JPS6224745B2 - - Google Patents

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JPS6224745B2
JPS6224745B2 JP11607076A JP11607076A JPS6224745B2 JP S6224745 B2 JPS6224745 B2 JP S6224745B2 JP 11607076 A JP11607076 A JP 11607076A JP 11607076 A JP11607076 A JP 11607076A JP S6224745 B2 JPS6224745 B2 JP S6224745B2
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JP
Japan
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hepatitis
antibody
antibodies
enzyme
antigen
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JP11607076A
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JPS5257316A (en
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Pii Harubaato Shiimoa
Anken Miruton
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Cordis Corp
Original Assignee
Cordis Corp
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Publication date
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Priority claimed from US06/617,743 external-priority patent/US4474878A/en
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Publication of JPS6224745B2 publication Critical patent/JPS6224745B2/ja
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545Synthetic resin

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  • Food Science & Technology (AREA)
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  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
本発明は抂ね、肝臓炎に関連したアンチゲンの
存圚を怜出する方法に係る。特定するに、本発明
は、肝臓炎の存圚を怜出すべく酵玠で暙識された
抗䜓を甚いおアンチゲンず反応させるこずを包含
する肝臓炎に関連したアンチゲンの免疫枬定に係
る。 「肝臓の炎症」を意味する肝臓炎は、胆管が感
染し又は閉塞するこずによる。ビヌルス性肝臓炎
には皮類圚぀お、䞀方が他のものより朜䌏期が
長いず考えられる。埓前、患者が肝臓炎にかかり
既知の非経口的暎露を有したずき、その肝臓炎は
「血枅性肝炎」ずいわれた。もし患者が既知の非
経口的暎露を有さず経口的に肝臓炎にかか぀おい
れば、それは「䌝染性肝炎」ず呌ばれた。しかし
ながら、文献等で情報提䟛されおいるように、䞡
者は朜䌏期が重なり合い、その䞊「䌝染性肝炎」
であ぀おも非経口的にかかるこずがあり、所謂
「血枅性」肝炎であ぀おも経口的にかかるこずが
ある。かくしお、肝臓炎には少くずも皮の違぀
た媒介によ぀お匕き起される二぀のタむプがある
ように思われるが、これらを識別するのに甚語
「血枅性肝炎」および「䌝染性肝炎」を甚いるべ
きでない。埓぀お、「䌝染性肝炎」に最も近䌌し
たタむプの肝炎には「肝臓炎」を甚いるべ
きであり、たた「血枅性肝炎」に最も近䌌しおい
るものには肝臓炎」を甚いるべきこずが
瀺唆されおいる。 本明现曞に蚘茉の「䟋」は肝臓炎に関連した
アンチゲンの怜出に指向する。而しお、血枅性肝
炎に最も近䌌した肝臓炎にかか぀おいる患者は、
それがどんな症状であれ、しばしば血液䞭に䞊蚘
アンチゲンを有しおいる。この時点で泚意すべき
こずは、肝臓炎又は仮定される肝臓炎に関連
したアンチゲンの存圚を枬定するための信頌しう
る方法がないずいうこずである。かくしお、本明
现曞䞭の䟋は肝臓炎に関連したアンチゲンの存
圚を怜出するこずに指向する。しかしながら、別
タむプの肝臓炎に関連したアンチゲンであ぀おも
それが䞀床同定されたならそのアンチゲンの存圚
を怜出するのに本発明の方法が䜿甚され埗ない理
由はない。 「血枅性肝炎」ないし肝臓炎にかかるず、無
芖するこずのできない苛酷な臚床問題が創出す
る。而しお、問題が苛酷なるが故に、肝臓炎を怜
出するための詊隓方法が皮々開発された。かかる
詊隓方法に、ミクロ・アりチタラニヌMicro―
Ouchterlony、免疫拡散、補䜓結合、免疫電気
滲透法Immunoelectro―osmophoresis、ヘム
凝集およびヘム凝集抑制、電子顕埮鏡、ならびに
固盞攟射免疫枬定が包含される。これらの詊隓方
法は各々、ブリテむツシナ・メゞカル・ブリテン
British Medical Bulletin、1972、Vol.28、No.
りむルス性肝炎、P138〜141に詳述されお
いるので必芁に応じこれを参照されたい。 免疫電気滲透法又は逆電気泳動法CEP
は、肝臓炎に関連したアンチゲン以䞋時折肝炎
関連アンチゲン又は単に肝炎アンチゲンず呌称す
るずその抗䜓以䞋単に肝炎抗䜓ず呌ぶを怜
出する迅速䞔぀簡単な方法を䟛䞎する。しかしな
がら、この技術は、䟋えば補䜓結合に比べ若干感
床においお劣る。而しお、その䞻な利点は、時
間内で詊隓を完了しうるずいうこずであるが、し
かしながら、感床レベルが䜎いために、CEPは
食品医薬管理局the Food and Drug
Administrationによ぀おもはや認可されおいな
い。 攟射免疫枬定法RIAは、詊隓を行うのに必
芁な装眮が比范的耇雑、特殊な高䟡装眮であるば
かりでなく、攟射性同䜍元玠ラゞオアむ゜トヌ
プを取扱う際厳重な予防策が芁求されるので、
この技術を日垞蚺断目的に適甚するこずは若干制
限されるものず信ずる。その䞊、ラゞオアむ゜ト
ヌプ暙識は重倧な朜圚的健康危険を呈し、監芖お
よび原子゚ネルギヌ委員䌚Atomic Energy
Commissionの䜿甚および補造に察する免
蚱を必芁ずし、䞔぀廃棄物凊理問題を呈する。に
もかかわらず、この技術は今日、免疫枬定するの
にかなりよく定着しおいる。 無論、免疫孊的方法は、党おの抗䜓およびアン
チゲンの䞻芁特性すなわち特定の補䜓アンチゲン
又は抗䜓ずの反応性に䟝拠する。かくしお、もし
抗䜓がそのアンチゲンを含有する血枅に添加され
るなら、抗䜓ずアンチゲンは錯圢成し而しお溶液
から析出するこずができる。ほずんどの前蚘詊隓
方法においお、この簡単な事実を利甚するこずに
より、人血枅䞭のアンチゲンの存圚が怜出され
る。 これたで、暙識抗䜓が皮々のアンチゲンを同定
するために甚いられおきた。もし、特定のアンチ
ゲンに察し特異性であるこずがわか぀おいる抗䜓
を、該抗䜓産性のため刺激された寄䞻動物の血枅
又は血しようのグロブリン郚分から分離するな
ら、この抗䜓は既知方法によ぀お暙識するこずが
できる。この抗䜓を、暙識剀䟋えば䞊述の劂きラ
ゞオアむ゜トヌプ又は螢光薬品のような物理的に
怜出できる物質ず結合させるこずにより、抗䜓の
存圚を怜出するこずができる。かくしお、暙識抗
䜓を蚺断に甚いるずき、察応するアンチゲンが或
る調補詊隓詊料䞭に存圚すれば、該暙識抗䜓はそ
のアンチゲンず結合し、而しお詊隓詊料䞭の該暙
識抗䜓を怜出するこずによりアンチゲンの存圚が
確認されうる。 この蚺断甚暙識抗䜓は、それが怜出を所望され
るアンチゲンずだけ反応し該アンチゲンずは党く
異なるかさほど重芁でない他の近瞁アンチゲンず
盞互反応しないように十分特異性であるべきであ
る。かくしお、いかなる免疫枬定においおも、抗
䜓の絊源および抗䜓の産生方法がいずれも党く臚
界的であるずいうこずは明らかである。 前述の劂く、肝臓炎に関連したアンチゲンを怜
出する方法の䞀぀に固盞攟射免疫枬定法が包含さ
れる。この手順は米囜特蚱第3867517号に開瀺さ
れおいる。該特蚱に開瀺される劂く、攟射免疫枬
定を行う際、該枬定に甚いられる成圢ポリスチレ
ンのチナヌブり゚ルないしむンサヌトが先ず抗䜓
で被芆される。これは、被芆すべき該郚材を抗䜓
溶液ず䞀緒に枩眮するこずによ぀お達成される。
その埌、未知詊料を、この抗䜓被芆せるチナヌブ
り゚ルないしむンサヌトず共に枩眮しお抗䜓ず該
詊料䞭に存圚するアンチゲンずを反応させる。チ
ナヌブり゚ルは次いで掗浄され、曎に攟射性同䜍
䜓―125で暙識された抗䜓ず共に枩眮される。
再床の掗浄によ぀お、未結合の暙識抗䜓が党お取
り陀かれる。かくしお、詊隓詊料䞭にアンチゲン
が存圚する堎合、ポリスチレンのチナヌブり゚ル
ないしむンサヌト、抗䜓、アンチゲンおよび
―125暙識抗䜓からなるサンドむツチが圢成され
る。次いで、この―125暙識抗䜓から出る攟射
線が蚈数噚によ぀お枬定され察照ず比范される。 たた、攟射免疫枬定を行う際、眮換ポリスチレ
ン䟋えばむ゜チオシアノスチレンをグラフトさせ
たポリテトロフルオル゚チレンの円板が有甚であ
りうるこずも開瀺されおいる。このポリスチレン
は、たん癜質ず共有結合しお生物詊隓に有甚な詊
薬をもたらしうるたん癜質反応性基の特殊蚭蚈衚
面をも぀䞍溶性物質である。最近、抗䜓をラゞオ
アむ゜トヌプ又は螢光薬品で暙識するこずに取぀
お代る重芁な方法が開発された。これは、抗䜓を
酵玠で暙識する方法である。この手順に぀いお
は、米囜特蚱第3654090号および同第3791932号に
蚘茉されおいる。たた、クリニカ・ケミカル・ア
クタClinika chemical Acta、481973、15
〜18には、サンドむツチ法又は競合いずれかによ
るアルフアプトプロテむンの酵玠結合匏免疫枬
定が開瀺されおいる。 酵玠暙識は、攟射免疫枬定に比范しおいく぀か
の重芁な利点を有しおいる。䟋えば、最終混合物
䞭の酵玠暙識分子は党お、読み取りに参䞎するが
他方、最終混合物䞭のアむ゜トヌプ原子は、読み
取りの間ごく小割合しか厩壊せず而しお該割合の
みが攟射免疫枬定に参䞎するにすぎない。たた、
酵玠暙識では、怜出可胜な最終生成物を圢成すべ
く倚くの基質分子を攻撃するこずにより、党おの
暙識が読み取りに、䟋えば100000回minたで反
埩参䞎し、それがため感床が倧巟に高められる
がアむ゜トヌプ暙識原子は読み取りの間床だ
け厩壊し、その埌は参䞎しなくなる。酵玠暙識詊
薬は保存寿呜が長いがアむ゜トヌプ暙識詊薬は
絶えず厩壊し぀぀あり、その保存寿呜問題は苛酷
である。たた、酵玠暙識詊薬の䜿甚に関連した健
康危険は最小のものであるが、アむ゜トヌプ暙識
の堎合それは重倧である。曎にたた、酵玠暙識に
よる免疫枬定は、簡単で䞔぀比范的安䟡な読み取
り装眮を甚いるこずができるがアむ゜トヌプに
よる免疫枬定の銖尟は、これず著しく盞違しお厩
壊の怜出効率に䟝拠し而しおたた、きわめお高䟡
に぀く怜出装眮の性胜に䟝拠する。 人の血液䞭に肝炎アンチゲンを芋出すこずは、
肝臓炎の臚床歎を取埗するこずず均等ではないか
もしれないが、皮々の研究によ぀お、肝炎アンチ
ゲンに関し陜性ず出た血液を患者が受容したずき
肝炎感染の発病が高いずわか぀た。しばしば、血
液センタヌから入手される特定の血液ナニツトを
䜿甚するか吊かを、比范的短時間で決定せねばな
らないので、肝臓炎のスクリヌニングテスト遞
別詊隓を高䟡な装眮を必芁ずするこずなく高感
床、迅速䞔぀容易に行うこずはきわめお重芁であ
る。肝臓炎に関連したアンチゲンの怜出に埓来甚
いられた皮々の詊隓は或る皋床満足されおきたけ
れども、しかしこれは党お䞀぀又は二぀以䞊の欠
点を有した。 毎幎肝臓炎によ぀お䜕千人もの人が死に䞔぀入
院しおいる。長い間、この病気を抑制する鍵は、
䞖界的に有効でありたた容易䞔぀日垞的に行いう
る血液遞別技術であるず考えられおきた。既述の
ように、いく぀かの技術が今日受容されおいるけ
れども、それらは比范的䜎感床であり、繁雑䞔぀
時間のかかる手順を必芁ずし、ほずんどのヘモト
ロゞヌラブhemotology labにおいお容易に
は利甚し埗ない耇雑な装眮を䜿甚せねばならず、
或は、非垞に䞍安定で手近かには保党し埗ない詊
薬を甚いねばならない。それ故、これらの技術は
理想的な詊隓の芁求を満たすものではなか぀た。 抂括するに、本発明は、「サンドむツチ」原理
を甚いた肝炎アンチゲンの盎接的免疫枬定を包含
する。この枬定を行うに際し、怜出せんずするア
ンチゲンを、これず反応する抗䜓局の間にはさ
む。䞀方の抗䜓局は酵玠で暙識されおおり、他の
局は䞍溶性郚材に共有結合しおいる。酵玠は、化
孊基質にさらされるが、該基質は酵玠觊媒の存圚
で化孊倉化を起こしお反応生成物を圢成する。肝
臓炎の有無は、この反応生成物を定量するこずに
よ぀お決定される。 本発明の別の様盞に埓えば、肝臓炎の怜出キツ
トないしセツトが䟛䞎される。この怜出セツトの
䞉倧詊薬は、肝臓炎に関連したアンチゲンず反応
する抗䜓を結合させた䞍溶性重合䜓固䜓、酵玠で
暙識された肝炎抗䜓詊薬および、酵玠の觊媒的圱
響䞋化孊的に倉化しお怜出可胜な最終生成物を圢
成するこずのできる酵玠基質である。遞ばれた具
䜓化では、結合䜓の酵玠がアルカリ性ホスフアタ
ヌれりん酞酵玠であり、酵玠基質が―ニト
ロプニルホスプヌトである。䞊蚘怜出セツト
にはたた、肝炎アンチゲンに察し陰性、匱陜性お
よび匷陜性の血枅を包含する察照血枅、詊隓詊料
―䞍溶性重合䜓固䜓間の非特異性反応の頻床を最
小限にする詊隓詊料甚銬グロブリン添加剀の溶
液、酵玠基質溶液のPHを反応に最適な範囲に保持
すべく䌁図された緩衝液、ならびに枩眮で甚いら
れる少量の詊薬―䞍溶性重合䜓固䜓間の接觊を高
めるように蚈算された寞法の耇数個のバむアル
小びんが含たれる。酵玠―酵玠基質系ずしお
アルカリ性ホスフアタヌれおよび―ニトロプ
ニルホスプヌトを甚いるずき、緩衝液は
Na2CO30.028MおよびMg〓0.001Mの氎溶液であ
る。 本発明の別の態様においお、アルカリ性ホスフ
アタヌれの劂き官胜酵玠ず化孊的に結合した、免
疫孊䞊掻性な粟補肝炎抗䜓が免疫枬定法に甚いら
れるべく䟛䞎される。 本発明の曎に別の態様においお、円板様䞍溶性
郚材ないしマトリツクスが免疫枬定法に甚いられ
るべく䟛䞎される。このマトリツクスはその衚面
局に、たん癜質ず反応する耇数個の基を、䞀様に
グラフトさせおいる。粟補された肝炎抗䜓はこの
反応基に共有結合しお肝炎抗䜓の倖面局をもたら
す。 免疫枬定法においお、䞊蚘の䞍溶性郚材は平底
のバむアルに入れられ、䞔぀液䜓詊隓詊料で皋よ
く芆われる。詊隓が再珟性であるためには、詊隓
詊料䞭のアンチゲンが抗䜓で被芆された円板の衚
面党䜓に暎露されおいるこずが重芁である。平ら
な衚面をも぀円板の䜿甚は感床損倱に垰すこずが
発芋された。埓぀お、本発明の円板の䞡面は、円
板面―バむアル底の接觊を少くするように或る䞍
敎圢状に倉圢されおいる。遞ばれた䞀぀の具䜓化
では、抗䜓を結合させるに先立぀お円板をプレス
に通すこずにより、その䞡面を焌き網様ないし栌
子圢にされる。 それ故、本発明の䞻芁目的は、䜓液䞭の肝臓炎
に関連したアンチゲンの有無を迅速、簡単、正確
䞔぀日垞的に決定しうるような肝臓炎の怜出キツ
トおよびその䜿甚方法を提瀺するこずである。 本発明の別の目的は、比范的未熟な人が肝臓炎
に関連したアンチゲンの高感床再珟性免疫枬定法
を日垞基準で実斜するのに適合せる単䜍化詊隓セ
ツトを提䟛するこずである。 本発明の別の目的は、免疫枬定法を実斜するに
際し手順䞊の誀りを最小限にすべく䌁図された劂
䞊の詊隓セツトにしお、必芁な詊薬、反応容噚等
を党お、詊隓の粟床および感床を最適にすべく䌁
図された圢で入れた該詊隓セツトを提䟛するこず
である。 本発明の別の目的は、詊隓の際実斜される皮々
の工皋を暙準化するように䌁図された詊隓セツト
入り実隓宀装眮を提䟛するこずである。 本発明の曎に別の目的は、詊隓詊料の比范基準
ずしお、肝炎関連アンチゲンに察し陰性、匱陜性
および匷陜性の察照詊料を含む詊隓セツトを提䟛
するこずである。 本発明の別の目的は、免疫枬定法で甚いられる
肝炎抗䜓―酵玠結合䜓にしお、抗䜓ず酵玠ずが各
各の所望される化孊特性を保有するが劂き該結合
䜓を提䟛するこずである。 本発明の他の目的は、免疫孊的特性ないし觊媒
特性を損倱するこずなく長期間保存するこずので
きる劂䞊の結合䜓にしお、肝臓炎に関連したアン
チゲンず高床に反応しうるものを提䟛するこずで
ある。 本発明の曎に別の目的は、反応に觊媒䜜甚を及
がしお最終生成物を高い反応速床でもたらすこず
のできる酵玠ず結合した肝炎抗䜓を提䟛するこず
である。而しお、䞊蚘最終生成物の濃床は、枬光
型怜出噚を甚いお正確に怜出されうる。 本発明の別の目的は、䞊述の劂き結合䜓にし
お、高床に粟補され而しお、肝臓炎に関連したア
ンチゲンの高感床、高粟床免疫枬定を促進するの
に倧いに貢献するずころの該結合䜓を提䟛するこ
ずである。 本発明の別の目的は、既述の詊隓で蚘した劂き
有甚な䞍溶性マトリツクスにしお、その衚面党䜓
に高濃床の粟補肝炎抗䜓を䞀様に分垃させたもの
を提䟛するこずである。 本発明の他の目的は、肝炎抗䜓を固䜓に結合さ
せるこずによ぀お、それが䜿甚䞭受けるかもしれ
ない機械力ないしは化孊的力によ぀お陀去されな
いようにするこずである。この点に関しお絶察に
必芁なこずは、䞊蚘結合を行う際抗䜓が官胜性の
たゝであるようにするこずすなわち抗䜓がその免
疫反応に参䞎でき而しお該結合によ぀お免疫化孊
的に倉性されないようにするこずである。 本発明の他の目的は、免疫枬定の際抗䜓で被芆
された䞍溶性固䜓が取扱いやすいように䞔぀た
た、枩眮の際䜿甚溶液にその被芆衚面のより倚い
郚分が定量暎露されるように該䞍溶性固䜓の圢状
を改善するこずである。 劂䞊の目的および他の目的ならびに本発明の特
城は、䞀぀の遞定された而しお奜たしい具䜓化を
以䞋説瀺するこずによ぀お圓業者には明らかずな
ろう。 その前に、添付図面を簡単に説明するなら、 第図は、本発明の方法の工皋を芁玄した流れ
図であり、第図は、本発明の方法および詊隓セ
ツトに甚いられる遞定された䞍溶性郚材の透芖図
であり、 第図第図および第図は、本発明の免疫
枬定法の䞉぀の枩眮段階を図瀺し、 第図は、本発明に埓぀お詊隓される詊隓詊料
の陜性免疫枬定の際珟出する「サンドむツチ」構
造の抂略的衚瀺である。 奜たしい具䜓化の説明 先ず、本発明をその最も広い党様盞においお詳
述する。本発明に埓぀た肝臓炎の怜出方法は、第
図に䟋瀺する劂き四぀の異なる段階で実斜され
る。 第の段階は、䞍溶性郚材第図参照
䞊に固定させた抗䜓を第図に図瀺せる劂き詊隓
血枅䞭に存圚するアンチゲンず反応させるこずを
包含する。この反応はアンチゲンを固定し、而し
お該アンチゲンは、第図に瀺す劂き第の工皋
で酵玠暙識された抗䜓ず反応しお、該酵玠暙識さ
れた抗䜓をも固定するようになる。第図に瀺す
劂く、酵玠は適圓な基質にさらされ、該基質は酵
玠の䜜甚を受けお色の倉化をきたす第の段
階。この色倉化は、肝臓炎に関連したアンチゲ
ンの存圚を瀺す指暙ずなる。最埌の第段階は、
色の床合いを読み䞔぀これを察照基準で埗られた
倀ず比范するこずを包含する。 䞊に抂蚘した詊隓に必芁ずされるもの党おを含
む本発明の肝炎怜出セツトは100回の詊隓に向く
よう䌁図される。明らかな劂く、以䞋に開瀺せる
詊薬の量等を比䟋的に加枛するこずにより、これ
よりも倧きな又は小さな芏暡のセツトを補造する
こずができる。詊薬および察照を含むキツトは䟋
えば箱の䞭に配列されお、䜿甚時たで〜℃で
保存される。曎に、100回の詊隓を行うのに十分
な個数のバむアルが備え付けられる。 たた、第図に瀺す劂き栌子圢に䌌た衚面を有
し、その倖偎には肝炎アンチゲンず反応する抗䜓
局を結合、凍結也燥させた重合䜓円板が100〜105
個備え付けられる。かかる䞍溶性固䜓円板の正確
な性質ずその補造法に぀いおは埌で開瀺する。 詊隓セツトの第の詊薬は、肝炎関連抗䜓―ア
ルカリ性ホスフアタヌれ結合䜓の詊料よりなる。
この詊薬の正確な性質、その補造法および有甚な
代替詊薬に぀いおは埌で開瀺する。この詊薬は、
そのたゝ䜿甚に䟛される溶液ずしお支絊される。 詊隓セツトの第の詊薬は、400mgの―ニト
ロプニルホスプヌト酵玠基質である。この化
合物は、粉末圢で安定であるが、しかし緩衝液に
溶解させおmgmlの溶液にするずきは比范的䞍
安定ずなる。埓぀お、かかる溶液は䜿甚盎前に調
補しなければならない。 詊隓の際に甚いられる他の物質に、或る量の銬
グロブリン、詊料垌釈剀ならびに皮々の緩衝液お
よび掗浄液が包含される。これらの詊薬および物
質の正確な性質および補造法に぀いおは埌で述べ
る。  抗䜓の産生 本発明を実斜するために、肝臓炎に関連したア
ンチゲンず反応する抗䜓を取埗するこずが必芁で
ある。泚意すべきは、かかる抗䜓が存圚するずい
うこず而しお、本発明を特定の抗䜓の䜿甚に限定
する぀もりはないずいうこずである。 反応性抗䜓は、既知のアンチゲンないし抗原詊
料を泚入された寄䞻動物から採血したものを粟補
するこずによ぀お甚意するこずができる。肝臓炎
に関連したアンチゲンず反応する抗䜓は抂ね、英
囜特蚱第1387625号に開瀺された方法によ぀お産
生されうる。 肝炎抗䜓の産生は先ず、肝炎に間連したアンチ
ゲンに぀いお陜性であるこずがわか぀おいる血液
の取埗に䟝拠する。埓぀お、皮々の絊源から埗ら
れた血液ナニツトは先ず、それが本発明の粟補さ
れた免疫特異性抗䜓を産生するのに適しおいるか
どうかを決定すべく評䟡されねばならない。 肝炎アンチゲンに関し陜性ず思われる血液袋セ
グメントを〜℃で垂盎䜍眮に保ち血球が䞋半
分に萜ち着くようにする。該血球から血しようが
分離される。而しお、この垌釈前の血しようずそ
しお生理食塩氎で16に垌釈せる詊料の、基準
抗䜓に察する力䟡を呚知の逆電気泳動CEP
法によ぀お詊隓した。垌釈しおない血しようず
16に垌釈した詊料がいずれも陜性であるずき
は、その血液ナニツトは、埌述の劂き本発明の粟
補抗䜓の調補甚に受容されるず認められる。 血液ナニツトから単離されたアンチゲン郚分
は、寄䞻動物䜓内での抗䜓産生を刺激するのに甚
いられ、或は該動物によ぀お産生される抗䜓を粟
補するのに甚いられる。アンチゲンがいずれに甚
いられるにせよ、その前にこれを前単離プロセス
に付さなければならない。 血しようは無菌の枛圧容噚に移され、そこで、
CaCl2の5M溶液を、血しよう200mlに぀き
Cacl20.75mlの基準で加えるこずにより凝固され
る。次いで、この溶液を氎济䞭37℃で時間枩眮
し又は、凝塊が圢成するたで枩眮する。堅い凝塊
が圢成した埌、血しようを−20℃で凍結させ䞔぀
〜℃で融解させお凝塊を収瞮せしめる。血枅
が凝塊から分離する。これを必芁に応じ過する
ず、このものはそのたゝ、免疫化甚肝炎アンチゲ
ンペレツトの補造に䟛され、或は免疫吞収塔での
䜿甚に䟛される。 (1) 免疫化甚アンチゲンペレツトの補造 䞊蚘プロセスに付した肝炎陜性血枅を℃で30
分間10000rpmの遠心分離にかけた。この遠心分
離の䞊柄み液を超遠心管に配分しお、䟋えばベツ
クマンBeckmanL2―65B機で℃、〜20時
間40000〜50000rpmの超遠心に付した。各管内の
䞊柄み液を取り出し、廃棄した。アンチゲンを含
むペレツトは、芏定0.15M食塩類で前ゆすぎ
した。 次いで、各遠心管に少容量の生理食塩氎を加
え、管内の内容物を音響振動sonicationに付
しおペツトを厩壊させた。次いで、各゜ニケヌタ
チナヌブ内の懞濁物を䞀緒にしプヌルし、こ
れを再床、生理食塩氎の入぀た枅浄なチナヌブに
等配分した。この溶液を再び、䞊蚘の劂く、ベツ
クマンL2―65B遠心機で℃、〜20時間40000
〜50000rpmで遠心する。 䞊段に蚘茉の手順は回ないしそれ以䞊反埩す
るこずができる。 各遠心管から䞊柄み液を取り陀いた埌、ペレツ
ト物質を最小容量の生理食塩氎䞭にプヌルした。
詊料を基準肝炎抗䜓に察しお分析した。もしペレ
ツトがCEPにより25又はそれ以䞊の力䟡を
瀺すなら、それを免疫化に甚いるこずができる。
プヌルしたアンチゲンペレツトをmlず぀の分取
量に分けお将来の䜿甚に備え−20℃で凍結した。 (2) 肝炎抗䜓の産生および前粟補 䞊述の劂く調敎したアンチゲンペレツトの詊料
を、免疫化の朝、等容のフロむンドFreund
完党補助液に添加しお、圓業者に呚知の手順に埓
い゚マルゞペンを調補した。次いで、該アンチゲ
ンを寄䞻動物䟋えば銬に、それ自䜓既知の技術に
埓い泚射しお肝炎抗䜓を発生した。免疫性を付䞎
した銬から採血し、或はこの銬を慣甚技術による
血しよう搬出法plasmapheresisに付した。
別法ずしお又は远加的に、他の免疫付䞎ルヌトで
補助液䞍圚の調剀を甚いるこずができる。 採取した血液は、埌の免疫吞収―粟補工皋を予
期しお肝炎抗䜓を単離すべく凊理せねばならな
い。抂括するに、この前粟補は段階で遂行され
る。先ず、寄䞻動物からの血しようを再石灰化す
る。次いで、䞍溶性アンチゲン―抗䜓の錯圢成を
惹起するこずにより肝炎関連抗䜓以倖の抗䜓を沈
降させるのに十分量の正垞人血しようNHP
ず䞊で埗た血枅ずを混合する。吞収された抗血枅
を、CEPを䜿぀お肝炎抗䜓に関し分析する。最
埌に、肝炎に関連したアンチゲンず反応する抗䜓
を硫酞アンモニりムで沈殿させる。この物質は䜿
甚時たで凍結するこずができる。 (3) 免疫吞収剀チダヌコヌル塔の補造 本発明の詊薬を生成するのに甚いられる粟補抗
䜓の補造は、䞊述の劂く産生された肝炎抗䜓を免
疫特異性抜出プロセスに付すこずにより達成され
る。この手順の総説が、「アンチゲンず抗䜓の免
疫埗異性分離」Immunospecific Separation of
Antigens and Autibodies」ず題したブラデむ
ツシナBradish等の1975幎月19日付け英囜
特蚱第1387625号に蚘されおいるので必芁に応じ
これを参照されたい。 䞀般に、この粟補プロセスを本発明で利甚する
ずき、それは、抗䜓が肝炎アンチゲンず反応しお
錯圢成し而しお、採血から抜出された抗䜓詊料䞭
に䞍可避的に存圚する他の倖来抗䜓およびたん癜
質を陀倖するずいう抗䜓の胜力を利甚する。 前掗浄した吞収剀カヌボンをガラス管ないしプ
ラスチツク管に慣甚技術を甚いお充おんするこず
により、塔を甚意した。肝炎アンチゲンの異なる
混成物を埗るために、別個の血枅詊料少くずも
個からアンチゲンをプヌルした。次いで、プヌル
したアンチゲンを、柎倖吞収を基にしお〜
mgml溶媒のたん癜質濃床に調敎した。 アンチゲンをカヌボンに付着させるべく、この
垌溶液を300〜1000mlhr範囲の流量で吞収塔に
導入した。この際、吞収塔内のチダヌコヌル
圓り75mgのたん癜質を添加するようにすべきであ
る。吞収塔からの流出物を500mlの分取量で集
め、その各々をたん癜質含量に぀いお怜査した。
流出物が出発物質のたん癜質含量にほゞ等しい該
含量を瀺すずき、吞収塔はアンチゲンで飜和され
たず認められる。チダヌコヌル局は、流出物が
280nmにおいお目立぀皋の怜出可胜な吞収を瀺さ
なくなるたで塔に硫酞塩緩衝剀入り食塩氎
PBSを流すこずによ぀お、チダヌコヌル局を
掗浄した。 ゆるく結合したたん癜質を溶離すべく、チダヌ
コヌル局を新しく調補したチオ硫酞ナトリりム
200mg入り5Mよう化ナトリりム液でフラツシ
ナ掗い流しした。その埌、吞収塔に十分量の
PBSを流し入れお、該塔から䞊蚘のよう化ナトリ
りム液を流去する。而しお、mgmlのナトリり
ムアゞト防腐剀を含有するPBCで吞収局を最
終的に掗浄した埌、塔を〜℃に保存するこず
により、埌の䜿甚に備えるこずができる。 (4) 酵玠結合䜓に甚いられる抗䜓および䞍溶性固
䜓の補造 䞊述の劂く粟補した抗䜓は硫酞アンモニりムが
ない。これをPBSによ぀お、抗䜓郚察緩衝剀
郚の基準で垌釈した。塔を敎備し、画分が集めら
れるように䜍眮づけた。この塔に、䞊蚘の抗䜓溶
液を玄200mlhrの流量で連続的に添加した。流
出物を集め、これをたん癜質および肝炎抗䜓含量
に぀いお詊隓するこずにより、塔がい぀抗䜓で飜
和されるかを決定した。飜和が達せられた埌、塔
の局をPBSで掗浄しおゆるく吞収されたたん癜質
を陀去した。 この時点で、チダヌコヌル局に固定したアンチ
ゲンは、このものず反応する抗䜓ず結合しおい
る。たた、塔を通぀おきた他の倖来たん癜質およ
び抗䜓は、この局に固定したアンチゲンに察しお
非特異性であり、而しお䞊蚘抗䜓から分離しおき
た。 この抗䜓―アンチゲン結合を砎断し䞔぀粟補抗
䜓を溶離すべく、䜿甚盎前に調補したNaIの5M溶
液を塔に導入した。このNaI溶液の䜿甚容量は、
局に結合した抗䜓を党お取り出すのに十分である
べきである。塔流量を少くずも20mlhrに蚭定す
るずき、溶出液が適圓な容量の画分で集められ
る。集た぀た合蚈量は少くずも、よう化ナトリり
ムNAI溶液の添加容量に等しくあるべきであ
る。 粟補抗䜓の各画分は、集められるず二回の過
に付される。すなわち、䞀回目は0.45Όの膜に通
し、二回目は0.22Όの膜に通す。次いで、〜
℃の蒞留氎を甚いお、埗られた液をに垌
釈する。䟋えば200mlの液を40mlの蒞留氎に添
加する。次いで、垌釈したこれら抗䜓画分を、䟋
えば、XM―50の膜を備えたアミコン
AMICON濃瞮機に入れお濃瞮する。 最終粟補工皋ずしお、この濃瞮された粟補抗䜓
を透析する。透析の埌、抗䜓を取り出しお遠心分
離にかける。䞊柄み液を少くずも20時間0.01Mの
硫酞ナトリりム溶液に察しお透析し、これをPBS
に察する初めの透析ず比范する。この埌の透析が
終了した埌、抗䜓のたん癜質濃床を枬定する。 次いで、この抗䜓に぀いお、CEP技術に埓い
基準アンチゲンに察する掻性床を枬定しお抗䜓含
量を決定し、たたもし受け入れられるずわか぀た
ら、これを凍結也燥しお䜿甚時たで保存する。  抗䜓―酵玠結合䜓の補造 子牛の腞内アルカリ性ホスフアタヌれを再構成
せる抗䜓の溶液に、の酵玠抗䜓比で混合
するこずにより、最終濃床がBPSPH7.4溶液
mlに぀き党たん癜質10mg以䞊になるようにす
る。この溶液を透析しおNH4 +むオンを完党に陀
去する。 透析凊理された抗䜓―酵玠混合物を次いで遠心
分離にかけ䞍溶性物質を党お陀く。PBS―Mg〓
溶液の添加により、䞊柄み液のたん癜質含量を10
mgmlに調敎する。この溶液にのグルタルア
ルデヒド溶液を、抗䜓―酵玠溶液10mlに぀きグル
タルアルデヒド溶液mlの基準で添加する。3.5
〜20分間緩埐に撹拌し而しおこの間、抗䜓ず酵玠
がグルタルアルデヒドによ぀お化孊結合した埌、
この結合䜓の溶液を0.001MのMg〓入りPBCに察
しお透析しおグルタルアルデヒドを陀去する。 次いで、透析凊理した物質を遠心分離にかけ、
埗られた䞊柄み液にトリスヒドロキシメチル
アミノメタンPH緩衝剀0.05M、正垞人アル
ブミン結晶質、NaN30.02および
MgCl20.001Mの氎溶液を添加しおこれを垌釈し
た。 アルカリ性ホスフアタヌれに加えお、他の酵玠
も亊本発明の方法に甚いるこずができる。事実、
抗䜓に共有結合しうる酵玠ずしおほずんど無限の
ものが挙げられる。かかる皮々の酵玠のうち以䞋
に列挙したものが特に有利である。  アルコヌル脱氎玠酵玠  グリセロヌル脱氎玠酵玠  グリオキシレヌト還元酵玠  ―乳酞脱氎玠酵玠  りんご酞脱氎玠酵玠  グルコヌス―りん酞脱氎玠酵玠  マンニツト―りん酞脱氎玠酵玠  グルコヌル酞化酵玠  ガラクトヌス酞化酵玠 10 ―アミノ酞酞化酵玠 11 ―アミノ酞酞化酵玠 12 ポリプノヌル酞化酵玠 13 アスコルビン酞酞化酵玠 14 カタラヌれ 15 ペルオキシダヌれ 16 コリン゚ステラヌれ 17 ホスフオリパヌれ 18 α―アミラヌれ 19 リゟチヌム 20 β―ガラクトシダヌれ 21 アミログルシダヌれ 22 β―グルクロニダヌれ 23 カルボキシペプチダヌれ 24 りレアヌれ 25 無機ピロホスフアタヌれ 26 アルドラヌれ 27 炭酞脱氎酵玠 28 ヒスチダヌれ 抗䜓を暙識するのに甚いられる酵玠は、いく぀
かの考慮すべき事柄に留意しお遞定される。かか
る留意すべき事柄には、酵玠の安定性酵玠の枬定
容易性、抗䜓の共有結合の条件に察する酵玠の耐
久性ならびに酵玠の入手性および䟡栌が包含され
る。  抗䜓で被芆された䞍溶性郚材の補造 詊薬補造の次の工皋は、粟補抗䜓の䞀郚分を䞍
溶性郚材に共有結合させるこずである。この結合
を行うために、甚いられる䞍溶性郚材は、反応基
又は生物詊隓に甚いられる特異性抗䜓ず反応しう
る郚䜍を䞎えられおいなければならない。 「グラフト・コポリマヌズGraft
Copolymers」ず題したG.W.トレギアヌ
Tregear等の米囜特蚱第3700609号には、或る
重合䜓䞻鎖に別の重合䜓又は共重合䜓の偎鎖をグ
ラフトさせおなる䞍溶性連続重合䜓物質が開瀺さ
れおいる。このグラフトされた重合䜓を適宜遞定
するこずによ぀お、生物物質を䞍溶性マトリツク
スに化孊結合させるこずができる。䞊蚘特蚱に開
瀺された生成物は、むンペリアル・ケミカル・む
ンダストリヌズ・オブ・オりストレむリア・アン
ド・ニナヌゞヌランドICIANZより商品名プ
ロタポヌルPROTAPOLDIの円板圢で垂
販されおいる。 プロタポヌルDIは、む゜チオシアノポリ
スチレン基を衚面党䜓にグラフトさせたポリテト
ラフルオロ゚チレン䞻鎖よりなり、攟射免疫枬定
法に䜿甚すべく䌁図されおいる。珟圚入手されう
るこの皮の円板は、厚さが玄0.01むンチ、盎埄が
箄0.5むンチである。 第図に瀺す劂き本発明の䞀぀の重芁な具䜓化
に埓えば、各円板は、䞀連の皜線ず別の
䞀連の皜線ずで構成される栌子圢焌き網暡様
の䞡面を付䞎されおいる。皜線および
は奜たしくは互いに垂盎であり而しおそれらは
耇数個の矩圢くがみを画成する。各皜線
およびの偎面は、くがみの隣接察から䞊
方向ぞず次第にテヌパヌ断面厚が枛少しお、
皜線の頂郚を画成する線ずなる。泚意すべきこず
は、図面の皜線およびが、本発明の説明
を簡略化するために非垞に誇匵しお描かれおいる
ずいうこずである。 円板の所望圢状は、該所望圢状を円板に付䞎す
べく䌁図された、突起を衚面にも぀ロヌラヌに該
円板を通すこずによ぀お達成される。明らかなよ
うに、このロヌラヌは、円板を事実䞊砎壊するこ
ずなくその重合䜓物質の倖芳を倉圢するに十分量
の圧力をもたらすように蚭蚈されおいる。これ
は、円板がその衚面に反応性局を有しおいるので
重芁である。かくしお、円板を射ち抜くこずによ
り、抗䜓が結合するこずのできない円郚が暎露さ
れる。ポリテトラフルオロ゚チレン局の暎露は事
実䞊、結合胜力の䜎い円板をもたらすであろう。 考慮すべき䞻な事柄は、平底のバむアルに入れ
たずき実質䞊詊隓詊料ず完党接觊の状態になるよ
うな䞡面をも぀円板をもたらすこずである。すな
わち、マトリツクスずバむアル底ずの間の面同士
の接觊を最小限にすべきである。本発明の別の重
芁な具䜓化では、円板の䞡面は、高䜎点分野をも
぀ように圢づくられおいる。 既述の劂く、凍結也燥圢に補造された抗䜓は、
抗䜓5.0mg毎に0.1MのNaHCO3PH9.6を100ml
添加するこずによ぀お再構成される。䞀般に、そ
の結合方法は、〜℃の該垌溶液に撹拌䞋、栌
子圢ないし焌き網暡様の衚面をも぀円板を〜16
時間接觊させるこずを包含する。次いで、抗䜓垌
溶液を廃棄した埌、円板を、二床連続容量の
0.1M NaHCO3PH9.6りん酞塩緩衝剀入り食塩
氎および、0.5のトりむヌンTWEEN20を
含有するりん酞塩緩衝剀入り食塩氎䞭0.3の冷
い〜℃牛血枅アルブミンで掗浄する。曎
に、結晶質の牛血枅アルブミンで掗浄し䞔぀ドラ
むアむス䞊で凍結させた埌、凍結也燥を行い、而
しおこの円板を䜿甚に䟛すたで〜℃で保存す
る。 本明现曞䞭の蚘茉は、肝炎抗䜓を結合させた円
板の補造に係るけれども、本発明の円板がほずん
ど無限の数のたん癜質を固定するのに有甚である
こずは圓業者に明らかであろう。䟋えば、詊隓詊
料―円板間の接觊増加によ぀お、䞋蚘たん癜宀が
該円板ずの結合を包含する詊隓に甚いるこずがで
きる。すなわち、かかるたん癜質に、ゞコキシ
ン、アヘン剀およびステロむドの劂き薬品に察す
る抗䜓倩然産物䟋えばむンシナリンおよび他の
ホルモンに察する抗䜓ならびに、血液その他の
䜓液䞭に芋出される代謝産物に察する特異性酵玠
が包含される。 䟋 以䞋の手順を甚いお円板8000枚を補造した。各
円板を先ず、既述の劂き所望圢状にするためにプ
レス凊理した。肝炎抗䜓は円板8000枚のバツチに
40mg必芁であ぀た。すなわち、円板1000枚に぀き
mgである。再構成した抗䜓のたん癜質含量を、
0.1MのNaHCO3PH9.6800mlの最終容量におい
お0.05mgmlに調敎した。次いで、この党800ml
の緩衝剀入り抗䜓を、掩れ止めラむナヌを備え䞭
には円板8000枚の入぀た1000mlのねじ蓋びんに装
入した。そしお、このびんを16時間䟋えば䞀倜
〜℃で回転させお各回転サむクルを通し円板が
緩埐にタンブリングするようにした。その埌、液
をびんから流し出し廃棄した。円板はの広口
フラスコに移した。 円板を冷い〜℃0.1MのNAHCO3緩衝
液PH9.6で二床続けお掗浄し、その埌該
緩衝液を陀去した。次いで、円板を再床掗浄し
た。このずきは、冷い緩衝剀0.01Mのりん酞ナ
トリりム、0.15MのNACl、PH7.4ず぀二床
の連続掗浄であ぀た。残留せる緩衝剀を陀去した
埌、円板を䞉床目の掗浄に付した。これには、冷
たい牛血枅アルブミン溶液0.3量ず぀
二床の連続掗浄を甚いた。 最埌に、円板を、mgml濃床の冷い結晶質牛
血枅アルブミンPH溶液量ず぀二床の連
続掗浄に付した。この工皋は、円板䞊のたん癜質
にたん癜質環境を䞎える目的で実斜された。残留
掗液を陀去した埌、円板を、䞀枚の玙で内匵り
した皿ないしはトレヌ×9inに移した。該
トレヌには倫々、200mlの結晶質牛血枅アルブミ
ン溶液が入れおあ぀た。移し終぀た埌、䞀枚の
玙を䜿぀おこれらを芆぀た。緩衝剀を完党に陀去
し、次いで円板をドラむアむス䞊で30分急速に凍
結させた。 しかる埌、トレヌの内容物を凍結也燥させ、也
燥した円板を取り出し、これを目止めした容噚内
で貯蔵した。 (1) 察照血枅の調補 免疫枬定から意味深い資料を埗るために、陰性
ず陜性の察照血枅を甚意しお所定の詊隓詊料ず適
宜比范する必芁がある。かかる察照物の調補を以
䞋に詳述する。 陰性の察照は、䟋えば攟射免疫枬定法により、
肝炎アンチゲンに぀いお詊隓し陰性ずわか぀た人
血しようから補造した。而しお、肝炎アンチゲン
に関し明らかに陰性である各ナニツトに、5Mの
CaCl2を血しよう200mlに぀きCaCl2溶液0.75mlの
基準で添加しお凝塊を誘匕した。次いで、凝塊が
圢成するたでこの血しようを氎济䞭37℃で枩眮し
た。凝塊した血しようナニツトを次いで−20℃で
凍結しお少くずも12時間貯蔵した。次いで、この
血しようナニツトを〜℃で融解させ、血枅を
集めた。もし血枅が過床に濁぀おいたら、これ
を、䟋えば〜℃で30分間9000rpmの遠心分離
により枅柄化するこずが望たしいかもしれない。 シリカ䟋えば゚アロゞルAEROSIL―380
を血枅圓り20加え、時間宀枩で混合しお
リポプロテむンを陀去し血枅を安定化させた。次
いで、この混合物を遠心分離にかけ、沈殿物を廃
棄した。もし所望なら、適圓な過手段によ぀お
過しおシリカを陀去するこずができる。 次いで、䞊柄み液を曎に、䟋えばミリポア
MILLIPORE膜ないしホヌムHORM膜そ
れに倚孔率が連続的に䜎䞋するパツドで過凊理
した。パツドは0.45ミクロンの膜である。この
0.45ミクロンの膜で過する前に、ナトリりムア
ゞドNaN3を0.1重量の濃床で䞊蚘䞊柄み液
に添加した。斯界で呚知の劂く、ナトリりムアゞ
ドは防腐剀ずしお䜜甚する。0.45ミクロンないし
それ以䞋の倚孔率フむルタヌによる最埌の過
は、無菌の装眮および技術を甚いた局流環境で行
うべきである。 次いで、この無菌溶液は、免疫枬定甚詊薬目止
め溶噚に小分けされるたで〜℃で貯蔵されう
る。提瀺した100回の詊隓セツトには、7.5mlの陰
性察照血枅が䟛䞎される。 陜性察照血枅は、肝炎アンチゲン詊隓で陜性ず
出た血液ナニツトからの血しようを再石灰化する
こずにより補造した。各陜性ナニツトから詊
料を採取し、これらを䞀緒にプヌルしお詊隓プヌ
ルずした。先ず、この詊隓プヌルを60℃で10時間
熱凊理しお詊料䞭の肝炎誘発物質を党お䞍掻性に
した。該プヌルが宀枩に冷华したずき、アンチゲ
ン掻性が保留されおいたこずを怜査すべく䞀郚分
を取り出し、CEP技術を䜿぀お基準抗䜓に察し
滎定した。次いで、詊隓プヌルに、血枅圓り
20濃床のシリカを添加した。この血枅を次いで
時間宀枩で撹拌し、その埌これを〜℃で30
分間9000rpmの遠心分離にかけた。沈殿物は廃棄
した。 埗られた䞊柄み液を、CEPを䜿぀お察照基準
抗䜓に察し滎定した。もし力䟡が申分のないレベ
ルのたゝであれば、党血枅ナニツトの総量を䞀緒
にプヌルし䞔぀これを、詊隓プヌルで述べたず同
じプロセスに付すこずができる。 䞀緒にした詊隓プヌルず䞻芁プヌルは、本発明
の免疫枬定で陜性察照血枅に関し最適結果が埗ら
れるように十分量の陰性察照血枅で垌釈した。奜
たしくは、本発明詊隓での陜性察照血枅の読みが
吞光床単䜍×1000で2000より高くあるべきであ
る。この垌釈した陜性察照血枅を次いで、既述の
劂き、連続範囲の䜎䞋倚孔率を甚いる適圓な手段
で過した。0.45ミクロン又はそれ以䞋の膜で最
終的に過する前に、0.1重量のナトリりムア
ゞドを添加した。陰性プヌルのずきのように、こ
の最埌の過は、局流環境䞭無菌条件䞋で行うべ
きである。 匱陜性察照血枅は、匷陜性察照を陰性血枅で垌
釈するこずにより補造するこずができる。匱陜性
血枅の読みは、本発明の詊隓で枬定するずき600
〜1000であるべきである。本発明の奜たしい具䜓
化の100回詊隓セツトには匷陜性察照2.5mlず匱陜
性察照2.5mlが備え付けられる。  その他の詊薬および装眮 0.5むンチよりわずかに倧きなすなわち、盎埄
0.50むンチの円板に぀り合う寞法の盎埄を有する
200ないしそれ以䞊のガラス補平底バむアル䜿
い捚おが備え぀けられる。これらバむアルのう
ち100個は、詊隓の初めの枩眮および掗浄甚に䜿
われ、残る100個は、埌の、酵玠基質ずの枩眮に
甚いられる。埓぀お、この詊隓セツトにより、
100回の枬定を同時に行うこずができる。 以䞋に詳述する劂く、䞍溶性固䜓円板䞀枚をこ
れら100個のバむアル各々に入れる前に、銬グロ
ブリン詊隓詊料垌釈剀を0.05mlず぀各バむアルに
入れる。この工皋は、詊隓詊料ず䞍溶性円板ずの
初めの枩眮で非特異性反応を排陀する予備手段ず
ずれる。円板䞊に被芆される抗䜓は粟補されおお
り、肝炎アンチゲンず高床に反応するけれども、
人血枅又は血しよう䞭には、銬グロブリンそのも
のず反応し埗而しお円板ず酵玠暙識結合䜓ずの間
に橋を圢成しお擬䌌陜性反応をもたらしうる物質
が時折存圚する。先の工皋で添加した銬グロブリ
ンはこの物質ず結合し、そのため円板ずの反応は
自由でない。先に開瀺した劂く、円板䞊に被芆さ
れた抗䜓は、人血液から集めた肝炎関連アンチゲ
ンで銬を免疫化するこずにより産生される。本発
明の100回詊隓セツトには、りん酞塩緩衝剀入り
食塩氎PBSに銬グロブリン330mgを溶解しお
なる溶液5.5mlが備え぀けられる。  基質の補造 詊隓の酵玠反応甚に遞んだ基質は―ニトロフ
゚ニルホスプヌトである。このものは、炭酞ナ
トリりム緩衝剀にmgmlの濃床で溶解させた。
緩衝剀の濃床は0.028モルの炭酞ナトリりムおよ
び0.001モルのマグネシりムPH9.8であ぀た。 この時点で泚意すべきこずは、䞋の衚に瀺す
劂く他の基質を適圓なPH緩衝剀ず共に甚いるこず
ができるずいうこずである。
【衚】 プヌト
【衚】 リルホスプヌト
䞊衚に瀺した基質は党お有機りん酞゚ステルで
ある。奜たしい酵玠アルカリ性ホスフアタヌれに
合぀た基質ずしお他の有機りん酞゚ステルが䜿甚
されうるこずは明らかである。曎に、泚意すべき
こずは、アルカリ性ホスフアタヌれ以倖の酵玠を
抗䜓―酵玠結合䜓に甚いるずきも、適圓な基質を
遞定するこずは圓業者にず぀おほずんど困難でな
いずいうこずである。  方 法 詊隓を本発明に埓぀お行うべく、バむアル100
個を架で区分けし、皮々の詊料に察応するように
これらを識別した。各バむアルに銬グロブリン溶
æ¶²0.05mlを入れ、次いで95個のバむアルに詊隓詊
料0.5mlを添加した。同時に、他のバむアル個
に倫々、陰性察照血枅の詊料0.5mlを添加し、他
の個に匷陜性察照血枅の詊料0.5mlを入れ、そ
しお残る個には匱陜性察照血枅の詊料0.5mlを
入れた。かかる銬グロブリンず各詊料を入れた
100個のバむアルに、次いで、抗䜓で被芆した円
板を䞀枚ず぀装入した。これらのバむアルを、䟋
えば振ずう䞭の氎济で0.5時間43℃で枩眮した。
この枩眮の間、察照又は詊隓詊料䞭に存圚する肝
炎アンチゲンは円板䞊の抗䜓ず結合する。 䞍溶性円板郚材の入぀たバむアルに酵玠暙識さ
れた抗䜓詊薬を添加する前に、初めの枩眮で圢成
した䞊局液を取り陀かねばならず、たた䞍溶性郚
材を掗浄しお未結合アンチゲンを陀去せねばなら
ない。この掗浄溶液は奜たしくは、塩化ナトリり
ムの0.85溶液PH6.5〜7.5である。該溶液を
2.5mlず぀甚いお二回掗浄した埌、各バむアルに
抗䜓―酵玠結合䜓0.3mlを添加し、そしお再床、
バむアルを振ずうしながら43℃で時間枩眮し
た。而しお、その間、酵玠暙識された抗䜓は、初
めの枩眮で抗䜓被芆せる円板に固定された肝炎ア
ンチゲンず反応する。 酵玠暙識された抗䜓詊薬の添加および第の枩
眮の埌、圢成せる䞊局液ないし䞊柄み液をアスピ
レヌタヌで陀去し、各バむアル内の円板を掗浄溶
æ¶²2.5mlの分取量で回掗浄した。この掗浄によ
぀お、未反応の抗䜓―酵玠結合䜓が陀去された。
次いで、各䞍溶性郚材を枅浄なバむアルに移し、
これに2.5mlの―ニトロプニルホスプヌト
pNPP酵玠基質―緩衝剀溶液を添加した
mgpNPPml。―ニトロプニルホスプヌ
ト―アルカリ性ホスフアタヌれ系の最適な䜜業PH
が9.8であるので、酵玠基質は炭酞塩−Mg〓緩衝
液PH9.8±0.1に溶解される。この緩衝液を甚
いるずき、それはNa2CO30.028MおよびMg〓
0.001Mの氎溶液よりなる。詊隓セツトには、40
mlの濃厚物が備え付けられうる。而しお、これを
蒞留氎で垌釈するずきは、400mgのpNPPに盎接
添加されうる。この緩衝剀入り基質を入れた埌、
バむアルは第の枩眮に付される。これは、振ず
うしながら43℃で時間行われる。もし別の抗䜓
―酵玠結合䜓が甚いられるなら、別の基質を䜿甚
せねばならない。 次いで、各バむアルに2MのNaOH溶液滎
0.1mlを添加しお反応を停止させる。この目的
のために、各詊隓セツトには3Mの氎酞化ナトリ
りム15mlが備え぀けられる。 円板䞊に酵玠が存圚する堎合、すなわち、肝臓
炎に関連したアンチゲンに぀いお陜性の詊料を入
れたバむアル内で、䞊に開瀺した酵玠基質溶液は
無色の液䜓から黄色の液䜓ぞず倉化する。 陰性察照から埗られた䞊柄み液を適圓なバむア
ル内にプヌルする。蒞留氎をブランクずした分光
光床蚈により、その405nmでの吞収を読む。この
陰性察照の読みが600吞光床単䜍×1000より
も小さいずき、それは、詊隓詊料の結果ず比范す
るのに適圓な基準ず認められる。次いで、このプ
ヌルした陰性察照詊料をブランクずしお、詊隓詊
料および陜性察照の倀を読み、その結果を吞光床
単䜍×1000ずしお蚘録する。或る分光光床蚈を甚
いるずき、該装眮に陰性察照を挿入し、読みを零
に調敎し䞔぀詊隓詊料の倀を盎接読むこずが可胜
である。䞊蚘プヌルした陰性察照詊料をブランク
ずしお甚いた、未知詊隓詊料の光孊密床吞光
床×1000の倀が100より倧きいずき、該詊料は、
肝臓炎に関連したアンチゲンに぀いお陜性ず認め
られる。この倀は、非反埩性の陜性が存圚するな
ら抂ね実隓宀技術の誀差から生ずるずころの該非
反埩性陜性を制限するために遞定された。 たた、詊隓詊料の読みは、匱陜性察照詊料およ
び匷陜性察照詊料ずも比范するこずができる。か
くしお、詊料䞭の肝炎アンチゲンの有無のみなら
ずその濃床も知るこずができる。 䟋 未知詊料の各矀に関しお五぀の察照すなわち陰
性察照、匷陜性察照、および匱陜性察照が
詊隓されるべきである。これらの察照は、詊隓詊
料ず同じプロセスおよび枩眮時間に付すべきであ
る。 泚意各移動には枅浄なピペツト又は䜿い捚お末
口を甚いお盞互汚染cross―contaminationを
避けるこず。  氎济を43℃に予め蚭定する。  詊隓詊料および察照に察応させるべく組の
バむアルに番号を付し、これらのバむアルをバ
むアル保持噚に入れる。第組のバむアルは、
詊隓詊料および察照を抗䜓被芆せる円板および
抗䜓―酵玠暙識詊薬ず共に枩眮するのに甚い、
第組のバむアルは、工皋12で基質反応に甚い
る。  第組のバむアル底に銬グロブリン詊薬0.05
ml滎をピペツトで入れる。有利なこず
に、銬グロブリンを詊隓詊料垌釈剀䞭に甚いる
こずによ぀お、或る人血枅䞭に存圚する抗䜓ず
銬グロブリンずが反応し、而しお該抗䜓から生
ずるずころ非特異性擬䌌陜性が本質䞊排陀され
る。  この第組のバむアルに、各詊隓詊料0.5ml
をピペツトで入れる。この際該詊料は、察応詊
料衚瀺をも぀バむアルの底郚に添加される。同
時に、陜性および陰性の詊料0.5mlを察応する
各バむアルの底郚にピペツトで入れる。  該第組の各バむアルに抗䜓被芆せる円板䞀
枚を移し入れる。円板の衚面は枅浄に保぀。而
しお、円板の移動は、枅浄なピンセツト又はサ
クシペン・チツプド・カニナヌレを甚いお行う
べきである。円板を手で取り扱うべきでない。  䞊蚘バむアルを、穏和な撹拌を行うべく振ず
う付属装眮を備えた氎济で30分間43℃で枩眮す
る。  各詊料を抗䜓被芆せる円板ず共に枩眮した
埌、各バむアルから䞊柄み液を党お完党にアス
ピレヌトする。バむアル党郚に等匵食塩氎2.5
mlを添加しお円板を掗浄する。この手順を反埩
しお各円板を二回掗浄する。党流䜓の陀去を助
成すべく、バむアル保持噚を傟けながらアスピ
レヌトする。各掗浄液を加えた埌、バむアル保
持噚を振ずうする。アスピレヌタに結合した容
噚内に集められた廃液は、投棄前に高圧蒞気滅
菌121℃で最䜎時間に付すべきである。  最埌の掗浄およびアスピレヌシペンの埌、各
バむアルに酵玠暙識した抗䜓の溶液0.3mlを添
加する。  これらのバむアルを、穏和に撹拌すべく振ず
う付属装眮を備えた氎济内で時間43℃で枩眮
する。 10 ―ニトロプニルホスプヌトpNPP
100mgのバむアル個の内容物を100mlの垌
基質緩衝液にゆすぎ入れるこずにより、pNPP
基質を調補する。なお、垌基質緩衝液は、蒞
留氎90mlに濃重炭酞ナトリりム緩衝剀10mlを添
加するこずによ぀お調補される。静かに回転
させお混合する。而しお、溶液化は盎ちに生起
すべきである。 泚意この基質溶液は、䜿甚するその日に調補す
べきである。而しお、䞍䜿甚時は冷凍しおおくべ
きである。24時間経過した溶液は廃棄すべきであ
る。 11 䞊柄み液を、工皋のようにアスピレヌトし
䞔぀䞉回掗浄する。 12 工皋で甚意した番号付きの、第組の枅浄
なバむアルに円板を移し入れる。 13 円板を入れた各バむアルに、工皋10で調補し
た―ニトロプニルホスプヌト基質溶液を
2.5ml添加する。 14 これらのバむアルを、穏和な撹拌のため振ず
う付属装眮を備えた氎济で時間43℃で枩眮す
る。 15 該バむアル党郚に3Mの氎酞化ナトリりム溶
液滎玄0.1mlを添加しお反応を停止させ
る。バむアルを保持噚内で振ずうしお詊薬をよ
く混合する。吞光床の読み取りは、反応停止埌
時間内で行うべきである。 16 䞉぀の陰性察照をプヌルしお、光床蚈によ
る、蒞留氎をブランクずした405nmでの吞光床
を読む。該結果を吞光床単䜍×1000ずしお蚘録
する。もし陰性察照が600より高い倀を瀺すな
ら、詊隓は䞍十分だ぀たこずになり、而しお詊
隓を繰返えさなければならない。貫流匏光床蚈
を甚い䞔぀匷陜性詊料に遭遇するずきは、次の
詊料の吞光床を読む前にキナベツトないし平皿
を蒞留氎でゆすぐべきである。䜿い捚おでない
キナベツトを甚いるずきは、陜性の読みに続い
お該キナベツトを蒞留氎でゆすがねばならな
い。 17 プヌルした陰性察照の堎合、装眮を零の吞光
床に調敎する。各反応混合物の吞光床を枬定
し、その結果を吞光床単䜍×1000ずしお蚘録す
る。しかしながら、或る光床蚈を甚いるずき、
その装眮を零に調敎するこずができない。この
堎合、陰性察照の読みを各詊料の読みから差し
匕かねばならない。 結果の評䟡 未知の詊隓詊料の吞光床単䜍×1000の倀が、プ
ヌルした陰性察照をブランクずしお、100より高
いずき、該詊隓詊料は反応性であるず認められ
る。反応性ず認められる詊料に぀いおは詊隓を反
埩するこずが望たしいかもしれない。反応性血枅
を、肝臓炎に関連したアンチゲンに぀いお陜性ず
分類する前に、コヌデむス・コンフアヌマトリ・
テスト・セツトCordis Confirmatory Test
Setで詊隓しお確認を埗る必芁がある。この詊
隓は反応性詊料党おに぀いお行わなければならな
い。銬グロブリンずの䞭和によ぀お確認された反
応性血枅は、肝臓炎アンチゲンに぀いお陜性で
あるず認めなければならない。䞊述の劂く、確認
詊隓は、結果を評䟡するために必芁であるが、た
たそれは、食品医薬管理局や倚くの州の法埋で芁
求されおもいる。抂括するに、本発明に埓぀た確
認詊隓は次のようにしお遂行される。 すなわち、陜性詊隓詊料は二床詊隓する。各バ
むアル内の円板に該詊料をさらす第段階の埌、
掗浄に匕続いお、䞀方の円板を肝炎アンチゲンに
察し特異性の抗䜓に暎露し、たた他の円板を正垞
銬血枅に暎露する。30分間枩眮する。その埌の手
順は、日垞遞別詊隓で行぀おいるのず同じであ
る。もし詊料が肝臓炎に぀いお陜性であるなら、
銬抗䜓に暎露された詊料はきわめお䜎い倀を瀺す
のに正垞銬血枅に暎露された円板は、日垞遞別
詊隓で芋出されるのず均等の高い倀を瀺す。 䜎濃床の肝炎アンチゲンを有する詊料は最終読
み取り倀が䜎くなりがちである。高濃床の肝炎ア
ンチゲンを有する詊料は最倧倀を瀺す。濃床差が
狭い範囲であれば、該結果読み取られる光孊密床
は、詊料䞭に存圚する肝炎アンチゲンの濃床に関
する定量情報を䞎える傟向がある。 方法の限界  非反埩性反応性もし或る反応性詊料に関す
る反埩詊隓が100切り取り倀より小さな倀を瀺
すなら、この詊隓は非反埩性反応性であるず掚
定され䞔぀肝臓炎に関連したアンチゲンに぀い
お陰性ず認められる。最初の結果は、䞍十分な
掗浄の劂き技術䞊の誀差のせいかもしれない。  非特異性陜性或る人血枅䞭に存圚する、銬
グロブリンに察し反応性の抗䜓から生ずる非特
異性陜性は、詊隓詊料垌釈剀䞭の銬グロブリン
を甚いるこずによ぀お本質䞊排陀される。  EDTA䞭に集められた血液からの血しようは
䜿甚すべきでない。 泚目すべきこずは、各皮工皋での枩眮時間およ
び枩眮枩床が広い範囲にわたりうるずいうこずで
ある。かくしお、本発明は、枩眮の時間および枩
床に関しいかなる態様にも限定される぀もりはな
い。䟋えば、䞍溶性郚材を詊料ず共に枩眮する時
間は10分〜24時間の範囲であり埗、たたその枩床
は℃〜50℃の範囲でありうる。他方、䞍溶性郚
材を酵玠暙識された結合盞手ず共に枩眮する時間
は30分〜24時間であり、その枩床は℃〜50℃で
ある。 たた、泚目すべきこずは、本発明の方法が肝臓
炎に関連したアンチゲンの存圚するどんな䜓液に
も甚いられお該アンチゲンの存圚を怜出するこず
ができるずいうこずである。かくしお、本方法
は、血枅、血しよう、血しようの成分、血枅の成
分、尿、唟液および脳背髄液䞭の肝炎アンチゲン
の有無を決定するのに甚いるこずができる。 結 果 本発明に埓぀お実斜した詊隓結果を次衚に瀺
す。衚に瀺した結果は、CEP方法により肝炎
に぀いお陜性ず出た詊料に関する本発明に埓぀た
詊隓結果である。衚に瀺した結果は、攟射免疫
詊隓では肝炎に぀いお陜性であ぀たがCEP方法
では陰性ず出た詊隓詊料に関する倀である。衚
に瀺した倀は、攟射免疫詊隓、CEP䞡方法で肝
炎に぀いお陰性ず出た詊隓詊料の結果である。衚
およびに瀺した皮々の詊料に関する数倀
は、本発明の方法で詊隓しお埗られた倀である。
【衚】 本発明は、その粟神ないし䞍可欠な特城を逞脱
するこずなく他の特定態様で具䜓化するこずがで
きる。それ故、歀凊に蚘茉した具䜓化は、䞊の説
明よりはむしろ「特蚱請求の範囲」によ぀お瀺さ
れる本発明の範囲を、党おの点で、䟋瀺するもの
であり限定するものではないず認められるべきで
ある。
【図面の簡単な説明】
第図は、本発明の方法の工皋を芁玄した流れ
図である。第図は、本発明の方法および詊隓セ
ツトに甚いられる遞定された䞍溶性郚材の透芖図
である。第図第図および第図は、本発明
の免疫枬定法の䞉぀の枩眮段階を図瀺する。第
図は、本発明に埓぀お詊隓される詊隓詊料の陜性
免疫枬定の際に珟出する「サンドむツチ」構造の
抂略的衚瀺である。 図䞭䞻芁郚分を瀺す蚘号の説明は以䞋の通りで
ある。䞍溶性マトリツクス、栌子圢
暡様の衚面、バむアル。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  肝炎アンチゲンを含む液䜓詊料から該アンチ
    ゲンを怜出するに圓り、 (a) 前蚘アンチゲンず関連せる第䞀量の抗䜓にし
    お、氎䞍溶性氎非懞濁性固䜓キダリアヌに結合
    した抗䜓を甚意し、 (b) 前蚘液䜓詊料を前蚘工皋(a)の固䜓キダリアヌ
    ず接觊枩眮しお反応混合物を圢成し、 (c) 前蚘アンチゲンず関連せる第二量の抗䜓にし
    お、酵玠ず共有結合した抗䜓の溶液を甚意し、 (d) 前蚘工皋(b)より取埗せる反応混合物を前蚘工
    繋(c)の酵玠結合抗䜓ず接觊枩眮し、酵玠結合抗
    䜓の溶液から固䜓キダリアヌを分離し、 (e) 固䜓盞に結合せる物質の酵玠掻性を、怜出す
    べき肝炎アンチゲンの存圚に盞関させる諞工皋
    よりなる方法。
JP11607076A 1975-09-29 1976-09-29 Determination of presence of antigen related to hepatisis Granted JPS5257316A (en)

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CA1106281A (en) 1981-08-04
FR2325934B1 (ja) 1982-08-20
NL7610801A (nl) 1977-03-31
SE7610683L (sv) 1977-06-10
FR2325934A1 (fr) 1977-04-22
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