JPS62255429A - 部分精製骨誘導因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、　ＦＩの量、細な量′■ （産業上の利用分野） 本発明はタンパク質化学および骨形成に関する。

特に、急速な骨の成長を促進する１部分精製したタンパ
ク様因子に関する。

（従来の技術） 生存系に接触して置かれると新管形成を刺激し得る物質
が、骨に含まれることが確立されている（Ｕｒｉｓｔ、
　　Ｍ、　　Ｉ？、、　　Ｃｌ１ｎ　０ｒｔｈｏ　　（
１９６８）　　５６　：　３７　；５ｃｉｅｎｃｅ　（
１９６５）　１５０　：　８９３　：　Ｒｅｄｄｉ、　
Ａ、　）１．、　ｅｔａｌ、　　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　
Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　　（ＵＳＡ）　　（１９７２）　６
９　：　１６０１）。

この活性の原因となる因子は何でも精製しようという試
みがなされてきた。Ｕｒｉｓｔの米国特許番号４．２９
４，７５３および４，４５５，２５６の開示によれば、
「ウシの形態形成タンパク質ｊ　　（ＢＭＰ）が無機質
脱落化骨から尿素あるいは塩酸グアニジンを用いて抽出
され再沈澱された。Ｕｒｉｓｔは１！続して、この粗タ
ンパク質混合物をイオン交換で精製することにより、　
ｐＨ４，８のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に
吸着されない活性が生じることを報告した（ｌＪｒｉｓ
Ｌ。

Ｍ、　Ｒ，、Ｃｌ１ｎ　０ｒｔｈｏ　　Ｒｅｌ　Ｒｅｓ
　（１９Ｂ２）　１６２　：　２１９）。

Ｕｒｉｓｔの最新の報告（Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８３
）　２２０　：　６８０−６８５　　ａｎｄ　　Ｐｒｏ
ｃ　　Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ　　５ｃｉｅｎｃｅ　　（
ＵＳＡ）　　（１９８４）８１　：　３７１−３７５）
には１分子量１７，５００ダルトンおよび１８．５００
ダルトンのＢｌ’ＩＰが記載されている。

米国特許番号４，４３４，０９４は、明らかに骨の発生
を刺激する骨由来タンパク質であるものを、カオトロピ
ック剤による抽出、陰イオン交換カラムおよび陽イオン
交換カラムでの分離、およびｐＨ４，８のＣＭＣに吸着
された分画からの活性の回収により。

部分精製することを報告している。この新しいタンパク
質分画は［骨形成因子Ｊ　　（ＯＦ）と名付けられ、約
３０，０００ダルトンより小さい分子量を有し上述の精
製工程を経ることにより特徴づけられた。

このタンパク質から２つのタンパク質が均質なものに精
製された。これら２つのタンパク質は、約１５０から２
００ｍＭのＮａＣｌｔＪＩ度勾配でＣＭＣ樹脂から溶出
し、約２６，０００ダルトンの分子量を有する。これら
タンパク質は、共有のヨーロッパ特許出願公開公報８５
−３０４３４８〜６（公開日　１９８６年１月２２日）
に記載されている。これらタンパク質は骨形成に関与す
ると考えられているが、それ自身では骨形成活性を示さ
ない。

本出願は、上記ＣＭＣ結合物分画に存在し、約１５０ｍ
Ｍより低いＮａＣｌｔｌ度勾配で樹脂から溶出する。骨
誘導因子に関するものである。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、無機質脱落化骨（ＤＭＢ）から部分精製骨ｉ
ｒｎ　’ｆＬ因子を得る方法、それにより調製した因子
。

該因子を含む移植片材料、および該因子を用いて咄乳動
物において骨形成を誘導する方法に関する。

（問題点を解決するための手段） 本発明の部分精製付誘導因子の調製法は、以下の工程、
（ａ）非繊維性タンパク質を可溶化するカ第１・ロビソ
ク（解離的）エクストラクタントを用いて無機質脱落化
骨を抽出すること、（ｂ）工程（ａｌの抽出物をゲル及
３過にかけて、分子量１０，０００から３０，０００の
タンパク質を含む分画を回収すること、（Ｃ）工程ｆｂ
ｌの分画を、４．５から５．５程度のｐＨにてカルボキ
シメチルセルロース陽イオン交換体上に吸着させること
、および（ａｉ塩化ナトリウム濃度勾配により該陽イオ
ン交換体から活性タンパク質分画を溶出すること、を含
有し、該活性タンパク質分画を非イオン性カオトロピッ
ク剤存在下で約１０ｍＭから約１５０ｍＭまでの濃度勾
配で溶出することを特徴とする。

本発明の部分精製付誘導因子は、上記方法により調製さ
れることを特徴とする。

本発明の骨形成移植片材料は、その活性成分が上記部分
精製付誘導因子であることを特徴どする。

本発明の生存咄乳動物の所定部位りこおいて骨形成を誘
導する方法は、該部位に骨形成材料を注入することを含
み、該材料がト記部分積製骨誘ｍ因子であることを特徴
とする 特許請求されている本発明の骨誘導因子の天然源は、骨
、象牙質、骨肉腫、あるいは軟骨肉腫である。ヒト、サ
ル、ウシおよびラットの骨誘うπ性タンパク質は異種移
植片内でのその軟骨内骨形成能については非種特異的で
あるという主張（Ｓａｍｐａｔｌｉ。

Ｔ、　Ｋ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａ
ｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）（１９８３）’　８０　：
　６５９１）を考慮すると、特許請求されている本発明
の因子は哺乳動物種間で高度に保存されてきたと考えら
れる（即ち、異なる哺乳動物種由来の因子は、実質的に
相同なアミノ酸配列を有し、それはあったところで１つ
もしくはそれ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、あるい
は置換により変化するが、それが分子の非種特異的な骨
誘導活性に逆の影Ｃをおよぼすことはないであろう）。

これに関し、ここで用いられているように、「実質的に
等価な」および「実質的に相同な」という用語は、因子
が種に関係なく、場合により、実施例で述べる因子と同
じアミノ酸組成もしくは配列を有する場合２　もしくば
似ているが異なるアミノ酸組成もしくは配列を有しその
相違が非種特異的な軟骨内骨誘導活性に逆の影響をおよ
ぼさない場合。

を意味するものとする。従って、このような因子は様々
な哺乳動物由来の細胞あるいは組織から得られる。天然
源からの精製により調製される因子の源としては、ブタ
あるいはウシの長管が入手容易であることから好都合で
ある。

様々な初！Ｉ１１羽製法が可能であるが、基本的には。

骨はまず機械的技術または研摩技術により清掃され、破
砕され２例えば希釈酸水溶液で好ましくは低温でさらに
洗浄され２次いでエーテルあるいは酢酸エチルのような
脂肪親和性溶媒による抽出で脱脂される。骨は次に１通
常、より強い酸を用いた抽出により、様々な形のリン酸
カルシウムを除去して無ａ質脱落化される。これらの技
術は当分野では理解されており３例えば米国特許番号４
，４３４，０９４に開示されている。得られた調製物で
ある無機質脱落化骨は、特許請求されている骨形成因子
調製用の出発材料である。

初期の抽出は、無機質脱落化骨から非繊維性（即ち、非
コラーゲン性）のタンパク質を除去するものである。こ
れは塩酸グアニジン（約４モル以上）、尿素（８モル）
プラス塩、あるいはドデシル硫酸ナトリウム（約１重■
％以上）のようなカオトロピック剤、または当分野で知
られているような他のカオトロピック剤（Ｔｅｒｍｉｎ
ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　ＪＲｉｏｔ　Ｃｈｅ＋ｎ　（１９
８０）２５５　：９７６０−９７７２：および５ａｊｅ
ｒａａｎｄ　　Ｈａｓｃａｌｌ、Ｊ　　Ｂｉｏｌ　　Ｃ
ｈｅｍ　　（１９６９）２４４　　ニア７−８７ａｎｄ
　２３８４−２３９６　）　、を用いて行うことができ
る。

抽出は、抽出タンパク質が分解されたりあるいは変性さ
れたりする可能性を低（するために、プロテアーゼ阻害
剤存在下で温度を下げて行うのが好ましい。含まれるプ
ロテアーゼ阻害剤の例として。

フェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｉ’ＭＳＦ）
ソディウムアジド、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）　
。

ベンズアミジン、および６−アミノヘキサン酸がある。

媒質のｐＨは選択されるエクストラクタントに依る。抽
出工程は通常約４時間から１日のオーダーで行う。

抽出後、エクストラクタントは水に対して透析するなど
の適切な手段により除去してよく、必要に応じてその前
に限外濾過による濃縮を行なってもよい。塩もまた。制
′４１１１された電気泳動１分子ふるい、あるいは当分
野で周知の他のあらゆる手段を用いて除去され得る。ま
た、タンパク質の変性を最小にとどめるために、この工
程の間は低温を維持することが好ましい。あるいは、エ
クストラクタントであるカオトロピック剤は除去する必
要はなく、むしろ溶液は例えば限外濾過により単に濃縮
するだけでよい。

カオトロピック剤に溶解あるいは再溶解した抽出物は、
ゲル濾過にかけて分子量が約３０，０００ダルトンより
小さい分画を得ることにより、純度が太き（高められる
。ゲル分粒は標準的な技術を用いて行うが、好ましくは
セファクリル　カラムで室温（１０〜２５°Ｃ）で行う
。

次に低分子量分画を、ｐｌｌが約４．５から５．２好ま
しくは約４．８のＣＭＣを用いて、　６Ｍ尿素のような
非イオン性カオトロピック剤存在下で、イオン交換クロ
マトグラフィーにかける。他の陽イオン交換体を使用し
てもよく、それにはポリアクリルアミドや架橋デキスト
ラン由来のものが含まれる。しかし、セルロース陽イオ
ン交換体が好ましい。あらゆるイオン交換操作における
と同様、溶液はカラムに適用する前に競合イオンを除去
する必要があるのはいうまでもない。因子をカラムに吸
着させ、塩濃度勾配を約１０ｍＭから約１５０　ｍＭの
範囲で上げて溶出させる。

陽イオン交換カラムの１０ｍＭから１５０　ｍＭのＮａ
Ｃｌ分画をさらに精製するために、　Ｒ［’−＋１ＰＬ
ｃあるいは不変性ゲル電気泳動にかけてよい。

１０ｍＭから１５０ｍＭのＮａＣ１分画における因子の
存在は、以下に詳述するｉｎ　　ｖｉｖｏの骨誘導検定
により確認する。

（実施例） 下記の実施例は、特定の試料に適用される精製法の実例
を示すものであり１本発明はこれに限定されない。

Ａ、無私　　免Ｓ化管の調ゆ１ 屠殺場から新鮮ウシ中足骨を新しく得、ドライアイス上
で輸送した。骨を清掃して骨髄と非骨組識を除き、破壊
して径がｌ　ｃｍより小さい破片にし。

そして４℃にてミルで破砕した。破砕骨を骨１　ｋｇ当
たり９．４７７の２回蒸留水によりそれぞれ約１５分間
で２回洗い１次いで０．０ＩＮ　ＩＩｃＩで４℃にて一
晩洗った。洗浄した骨を３×３容量のエタノール。

続いて３×３容惟のジエチルエーテルを用いて脱脂した
。各洗浄は２０分間、終始室温で行なった。

得られた脱脂骨粉末を次に０．５Ｎ　ｌｌＣｌ　（２５
ｉｔ　／　ｋｇ脱脂骨）で４℃にて無機質脱落化した。

酸をデカントしそして得られたＤＭＢを洗浄ｐＨが４よ
り高くなるまで洗い、そしてＤＭＢを吸引濾過にて乾燥
した。

Ｂ、非コラーゲン性タンパク−の抽出 Ａ項で調製されたＤＭＢを、１ｋｇ当たり３．３１の４
Ｍ塩酸グアニジン、　ｌ０ｍＭエチレンジアミンテトラ
酢酸（ＥＤＴＡ）　　（ｐＨ６，８）　、　　１ｍＭ　
ＰＭＳＦ、および１０ｍＭＮＥＭで１６時間抽出した。

浮遊液を吸引濾過し。そして非可溶性材料を再度４時間
抽出した。可溶性分画を合わせ、アミコン限外濾過（Ｉ
ＯＫ）ユニットを用いた限外濾過により少なくとも５倍
に濃縮し、濃縮物を４日間にわたり３５容量の冷却脱イ
オン水６回交換に対して透析し１次いで凍結乾燥した。

本項における全操作は４℃にて行なった。但し、凍結乾
燥は標準的な凍結乾燥条件下にて行なった・ 旦−乃シリｌ過 ４Ｍ塩酸グアニジンに再溶解したＢ項の抽出物を。

４Ｍ塩酸グアニジン、　０．０２％　ソディウム　アジ
ド。

および１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ（６，８）で平衡化
したセファクリルＳ−２００カラム上で分離した。分画
を２８０ｎｍの吸光度で分析し１分画を第１図に示すよ
うに合わせた。第１図の分画Ｆ２は最大活性を有する低
分子量（ＬＭＷ、　１０．０００から３０．０００ダル
トン）のタンパク質分画を構成するが、これを１８０容
量の脱イオン水６回交換に対して透析し、凍結乾燥した
。凍結乾燥および透析（４℃）以外の全操作は室温にて
行なった。

Ｄ、イオン交換クロマトグラフィー ０項の分画Ｆ２を、　６Ｍ尿素、　１０ｍＭ　ＮａＣ１
，１ｍＭ　ＮＥＭ。

および５０１酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）に溶解し、
　１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。上清を
、同じ緩衝液で平衡化したＣ＋’＋５２　（市販のＣＭ
Ｃ）カラムで分離した。結合タンパク質を、同じ緩衝液
に溶かした１０ｍＭから４００ｍＭのＮａＣ１？Ｈ度勾
配を用いて、総容量３５０ｍ　ｌ　、流速２”１ｍｌ／
時間で、カラムから溶出した。（Ｊｌ−１，ＣＭ−２お
よびＣＬ３と名付けた３つの主要分画を第２図に示すよ
うに集めた。各分画を１１０容量の脱イオン水６回交換
に対して４日間透析し、凍結乾燥した。前述の操作は透
析（４℃）以外は全て室温で行なった。

Ｅ、ＲＰ−ＩＰＬＣ Ｄ項の凍結乾燥分画ＣＭ−２およびＣＭ−３をそれぞれ
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦΔ）に溶解し、溶液の
一部をＶｙｄａｃ　Ｃ１８ＲＰ−１１ＰＬＣカラム（４
，６ｕｒ　ＩＤ　Ｘ２５ｃＩｎ）にのせ、そして０．１
％ＴＦＡを用いて１ｍｊ？／分で５分間洗った。溶離溶
媒は０．１％ＴＦＡに溶かした０％から６０％のアセト
ニ１−リル濃度勾配で。

速度は２％／分とした。約２９．５分のピークＡおよび
約３１．３分のピークＢの２つのピークが得られた。

ヱー漱ｊ」ＩＶ酎耐λ医定 精製中の分画における所望のタンパク質の存在を、プロ
テオグリカン（ＰＧ）産生に対するｉｎ　　ｖｉｔｒ。

検定により確認した。　同定は、　ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚ
ｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　
ａｓｓａｙ）により行なった。

検定は、ラット胎児から単離した腓筋細胞を用いたアガ
ロースゲル培養モデルによる。それは、試料の軟骨特異
ＰＧ産生誘導能を検定する。旦　ｖｉｔｒ。

の軟骨誘導とＵ　旦皿の骨形成との相関は、　５ｅｙｅ
ｄｉｎ。

Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　　（１
９８３）　９７　：　１９５０−１９５３により示され
ている。

Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラット１９日胎児の上肢
から筋組織を無菌的に取り除き、Ｍｉ織を切り刻み、そ
れを１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および、５０ユニツ
ト／ｆｆｌ１ペニシリンまたは５０μｇ／１ｔｈ１スト
レプトマイシンを添加したイーグルの最少必須培地（Ｍ
Ｅ）１）で培養して、細胞培養を調製した。細胞は増殖
して２通常１週間以内に密集状態に達した。そこで、細
胞をトリプシン処理し、１：２に分けそして最初の３継
代以内で実験に用いた。

細胞を対照培地あるいは試験試料のいずれかを含むアガ
ロースゲル培養中に置いた。手順は基本的にはＢｅｎｙ
ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８２）　３０　
：　２１５によった。簡単に言えば、トリプシン処理に
より単層細胞を得、血球計算板で計数し、そして試験す
るタンパク質分画添加あるいは無添加の培地に最終細胞
濃度の２倍で再浮遊させた。対照培地はハムスＦ１２／
ダルベツコ最少必須培地（ＤＭＩＥＭ）あるいはＣＭＲ
Ｌ　１０６６　　（ジプコ製）で、各々１０％ＦＢＳと
抗生物質を含む。０．ＯＩＮ　ＨＣＬ中試験タンパク質
分画を、Ｆ１２に溶かした１％低融点アガロース（バイ
オ　ラッド製、　＃　１６２−００１７）で直接希釈し
て８等容１で希釈された所望濃度の試験タンパク質とし
。

そして希釈液０．２ｍ７２を０．１５ｍ　７！の１％高
融点アガロース（バイオ　ラ・７ド製、　　＃　１６２
−０１００）で覆った１７龍ウエルにまいた。得られた
培養を３７°Ｃで５分間インキユヘートし、４°Ｃにて
１０分間冷却し。

次いで１ｍｆｆの対応する培地（対照あるいは試験タン
パク質）をかぶせた。次に細胞を５％ＣＯｚ　、　９５
％空気の湿雰囲気中で培養し、その後、３〜４日目ごと
に対照培地で完全に置き換えることにより培地を供給し
た。７日後培養を凍結し検定前は一８０°Ｃにてｕｉ：
蔵した。

培養を４℃にて解凍し、　５０ｍＭ酢酸ナトリウム。

１３ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　６ｍＭ　ＮＥＭおよび３ｍ
ＭＰＭＳＦを含む４Ｍ塩酸グアニジン中でｐＨ５，８に
てホモジナイズし。

そして４°Ｃで一晩攪拌して抽出することにより。

培養の検定を行なった。２５．ＯＯＯＸｇ、　　１１″
Ｃで４００分間遠心分離しその上清分画を５０容量の０
，２Ｍ　ＮａＣｌ。

５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　（ｐＨ７，４）に対して４℃で
一晩透析した。

上清を、　Ｒｅｎａｒｄ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎａｌ　
Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８０）１０虹：２０５および米
国特許番号４，４３４，０９４に記載されているように
ＥＬｒＳＡによりプロテオグリカンに関して検定した。

簡単に言えば、　［：ＬＩＳＡに関しては、軟骨ＰＧに
対する抗血清を標率的な技術を用いてウサギで作った。

これはラット骨から抽出したヒアルロン酸あるいはＰＧ
と交叉反応性を示さなかった。Ｓｗａｒｍラット軟骨肉
腫組織由来の精製プロテオグリカン（Ｓｅｙｅｄｉｎ＋
　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、上記）を標準抗原として用いた
。透析した試料を、　０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０およ
び１■／ｍ７！ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリ
ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　（ｐＨ７，２）で１　：　
１　　（ｖ／ｖ）に希釈して検定用とした。セイヨウワ
サビペルオキシダーゼが結合したヤギの抗ウサギＩｇＧ
　　（タボ製）を、０−フェニレンジアミンを基質とし
て用いて２次抗体とした。

Ｄ項の３つのＣＭ結合分画（ＣＭＣ−８−１、ＣＭＣ−
８−２゜およびＣＭＣ−８−３と命名）のＥＬＩＳＡの
結果、およびＥ項のピークＡ　（ＣＩＦ−Ａと命名）の
タンパク質を。

第３図（ａ）および（ｂｌに示す。

旦−再盪底盪立 再構成については、上記方法で調製したタンパク質を、
骨コラーゲン粉末（ＢＣＰ、　Ｃ項の凍結乾燥固形物）
と溶液中コラーゲン（ＣＩＳ、コラーゲンコーボレショ
ン、パロ　アルド、カリフォルニアから登録商標ＺｙＧ
ＥＮ　Ａで入手可能）との重量比９：ｌの混合物、と合
わせた。ＣＩＳは、１０重世％の天然可溶性ウシ皮コラ
ーゲンを、そのｉｎ　　ｖｉｔｒｏでの軟骨形成活性に
従った割合で含む。第４図にその手順を概略的に示し、
再構成した（１υ材料の組成の詳細を第５図の表に示す
。この方法によれば。

再構成した試料は全てほぼ等しいユニット数の軟骨形成
活性（約１０００ユニット／１００■Ｒ−ＤＢＰ）を有
していた。ＣＩＦ−Ａの場合のみ適用量を２倍にし。

またＣＭＣ−８−１は２種の異なる適用量で再構成した
。

ＣＭＣ−８−１のタンパク質含量をビウレット分析によ
り決定し、他の全試料については２２０ｎｍにおいてＨ
ＯＥ　知のウシ血清アルブミンスタンダードのピーク部
と比較してＨＰＬＣビークを統合することにより測定し
た。純粋なＣＩＦ−ＡおよびＣＩＦ−Ｂの場合は、　Ｈ
ｒ’ＬＣ分画をｃｒｓ溶液へ直接添加しその後ＢＣＰと
混合した。また、　ＢＣＰ／ＣＩＳキャリアから成る対
照の試料を同じ条件下で調製・した。

Ｈ，パイオアフセイニ 試料の骨誘導能を、　Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラ
ット雄子供の皮下組織におけるその軟骨内骨形成誘導能
により検定した。試料を２回蒸留した滅菌水２容量（ν
／ｖ４″）で湿らせ、充分混合し、ｌｃｃ注射器につめ
。

切って重量を測定した。全ての試料を動物の各両脇の腹
側胸部に移植した。１４日および２８日後に体外移植組
織を取り除き、生化学的かつ組織学的に評価した。

ニーＪＩＶム艮隨 １４日および２８日後に取り出した体外移植組織を。

１０％中性ホルマリンで２６時間固定し２次いでパラフ
ィン包理処理して１組織学的評価を行なった。

包理組織から４から６ミクロン切片を作り、ヘマトキシ
リン−エオシン（−瓜の細胞学）によるか。

サフロニンー〇（プロテオグリカン）とゴモリトリクロ
ーム（コラーゲン）によるかのいずれかで連続染色した
。

丈−生■ネ桧定 １４日棒体外植組織を２分し、湿重量を測定し。

処理するまで一８０℃にて凍結した。試料をまず抽出し
てアルカリ性ホスファターゼ活性について検定し、続い
て抽出して軟骨に特異的なプロテオグリカンについて検
定した。右脇の２８日棒体外植組織を抽出して、まずア
ルカリ性ホスファターゼについて検定し１次いでカルシ
ウムについて検定した。抽出および検定の手順を以下に
述べる。

Ｊ、１．プロテオグリカンＡ〜 ＥＬＩＳＡ技術により軟骨プロテオグリカンを検定した
。体外移植組織の重量を取り出し直後測定し。

抽出まで一７０℃にて凍結した。抽出については。

体外移植組織を薄く切り、水冷抽出緩衝液中で。

チックマー　ティソシュマイザーを最高限にセットして
、　３０秒間、２回、ホモジナイズした。抽出緩衝液は
、６Ｍ塩酸グアニジン／７５ｍＭ酢酸ナトリウム、ある
いは４Ｍ塩酸グアニジン１５０ｍＭ酢酸塩で、いずれの
場合も２０ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　１　ｍＭ　ＰＭＳＦお
よび１０ｎ＋ＭＮＥＭをｐＨ５，８で含む。緩衝液は抽
出体外移植組織の重量に対し、１０：１の容量で使用し
た。次いで、試料を４℃で一晩（２０時間）インキュベ
ートした。試料を次に１２．ＯＯＯｒｐｍ　、　　４℃
で１時間遠心分離し、その上清を５０容量の５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ、　２００ｍＭＮａＣｌ、　（ｐＨ７，４）に
対して４℃で一晩透析した。透析ン夜について、ポリス
チレン　マイクロブレート（フロー　ラボラドリース、
マンクリーン、バージニア）を用い、　Ｒｅｎａｒｄ、
　ｅｔ　ａｌ、　ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍ１１１〜ｊ二
、３１１−１）−（コユニ１（−；ニー（１９８０）２
０７　　二３９９および５ｅｙｅｄｉｎ、　Ｓ、。

ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８３）
　９７　：　１９５０に記載されているようにしてＥＬ
ＩＳＡを行なった。５ｅｙｅｄｅ口、Ｓ、。

ｅｔａｌ（上記）に記載のようにして、　Ｓｗａｒｍラ
ット軟骨肉腫組織から抗血清およびプロテオグリカンを
調製した。セイヨウワサビペルオキシターゼが結合した
ヤギの抗ウサギＩｇＧを二次抗体として使用した。試料
は、　０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０と１ｒａｇ／ｌｌ１
ｌｌＢＳＡを含むＰＢＳの異なる溶液中で検定し、また
５ｈｕｕｒｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｍ
　（１９７７）８１　：　１に記載の抑制ＥＬＴＳΔに
より定■した。

ムム１遣Ｕυと乙欠ム 骨形成を、カルシウム測定によりまた評価した。

体外移植組織を細かく切って、　　１　：１０　（ｍ／
ν）の０．５Ｎ＋１ＣＩに浮遊して、イオンを溶解した
。試料を室温でさらに５日間インキユヘートし、　１２
，０００ｒｐｎ＋で４０分間遠心分離した。上清のカル
シウム濃度を原子吸着（トレース　アナリシス　ラボラ
トリ−。

ヘイワード、カリフォルニア）により測定した。

ムムヱ匹遣ユニ」スファターゼ肛 アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）測定のために。

体外移植組織を細かく切って、１０容ｆｆｌ　（１／１
０）の水冷１．５Ｍ　ＮａＣ１，３ｍＭ　Ｎａ１ｌＣＯ
３，ｐＨ７，５中でホモジナイズした。ホモジナイズし
た試料を次に１２，０００ｒｐｍ＋　４℃で５０分間遠
心分離し、その上清の一部を冷却蒸留水で１：１０に希
釈した。Ｉｌｕｇｇｊｎｓ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｌ」」Ｌル世−（１９６１）旦４ニア６１の方法により
、ポリスチレンプレートを使用してアルカリ性ホスファ
ターゼを評価した。

Ｋ９Ｍｉ！８試　および生化豐枠　の結果結果の一部を
以下の表に要約して示す。表は。

ＣＭＣ分画と合わせたＢＣＰ／ＣＳＩの組織学およびア
ルカリ性ホスファターゼ活性を要約したものである。

上記データから、　ＣＭＣ−８−１タンパク質は、骨形
成の速度、量および質がより貰いことで反映されている
ように、　ＣＭＣ結合物（総結合分画）に関連した管杭
ｍを増強することがわかる。これら実験は、軟骨内骨形
成が管杭導材料の純度およびその中のタンパク質分布の
影響を受けることを示している。これら実験はさらに、
ヨーロッパ特許出願８５．３０４８４８．６で同定され
ている２つのタンパク質が、骨形成に関与する細胞の分
化において機能し。

また軟骨および骨形成の速度と相対量に影響を与える可
能性を示唆している。

示されているように、１４日百合よび２８日口の体外移
植材料の組織学的データおよび生化学データから、再構
成した総ＣＭＣ結合物（ＣＭＣに結合した総タンパク質
）とＣＭＣ−８−１は移植片全てにおいて軟骨と骨の形
成を誘導することがわかった。１４日百合は、軟骨形成
はＲ−ＣＭＣＭＣ結合値移植片常に高く、シかも移植片
全体に均一に分布していた。

周辺には何らかの新しい骨が形成されていた。これに対
し、　Ｒ−ＣＭＣ−Ｂ−１は、１４日百合は軟骨はほん
の少ししかなく、すでに多くの骨が見られた。２８日目
では、　ｌ？−ＣＭＣ結合物の体外移植組織はまだ軟骨
を有していた。（軟骨と骨の量はほとんど同じようであ
った。）　Ｒ−ＣＭＣ−８−１はその間、軟骨は痕跡を
とどめるにすぎず、脂肪に冨んだ骨髄腔を伴うよく発達
した骨を含んでいた。後者の体外移植組織は全て１通常
具られるよりも大きいように思われた。組織学的観察を
生化学データにより確認した。両材料とも高レベルのア
ルカリ性ホスファターゼ活性を示した。２８日目のカル
シウム含量は両材料とも非常に高かった（Ｒ−ＣＭＣ結
合物では約３２ｍｇ　Ｃａ／ｇ湿組織、またＲ−ＣＭＣ
−８−１では約３９ｍｇＣａ／ｇ湿組織であった）。

特許請求されている骨形成材料は、ヒトを含む生存哺乳
動物における骨組織の修復、置換、あるいは増大用の骨
形成移植片組成物の活性成分として使用できる。骨形成
上有効な量の本材料は、正規には、移植用ＢＣＰのよう
な薬理学的かつ生理学的に受容可能な固形キャリアとと
もに処方される。

活性タンパク質とキャリアの重量比は、典型的には、１
；５０から１　：　１０００の範囲にある。移植片は従
来の外科技術により患者の所定部位に霞く。

特許請求されている因子はまた。オステオポローシスや
天理石骨病のような骨の欠陥を全身的に処置するために
も有用であろう。このような処置の場合は、治療上有効
な量のタンパク質を注入可能なキャリアとともに処方し
、非経口的に患者に投与する。

（発明の概要） １０．０００から３０．０００ダルトンのタンパク様部
分精製骨誘導因子を述べる。それは、ウシの無機質脱落
化骨から得られ、カオトロピフク剤による抽出。

゛ゲル濾過、　ｐＨ４，８のカルボキシメチルセルロー
スを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー、および約
１０ｍＭから約１５０ｍＭまでのＮａＣ１？Ｍ度勾配溶
出により得られる。

４、パ面の「′なＵ 第１図は、実施例（０項）のゲル濾過分画の光学密度（
吸光度）　　（２８０ｎｍ　）のグラフである。

第２図は、実施例（Ｄ項）の予備的なイオン交換クロマ
トグラフィーからの溶出物分画の光学密度（２８０ｎｍ
　）のグラフである。

第３図（ａ）および（ｂ）は、実施例に記載されている
Ｆ項のあるタンパク質について測定した軟骨形成比活性
を示すグラフである。

第４図は、実施例０項に記載の再構成手順を示す概略図
である。

第５図は、Ｇ項に記載の再構成試料およびＦ項の検定に
より測定したそれらの軟骨形成比活性を示す表である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、部分精製骨誘導因子の調製法であって、以下の工程
   、 （ａ）非繊維性タンパク質を可溶化するカオトロピック
   エクストラクタントで無機質脱落化骨を処理すること、 （ｂ）工程（ａ）の抽出物をゲル濾過にかけて、分子量
   １０，０００から３０，０００のタンパク質を含む分画
   を回収すること、 （ｃ）工程（ｂ）の分画を、４．５から５．５程度のｐ
   Ｈにてカルボキシメチルセルロース陽イオン交換体上に
   吸着させること、および （ｄ）塩化ナトリウム濃度勾配により該陽イオン交換体
   から活性タンパク質分画を溶出すること、を含有し、該
   活性タンパク質分画を非イオン性カオトロピック剤存在
   下で約１０ｍＭから約１５０ｍＭまでの濃度勾配で溶出
   することを特徴とする方法。 ２、部分精製骨誘導因子であって、以下の工程、（ａ）
   非繊維性タンパク質を可溶化するカオトロピックエクス
   トラクタントで無機質脱落化骨を処理すること、 （ｂ）工程（ａ）の抽出物をゲル濾過にかけて、分子量
   １０，０００から３０，０００のタンパク質を含む分画
   を回収すること、 （ｃ）工程（ｂ）の分画を、４．５から５．５程度のｐ
   Ｈにてカルボキシメチルセルロース陽イオン交換体上に
   吸着させること、および （ｄ）塩化ナトリウム濃度勾配により該陽イオン交換体
   から活性タンパク質分画を溶出すること、を含有し、該
   活性タンパク質分画を非イオン性カオトロピック剤存在
   下で約１０ｍＭから約１５０ｍＭまでの濃度勾配で溶出
   することを特徴とする方法により調製された部分精製骨
   誘導因子。 ３、骨形成移植片材料であって、その活性成分が以下の
   工程、 （ａ）非繊維性タンパク質を可溶化するカオトロピック
   エクストラクタントで無機質脱落化骨を処理すること、 （ｂ）工程（ａ）の抽出物をゲル濾過にかけて、分子量
   １０，０００から３０，０００のタンパク質を含む分画
   を回収すること。 （ｃ）工程（ｂ）の分画を、４．５から５．５程度のｐ
   Ｈにてカルボキシメチルセルロース陽イオン交換体上に
   吸着させること、および （ｄ）塩化ナトリウム濃度勾配により該陽イオン交換体
   から活性タンパク質分画を溶出すること、を含有し、該
   活性タンパク質分画を非イオン性カオトロピック剤存在
   下で約１０ｍＭから約１５０ｍＭまでの濃度勾配で溶出
   することを特徴とする方法により調製された部分精製骨
   誘導因子である骨形成移植片材料。 ４、生存哺乳動物の所定部位に骨形成上活性な材料を移
   植することを含み、該部位における骨形成を誘導する方
   法であって、該材料が以下の工程、（ａ）非繊維性タン
   パク質を可溶化するカオトロピックエクストラクタント
   で無機質脱落化骨を処理すること、 （ｂ）工程（ａ）の抽出物をゲル濾過にかけて、分子量
   １０，０００から３０，０００のタンパク質を含む分画
   を回収すること。 （ｃ）工程（ｂ）の分画を、４．５から５．５程度のｐ
   Ｈにてカルボキシメチルセルロース陽イオン交換体上に
   吸着させること、および （ｄ）塩化ナトリウム濃度勾配により該陽イオン交換体
   から活性タンパク質分画を溶出すること、を含有し、該
   活性タンパク質分画を非イオン性カオトロピック剤存在
   下で約１０ｍＭから約１５０ｍＭまでの濃度勾配で溶出
   することを特徴とする方法により調製された部分精製骨
   誘導因子である方法。