毎に
同様の投与を行つた。最後の投与（第５回目の投
与）から１週間後に、このウサギの耳静脈から10
mlを採血し、これを3000回転、10分間の遠心分離
にかけ、得られた抗血清を−20℃に保存した。使
用時においては、該抗血清を解凍し、BSA0.06
％、牛―γ―グロブリン0.05％を含む0.05Mホウ
酸緩衝液（PH8.0）を用いて１：3000の希釈率で
希釈し、標準曲線を作成した。 測定操作 エストリオール―３―グルクロナイドを含む試
料にエストリオール―３―グルクロナイド―６，
７― 3H（約7500dpm）および抗血清0.25mlを添
加し、４℃で１時間孵置する。次いで50％硫安溶
液0.25mlを添加し、４℃で20分間放置後、3000回
転で15分間遠心し、得られた上澄液0.2mlをと
り、放射活性を計測する。 交叉反応性について ６―オキソエストリオール―３―グルクロナイ
ド―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―
BSA結合体で免疫したウサギから得られた前述
の抗血清の特異性を調べるために、32種のステロ
イドを用いてその交叉反応性をエストリオール―
３―グルクロナイド―６，７― 3Hの本抗血清へ
の結合量を標準曲線より求めた結果を第１表に示
す。 第１表の交叉反応性の欄における数値は、非標
識エストリオール―３―グルクロナイドの50％阻
止量を100とし、これに対する各種のステロイド
の読みの比率の逆数を百分率で示したものであ
る。
の免疫学的測定用抗原およびその製造法に関する
ものである。 さらに詳しくは、エストリオール―３―グルク
ロナイドの特異抗血清を得るためのハプテン―蛋
白結合抗原の新規合成法に関する。 エストリオールはエストロゲンの一種であり、
遊離型、抱合型等が知られている。このうち遊離
型は血中には存在するが尿中には通常出現せず、
グルクロン酸抱合型、あるいは硫酸抱合型として
排せつされる。 なかでも、グルクロン酸抱合型については、近
時、その生理的意義が注目されるようになり、妊
婦の血中および尿中に出現するエストリオール―
３―グルクロナイドとエストリオール―16−グル
クロナイドを分画測定することにより、胎児胎盤
機能を、より適確にとらえることの必要性が指摘
されている。 従来、体液中のエストリオールは結合型エスト
リオールを加水分解して、遊離型としたのち、抽
出後、コーバー反応を利用した比色法、または蛍
光法あるいは免疫測定法等を組合せて測定されて
きた。しかしながら水解操作を必要とするこれら
の測定法は、操作が煩雑であり、総エストリオー
ル量から遊離エリトリオール量を差引くことによ
つて抱合型と蛋白結合型の総量を一応求めること
は出来るが、グルクロン酸抱合型と硫酸抱合型の
分画測定並びにグルクロン酸抱合型のうち、エス
トリオール―３―グルクロナイドとエストリオー
ル―16―グルクロナイドの分画測定はほとんど不
可能であつた。 本発明は体液中のエストリオール―３―グルク
ロナイドを免疫学的に測定する時に必要な特異抗
体を作製するためのハプテン―蛋白結合抗原の新
規な合成法に関するものであり、該抗原を用いて
作製された抗体を使用することにより、体液中の
エストリオール―３―グルクロナイドを共存する
類似物質の影響を受けることなく、特異的に測定
することが可能となる。 近時、体液中のホルモンの測定法として注目さ
れているラジオイムノアツセイは放射性核種で標
識したホルモンと該ホルモンに対する抗体の結合
比が反応液中に加えられた抗原、即ち非標識ホル
モンの量によつて変化することを利用した方法で
あり、感度が高く、多数検体の測定が可能である
ことから、臨床検査室に於いて賞用されている。 しかしながら、その特異性に関しては議論の多
いところである。即ち、一般に体液中には測定対
象物質と類似の構造を有する物質が多数存在して
いるので、測定に用いる抗体は測定対象物質との
み反応するもの、即ち特異性が高く、交叉反応性
の低いものが要求される。測定対象物質との結合
定数が大で、かつ、特異性の高い抗体が用意され
れば該対象物質を測定するためのラジオイムノア
ツセイは、ほぼ確立したことになる。 前述の如く、体液中のエストリオールを従来法
で測定する場合、一般的には水解操作が必要にな
るがラジオイムノアツセイにおいては、エストリ
オールグルクロナイドと特異的に結合する抗体が
用意されれば、水解操作が不要となり、特異的、
かつ高感度な測定が可能となるので、今日ではエ
ストリオールグルクロナイドに限らず、各種のス
テロイドホルモンの抱合体を水解せずに免疫学的
に測定するための特異抗体の製造法、即ち、特異
抗体を製造するための抗原として、どのような物
質を使用すればよいかという点に免疫学的な測定
法を確立するための研究が進められている。 その一つの例として、エストロゲン―３―グル
クロナイドのグルクロン酸部分のカルボキシル基
にBSAを結合させた、いわゆるハプテン―蛋白
結合抗原が合成され、該抗原を用いて作製された
抗体を用いて、エストロゲン―３―グルクロナイ
ドを測定する方法が報告されているが、該抗体は
特異性が低く、遊離エストロゲンおよびエストロ
ゲン―16―グルクロナイド等に対して交叉反応性
を示すので、満足出来る結果を与えていない。
（P.Samarajeewa et al：Biochem.J.151，369〜
376，1975年） また、カルボキシフエニルアゾエストリオール
―16―グルクロナイドのC2位またはC4位にカー
ボジイミド法を用いてBSAを結合させたハプテ
ン―蛋白結合抗原の場合、該抗原を用いて作製さ
れた抗体は、遊離エストロゲンに対し2.2％以下
という比較的低い交叉反応性を示し、改良された
特異性を示したが、なお不充分であり、この不充
分な特異性はベンゾイル基にBSAを結合させる
際に同時にグルクロン酸部分のカルボン酸にも
BSAが結合するためであると推定されている。
（J.R.Soares et al：FEBS Lett，61，263〜
266，1976年） また、エストロンサルフエートのC6位にBSA
を結合させる方法（T.Nambara et al：J.Steroid
Biochem.13，1075〜1079，1980年）、エストロゲ
ンＤ環グルクロナイドのC2またはC4位にBSAを
結合させる方法（T.Nambara et al：J.Steroid
Biochem.９，785〜790，1978年、J.Pharm.Dyn.
１，55〜59，1978年）の場合、ハプテン―蛋白結
合抗原を用いて作製された抗体は、いずれもハプ
テンに対して高い特異性を示すことから、ハプテ
ンとBSAの結合部位から離れているハプテン分
子の一部分が、抗原性決定部位となつているこ
と、抗体の特異性は該抗原性決定部位に向けられ
ていることが理解される。 このことはエストロゲン―３―グルクロナイド
の場合、Ａ環C3位に近隣するC2あるいはC4位に
担体蛋白を結合させた抗原よりも、Ｂ環C6位に
担体蛋白を結合させた抗原の方がＡ環の構造を良
好に認識する抗体を産生させる上で有利であるこ
とを示している。 しかしながら、目下のところ、エストリオール
―３―グルクロナイドのC6位にBSAを結合させ
ることにより、エストリオール―３―グルクロナ
イドに対する特異抗血清を得るためのハプテン―
蛋白結合抗原の合成法についての報告はない。 このような観点から、本発明者等は、エストリ
オール―３―グルクロナイドを免疫学的に測定す
る時に使用出来る特異性の高い抗体を作製するこ
とを目的として、ハプテン―BSA結合体を鋭意
検索した結果、本発明を完成するに至つたもので
ある。 本発明は、エストリオール―３―グルクロナイ
ドのＡ環グルクロン酸部位にBSAが結合しない
ようにしながら、ステロイド骨格Ｂ環のC6位に
BSAを結合させたハプテン―BSA結合体の合成
法に関する。 本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第
１項に記載されている物質、すなわち、６―オキ
ソエストリオール―３―グルクロナイド―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
を用いて作製された抗体は、すでに公知の方法で
得られたエストリオール―３―グルクロナイド―
BSA結合体を用いて作製された抗体に比較して
ステロイドのＡ環構造の認識性が特に優れてお
り、特異性においてもさらに向上することが明り
ようとなり、本発明を完成した。 本発明に基づいて作製された抗体は、エストリ
オール―３―グルクロナイドのラジオイムノアツ
セイ用として特に好適であるが、ラジオイムノア
ツセイに限らず、羊赤血球またはポリスチレンラ
テツクス粒子を担体とする凝集反応および凝集阻
止反応に用いることも可能である。 本発明は、特許請求の範囲第２項イ〜ニに記載
した工程に基づいて６―オキソエストリオール―
３―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシム―BSA結合体を合成する方法に関
するものであるが、本発明のさらに加わつた特徴
の一つとして、エストリオール―３―グルクロナ
イドのグルクロン酸部分の保護基を合成工程の最
終段階、すなわち、特許請求の範囲第２項ニに記
載した工程において脱離させることにある。 本発明に基づくエストリオール―３―グルクロ
ナイド測定用の抗原として用いられる新規ステロ
イド化合物は、化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―３―グル
クロナイド―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキ
シム―BSA結合体である。 本発明による新規ステロイド化合物は下記の構
成、すなわち、イ化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテートをメチル（２，３，４―トリ―Ｏ―
アセチル―１α―ブロモ―１―デオキシ―Ｄ―グ
ルコピラノシド）ウロネートと反応させ６―オキ
ソエストリオール―16，17―ジアセテート―３―
グルクロナイド―トリアセテートメチルエステル
（）とする工程、ロ化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテート―３―グルクロナイドトリアセテー
トメチルエステルを酢酸ナトリウムの存在下、Ｏ
―カルボキシメチルヒドロキシルアミン塩酸塩と
反応させ６―オキソエストリオール―16，17―ジ
アセテート―３―グルクロナイド―トリアセテー
トメチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシム（）とする工程、）化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテート―３―グルクロナイド―トリアセテ
ートメチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシムをBSAと反応させ６―オキソエス
トリオール―16，17―ジアセテート―３―グルク
ロナイド―トリアセテートメチルエステル―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
とする工程、ニ化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテート―３―グルクロナイド―トリアセテ
ートメチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシム―BSA結合体（）を部分的に加
水分解する工程、以上のイ、ロ、ハ、ニの各工程
を組合せることによつて製造されるものである。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 化学構造式（）で示される市販の化合物、６
―オキソエストリオール―16，17―ジアセテート
300mgをトルエン50mlに溶解後、炭酸カドミウム
300mgを加え、ケタール化装置により脱水後、メ
チル（２，３，４―トリ―Ｏ―アセチル―１α―
ブロモ―１―デオキシ―Ｄ―グルコピラノシド）
ウロネート300mgを加え、14時間還流後、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフイー（ヘキサン／酢酸
エチル１：１）に付す。次いで分取TLC（ヘキ
サン／酢酸エチル３：２）に付し、Rf値0.23の画
分を酢酸エチルで溶出後、減圧濃縮した後、メタ
ノールから再結晶すると、化合物（）105mgが
無色針状結晶として得られた。 無色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 230゜〜231.5゜ 〔α〕２５ Ｄ −55.9゜（Ｃ＝0.47，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：59.70、Ｈ：6.14 化学式C35H42O15に対する計算値 Ｃ：59.83、Ｈ：5.98 NMR（CDCl3） 0.87 （3H，ｓ，18―CH3） 2.04，2.10 （12H，3H，eachs，16―，17−，
2′―，3′―，4′―OCOCH3） 3.72 （3H，ｓ，COOCH3） 4.25 （1H，ｍ，5′―Ｈ） 4.95 （1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 5.30 （5H，ｍ，16β―，17α―，2′―，3′―，
4′―Ｈ） 7.22 （2H，ｍ，aromatic Ｈ） 7.60 （1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４―Ｈ） 無色針状結晶性化合物（）80mgをメタノー
ル／酢酸エチル（５：１）18mlに溶解し、Ｏ―カ
ルボキシメチルヒドロキシルアミン塩酸塩190mg
および10％酢酸ナトリウム溶液1.0mlを加え、35
℃で12時間撹拌後、反応液に水を加え、酢酸エチ
ルで抽出する。抽出液を水洗乾燥後、溶媒を留去
し、残査をエーテルから再結晶すると化合物
（）60mgが無色針状結晶として得られた。 無色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 183゜〜185゜ 〔α〕２０ Ｄ −58.6゜（Ｃ＝0.47，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：55.29、Ｈ：5.69、Ｎ：1.89 化学式C37H45O17N・１１／２H2Oに対する計算値 Ｃ：55.36、Ｈ：6.03、Ｎ：1.74 NMR（CDCl3） 0.82 （3H，ｓ，18―CH3） 2.02 （15H，ｍ，16―，17―，2′―，3′―4′―
OCOCH3） 3.75 （3H，ｓ，COOCH3） 4.20 （1H，ｍ，5′―Ｈ） 4.70 （2H，ｓ，＝NOCH2―） 4.95 （1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 5.05〜5.40 （5H，ｍ，16β―，17α―，2′―，
3′―，4′―Ｈ） 6.95 （1H，dd，Ｊ＝８，２Hz，２―Ｈ） 7.20 （1H，ｄ，Ｊ＝８Hz，１―Ｈ） 7.50 （1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４―Ｈ） 無色針状結晶性化合物（）60mgをジメチルホ
ルムアミド（以下DMFと略称す）2.4mlに溶解
し、氷冷下、トリ―ｎ―ブチルアミン80μｌおよ
びイソブチルクロロフオルメート18μｌを添加し
30分後、氷冷下、BSA192mgを含有する含水DMF
のアルカリ溶液（H2O3.6ml―DMF4.8ml―1N
NaOH0.2ml）を加え、PH7.0〜7.5に調整後、４℃
で15時間撹拌し、得られた反応液を冷水にて23時
間透析後、凍結乾燥に付し、ハプテン―BSA結
合体（）275mgを得た。 ハプテン―BSA結合体（）275mgを水50ml溶
解後、5N NaOHにてPH12.0〜12.5に調整した液
を25℃で18時間撹拌する。次に冷水で22時間透析
後、凍結乾燥し、化合物（）232mgを得た。 化合物（）、すなわち６―オキソエストリオ
ール―３―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキ
シメチル）オキシム―BSA結合体のBSA1モル当
りのハプテン結合モル数をUV法により求めたと
ころ34モルであつた。 実施例 ２ 抗体の作成（ウサギの免疫） 体重2.5〜3.0Kgの在来種白色ウサギ３羽に６―
オキソエストリオール―３―グルクロナイド―６
―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結
合体抗原を以下の如く免疫した。 すなわち、抗原２mgを滅菌生理食塩液0.5mlに
溶解させ、これをフロイント・コンプリート・ア
ジユバンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエ
マルジヨンをウサギの肩甲部および足蹠数ケ所に
皮下投与した。以後２ケ月にわたつて２週間毎に
同様の投与を行つた。最後の投与（第５回目の投
与）から１週間後に、このウサギの耳静脈から10
mlを採血し、これを3000回転、10分間の遠心分離
にかけ、得られた抗血清を−20℃に保存した。使
用時においては、該抗血清を解凍し、BSA0.06
％、牛―γ―グロブリン0.05％を含む0.05Mホウ
酸緩衝液（PH8.0）を用いて１：3000の希釈率で
希釈し、標準曲線を作成した。 測定操作 エストリオール―３―グルクロナイドを含む試
料にエストリオール―３―グルクロナイド―６，
７― 3H（約7500dpm）および抗血清0.25mlを添
加し、４℃で１時間孵置する。次いで50％硫安溶
液0.25mlを添加し、４℃で20分間放置後、3000回
転で15分間遠心し、得られた上澄液0.2mlをと
り、放射活性を計測する。 交叉反応性について ６―オキソエストリオール―３―グルクロナイ
ド―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―
BSA結合体で免疫したウサギから得られた前述
の抗血清の特異性を調べるために、32種のステロ
イドを用いてその交叉反応性をエストリオール―
３―グルクロナイド―６，７― 3Hの本抗血清へ
の結合量を標準曲線より求めた結果を第１表に示
す。 第１表の交叉反応性の欄における数値は、非標
識エストリオール―３―グルクロナイドの50％阻
止量を100とし、これに対する各種のステロイド
の読みの比率の逆数を百分率で示したものであ
る。
【表】
【表】
第１表の結果より、本発明の新規化合物を利用
した抗原による抗体を使用したもののエストリオ
ール―３―グルクロナイドに対する特異性が他の
ものに比較して、極めて高く、交叉反応が低く抑
えられていることが明りようである。
した抗原による抗体を使用したもののエストリオ
ール―３―グルクロナイドに対する特異性が他の
ものに比較して、極めて高く、交叉反応が低く抑
えられていることが明りようである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―３―グル
クロナイド―６―（ｏ―カルボキシメチル）オキ
シム―BSA結合体（式中―NH―BSAは牛血清ア
ルブミン残基を表わし、Ｇは で示されるグルクロニル基を表わす。以下同
様。）から成るエストリオール―３―グルクロナ
イド測定用抗原。 ２ イ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテート（）をメチル（２，３，４―トリ
―ｏ―アセチル―１α―ブロモ―１―デオキシ―
Ｄ―グルコピラノシド）ウロネートと反応させ６
―オキソエストリオール―16，17―ジアセテート
―３―グルクロナイド―トリアセテートメチルエ
ステル（）とする工程、 ロ 化学構造式 （式中G′は で示されるグルクロニル基を表わす。以下同
様。）で示される６―オキソエストリオール―
16，17―ジアセテート―３―グルクロナイド―ト
リアセテートメチルエステル（）を酢酸ナトリ
ウムの存在下、ｏ―カルボキシメチルヒドロキシ
ルアミン塩酸塩と反応させ６―オキソエストリオ
ール―16，17―ジアセテート―３―グルクロナイ
ド―トリアセテートメチルエステル―６―（ｏ―
カルボキシメチル）オキシム（）とする工程、 ハ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジセテート―３―グルクロナイド―トリアセテー
トメチルエステル―６―（ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシム（）を牛血清アルブミン（以下、
BSAと略す）と反応させ６―オキソエストリオ
ール―16，17―ジアセテート―３―グルクロナイ
ド―トリアセテートメチルエステル―６―（ｏ―
カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
（）とする工程、 ニ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16，17―
ジアセテート―３―グルクロナイド―トリアセテ
ート―６―（ｏ―カルボキシメチル）オキシム―
BSA結合体（）を部分的に加水分解すること
を特徴とする化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―３―グル
クロナイド―６―（ｏ―カルボキシメチル）オキ
シム―BSA結合体（）の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16883381A JPS5871459A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | エストリオ−ル−３−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16883381A JPS5871459A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | エストリオ−ル−３−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5871459A JPS5871459A (ja) | 1983-04-28 |
| JPS6224743B2 true JPS6224743B2 (ja) | 1987-05-29 |
Family
ID=15875360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16883381A Granted JPS5871459A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | エストリオ−ル−３−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5871459A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5854009A (en) * | 1995-09-19 | 1998-12-29 | Immuna Care Corporation | Method of detecting estrogen-sensitive pathologies |
-
1981
- 1981-10-23 JP JP16883381A patent/JPS5871459A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5871459A (ja) | 1983-04-28 |
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