JPS62248489A - 組換えｄｎａ及びそれを用いるポリペプチドの製造法 - Google Patents
組換えｄｎａ及びそれを用いるポリペプチドの製造法Info
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- JPS62248489A JPS62248489A JP61092480A JP9248086A JPS62248489A JP S62248489 A JPS62248489 A JP S62248489A JP 61092480 A JP61092480 A JP 61092480A JP 9248086 A JP9248086 A JP 9248086A JP S62248489 A JPS62248489 A JP S62248489A
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- Japan
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- dna
- polypeptide
- arg
- gene
- terminal
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は組換えＤＮＡ及びそれを用いるポリペプチド
の製造法に関する。本発明を利用することによりＮ−末
端が均一なアミノ酸を有するポリペプチドを製造するこ
とができ、得られたポリペプチドを医薬等に応用するの
に適している。
の製造法に関する。本発明を利用することによりＮ−末
端が均一なアミノ酸を有するポリペプチドを製造するこ
とができ、得られたポリペプチドを医薬等に応用するの
に適している。
従来の技術
組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌等により動物遺伝子等
を発現せしめて４１ノーグチドを製造する場合、生産さ
れたポリペプチドのＮ−末端は、メチオニンあるいはホ
ルミルメチオニンであったシもしくはこれらがないこと
もあシ、一様ではない。
を発現せしめて４１ノーグチドを製造する場合、生産さ
れたポリペプチドのＮ−末端は、メチオニンあるいはホ
ルミルメチオニンであったシもしくはこれらがないこと
もあシ、一様ではない。
従ってこれらポリペプチドを、医薬等に利用する場合の
障害となることもあった。との問題を解決するための例
としてヒトβグロビンを得る方法がある（欧州特許出願
０１６１９３７）。この方法では５′末端よシ３１コの
アミノ酸をコードした遺伝子の３′末端に、 Ｅｌｓ駕
−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ −Ａｒｇをコードする遺伝子を接
続し、さらにこの３′末端とヒトβグロビン遺伝子の５
′末端を接続し九遺伝子を大腸菌のグラスミド中に組み
、これを培養することによシ、上記の遺伝子に対応した
融合β−グロビン蛋白を一取得し、これに血液凝固因子
Ｘ、を作用させて加水分解し、Ｎ末端が一様なβグロビ
ン蛋白を得る方法が記載されている。
障害となることもあった。との問題を解決するための例
としてヒトβグロビンを得る方法がある（欧州特許出願
０１６１９３７）。この方法では５′末端よシ３１コの
アミノ酸をコードした遺伝子の３′末端に、 Ｅｌｓ駕
−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ −Ａｒｇをコードする遺伝子を接
続し、さらにこの３′末端とヒトβグロビン遺伝子の５
′末端を接続し九遺伝子を大腸菌のグラスミド中に組み
、これを培養することによシ、上記の遺伝子に対応した
融合β−グロビン蛋白を一取得し、これに血液凝固因子
Ｘ、を作用させて加水分解し、Ｎ末端が一様なβグロビ
ン蛋白を得る方法が記載されている。
発明が解決しようとする問題点
このような状況下において、この発明は、組換えＤＮＡ
法を用いるポリペプチドの製造法において、Ｎ−末端が
一様なポＩＪ、！’７’チドを得るための新しい組換え
ＤＮＡ及びポリペプチドの製造法を提供しようとするも
のである。
法を用いるポリペプチドの製造法において、Ｎ−末端が
一様なポＩＪ、！’７’チドを得るための新しい組換え
ＤＮＡ及びポリペプチドの製造法を提供しようとするも
のである。
本発明者らは叙上の問題点を解決するため研究を行い、
次の発明を取得するに至った。
次の発明を取得するに至った。
（１） Ｐｈｓ −ＡｒｇをコードするＤＮＡの３′
−末端がポリペプチドをコードする遺伝子の５′−末端
に結合されているＤＮＡを少くとも有する組換えＤＮＡ
０（２）Ｐｈｅ −ＡｒｇをコードするＤＮＡの３′
−末端がポリペプチドをコードする遺伝子の５′−末端
に結合されているＤＮＡを少くとも有する組換えＤＮＡ
を′生物を培養し、得られた融合ポリペプチドをカリク
レインを用いて加水分解することを特徴とするポリ４プ
チドの製造法。
−末端がポリペプチドをコードする遺伝子の５′−末端
に結合されているＤＮＡを少くとも有する組換えＤＮＡ
０（２）Ｐｈｅ −ＡｒｇをコードするＤＮＡの３′
−末端がポリペプチドをコードする遺伝子の５′−末端
に結合されているＤＮＡを少くとも有する組換えＤＮＡ
を′生物を培養し、得られた融合ポリペプチドをカリク
レインを用いて加水分解することを特徴とするポリ４プ
チドの製造法。
Ｐｈｅ −ＡｒｇをコードするＤＮＡは具体的には、Ｐ
ｈａ カＴＴＴ 、 ＴＴＣ、Ａｒｇ ７５Ｅ ＣＧＴ
、 ＣＧＣ、ＣＧＡ 。
ｈａ カＴＴＴ 、 ＴＴＣ、Ａｒｇ ７５Ｅ ＣＧＴ
、 ＣＧＣ、ＣＧＡ 。
ＣＧＧ 、 ＡＧＡ 、 ＡＧＧであることから、これ
を組合せ九１２通りのすべてが含まれる。
を組合せ九１２通りのすべてが含まれる。
ポリ−２ｆチドをコードする遺伝子としては、分子内に
Ｐｈｅ −Ａｒｇの配列を含まないもの、例えばインタ
ーフェロンｒ、インターフェロンα、インスリン、レニ
ンなどの遺伝子がそのまま使用出来る。また分子内にＰ
ｈｅ −Ａｒｇの配列が存在している場合でも、この配
列に相当する遺伝子配列をアミノ酸の配列が異なるよう
に変換して用いることも可能である。
Ｐｈｅ −Ａｒｇの配列を含まないもの、例えばインタ
ーフェロンｒ、インターフェロンα、インスリン、レニ
ンなどの遺伝子がそのまま使用出来る。また分子内にＰ
ｈｅ −Ａｒｇの配列が存在している場合でも、この配
列に相当する遺伝子配列をアミノ酸の配列が異なるよう
に変換して用いることも可能である。
Ｐｈｅ −ＡｒｇをコードするＤＮＡの３′−末端をポ
リペプチドをコードする遺伝子の５′−末端に結合せし
めるには、通常知られている方法、例えば、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを使用する。
リペプチドをコードする遺伝子の５′−末端に結合せし
めるには、通常知られている方法、例えば、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを使用する。
かくして得られた組換えＤＮＡが導入される微生物は、
通常遺伝子組み換えの行なわれる微生物、例えば大腸菌
、枯草菌、サツカロミセス属等がある。
通常遺伝子組み換えの行なわれる微生物、例えば大腸菌
、枯草菌、サツカロミセス属等がある。
組換えＤＮＡが導入されている微生物を培養する方法は
、通常知られている方法、例えば液体培地に菌を接種し
、通気、攪拌状態で培養を行なう。
、通常知られている方法、例えば液体培地に菌を接種し
、通気、攪拌状態で培養を行なう。
Ｐｈｅ −ＡｒｇをコードするＤＮＡの５瓜末端側には
蛋白合成開始コドンであるメチオニンコドンをコードし
ておく必要があるが、メチオニンコドンとｐｈ・−Ａｒ
ｇのコドンの中間に酸性もしくは塩基性アミノ酸あるい
は疎水性アミノ酸もしくは親水性アミノ酸を多く含むペ
プチドをコードするＤＮＡをさらに挿入することによシ
カリフレインによる切断反応後の未反応ペプチドと生成
ペプチドの三種のペプチド分離が容易になる更には単に
５ないし５０個程度の単一アミノ酸よシなるもしくは、
異なるアミノ酸よシなるペプチドをコードするＤＮＡを
挿入することによシ三種のペプチドの分離が容易になる
。
蛋白合成開始コドンであるメチオニンコドンをコードし
ておく必要があるが、メチオニンコドンとｐｈ・−Ａｒ
ｇのコドンの中間に酸性もしくは塩基性アミノ酸あるい
は疎水性アミノ酸もしくは親水性アミノ酸を多く含むペ
プチドをコードするＤＮＡをさらに挿入することによシ
カリフレインによる切断反応後の未反応ペプチドと生成
ペプチドの三種のペプチド分離が容易になる更には単に
５ないし５０個程度の単一アミノ酸よシなるもしくは、
異なるアミノ酸よシなるペプチドをコードするＤＮＡを
挿入することによシ三種のペプチドの分離が容易になる
。
得られた融合ポリペプチドは、分子中にｐｈ・−Ａｒｇ
である配列を有しているので、カリクレインを用いて加
水分解するとＡｒｇとポリペプチドのＮ一端の間で切断
されＮ一端が一様なポリペプチドが得られる。
である配列を有しているので、カリクレインを用いて加
水分解するとＡｒｇとポリペプチドのＮ一端の間で切断
されＮ一端が一様なポリペプチドが得られる。
カリクレインを用いて加水分解するには、カリクレイン
と基質である融合ポリペプチドとのモル比はおよそ酵素
二基質＝１：１００ないし５００で反応温度２０ないし
５０℃、ｐＨ６ないし１０、望ましくは、３５ないし４
０℃、ｐ）１７．５ないし８．５にて反応を行なう。
と基質である融合ポリペプチドとのモル比はおよそ酵素
二基質＝１：１００ないし５００で反応温度２０ないし
５０℃、ｐＨ６ないし１０、望ましくは、３５ないし４
０℃、ｐ）１７．５ないし８．５にて反応を行なう。
実施例１
（１１１Ｌ−２蛋白のＮ末端側にＰｈｅ −Ａｒｇ構造
を付加したｒＬ−２（Ｋ−Ｈ，−２）を生産する菌の造
成■ ｐＢＲ３２２をベクターとしてトリググロモータ
ーを搭載したｆＬ−２表現プラスミド（ｐＴ９−１１
）（第１図参照）を用いて行なった。なおｐＴ９−１１
は、以下のように造成した。
を付加したｒＬ−２（Ｋ−Ｈ，−２）を生産する菌の造
成■ ｐＢＲ３２２をベクターとしてトリググロモータ
ーを搭載したｆＬ−２表現プラスミド（ｐＴ９−１１
）（第１図参照）を用いて行なった。なおｐＴ９−１１
は、以下のように造成した。
まず、ＰＩＥ、−２−５ＯＡ （欧州特許出願公開９１
５３９号）をＰ＋！ｔｌ 、 Ｄｒａ）で切断し、この
断片と、ＢａｍＨｌリンカ−と、ｐＢＲ３２２のＰａｔ
１−ＥｅｏＲｌの大きい断片（ＥｃｏＲ１部位はフレ
ノウ処理）とをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、プラスミ
ドを造成した。このグラスミドをＨｇｊＡｌで切断し、
ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ）処理後、ＢａｍＨＩ
で切断した。この断片とｐＤＲ７２０をＪａｌとＢａｍ
ＨＩで切１析して得られた大きいＨｐａ ｌ −Ｂａｍ
Ｈ１断片と合成オリゴマーａを連結し、ｐＭ［−９を得
た。
５３９号）をＰ＋！ｔｌ 、 Ｄｒａ）で切断し、この
断片と、ＢａｍＨｌリンカ−と、ｐＢＲ３２２のＰａｔ
１−ＥｅｏＲｌの大きい断片（ＥｃｏＲ１部位はフレ
ノウ処理）とをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、プラスミ
ドを造成した。このグラスミドをＨｇｊＡｌで切断し、
ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ）処理後、ＢａｍＨＩ
で切断した。この断片とｐＤＲ７２０をＪａｌとＢａｍ
ＨＩで切１析して得られた大きいＨｐａ ｌ −Ｂａｍ
Ｈ１断片と合成オリゴマーａを連結し、ｐＭ［−９を得
た。
一方、ｐＢＲ３２２ｆ：Ｐｖｕ ｎとＳａｌ ｌ切断し
、大きいＰｖｕ １１− Ｓａｔ ｌ断片を合成オリゴ
マー〇と連結し、ｐＴｒｐ Ａを得た。
、大きいＰｖｕ １１− Ｓａｔ ｌ断片を合成オリゴ
マー〇と連結し、ｐＴｒｐ Ａを得た。
このようにして得られたｐＭＩ−９とｐＴｒｐＡを共に
、ＥａｏＲｌとＢａｍＨＩで切断し、ｐＭＩ−９のＴＬ
−２遺伝子を含む断片とｐＴｒｐＡのｔｒｐＡターミネ
ータ−を含む断片を連結し、ｐＴ９−１１を得喪。
、ＥａｏＲｌとＢａｍＨＩで切断し、ｐＭＩ−９のＴＬ
−２遺伝子を含む断片とｐＴｒｐＡのｔｒｐＡターミネ
ータ−を含む断片を連結し、ｐＴ９−１１を得喪。
このプラスミド（ｐＴ９−１１ ’）の一部の構造を第
２図（３）のＤＮＡを挿入することによυ変換したｆＬ
−２遺伝子を有するグラスミドｐＴ１３ＳＮｅｏ （第
２図）を構築した。
２図（３）のＤＮＡを挿入することによυ変換したｆＬ
−２遺伝子を有するグラスミドｐＴ１３ＳＮｅｏ （第
２図）を構築した。
ｐＴ１３ｓＮｅｏのｐＴ−９−１１との構造上の違いは
第２図−１の（３）の部分であり、この部分の核酸配列
は第２図−２に示した通りである。
第２図−１の（３）の部分であり、この部分の核酸配列
は第２図−２に示した通りである。
ＰＴ１３ＳＮｅｏプラスミドをＥ、ｃｏｌｌ ＨＢＩＯ
Ｉに組み込んだ菌（Ｅ、ｃｏｌｌ ｐＴ１３ｓＮｃｏ／
ＨＢＩＯＩ ）を常法により取得し、これを培養してプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このグラスミドに制限酵素
Ｎｅｏ ｌを作用させ、次いでＸｈｏｌを作用させて、
Ｎｅｏ ｌ 、 Ｘｈｏ Ｉで切断されたｇｅｏＲ１サ
イトを含むＤＮＡフラグメント（ＮＣ’ Ｉ ＃ Ｘｈ
ｏ ｌ切断ＤＮＡフラグメント）を調製した。
Ｉに組み込んだ菌（Ｅ、ｃｏｌｌ ｐＴ１３ｓＮｃｏ／
ＨＢＩＯＩ ）を常法により取得し、これを培養してプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このグラスミドに制限酵素
Ｎｅｏ ｌを作用させ、次いでＸｈｏｌを作用させて、
Ｎｅｏ ｌ 、 Ｘｈｏ Ｉで切断されたｇｅｏＲ１サ
イトを含むＤＮＡフラグメント（ＮＣ’ Ｉ ＃ Ｘｈ
ｏ ｌ切断ＤＮＡフラグメント）を調製した。
■ 他方、挿入ＤＮＡとして＠３図に示した２種のオリ
ゴヌクレオチドＪ１をＤＮＡ合成機を用いて合成した。
ゴヌクレオチドＪ１をＤＮＡ合成機を用いて合成した。
■ Ｎｅｏ Ｉ 、 Ｘｈｏ ｌ切断ＤＮＡフラグメン
トと、２種の合成オリゴヌクレオチドを混合し、Ｔ４Ｏ
ＮＡ ＩＪガーゼを作用させてライゲージ、ンヲ行ない
Ｉし２蛋白の直前にＭａｔ −Ａｒｇ −Ｐｒｏ −Ｐ
ｈｅ −Ａｒｇをコードする構造をもつグラスミド（ｐ
Ｔ１３ｓｘｔｔ、−２） ｔ−得た。
トと、２種の合成オリゴヌクレオチドを混合し、Ｔ４Ｏ
ＮＡ ＩＪガーゼを作用させてライゲージ、ンヲ行ない
Ｉし２蛋白の直前にＭａｔ −Ａｒｇ −Ｐｒｏ −Ｐ
ｈｅ −Ａｒｇをコードする構造をもつグラスミド（ｐ
Ｔ１３ｓｘｔｔ、−２） ｔ−得た。
■ 得られたｐＴ１３ｓＫＴＬ−２とＥ、ｃｏｌｌ Ｈ
ＢＩＯＩ ９体をＴＣＭ （１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ
ｐＨ７，５、１０ｍＭＣａＣ１２，１０ｍＭ ＭｇＣ２
２） ２００μＡ！中で０℃にて２０分保ち、その後４
２’Ｃ，２分静置し、さらにこれにｌ ｔｎｌのし一グ
ロス（トリグトン１％、酵母工會ス０．５ ％ 、 Ｎ
ａＣＬ ０．５ ％ 、グルコース０．２％）を添加し
て３７’（にて１時間撮盪した。遠心沈澱法によシ菌体
区分を集め、これを水で適宜希釈してアンピシリン（５
０γ／／！／）を含むＬ−７０ス平板に塗抹した。この
平板を３７°Ｃで２０時間培養して出現したコロニー１
０コを釣菌した。
ＢＩＯＩ ９体をＴＣＭ （１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ
ｐＨ７，５、１０ｍＭＣａＣ１２，１０ｍＭ ＭｇＣ２
２） ２００μＡ！中で０℃にて２０分保ち、その後４
２’Ｃ，２分静置し、さらにこれにｌ ｔｎｌのし一グ
ロス（トリグトン１％、酵母工會ス０．５ ％ 、 Ｎ
ａＣＬ ０．５ ％ 、グルコース０．２％）を添加し
て３７’（にて１時間撮盪した。遠心沈澱法によシ菌体
区分を集め、これを水で適宜希釈してアンピシリン（５
０γ／／！／）を含むＬ−７０ス平板に塗抹した。この
平板を３７°Ｃで２０時間培養して出現したコロニー１
０コを釣菌した。
■ 釣菌したコロニーをそれぞれ１イヨン平板で培養し
菌体を集め常法によシブラスミドＤＮＡを調製した。こ
のグラスミドに制限酵素Ａｃｔｌを作用させ本酵素によ
るグラスミドの開裂が確認された菌株の中から１株（Ｅ
、 ｅｏｌ Ｉ 、 ｐＴ−１３ＳＫ ＩＬ−２／ＨＢ
ＩＯＩ）を選択した。
菌体を集め常法によシブラスミドＤＮＡを調製した。こ
のグラスミドに制限酵素Ａｃｔｌを作用させ本酵素によ
るグラスミドの開裂が確認された菌株の中から１株（Ｅ
、 ｅｏｌ Ｉ 、 ｐＴ−１３ＳＫ ＩＬ−２／ＨＢ
ＩＯＩ）を選択した。
（２）培養及び生産物の取得
選択したｐ’ｒ １３ＳＫ ＩＬ−２／ＨＢ １０１
を、トリゾトン１％、酵母エキス０．５ ％ 、 Ｎａ
Ｃｊ Ｏ，５ｆｂ及びグｙコース０．２係の組成の培地
ＩＱＱａ／を含む坂ロフラスコを用いて３１℃、１６時
間振とり培養した。
を、トリゾトン１％、酵母エキス０．５ ％ 、 Ｎａ
Ｃｊ Ｏ，５ｆｂ及びグｙコース０．２係の組成の培地
ＩＱＱａ／を含む坂ロフラスコを用いて３１℃、１６時
間振とり培養した。
培養液８３−を１．５１のＭ９−カザミノ酸培地（カブ
ミノ酸１．０係、酵母エキス０．２俤、ＮＨ４Ｃ２０，
５係、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，０５％、Ｃ＆Ｃ１２−
２Ｈ２００，００５％、、Ｌ−Ｌ＠％ ０．０４％、Ｌ
−ＰｒｏＯ，０４ズ、ＶＢｌ−ＨＣｔＯ，ＯＯ０４慢、
グルコース２慢、ＫＨ２ＰＯ４０，１幅。
ミノ酸１．０係、酵母エキス０．２俤、ＮＨ４Ｃ２０，
５係、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，０５％、Ｃ＆Ｃ１２−
２Ｈ２００，００５％、、Ｌ−Ｌ＠％ ０．０４％、Ｌ
−ＰｒｏＯ，０４ズ、ＶＢｌ−ＨＣｔＯ，ＯＯ０４慢、
グルコース２慢、ＫＨ２ＰＯ４０，１幅。
ＴＭＡ−８１２（消泡剤）０．０２鳴り、アンピシリン
１００ Ａｌｌ／’ｒＬ１．ストレプトマイシン２５ｐ
ｌ／ｒｕｇ含む）を張り込んだ３１容ミニジヤーフアナ
ンターに接種し、７０ Ｑ ｒｐｒｎ 、にマメｍの通
気攪拌条件で。
１００ Ａｌｌ／’ｒＬ１．ストレプトマイシン２５ｐ
ｌ／ｒｕｇ含む）を張り込んだ３１容ミニジヤーフアナ
ンターに接種し、７０ Ｑ ｒｐｒｎ 、にマメｍの通
気攪拌条件で。
３１℃、 ｐ）１６．２に制御で培養を行なった。菌体
濁度（ＯＤ６６ｏｎｍ）が４．５に生育した時点で２５
ｔｉｌｌ／ｍｌＯ３−イア トールアクリル酸と、フィ
ード培地（カザミノ酸１％、Ｌ−Ｌｅ７１０．０４％
、Ｌ −Ｐｒ。
濁度（ＯＤ６６ｏｎｍ）が４．５に生育した時点で２５
ｔｉｌｌ／ｍｌＯ３−イア トールアクリル酸と、フィ
ード培地（カザミノ酸１％、Ｌ−Ｌｅ７１０．０４％
、Ｌ −Ｐｒ。
０．０４％ 、 ＶＢ −ＨＣＡ ０．０００４’ｊ
、ＴＭＡ−８１２０，００１２５ｍｌ？／ｄｔを添加し
、さらに培養を１０〜２０時間継続した。
、ＴＭＡ−８１２０，００１２５ｍｌ？／ｄｔを添加し
、さらに培養を１０〜２０時間継続した。
菌体内に生成した顆粒を以下の手順で抽出した口菌体濃
度を遠心分離で２倍に濃縮し、そこにリゾチーＡ Ｏ，
０４１１／ｌ 、 ＥＤＴＡ ０１５Ｍを添加した後、
５〜１５℃、３〜６時間攪拌し、次いで、超音波破砕で
菌体を破壊し、８０００ｒｐｒｎ ＊ ５ ｍｉｎの遠
心分離で顆粒を回収した。
度を遠心分離で２倍に濃縮し、そこにリゾチーＡ Ｏ，
０４１１／ｌ 、 ＥＤＴＡ ０１５Ｍを添加した後、
５〜１５℃、３〜６時間攪拌し、次いで、超音波破砕で
菌体を破壊し、８０００ｒｐｒｎ ＊ ５ ｍｉｎの遠
心分離で顆粒を回収した。
この液を、Ｋ−ｒＬ−２４度が１００ ｐＨ／ｄ 、
及ヒ溶液濃度が２Ｍグアニジンとなるように濃度調整を
行ない、これに、酸化型グルタチオン１ｍＭと還元型グ
ルタチオン１０ｍＭを添加し、ＰＨｓ、 ｏ 、室温で
１０〜１６時間でインキ、ベートした。次に、この溶液
をホロファイバーで濃縮し、５ｅｐｈａｄａｘＧ−２５
によるｌ”ｋ（ｐ過でグアニジンを除去する。
及ヒ溶液濃度が２Ｍグアニジンとなるように濃度調整を
行ない、これに、酸化型グルタチオン１ｍＭと還元型グ
ルタチオン１０ｍＭを添加し、ＰＨｓ、 ｏ 、室温で
１０〜１６時間でインキ、ベートした。次に、この溶液
をホロファイバーで濃縮し、５ｅｐｈａｄａｘＧ−２５
によるｌ”ｋ（ｐ過でグアニジンを除去する。
さらに、ＣＭ −Ｓ＠ｐｈａｒｏａｅによるイオン交換
クロマトグラフィーを行ない、次いで、５ｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５によるｒル濾過によシ、Ｋ−ＩＬ−２相当
区分を得た。
クロマトグラフィーを行ない、次いで、５ｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５によるｒル濾過によシ、Ｋ−ＩＬ−２相当
区分を得た。
本物質をプロテインシークエンチーにて、Ｎ末端側のア
ミノ酸配列を検定した結果、Ｍ＠ ｔ −Ａｒｇ −Ｐ
ｒｏ −Ｐｈａ −Ａｒｇ −ｒＬ−２（ＫＪＬ−２）
であることを確認した。
ミノ酸配列を検定した結果、Ｍ＠ ｔ −Ａｒｇ −Ｐ
ｒｏ −Ｐｈａ −Ａｒｇ −ｒＬ−２（ＫＪＬ−２）
であることを確認した。
（３） カリクレインによる切断
１１３ ｍＭＮａｃｔを含む、 ５０ｍＭ Ｔｒｉｍ−
ＨＣ１緩衝液、ｐＨ７，８中で、得られ九に一１Ｌ−２
８２５〜とヒトプラズマカリクレインを３７℃、１６時
間反応後、逆相ＨＰＬＣでルー２相当区分を分取した。
ＨＣ１緩衝液、ｐＨ７，８中で、得られ九に一１Ｌ−２
８２５〜とヒトプラズマカリクレインを３７℃、１６時
間反応後、逆相ＨＰＬＣでルー２相当区分を分取した。
これを、プロテインシークエンチーにて、Ｎ末端付近の
アミノ酸配列を分析した結果、Ｋ−ｒＬ−２が定量的に
ルー２蛋白に変換されたことが確認された。
アミノ酸配列を分析した結果、Ｋ−ｒＬ−２が定量的に
ルー２蛋白に変換されたことが確認された。
また、未変換のに−Ｉ Ｌ−２が微封に残存していても
、ＦＰＬＣイオン変換クロマトグラフィーによシ、完全
に、Ｋ−ＴＬ−２とｆ Ｌ−２を分離することが出来る
。
、ＦＰＬＣイオン変換クロマトグラフィーによシ、完全
に、Ｋ−ＴＬ−２とｆ Ｌ−２を分離することが出来る
。
実施例２
（１） ＴＬ−１β蛋白のＮ末端側にＰｈｓ−Ａｒｇ
構造を付加したｆＬ−１β（ｆＬ−１β−Ｋ）を生産す
る蕗の造成■ ｐＢＲ３２２をベクターとしてＴｒｐプ
ロモーターを搭載したＩＬ−１β表現プラスミド（ｐＴ
９−１１ ）を用い、このグラスミドのＩＬ−２遺伝子
部分を、ＩＬ−１β遺伝子に変換したプラスミドｐ’ｒ
ＴＬ−１β（第４図）を構築した。
構造を付加したｆＬ−１β（ｆＬ−１β−Ｋ）を生産す
る蕗の造成■ ｐＢＲ３２２をベクターとしてＴｒｐプ
ロモーターを搭載したＩＬ−１β表現プラスミド（ｐＴ
９−１１ ）を用い、このグラスミドのＩＬ−２遺伝子
部分を、ＩＬ−１β遺伝子に変換したプラスミドｐ’ｒ
ＴＬ−１β（第４図）を構築した。
ｐ’ｒ ｔｔ、−１βのｐ’ｒ ９−１１との構造上の
違いは、第４図−１の（３）の部分であシ、この部分の
塩基配列は第４図−２に示した通シである。ｐＴＩＬ−
１βプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩに組み込ん
だ菌（Ｅ、 ｃａｌｌｐ’ｒ ｔｔ、−１β／ＨＢＩＯ
Ｉ）を常法によシ取得し、これを培養して、プラスミド
ＤＮＡを調製した。このプラスミドに制限酵素Ｃ１ｍ
ｌを作用させ、次いでＨｌ ｎｄ■を作用させて−Ｃ１
ａ Ｉ 、 Ｈｌｎｄｌｌで切断され九ＥｅｏＲ７サイ
トを含むＤＮＡフラグメント（Ｃ１ａ ｌ 。
違いは、第４図−１の（３）の部分であシ、この部分の
塩基配列は第４図−２に示した通シである。ｐＴＩＬ−
１βプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩに組み込ん
だ菌（Ｅ、 ｃａｌｌｐ’ｒ ｔｔ、−１β／ＨＢＩＯ
Ｉ）を常法によシ取得し、これを培養して、プラスミド
ＤＮＡを調製した。このプラスミドに制限酵素Ｃ１ｍ
ｌを作用させ、次いでＨｌ ｎｄ■を作用させて−Ｃ１
ａ Ｉ 、 Ｈｌｎｄｌｌで切断され九ＥｅｏＲ７サイ
トを含むＤＮＡフラグメント（Ｃ１ａ ｌ 。
）（ｉｎｄ ［１切断ＤＮＡフラグメント）を調製した
。
。
■ 他方、挿入ＤＮＡとして第５図に示した２種のオリ
ゴヌクレオチドｂをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
ゴヌクレオチドｂをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
■ Ｃ１ｍ ｌ 、 Ｈｌｎｄ ｉｌｌ切断ＤＮＡフラ
グメントと２種の合成オリゴヌクレオチドを混合し、Ｔ
４ＤＮＡ ＩＪガーゼを作用させて、ライダーシ、ンを
行ないＴＬ−１β蛋白の直前に、Ｍ＠ｔ −Ａｓｐ −
Ａｓｐ −Ａｓｐ −Ｖａｌ−Ａａｐ −Ｐｈｅ −Ａ
ｒｇをコードする構造をもつプラスミド（ｐ’ｒ ｔｔ
、−１β−Ｋ）を得た。
グメントと２種の合成オリゴヌクレオチドを混合し、Ｔ
４ＤＮＡ ＩＪガーゼを作用させて、ライダーシ、ンを
行ないＴＬ−１β蛋白の直前に、Ｍ＠ｔ −Ａｓｐ −
Ａｓｐ −Ａｓｐ −Ｖａｌ−Ａａｐ −Ｐｈｅ −Ａ
ｒｇをコードする構造をもつプラスミド（ｐ’ｒ ｔｔ
、−１β−Ｋ）を得た。
■ 得られたｐ’ｒ ｒＬ−１β−Ｋを実施例１と同様
な方法で、Ｅ、 ｃｏｌ ｌ ＨＢＩＯＩ菌体にトラン
スフシームし、ン ア丼ピシリン（５０ｒ／ｒＲ１）を含むブイヨン平板培
養で出現したコロニー２０コを釣菌した。
な方法で、Ｅ、 ｃｏｌ ｌ ＨＢＩＯＩ菌体にトラン
スフシームし、ン ア丼ピシリン（５０ｒ／ｒＲ１）を含むブイヨン平板培
養で出現したコロニー２０コを釣菌した。
■ 釣菌したコロニーをそれぞれブイヨン平板で培養し
、菌体を集め、常法によシブラスミドＤＮＡを調製した
。
、菌体を集め、常法によシブラスミドＤＮＡを調製した
。
このグラスミドに制限酵素Ｓａｌ ｌを作用させ、本酵
素によるグラスミドの開裂が確認された菌株の中から１
株（Ｅ、 ｃｏｌｔ 、 ｐＴ ＩＩ、−１β−に／Ｈ
ＢＩＯＩ ’）を選択した。
素によるグラスミドの開裂が確認された菌株の中から１
株（Ｅ、 ｃｏｌｔ 、 ｐＴ ＩＩ、−１β−に／Ｈ
ＢＩＯＩ ’）を選択した。
（２）培養及び生産物の取得
実施例１と同様の方法によＦ） Ｅ、ｃｏｌｌ ｐＴＴ
Ｌ−１β−に／ＨＢＩＯＩの生産する蛋白が、Ｍａｔ
−Ａｓｐ −Ａｓｐ −Ａｓｐ−Ｖａｌ −Ａｓｐ −
Ｐｈｓ −Ａｒｇ −ＩＬ−１β であることが確認さ
れた。
Ｌ−１β−に／ＨＢＩＯＩの生産する蛋白が、Ｍａｔ
−Ａｓｐ −Ａｓｐ −Ａｓｐ−Ｖａｌ −Ａｓｐ −
Ｐｈｓ −Ａｒｇ −ＩＬ−１β であることが確認さ
れた。
（３） カリクレインによる切断
実施例１と同様の方法を行なった結果、ＴＬ−１β−Ｋ
が定量的にＴＩ、−１β蛋白に変換され°た。
が定量的にＴＩ、−１β蛋白に変換され°た。
第１図は、ＴＬ−２表現グラスミドｐＴ９−１１の造成
経過説明図である。 第２図は、ＴＬ−２遺伝子を有するプラスミドＰＴ１３
８Ｎｃｏの説明図である。 （１）は、ｐＢＲ３２２よシ由来したＤＮＡである。 （２）は、ｐＴ９−１１よシ由来したＤＮＡである。 （３）は、ｐＴ９−１１の構造が変換されたＤＮＡ部で
ある（第２図−２に示されている）。 第３図は、合成オリゴヌクレオチドａの説明図である。 ！４図は、変換されたＴＬ−２遺伝子を有するプラスミ
）” ｐ’ｒ ｒｔ、−１βの説明図である。 （１）は、ｐＢＲ３２２よシ由来したＤＮＡである。 （２）は、ｐＴ９−１１よシ由来したＤＮＡである。 （３）は、ｐＴ９−１１の構造が変換されたＤＮＡ部で
ある（第４図−２に示されている）。 第５図は、合成オリゴ９ヌクレオチドｂの説明図である
。
経過説明図である。 第２図は、ＴＬ−２遺伝子を有するプラスミドＰＴ１３
８Ｎｃｏの説明図である。 （１）は、ｐＢＲ３２２よシ由来したＤＮＡである。 （２）は、ｐＴ９−１１よシ由来したＤＮＡである。 （３）は、ｐＴ９−１１の構造が変換されたＤＮＡ部で
ある（第２図−２に示されている）。 第３図は、合成オリゴヌクレオチドａの説明図である。 ！４図は、変換されたＴＬ−２遺伝子を有するプラスミ
）” ｐ’ｒ ｒｔ、−１βの説明図である。 （１）は、ｐＢＲ３２２よシ由来したＤＮＡである。 （２）は、ｐＴ９−１１よシ由来したＤＮＡである。 （３）は、ｐＴ９−１１の構造が変換されたＤＮＡ部で
ある（第４図−２に示されている）。 第５図は、合成オリゴ９ヌクレオチドｂの説明図である
。
Claims (2)
- （１）Ｐｈｅ−ＡｒｇをコードするＤＮＡの３′−端が
ポリペプチドをコードする遺伝子の５′−端に結合され
ているＤＮＡを少くとも有する組換えＤＮＡ。 - （２）Ｐｈｅ−ＡｒｇをコードするＤＮＡの３′−端が
ポリペプチドをコードする遺伝子の５′−端に結合され
ているＤＮＡを少くとも有する組換えＤＮＡを有する組
換えＤＮＡが導入されている微生物を培養し、得られた
融合ポリペプチドをカリクレインを用いて加水分解する
ことを特徴とする、ポリペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61092480A JPS62248489A (ja) | 1986-04-22 | 1986-04-22 | 組換えｄｎａ及びそれを用いるポリペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61092480A JPS62248489A (ja) | 1986-04-22 | 1986-04-22 | 組換えｄｎａ及びそれを用いるポリペプチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62248489A true JPS62248489A (ja) | 1987-10-29 |
Family
ID=14055469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61092480A Pending JPS62248489A (ja) | 1986-04-22 | 1986-04-22 | 組換えｄｎａ及びそれを用いるポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62248489A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001005822A3 (en) * | 1999-07-16 | 2001-05-25 | Univ Manchester | Molecules derived from interleukin-1 beta |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56166200A (en) * | 1980-02-29 | 1981-12-21 | Univ California | Idiosyncratically cutting linker |
-
1986
- 1986-04-22 JP JP61092480A patent/JPS62248489A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56166200A (en) * | 1980-02-29 | 1981-12-21 | Univ California | Idiosyncratically cutting linker |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001005822A3 (en) * | 1999-07-16 | 2001-05-25 | Univ Manchester | Molecules derived from interleukin-1 beta |
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