JPS62259596A - ハイブリツドタンパク質の精製方法 - Google Patents
ハイブリツドタンパク質の精製方法Info
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- JPS62259596A JPS62259596A JP10342387A JP10342387A JPS62259596A JP S62259596 A JPS62259596 A JP S62259596A JP 10342387 A JP10342387 A JP 10342387A JP 10342387 A JP10342387 A JP 10342387A JP S62259596 A JPS62259596 A JP S62259596A
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- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えＤＮＡ技術を用いた形質転換宿主によるハイブリ
ッドタンパク質としての所望のタンパク質の発現は、当
該技術分野において公知である。
ッドタンパク質としての所望のタンパク質の発現は、当
該技術分野において公知である。
従来、所望のタンパク質は、硫酸アンモニウム沈降、イ
オン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラ
フィーでのマルチ分離にＩＩＩ製細胞抽出物を付すこと
により単離された。これらの方法は、タンパク質の凝集
及び分解の可能性を残している。収率は一貫して低く、
生成物は多量の不純物を含有している。しかも、これら
の方法は時間を要し、通常約１週間〜約１０日間又はそ
れ以上かかる。
オン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラ
フィーでのマルチ分離にＩＩＩ製細胞抽出物を付すこと
により単離された。これらの方法は、タンパク質の凝集
及び分解の可能性を残している。収率は一貫して低く、
生成物は多量の不純物を含有している。しかも、これら
の方法は時間を要し、通常約１週間〜約１０日間又はそ
れ以上かかる。
レニン切断部位を介して所望のペプチドに結合せしめら
れたβ−ガラクトシダーゼ部分を含有するハイブリッド
タンパク質は、非特異的吸着が生じないか又は最小限で
しか生じないような条件下でアフィニティーマトリック
スに吸着される。マトリックス−ハイブリッドタンパク
質複合体は次いで、弱く結合又は会合したタンパク質を
除去するために、緩衝液で洗浄される。マトリックスは
次いでインキュベート用緩衝液に再懸濁され、レニンが
ハイブリッドタンパク質を切断するために加えられる。
れたβ−ガラクトシダーゼ部分を含有するハイブリッド
タンパク質は、非特異的吸着が生じないか又は最小限で
しか生じないような条件下でアフィニティーマトリック
スに吸着される。マトリックス−ハイブリッドタンパク
質複合体は次いで、弱く結合又は会合したタンパク質を
除去するために、緩衝液で洗浄される。マトリックスは
次いでインキュベート用緩衝液に再懸濁され、レニンが
ハイブリッドタンパク質を切断するために加えられる。
所望のペプチドは上澄液に放出されるが、他方β−ガラ
クトシダーゼ部分はアフィニティーマトリックスに結合
したままで残る。所望のタンパク質の精製は、陰イオン
交換クロマトグラフィーにより完了される。
クトシダーゼ部分はアフィニティーマトリックスに結合
したままで残る。所望のタンパク質の精製は、陰イオン
交換クロマトグラフィーにより完了される。
したがって、本発明の目的は、ハイブリッドタンパク質
から所望のタンパク質を単離するための改良方法を提供
することにある。
から所望のタンパク質を単離するための改良方法を提供
することにある。
本発明の他の目的は、短時間で所望のタンパク質を単離
するための改善方法を提供することである。更に他の目
的は、タンパク質の凝集及び分解の可能性を排除する方
法を提供することである。
するための改善方法を提供することである。更に他の目
的は、タンパク質の凝集及び分解の可能性を排除する方
法を提供することである。
更に別の目的は、所望のタンパク質の更に高い収率及び
高純度を達成する方法を提供することである。本発明の
これら及び他の目的は、下記説明から明らかになるであ
ろう。
高純度を達成する方法を提供することである。本発明の
これら及び他の目的は、下記説明から明らかになるであ
ろう。
本発明は、ハイブリッドタンパク質からの所望のタンパ
ク質の迅速かつ効率の高い分翻方法に関する。本明細書
で用いられる所望のタンパク質という語は、天然及び修
正タンパク質のみならず、天然又は修正タンパク質由来
のポリペプチド及びペプチドをも包含する。ハイブリッ
ドタンパク質は所望のタンパク質を含有しているが、こ
のタンパク質は酵素切断部位に連結せしめられ、次いで
この部位は安定的発現タンパク質ｔこ付着せしめられて
いる。所望のタンパク質は、当業者で公知の組換えＤＮ
Ａ技術を用いて形質転換宿主から融合又はハイブリッド
タンパク質として産生される。
ク質の迅速かつ効率の高い分翻方法に関する。本明細書
で用いられる所望のタンパク質という語は、天然及び修
正タンパク質のみならず、天然又は修正タンパク質由来
のポリペプチド及びペプチドをも包含する。ハイブリッ
ドタンパク質は所望のタンパク質を含有しているが、こ
のタンパク質は酵素切断部位に連結せしめられ、次いで
この部位は安定的発現タンパク質ｔこ付着せしめられて
いる。所望のタンパク質は、当業者で公知の組換えＤＮ
Ａ技術を用いて形質転換宿主から融合又はハイブリッド
タンパク質として産生される。
ハイブリッドタンパク質はベクターから発現されるが、
このベクターにおいて、所望のタンパク質についてコー
ドするＤＮＡ及び安定的発現タンパク質についてコード
するＤＮＡは、酵素レニンで認識される酵素切断部位に
ついてコードするＤＮＡ断片によって結合されている。
このベクターにおいて、所望のタンパク質についてコー
ドするＤＮＡ及び安定的発現タンパク質についてコード
するＤＮＡは、酵素レニンで認識される酵素切断部位に
ついてコードするＤＮＡ断片によって結合されている。
その結果、発現ハイブリッドタンパク質は、安定的発現
タンパク質から所望のタンパク質を分離するために、レ
ニンで切断することができる。酵素レニンで認識される
部位を含有するハイブリットパタンバク質の構造は、１
９８５年５月２４日に出願された米国特許出願第６１４
，０８５号明細書に開示されており、この開示は参考の
ため本明細書に包含される。好ましくは、ハイブリッド
タンパク質の非所望又は安定的発現部分は、β−ガラク
トシダーゼからなる。
タンパク質から所望のタンパク質を分離するために、レ
ニンで切断することができる。酵素レニンで認識される
部位を含有するハイブリットパタンバク質の構造は、１
９８５年５月２４日に出願された米国特許出願第６１４
，０８５号明細書に開示されており、この開示は参考の
ため本明細書に包含される。好ましくは、ハイブリッド
タンパク質の非所望又は安定的発現部分は、β−ガラク
トシダーゼからなる。
ハイブリッドタンパク質はこのため、酵素レニンで切断
され得るペプチド断片を介して所望のタンパク質に付着
したβ−ガラクトシダーゼから構成されることになる。
され得るペプチド断片を介して所望のタンパク質に付着
したβ−ガラクトシダーゼから構成されることになる。
下記説明及び実施例は、エプスタイン・バールウィルス
（ＥＢＶ）由来免疫原断片含有の特殊な融合タンパク質
に関する本発明について説明するものであるが、融合タ
ンパク質として形質転換宿主から発現された目的とする
いずれのタンパク質にも本発明は適用し得ると解される
。他のタンパク質の例としては、ウィルス抗原、細菌抗
原、キラミジア抗原、リケッチア抗原、真菌抗原、原生
動物抗原、ペプチド及びポリペプチドホルモン、成長因
子、免疫調節タンパク質及びペプチド、酵素、腫瘍形成
タンパク質、並びに他の生物学的活性ペプチド及びタン
パク質がある。
（ＥＢＶ）由来免疫原断片含有の特殊な融合タンパク質
に関する本発明について説明するものであるが、融合タ
ンパク質として形質転換宿主から発現された目的とする
いずれのタンパク質にも本発明は適用し得ると解される
。他のタンパク質の例としては、ウィルス抗原、細菌抗
原、キラミジア抗原、リケッチア抗原、真菌抗原、原生
動物抗原、ペプチド及びポリペプチドホルモン、成長因
子、免疫調節タンパク質及びペプチド、酵素、腫瘍形成
タンパク質、並びに他の生物学的活性ペプチド及びタン
パク質がある。
本発明によれば、ハイブリッドタンパク質含有の宿主細
胞試料は、緩衝液中に、好ましくは、イソプロパツール
巾約２００ｍＭ）リス、約２５０ｍＭＮａｃ１、約１０
ｍＭ炭酸塩、約１．０ｍＭβ−メルカプトエタノール、
約５％グリセロール及び約０、１ Ｍフェニルメチルス
ルホニルフルオリド含有のｐＨ約７．６のトリス緩衝液
中に、温度約５％〜約３５％で懸濁される。細胞破壊は
、化学的又は物理的手段により、好ましくは物理的破壊
により実施される。ハイブリッドタンパク質含有上澄液
は遠心分離で集められる。タンパク質は、核酸を沈降さ
せるために、硫酸ストレプトマイシン約２．５％〜約１
０％Ｗ／Ｖで処理してもよい。ハイブリッドタンパク質
は、マトリックス付着及びレニン切断に先立ち、遠心分
離後上澄液から集められ、許容される緩衝液に対して透
析される。許容される緩衝液は、ハイブリッドタンパク
質のマトリックスへの付着及びレニン切断のために、適
切なｐＨ及び塩濃度を有していなければならない。
胞試料は、緩衝液中に、好ましくは、イソプロパツール
巾約２００ｍＭ）リス、約２５０ｍＭＮａｃ１、約１０
ｍＭ炭酸塩、約１．０ｍＭβ−メルカプトエタノール、
約５％グリセロール及び約０、１ Ｍフェニルメチルス
ルホニルフルオリド含有のｐＨ約７．６のトリス緩衝液
中に、温度約５％〜約３５％で懸濁される。細胞破壊は
、化学的又は物理的手段により、好ましくは物理的破壊
により実施される。ハイブリッドタンパク質含有上澄液
は遠心分離で集められる。タンパク質は、核酸を沈降さ
せるために、硫酸ストレプトマイシン約２．５％〜約１
０％Ｗ／Ｖで処理してもよい。ハイブリッドタンパク質
は、マトリックス付着及びレニン切断に先立ち、遠心分
離後上澄液から集められ、許容される緩衝液に対して透
析される。許容される緩衝液は、ハイブリッドタンパク
質のマトリックスへの付着及びレニン切断のために、適
切なｐＨ及び塩濃度を有していなければならない。
下記実施例において使用されるようなエプスタイン・バ
ールウィルス（ＥＢＶ）の付着及ヒ切断のために許容さ
れる緩衝液は、ｐ Ｈ約７．４の約４０ｍＭトリス、約
２２５ ｍＭＮａＣ７＋、約１０ｍＭＭｇｃＩｌｚ、約
１０ｍＭβ−メルカプトエタノール及び約５ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸（緩衝液Ａ）からなる。透析は、約４
℃で約３〜約２４時間継続される。ハイブリッドタンパ
ク質は遠心分離により清澄化され、バッチ方法又はカラ
ム分離技術におけるアフィニティーマトリックスに加え
られる。アフィニティーマトリックスは、ウルマン、遺
伝子、第２９巻、第２７−３１頁、１９８４年（Ｕ Ｉ
Ｉｍａｎｎ、 Ｇｅｎｅ、 ２９ ： ２７ ３１（
１９８４））の操作法に従い、β−ガラクトシダーゼに
特異的なｐ−アミノフェニル−β−１）−チオガラクト
シド（ＴＰＥＧ）リガンドに結合した架橋結合アガロー
スゲル（ＡＧＲ）から形成されている。ＴＰＥＧは、ハ
イブリッドタンパク質含有ＥＢＶ免疫原の精製用に好ま
しい下記結合構造によってアガロースに付着せしめられ
ている：Ｎｙｒ−。
ールウィルス（ＥＢＶ）の付着及ヒ切断のために許容さ
れる緩衝液は、ｐ Ｈ約７．４の約４０ｍＭトリス、約
２２５ ｍＭＮａＣ７＋、約１０ｍＭＭｇｃＩｌｚ、約
１０ｍＭβ−メルカプトエタノール及び約５ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸（緩衝液Ａ）からなる。透析は、約４
℃で約３〜約２４時間継続される。ハイブリッドタンパ
ク質は遠心分離により清澄化され、バッチ方法又はカラ
ム分離技術におけるアフィニティーマトリックスに加え
られる。アフィニティーマトリックスは、ウルマン、遺
伝子、第２９巻、第２７−３１頁、１９８４年（Ｕ Ｉ
Ｉｍａｎｎ、 Ｇｅｎｅ、 ２９ ： ２７ ３１（
１９８４））の操作法に従い、β−ガラクトシダーゼに
特異的なｐ−アミノフェニル−β−１）−チオガラクト
シド（ＴＰＥＧ）リガンドに結合した架橋結合アガロー
スゲル（ＡＧＲ）から形成されている。ＴＰＥＧは、ハ
イブリッドタンパク質含有ＥＢＶ免疫原の精製用に好ま
しい下記結合構造によってアガロースに付着せしめられ
ている：Ｎｙｒ−。
ＡＧＲＯＣＮＨ（ＣＨｚ）ｓ ＣＮＨＴＰＥＧＥＢＶ
免疫原の精製は、ハイブリッドタンパク質約ｌｌｌ１ｇ
〜約２０ｍｇを固定ゲル約２．５ｍｊ！に加えて実施さ
れる。ハイブリッドタンパク質はＴＰＥＧ及び結合構造
に約１２０分開眼着せしめられ、弱く結合又は会合した
タンパク質を除去するために緩衝液Ａで洗浄され、同一
緩衝液に再懸濁される。ハイブリッドタンパク質はβ−
ガラクトシダーゼ部分によりＴＰＥＧと付着するが、他
方ＥＢ■部分は正電荷結合構造と会合する。レニンは、
特異的活性約４２５単位（Ｕ）／鎖β１５ｍｇとして、
約０．５ｍＮ／約２．５ｎｌＩｌ固定ゲルの濃度で加え
られ、約３７℃で約７〜約２４時間インキュベートされ
る。所望のタンパク質は緩衝液中に解離され、遠心分離
後に上澄液から単離される。ハイブリッドタンパク質か
ら解離された所望のタンパク質は、ヒト体液中のＥＢＶ
抗体量を調べる各種診断試験において、更に精製するこ
となく抗原として使用することができる。所望のタンパ
ク質は、ワクチン又は診断試験用抗原として使用するた
めには、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）により所望のタンパク質からレニンを分離す
ることによって、更に精製される。
免疫原の精製は、ハイブリッドタンパク質約ｌｌｌ１ｇ
〜約２０ｍｇを固定ゲル約２．５ｍｊ！に加えて実施さ
れる。ハイブリッドタンパク質はＴＰＥＧ及び結合構造
に約１２０分開眼着せしめられ、弱く結合又は会合した
タンパク質を除去するために緩衝液Ａで洗浄され、同一
緩衝液に再懸濁される。ハイブリッドタンパク質はβ−
ガラクトシダーゼ部分によりＴＰＥＧと付着するが、他
方ＥＢ■部分は正電荷結合構造と会合する。レニンは、
特異的活性約４２５単位（Ｕ）／鎖β１５ｍｇとして、
約０．５ｍＮ／約２．５ｎｌＩｌ固定ゲルの濃度で加え
られ、約３７℃で約７〜約２４時間インキュベートされ
る。所望のタンパク質は緩衝液中に解離され、遠心分離
後に上澄液から単離される。ハイブリッドタンパク質か
ら解離された所望のタンパク質は、ヒト体液中のＥＢＶ
抗体量を調べる各種診断試験において、更に精製するこ
となく抗原として使用することができる。所望のタンパ
ク質は、ワクチン又は診断試験用抗原として使用するた
めには、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）により所望のタンパク質からレニンを分離す
ることによって、更に精製される。
上記遠心分離後の固体マトリックスは付着したβ−ガラ
クトシダーゼを含有している。β−ガラクトシダーゼは
ｐＨ１０の０．１ＭＭホウ酸緩衝液溶離することにより
マトリックスから除去される。
クトシダーゼを含有している。β−ガラクトシダーゼは
ｐＨ１０の０．１ＭＭホウ酸緩衝液溶離することにより
マトリックスから除去される。
マトリックスは緩衝液Ａで洗浄され、再使用される。
所望のタンパク質は、同一のマトリックスを用いたアフ
ィニティーカラム技術によっても精製される。マトリッ
クスは上記のように製造され、カラムはウルマン、遺伝
子、第２９巻、第２７−３１頁、１９８４年の方法に従
い調製される。マトリックス充填カラムは緩衝＠Ａで洗
浄され、ハイブリッドタンパク質の洗浄清澄化試料がカ
ラムに充填される。充填されるハイブリッドタンパク質
濃度はバッチ方法の場合と同様である。付着が生じた後
、溶出液が検出可能なタンパク質及びβ−ガラクトシダ
ーゼ活性を含有しなくなるまで、カラムは緩衝液Ａで洗
浄される。レニン含有新鮮緩衝液Ａは約３７℃で約７〜
約２４時間カラム内を再循環せしめられる。所望のタン
パク質はカラム溶出液から単離される。レニンはＨＰＬ
Ｃにより所望のタンパク質から分離される。カラムは、
β−ガラクトシダーゼを除去するため、ｐＨ１０の０．
１ Ｍホウ酸緩衝液で処理することにより再生され、緩
衝液Ａで洗浄が繰返される。
ィニティーカラム技術によっても精製される。マトリッ
クスは上記のように製造され、カラムはウルマン、遺伝
子、第２９巻、第２７−３１頁、１９８４年の方法に従
い調製される。マトリックス充填カラムは緩衝＠Ａで洗
浄され、ハイブリッドタンパク質の洗浄清澄化試料がカ
ラムに充填される。充填されるハイブリッドタンパク質
濃度はバッチ方法の場合と同様である。付着が生じた後
、溶出液が検出可能なタンパク質及びβ−ガラクトシダ
ーゼ活性を含有しなくなるまで、カラムは緩衝液Ａで洗
浄される。レニン含有新鮮緩衝液Ａは約３７℃で約７〜
約２４時間カラム内を再循環せしめられる。所望のタン
パク質はカラム溶出液から単離される。レニンはＨＰＬ
Ｃにより所望のタンパク質から分離される。カラムは、
β−ガラクトシダーゼを除去するため、ｐＨ１０の０．
１ Ｍホウ酸緩衝液で処理することにより再生され、緩
衝液Ａで洗浄が繰返される。
すべての操作は、他に記述のない限り、４℃で行なった
。細菌細胞ペーストは、レニン切断部位に結合し次いで
β−ガラクトシダーゼに結合したクローンハイブリット
タンパク質エプスタイン・バールウィルス−膜抗原（Ｅ
ＢＶ−ＭＡ）含有のエシェリヒア・コリ１１１５７ （
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｔｌｌｓｔ）５０
ｇを十分量の破壊用緩衝液（２００ｍＭ）リス、２５０
ｍＭＮａＣｊ！、１０ｍＭ酢酸７グネシウム、１０ｍＭ
β−メルカプトエタノール及び５％グリセロール）と混
合することにより調製し、濃度１０％Ｗ／Ｖとした。細
胞破壊の直前にフェニルメチルスルホニルフルオリドを
最終濃度２ｍＭまで加え、セリンプロテアーゼを阻害し
た。細菌の均一懸濁液を８Ｊ’ｓ＋（約５．６ｋｇ／ｃ
ｎ）、背圧１２ ｆＪｓｉ （約０．８４ ｋｇ／ ｃ
Ａ）でスタンステッド（Ｓｔａｎｓｔｅｄ）圧力セルに
１回通過させることにより破壊した。
。細菌細胞ペーストは、レニン切断部位に結合し次いで
β−ガラクトシダーゼに結合したクローンハイブリット
タンパク質エプスタイン・バールウィルス−膜抗原（Ｅ
ＢＶ−ＭＡ）含有のエシェリヒア・コリ１１１５７ （
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｔｌｌｓｔ）５０
ｇを十分量の破壊用緩衝液（２００ｍＭ）リス、２５０
ｍＭＮａＣｊ！、１０ｍＭ酢酸７グネシウム、１０ｍＭ
β−メルカプトエタノール及び５％グリセロール）と混
合することにより調製し、濃度１０％Ｗ／Ｖとした。細
胞破壊の直前にフェニルメチルスルホニルフルオリドを
最終濃度２ｍＭまで加え、セリンプロテアーゼを阻害し
た。細菌の均一懸濁液を８Ｊ’ｓ＋（約５．６ｋｇ／ｃ
ｎ）、背圧１２ ｆＪｓｉ （約０．８４ ｋｇ／ ｃ
Ａ）でスタンステッド（Ｓｔａｎｓｔｅｄ）圧力セルに
１回通過させることにより破壊した。
破壊細胞懸濁液を１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離
することにより清澄化した。上澄液（５００ＩＩＩＩｌ
）を５０％硫酸ストレプトマイシン（Ｗ／Ｗ）５５ｍｊ
２と混合し、３０分間連続的に混合して、核酸を沈降さ
せた。タンパク質に冨む上澄液を１０、ＯＯＯｘｇで６
０分間遠心分離することにより集めた。
することにより清澄化した。上澄液（５００ＩＩＩＩｌ
）を５０％硫酸ストレプトマイシン（Ｗ／Ｗ）５５ｍｊ
２と混合し、３０分間連続的に混合して、核酸を沈降さ
せた。タンパク質に冨む上澄液を１０、ＯＯＯｘｇで６
０分間遠心分離することにより集めた。
このタンパク質に富む清澄化細胞抽出物をｐＨ７，４の
２２５ｍＭＮａＣｌ！、４０ｍＭ ）リス、１０ｍ Ｍ
ＭｇＣｊ！ ｚ 、１０ ｍ Ｍβ−メルカプトエタ
ノール及び５ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸衝液Ａ）
からなる切断用緩衝液に対して透析した。タンパク質溶
液（５００ｍ７りをスペクトラボール（ＳＰ−ｅｃｔｒ
ａｐｏｒ）膜チュービングに充填し、分子量１２．００
０−１４，０００で切断し、４℃で３時間攪拌を継続し
ながら緩衝液Ａ３０容量部に対して透析した。
２２５ｍＭＮａＣｌ！、４０ｍＭ ）リス、１０ｍ Ｍ
ＭｇＣｊ！ ｚ 、１０ ｍ Ｍβ−メルカプトエタ
ノール及び５ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸衝液Ａ）
からなる切断用緩衝液に対して透析した。タンパク質溶
液（５００ｍ７りをスペクトラボール（ＳＰ−ｅｃｔｒ
ａｐｏｒ）膜チュービングに充填し、分子量１２．００
０−１４，０００で切断し、４℃で３時間攪拌を継続し
ながら緩衝液Ａ３０容量部に対して透析した。
実施例１の生成物をローリ−（Ｌｏｗｒい分析用として
タンパク質５ＩＩ１ｇ／ｌｌ１ｌの濃度に調整した。β
−ガラクトシダーゼアフィニティーマトリックスを、活
性ＣＨ−セファロース４Ｂゲル（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ） ）にｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−チ
オガラクトシド（Ｔ Ｐ Ｅ Ｇ）β−ガラクトシダー
ゼリガンドを結合させることにより製造した。水１０ｍ
ｍ！中のＴＰＥ０１ｍＭ溶液をセファロースビーズ１０
０＋＋７！と混合し、ｐ Ｈ４，７の水８ＩＩＩｌ中の
７．５ｍＭＮ−アセチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミドの添加により結合した。反応
を室温で２４時間継続し、次いでマトリックスを蒸留水
で完全に洗浄した。
タンパク質５ＩＩ１ｇ／ｌｌ１ｌの濃度に調整した。β
−ガラクトシダーゼアフィニティーマトリックスを、活
性ＣＨ−セファロース４Ｂゲル（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ） ）にｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−チ
オガラクトシド（Ｔ Ｐ Ｅ Ｇ）β−ガラクトシダー
ゼリガンドを結合させることにより製造した。水１０ｍ
ｍ！中のＴＰＥ０１ｍＭ溶液をセファロースビーズ１０
０＋＋７！と混合し、ｐ Ｈ４，７の水８ＩＩＩｌ中の
７．５ｍＭＮ−アセチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミドの添加により結合した。反応
を室温で２４時間継続し、次いでマトリックスを蒸留水
で完全に洗浄した。
ＥＢＶ−ＭＡ結合ハイブリッドタンパク質のマトリック
スへの結合は、ハイブリッドタンパク質５ｍｇを固定マ
トリックス２．５ｍｌに加えることにより実施した。ハ
イプリントタンパク質はβ−ガラクトシダーゼ−ＴＰＥ
Ｇ結合部位を介してマトリックスに結合するが、他方Ｅ
ＢＶ抗原は正電荷結合構造と会合する。すべての非結合
の又は弱く結合したハイブリッドタンパク質は、標準酵
素試験により測定されるようなβ−ガラクトシダーゼ活
性を洗液が含有しなくなるまで、緩衝Ｗｉ、Ａで連続洗
浄して除去する。
スへの結合は、ハイブリッドタンパク質５ｍｇを固定マ
トリックス２．５ｍｌに加えることにより実施した。ハ
イプリントタンパク質はβ−ガラクトシダーゼ−ＴＰＥ
Ｇ結合部位を介してマトリックスに結合するが、他方Ｅ
ＢＶ抗原は正電荷結合構造と会合する。すべての非結合
の又は弱く結合したハイブリッドタンパク質は、標準酵
素試験により測定されるようなβ−ガラクトシダーゼ活
性を洗液が含有しなくなるまで、緩衝Ｗｉ、Ａで連続洗
浄して除去する。
活性４２５ Ｕ／ ｍｌｌの精製レニンを、β−ガラク
トシダーゼからＥＢＶ−ＭＡを切断するために使用した
。レニンをハイブリッドタンパク質５ｍｇ含有マトリッ
クス２．５ｍｌにつき０．５ｍβの濃度で加えた。レニ
ン切断を水浴振盪皿中３７°Ｃで一夜行なった。
トシダーゼからＥＢＶ−ＭＡを切断するために使用した
。レニンをハイブリッドタンパク質５ｍｇ含有マトリッ
クス２．５ｍｌにつき０．５ｍβの濃度で加えた。レニ
ン切断を水浴振盪皿中３７°Ｃで一夜行なった。
ＥＢＶ−ＭＡは上澄液中に解離されたが、β−ガラクト
シダーゼはアフィニティーマトリックスに強く結合した
ままであった。ＥＢＶ−ＭＡを、レニン及び他の不純物
を結合させるモノ−Ｑ（Ｍｏｎｏ−ロ）（ＨＲ５１５）
カラム（ファルマシア）を用いて、陰イオン交換高性能
液体クロマトグラフィーによりレニンから分離した。Ｅ
ＢＶ−ＭＡレニン混合物をカラムに充填し、ｐ Ｈ７，
７の２０ｍＭトリス中０〜０．５ＭＮａ（Ｊ！のＮａＣ
７！勾配で溶離した。ＥＢＶ−ＭＡの純度は、抗ＥＢＶ
高度免疫ヒト血清を用いて、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法（ＰＡＧＥ）（レーミリ、ネーチャー、第２２
７巻、第６８０頁、１９７１年（］、ａｅｍｍｉｌｉ＋
Ｎａｔｕｒｅ２２７：６Ｂ０，１．９７１））、ゲル銀
染色法 〔モリセー、アナライティカル・バイオケミス
トリー、第１１７巻、第３０７−３１０頁、１９８１年
） （Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ、 １１７：３０７−３１
０．１９８１））及びゲル免疫プロット法〔バーネット
、アナライティカル・バイオケミストリー、第１１２巻
、第１、９５−２０３頁、１９８１年）〕により測定し
た。
シダーゼはアフィニティーマトリックスに強く結合した
ままであった。ＥＢＶ−ＭＡを、レニン及び他の不純物
を結合させるモノ−Ｑ（Ｍｏｎｏ−ロ）（ＨＲ５１５）
カラム（ファルマシア）を用いて、陰イオン交換高性能
液体クロマトグラフィーによりレニンから分離した。Ｅ
ＢＶ−ＭＡレニン混合物をカラムに充填し、ｐ Ｈ７，
７の２０ｍＭトリス中０〜０．５ＭＮａ（Ｊ！のＮａＣ
７！勾配で溶離した。ＥＢＶ−ＭＡの純度は、抗ＥＢＶ
高度免疫ヒト血清を用いて、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法（ＰＡＧＥ）（レーミリ、ネーチャー、第２２
７巻、第６８０頁、１９７１年（］、ａｅｍｍｉｌｉ＋
Ｎａｔｕｒｅ２２７：６Ｂ０，１．９７１））、ゲル銀
染色法 〔モリセー、アナライティカル・バイオケミス
トリー、第１１７巻、第３０７−３１０頁、１９８１年
） （Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ、 １１７：３０７−３１
０．１９８１））及びゲル免疫プロット法〔バーネット
、アナライティカル・バイオケミストリー、第１１２巻
、第１、９５−２０３頁、１９８１年）〕により測定し
た。
破壊清澄化細胞抽出物はβ−ガラクトシダーゼ活性２５
Ｕ／ｍｇを有し、回収可能タンパク質１００％を含有し
ていた。アフィニティーマトリックスに付着させた場合
は、特異的活性を１１、２５Ｕ／ ｍｌｌに高め、回収
可能タンパク質１．８％を含有していた。実際に、ハイ
ブリッドタンパク質の約８０％はマトリックスにイ」着
して清澄化することができ、このため収率が著しく増加
する。ＨＰＬＣ分離後（７）ＥＢＶ−ＭＡはＰＡＧＥ及
び銀染色によると単一バンドからなっている。
Ｕ／ｍｇを有し、回収可能タンパク質１００％を含有し
ていた。アフィニティーマトリックスに付着させた場合
は、特異的活性を１１、２５Ｕ／ ｍｌｌに高め、回収
可能タンパク質１．８％を含有していた。実際に、ハイ
ブリッドタンパク質の約８０％はマトリックスにイ」着
して清澄化することができ、このため収率が著しく増加
する。ＨＰＬＣ分離後（７）ＥＢＶ−ＭＡはＰＡＧＥ及
び銀染色によると単一バンドからなっている。
単一バンドは抗ＥＢＶ高度免疫ヒト血清と特異的に反応
する。
する。
アフィニティーマトリックスは、ｐ Ｈ１０の１００ｍ
Ｍホウ酸ナトリウム及び１０ｍＭβ−メルカプトエタノ
ール含有ホウ酸緩衝液で処理して再生することができる
。これによりβ−ガラクトシダーゼを解離し、最小の２
倍容量での洗浄後、マトリックスは再使用が可能となる
。
Ｍホウ酸ナトリウム及び１０ｍＭβ−メルカプトエタノ
ール含有ホウ酸緩衝液で処理して再生することができる
。これによりβ−ガラクトシダーゼを解離し、最小の２
倍容量での洗浄後、マトリックスは再使用が可能となる
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、レニン切断部位を介して所望のタンパク質に結合せ
しめられたβ−ガラクトシダーゼ部分を含有するハイブ
リッドタンパク質の精製方法であって、 ａ，β−ガラクトシダーゼ部分によるハイブリッドタン
パク質のアフィニティーマトリックスへの付着；及び ｂ、切断部位のレニン切断によるハイブリッドタンパク
質からの所望のタンパク質の解離からなることを特徴と
する方法。 ２、アフィニティーマトリックスが結合構造によりアガ
ロースに付着せしめられたｐ−アミノフェニル−β−Ｄ
−チオガラクトシドである、特許請求の範囲第１項記載
の方法。 ３、結合構造が炭素原子７個を含有している、特許請求
の範囲第２項記載の方法。 ４、結合構造が正電荷を有する、特許請求の範囲第２項
記載の方法。 ５、結合構造が次式の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ａはアガロースを表わし、Ｔはｐ−アミノ
フェニル−β−Ｄ−チオガラクトシドを表わす） である、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ６、アガロースが架橋結合アガロースゲルである、特許
請求の範囲第２項記載の方法。 ７、所望のタンパク質が陰イオン交換クロマトグラフィ
ー及び許容される溶離剤によりレニンから分離せしめら
れる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、陰イオン交換体がトリメチルアンモニウムメチルで
ある、特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、所望のタンパク質が塩勾配で溶離せしめられる、特
許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、塩が塩化ナトリウムである、特許請求の範囲第９
項記載の方法。 １１、所望のペプチドがエプスタイン・バールウィルス
−膜抗原である、特許請求の範囲第７項記載の方法。 １２、炭素原子７個の正電荷結合構造によりアガロース
に付着せしめられるｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシドリガントに結合したβ−ガラクトシダーゼ
にレニン切断部位を介して付着せしめられた所望のペプ
チドを含有する組成物。 １３、炭素原子７個の正電荷結合構造によりアガロース
に付着せしめられるｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシドリガントに結合したβ−ガラクトシダーゼ
にレニン切断部位を介して付着せしめられた特許請求の
範囲第１１項記載の所望のペプチドを含有する組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US85691286A | 1986-04-28 | 1986-04-28 | |
| US856912 | 1986-04-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62259596A true JPS62259596A (ja) | 1987-11-11 |
Family
ID=25324761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10342387A Pending JPS62259596A (ja) | 1986-04-28 | 1987-04-28 | ハイブリツドタンパク質の精製方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0244147A3 (ja) |
| JP (1) | JPS62259596A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03501261A (ja) * | 1988-07-08 | 1991-03-22 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | セルロース結合融合タンパク質 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE135403T1 (de) * | 1987-03-10 | 1996-03-15 | New England Biolabs Inc | Herstellung und reinigung eines proteins, das mit einem bindungsprotein fusioniert ist |
| US5340731A (en) * | 1988-07-08 | 1994-08-23 | University Of British Columbia | Method of preparing a B-1,4 glycan matrix containing a bound fusion protein |
| WO1991011454A1 (en) * | 1990-01-24 | 1991-08-08 | The Upjohn Company | Method of purifying recombinant polypeptides |
| US5595887A (en) * | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
| US5888775A (en) * | 1994-04-29 | 1999-03-30 | Dade International Inc | Peptide synthesis and purification by fusion to penI protein or precipitation effective portion thereof |
| CN114230689B (zh) * | 2021-12-22 | 2022-11-11 | 青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司 | 一种分离藻红蛋白的亲和树脂、制备方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
| EP0163573B1 (en) * | 1984-05-24 | 1989-09-06 | Merck & Co. Inc. | Site-specific proteolysis by renin |
-
1987
- 1987-04-22 EP EP87303499A patent/EP0244147A3/en not_active Withdrawn
- 1987-04-28 JP JP10342387A patent/JPS62259596A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03501261A (ja) * | 1988-07-08 | 1991-03-22 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | セルロース結合融合タンパク質 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0244147A3 (en) | 1989-04-05 |
| EP0244147A2 (en) | 1987-11-04 |
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