JPS62262992A - 安定化されたｎａｄ（ｐ）ｈ−依存性で可溶性の同化型硝酸還元酵素、その製法及びこれを含有する硝酸塩測定試薬 - Google Patents
安定化されたｎａｄ（ｐ）ｈ−依存性で可溶性の同化型硝酸還元酵素、その製法及びこれを含有する硝酸塩測定試薬Info
- Publication number
- JPS62262992A JPS62262992A JP62106496A JP10649687A JPS62262992A JP S62262992 A JPS62262992 A JP S62262992A JP 62106496 A JP62106496 A JP 62106496A JP 10649687 A JP10649687 A JP 10649687A JP S62262992 A JPS62262992 A JP S62262992A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- buffer
- nitrate
- precipitate
- solution
- nad
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
- C12Y107/01—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.7.1)
- C12Y107/01002—Nitrate reductase [NAD(P)H] (1.7.1.2)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
友業上の利用分野
本発明は、安定化されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−依存性で可溶
性の同化型硝酸還元酵素その製法及びこれｔ含有る、硝
酸塩測定試薬に関る、。
性の同化型硝酸還元酵素その製法及びこれｔ含有る、硝
酸塩測定試薬に関る、。
従来の技術
硝酸塩の測定は、食品化学においては元素分析的課題に
属る、。食品中の硝酸塩−宮ｉを検査る、ために適用さ
れる多数の分析法が公知でおる（例えば１ハンドプーフ
・デル・レーベンスミツテルヒエミ−（Ｈａｎｄｂｕｃ
ｈ ｄｅｒ Ｌｅｂｅｎｓ−ｍｉｔｔｅｌｃｈｅｍｉｅ
） ｎ ／ ２ ” （１９６７年）、スプリンガ−
（ａｐｒｉｎｇｅｔ ）出版参照）。しかしながら全て
の公知分析法は極めて経費がかかシかつ煩雑な実施とい
う欠点を有る、。直接的実施法は屡々敏感で無く、かつ
ほとんど特異性が低い。従って実際には、ニトレートイ
オンを先ず還元し、引続き還元生成物音よυ高い特異性
を有る、方法により測定る、ように硝酸塩−測定上行な
う。硝酸塩の化学的測定に大事なことは、先ず還元剤で
亜硝酸塩に還元すべきことである。多数の常用の還元剤
のうち硝酸塩測定にはカドミウム−還元剤の使用だけが
奏効した。
属る、。食品中の硝酸塩−宮ｉを検査る、ために適用さ
れる多数の分析法が公知でおる（例えば１ハンドプーフ
・デル・レーベンスミツテルヒエミ−（Ｈａｎｄｂｕｃ
ｈ ｄｅｒ Ｌｅｂｅｎｓ−ｍｉｔｔｅｌｃｈｅｍｉｅ
） ｎ ／ ２ ” （１９６７年）、スプリンガ−
（ａｐｒｉｎｇｅｔ ）出版参照）。しかしながら全て
の公知分析法は極めて経費がかかシかつ煩雑な実施とい
う欠点を有る、。直接的実施法は屡々敏感で無く、かつ
ほとんど特異性が低い。従って実際には、ニトレートイ
オンを先ず還元し、引続き還元生成物音よυ高い特異性
を有る、方法により測定る、ように硝酸塩−測定上行な
う。硝酸塩の化学的測定に大事なことは、先ず還元剤で
亜硝酸塩に還元すべきことである。多数の常用の還元剤
のうち硝酸塩測定にはカドミウム−還元剤の使用だけが
奏効した。
しかしながらカドミウムの使用は極めて問題であると当
業者には考えられており、それというのもカドミウムは
少量ですでに毒性でありかつ又発ガン性であるからであ
る。
業者には考えられており、それというのもカドミウムは
少量ですでに毒性でありかつ又発ガン性であるからであ
る。
既に屡々カドミウム金他の還元剤によって代見る勢力が
なされた。しかしながらこハまで過当な他の還元剤は知
られていない。従って特異的な酵素的方法に大きな関心
がある。
なされた。しかしながらこハまで過当な他の還元剤は知
られていない。従って特異的な酵素的方法に大きな関心
がある。
硝酸塩を光度測定可能な反応で変換させる５稀の酵素が
公知である。
公知である。
硝酸還元＃素（Ｎ１ｔｒａｔ−Ｒｅｄｕｋｔａｓｅ ）
（Ｅ、Ｃ。
（Ｅ、Ｃ。
１．９．６．１ ）はフェロチトクロムの存在で硝酸塩
を還元し、硝酸還元酵素（ｇ、ｃ、１．７．９９．４
） ｕ硝酸塩−変換のために還元された受容体−例えは
メチルビオロｉｆン（Ｍｅｔｈｙｌｖｉｏｌｏｇｅｎ
） ｔ−心壁とる、；史に、硝酸塩ｔ−ＮＡＤＨ、ＮＡ
ＤＰＨ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在で還元る、もう３ｍの
酵素が公知である。
を還元し、硝酸還元酵素（ｇ、ｃ、１．７．９９．４
） ｕ硝酸塩−変換のために還元された受容体−例えは
メチルビオロｉｆン（Ｍｅｔｈｙｌｖｉｏｌｏｇｅｎ
） ｔ−心壁とる、；史に、硝酸塩ｔ−ＮＡＤＨ、ＮＡ
ＤＰＨ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在で還元る、もう３ｍの
酵素が公知である。
これらの全ての酵素は文献に詳細に記載されている。約
２００の文献に種々の動物性、他物性及び微生物性起源
からの製造、積装のためのｌ要性が記載される。更に、
硝酸塩変換酵素での硝酸塩−測定を提案している２つの
刊行物がある。
２００の文献に種々の動物性、他物性及び微生物性起源
からの製造、積装のためのｌ要性が記載される。更に、
硝酸塩変換酵素での硝酸塩−測定を提案している２つの
刊行物がある。
アナリテイカル・ケミストリイ（Ａｎａｌ。
Ｃｈｅｍ、 ） ５０巻、１３１９（１９７８年）には
硝酸還元酵素を用いる硝酸塩−還元が述べられている；
勿論生成した亜硝酸塩は亜硝酸−還元酵素（Ｎ：１ｔｒ
ｉｔ−Ｒｅｄｕｋｔａｓｅ ）の使用によりｔ気化学的
に測定される。
硝酸還元酵素を用いる硝酸塩−還元が述べられている；
勿論生成した亜硝酸塩は亜硝酸−還元酵素（Ｎ：１ｔｒ
ｉｔ−Ｒｅｄｕｋｔａｓｅ ）の使用によりｔ気化学的
に測定される。
アグリカルチユラル・アンド・ビオロジカル・ケミスト
リイ（Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ４７巻
、２４２７（１９８３年）でハマノ（Ｈａｍａｎｏ ）
等は、肉−及び魚製品中の硝酸塩−測定のために硝酸−
還元酵素（１，７，９９，４） ｋ使用し、この際生成
した亜硝酸塩は光分に特異的なジアゾ化−反応で測定さ
れる。
リイ（Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ４７巻
、２４２７（１９８３年）でハマノ（Ｈａｍａｎｏ ）
等は、肉−及び魚製品中の硝酸塩−測定のために硝酸−
還元酵素（１，７，９９，４） ｋ使用し、この際生成
した亜硝酸塩は光分に特異的なジアゾ化−反応で測定さ
れる。
ＮＡＤＨ％ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在で硝酸
塩を還元る、ことができる酵素を硝酸塩測定のために使
用る、ことは従来成功していない。その理由は酵素の大
きな不安定性にあり、この場合特にｉ！１記の補酵素に
依り硝酸塩ｒ還元る、ための酵素の特性は、この酵素が
他の、直接的でなく測定可能な還元剤を依然として利用
し得るとしても、極めて不安定でちゃ、通例は数時間以
内ですでに失なわれていく。しかし特に困難な点は、こ
の酵素が亜硝酸−還元酵素−活性も有し、これが生成し
友亜硝酸塩を更に還元させ、従って生成した亜硝酸塩の
測定に依る終点測定ができないことにある。既にＺ、
Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙ−ｓｊｏｌ 、 ＢＤ ６６巻
２９０〜２９３頁（１９７２年）に、ホウレンソウの葉
からの硝酸−還元酵素を用いる硝酸塩測定が記載されて
おり、この場合酸化されたＮＡＤＨ又は生成した亜硝酸
塩が測定可能であるはすだが、亜硝酸の測定が推奨され
、ＮＡＤのそれは推奨されない。しかじなからこの方法
の追試は使用可能な結果を生じなかった。
塩を還元る、ことができる酵素を硝酸塩測定のために使
用る、ことは従来成功していない。その理由は酵素の大
きな不安定性にあり、この場合特にｉ！１記の補酵素に
依り硝酸塩ｒ還元る、ための酵素の特性は、この酵素が
他の、直接的でなく測定可能な還元剤を依然として利用
し得るとしても、極めて不安定でちゃ、通例は数時間以
内ですでに失なわれていく。しかし特に困難な点は、こ
の酵素が亜硝酸−還元酵素−活性も有し、これが生成し
友亜硝酸塩を更に還元させ、従って生成した亜硝酸塩の
測定に依る終点測定ができないことにある。既にＺ、
Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙ−ｓｊｏｌ 、 ＢＤ ６６巻
２９０〜２９３頁（１９７２年）に、ホウレンソウの葉
からの硝酸−還元酵素を用いる硝酸塩測定が記載されて
おり、この場合酸化されたＮＡＤＨ又は生成した亜硝酸
塩が測定可能であるはすだが、亜硝酸の測定が推奨され
、ＮＡＤのそれは推奨されない。しかじなからこの方法
の追試は使用可能な結果を生じなかった。
発明が解決しようとる、問題点
従って本発明の課題は、従来記載された方法の欠点及び
困難な点を回避し、かつ硝酸−還元酵素によって還元さ
れる硝酸塩の尺度としてのＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（
Ｐ）への変換の直接的測定がさ 短時間以内で隔い正Ｃで行なうことができる硝酸塩測定
法を得ることであった。史にもう１つの課題はこの方法
のための適当な酵素及び試薬を得ることであった。
困難な点を回避し、かつ硝酸−還元酵素によって還元さ
れる硝酸塩の尺度としてのＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（
Ｐ）への変換の直接的測定がさ 短時間以内で隔い正Ｃで行なうことができる硝酸塩測定
法を得ることであった。史にもう１つの課題はこの方法
のための適当な酵素及び試薬を得ることであった。
問題点全解決る、ための手段
この問題の解決は、本発明に依９安定化されたＮＡＤ（
Ｐ）Ｈ−依存性で可溶性の同化型硝酸還元酵素の使用に
依り成功し、この酵素は、ドデシの ル硫酸ナトリウムの存在ｆｆｔ気泳動の際の約９０００
０Ｄの分子量及び３５°Ｃで３週間後の６０係よシ多い
残余活性全特徴とし、がっ、これは、トリス−酒石酸緩
衝液ｐＨ７〜８．５中の細砕化出発物質の懸濁液を製造
し、これに硝酸−還元酵素活性の１０〜２０％が生成沈
殿に移行る、よりなＩｏで可溶性のポリエチレンイミン
を添加し、沈殿を分離しかつ上澄液を常用の生化学的分
別法の後に前記の崩壊緩衝液（Ａｕｆｓｃｈｌｕβｐｕ
ｆｆｅｒｓ ）中で後処理し、得られる酵素溶液を透析
しかつ両性イオン緩衝液中で凍結乾燥る、ことによって
得られる。
Ｐ）Ｈ−依存性で可溶性の同化型硝酸還元酵素の使用に
依り成功し、この酵素は、ドデシの ル硫酸ナトリウムの存在ｆｆｔ気泳動の際の約９０００
０Ｄの分子量及び３５°Ｃで３週間後の６０係よシ多い
残余活性全特徴とし、がっ、これは、トリス−酒石酸緩
衝液ｐＨ７〜８．５中の細砕化出発物質の懸濁液を製造
し、これに硝酸−還元酵素活性の１０〜２０％が生成沈
殿に移行る、よりなＩｏで可溶性のポリエチレンイミン
を添加し、沈殿を分離しかつ上澄液を常用の生化学的分
別法の後に前記の崩壊緩衝液（Ａｕｆｓｃｈｌｕβｐｕ
ｆｆｅｒｓ ）中で後処理し、得られる酵素溶液を透析
しかつ両性イオン緩衝液中で凍結乾燥る、ことによって
得られる。
本発明によシ使用される酵素Ｅ、Ｃ，１，６，６，２は
補酵素としてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈでその還元酵素−活性の
５Ａ際に改良された安定性を有し、かつ適当な緩衝液の
存在で凍結乾燥状態はかりでなく水溶液に再構成された
状態でも、障害性の亜硝酸−還元酵素作用が生じること
なく、硝酸塩測定に使用る、ことができる。
補酵素としてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈでその還元酵素−活性の
５Ａ際に改良された安定性を有し、かつ適当な緩衝液の
存在で凍結乾燥状態はかりでなく水溶液に再構成された
状態でも、障害性の亜硝酸−還元酵素作用が生じること
なく、硝酸塩測定に使用る、ことができる。
生物原料からの本発明による安定化されたＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ−依存性で可溶性の同化型硝酸還元酵素製剤の製造は
、細砕、中性〜弱アルカリ性媒体中の崩壊及び錯化剤及
びメルカプタンの存在での分別により行なわれ、これは
、トリス−酒石酸緩衝液（−７〜８．５）中の細砕出発
物質の懸濁液を製造し、これに硝酸−還元酵素活性の１
０〜２０％が生成る、沈殿に移行る、ような倉で可俗性
の〆リエチレンイミンを添加し、沈殿を分離しかつ上演
液を常用の生化学的分別法の後に前記の分解緩衝液中で
後処理し、得られる＃素浴液を透析しかつ両性イオン緩
衝液中で凍結乾燥る、ことよりなる。
Ｈ−依存性で可溶性の同化型硝酸還元酵素製剤の製造は
、細砕、中性〜弱アルカリ性媒体中の崩壊及び錯化剤及
びメルカプタンの存在での分別により行なわれ、これは
、トリス−酒石酸緩衝液（−７〜８．５）中の細砕出発
物質の懸濁液を製造し、これに硝酸−還元酵素活性の１
０〜２０％が生成る、沈殿に移行る、ような倉で可俗性
の〆リエチレンイミンを添加し、沈殿を分離しかつ上演
液を常用の生化学的分別法の後に前記の分解緩衝液中で
後処理し、得られる＃素浴液を透析しかつ両性イオン緩
衝液中で凍結乾燥る、ことよりなる。
所望の特性を得るためには、特殊な緩衝液の使用、俗解
相での酵素の定量的保留を生じさせない条件下での？リ
エチレンイミン分別、並びに得られる、富化された、安
定化酵素の両性イオンＭ！債液中での凍結乾燥がｌ要で
ある。
相での酵素の定量的保留を生じさせない条件下での？リ
エチレンイミン分別、並びに得られる、富化された、安
定化酵素の両性イオンＭ！債液中での凍結乾燥がｌ要で
ある。
トリス−噛石酸會基礎とる、崩壊緩衝液は一１直７〜８
．５及び有利な濃度１０〜１００ ミＩＪモル／を含有
る、。ｐ）ｉ（ｍ７．２〜８．０ ′ｔ−有る、６０〜
７０ミリモルのトリス−酒石酸緩衝液准を有利に使用る
、。出発物質として、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−依存性の同化型
硝酸−還元酵素を含有る、自体公知の生物原料上使用る
、。糸状薗、特にクロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
Ｎｉｇｅｒ ）から有利に出発る、。
．５及び有利な濃度１０〜１００ ミＩＪモル／を含有
る、。ｐ）ｉ（ｍ７．２〜８．０ ′ｔ−有る、６０〜
７０ミリモルのトリス−酒石酸緩衝液准を有利に使用る
、。出発物質として、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−依存性の同化型
硝酸−還元酵素を含有る、自体公知の生物原料上使用る
、。糸状薗、特にクロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
Ｎｉｇｅｒ ）から有利に出発る、。
アスペルギルス・ｓｐ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ、 ＤＳＭ１７２９）又はアスペルギルス・ニドウラ
ンス（Ａｓｐｅｒｇｊｌｌｕ６ Ｎ１ｄｕｌａｎｓ ＃
ＤＳＭ ６３３５８ ）は出発ｖｌＪＩｘとして特に
有利である。
ｐ、 ＤＳＭ１７２９）又はアスペルギルス・ニドウラ
ンス（Ａｓｐｅｒｇｊｌｌｕ６ Ｎ１ｄｕｌａｎｓ ＃
ＤＳＭ ６３３５８ ）は出発ｖｌＪＩｘとして特に
有利である。
使用る、緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を殊に添加し、こ
の場合当業者に公知のプロテアーゼ阻害剤を使用る、こ
とができる。プロテアーゼ阻害剤としてベンズアミジン
又は／及びＰＭＳＦ七有利に使用る、。史に緩衝液に殊
に糖又は糖アルコールを添加し、この場合ｌａ度は２０
％（Ｇ／Ｖ）までであって良い。糖として蔗糖及び糖ア
ルコールとしてグリセリンを有利に使用る、が、他の抛
、例えはマンノース等、又は糖アルコール、例えはへキ
シット、ペンチット等全使用る、こともできる。
の場合当業者に公知のプロテアーゼ阻害剤を使用る、こ
とができる。プロテアーゼ阻害剤としてベンズアミジン
又は／及びＰＭＳＦ七有利に使用る、。史に緩衝液に殊
に糖又は糖アルコールを添加し、この場合ｌａ度は２０
％（Ｇ／Ｖ）までであって良い。糖として蔗糖及び糖ア
ルコールとしてグリセリンを有利に使用る、が、他の抛
、例えはマンノース等、又は糖アルコール、例えはへキ
シット、ペンチット等全使用る、こともできる。
酵素の精製の場合には、常法で錯化剤、例えはＥＤＴＡ
及びメルカプタン、例えはグルタチオン又はメルカプト
エタノールの存在で作条る、。
及びメルカプタン、例えはグルタチオン又はメルカプト
エタノールの存在で作条る、。
ＦＡＤ （Ｄ添加も有利であると実証された。
常用の生化学的分別法、例えは％Ｆｐｍアンモニウムー
分別法、又換体−クロマトグラフイー又は／及び分子−
一分別法による補装のためにこれ自体勿任意の１沃で使
用る、ことがでさる・しかしこの場合、常に前記のよう
な崩謙緩憤赦の存在で作条る、ことが２に要である。殊
に、なお少ｔの硝酸還元酵素活性が浴叡中に残貿る、、
すなわち全ての酵素活性が９．撲体に粘合式れないよう
な倉の、弱アルカリ性の陰イオン又換体？！−ポリエチ
レンイオン沈殿の上澄液に添加し、次いで交換体をイオ
ン濃度の上昇により俗離る、。過当な弱アルカリ性の陰
イオン交換体は例えば適当な支持材料、例えはアガロー
ス、セルロース等に結合された、ジエチルアミノエタノ
ール−、ｉ！に有る、ものである。
分別法、又換体−クロマトグラフイー又は／及び分子−
一分別法による補装のためにこれ自体勿任意の１沃で使
用る、ことがでさる・しかしこの場合、常に前記のよう
な崩謙緩憤赦の存在で作条る、ことが２に要である。殊
に、なお少ｔの硝酸還元酵素活性が浴叡中に残貿る、、
すなわち全ての酵素活性が９．撲体に粘合式れないよう
な倉の、弱アルカリ性の陰イオン又換体？！−ポリエチ
レンイオン沈殿の上澄液に添加し、次いで交換体をイオ
ン濃度の上昇により俗離る、。過当な弱アルカリ性の陰
イオン交換体は例えば適当な支持材料、例えはアガロー
ス、セルロース等に結合された、ジエチルアミノエタノ
ール−、ｉ！に有る、ものである。
クロマトグラフィーによる富化のために特に芳香族で置
換された、網状化アガロースが適当であると実証され、
従って本発明の範囲ではこの極の富化段階が有利である
。フェニルセファロースを介る、積装が特に有利でおる
。
換された、網状化アガロースが適当であると実証され、
従って本発明の範囲ではこの極の富化段階が有利である
。フェニルセファロースを介る、積装が特に有利でおる
。
更に不純物の除去のためには、陰イオン交換体処理又は
／及びクロマトグラフィーの前又は後に酵素に＋＃Ｌ酸
アンモニウムの絡加により沈殿させ、次いでそれ以降の
処理のため沈殿を再び崩墓緩＠液に俗解る、ことが有利
である。
／及びクロマトグラフィーの前又は後に酵素に＋＃Ｌ酸
アンモニウムの絡加により沈殿させ、次いでそれ以降の
処理のため沈殿を再び崩墓緩＠液に俗解る、ことが有利
である。
本発明による＃累の収得のために使用る、ことができる
他の富化段階は、チトクロム含有アガロースデルでの例
えはアフイニテイクロマトグラフイであり、例えは馬の
心；減からのチトクロムＣｔセファロースＣＬ６ＢＲ１
色配位子、例えはブルー−セファロース又はＦＡＤ−セ
ファロースに結合した。しかしながらフェニルセファロ
ースでの精製が特に有利である。
他の富化段階は、チトクロム含有アガロースデルでの例
えはアフイニテイクロマトグラフイであり、例えは馬の
心；減からのチトクロムＣｔセファロースＣＬ６ＢＲ１
色配位子、例えはブルー−セファロース又はＦＡＤ−セ
ファロースに結合した。しかしながらフェニルセファロ
ースでの精製が特に有利である。
本発明の方法に有利に使用る、糸状菌からの酵素は目お
状態で約２０００００の分子輩を有し、ＦＡＤ及びモリ
ブデンを有し、かつ硝酸塩に対る、ＫＭ約３．２ Ｘ
１０−’ Ｍ’に有る、。分子賃の測定はｒル濾過によ
シ行なわれる。
状態で約２０００００の分子輩を有し、ＦＡＤ及びモリ
ブデンを有し、かつ硝酸塩に対る、ＫＭ約３．２ Ｘ
１０−’ Ｍ’に有る、。分子賃の測定はｒル濾過によ
シ行なわれる。
両性イオン緩＠液としては本発明の範囲ではＣ）ＯＯＤ
−緩衝液が有利である。ＧＯＯＤ−緩衝液としては再び
ＨＩｌｊＰＥＳ−緩衝液が特に有利である。
−緩衝液が有利である。ＧＯＯＤ−緩衝液としては再び
ＨＩｌｊＰＥＳ−緩衝液が特に有利である。
凍結乾燥の実施のために酵素を１例えは（ｉｉｌＣ酸ア
ンモニウム添加により沈殿させ、次いで両性イオン緩衝
液に入れるか、又は崩壊緩衝徹中の酵素の爵液を両性イ
オン緩衝液に対して透析る、。
ンモニウム添加により沈殿させ、次いで両性イオン緩衝
液に入れるか、又は崩壊緩衝徹中の酵素の爵液を両性イ
オン緩衝液に対して透析る、。
両性イオン緩＠液は有利に０．０１〜０．２モルの纜度
で、特に有利に０．０２〜０．１七ル濃度で使用る、。
で、特に有利に０．０２〜０．１七ル濃度で使用る、。
′これは有利に少ｌ°の錯化剤、例えばｇＤＴＡ Ｏ−
１”’−５０ｍＭ ｓ少量のＦＡＤ 、特に１〜６０μ
Ｍ及び有利に０．５〜１ＱｍＭの濃度のスル７ヒドリル
ー化合物會含有し、かつ適当な塩基、例えは苛性ソーダ
溶液で一値６．５〜９、殊に７〜８に調整る、。
１”’−５０ｍＭ ｓ少量のＦＡＤ 、特に１〜６０μ
Ｍ及び有利に０．５〜１ＱｍＭの濃度のスル７ヒドリル
ー化合物會含有し、かつ適当な塩基、例えは苛性ソーダ
溶液で一値６．５〜９、殊に７〜８に調整る、。
本発明による酵素は一最適値約７．５を有し、基質特異
性は硝酸塩に対して１００係、亜硝酸塩に対して０．１
２％、ＮＡＤ／Ｐ／Ｈに対して１００係及びＮＡＤＨに
対して１３％である。
性は硝酸塩に対して１００係、亜硝酸塩に対して０．１
２％、ＮＡＤ／Ｐ／Ｈに対して１００係及びＮＡＤＨに
対して１３％である。
阻害剤は１０−’Ｍ以上における亜硝酸塩（生＆物阻吾
）、Ｍｎ”、Ｆｅ”、Ｃｕ”、Ｆｅ”（ＥＤＴＡの不在
で）、ＣＮ−及びアジドである。
）、Ｍｎ”、Ｆｅ”、Ｃｕ”、Ｆｅ”（ＥＤＴＡの不在
で）、ＣＮ−及びアジドである。
硝酸塩測定のために使用る、ために、凍結乾燥状態で存
在しかつ例えは評しく ｉｉ＋配し′ｆｃような両性イ
オン緩衝液を含有る、本発明による硝酸−還元酵素ｔ％
−値６．５〜９七Ｍる、窒素複素環緩備敵中に浴解し、
従って再構成状態では両社イオン緩衝液並びに窒素複素
環緩衝ｇ、勿含有る、。
在しかつ例えは評しく ｉｉ＋配し′ｆｃような両性イ
オン緩衝液を含有る、本発明による硝酸−還元酵素ｔ％
−値６．５〜９七Ｍる、窒素複素環緩備敵中に浴解し、
従って再構成状態では両社イオン緩衝液並びに窒素複素
環緩衝ｇ、勿含有る、。
従って俗解形の本発明による硝酸塩測定用試薬は、前に
定義したような硝酸−還元酵素、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、両性
イオン緩衝液−７〜９及び窒素複素環縫Ｙ＃ ’Ｑ ｐ
Ｈ６，５〜９の含量を特徴とる、。
定義したような硝酸−還元酵素、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、両性
イオン緩衝液−７〜９及び窒素複素環縫Ｙ＃ ’Ｑ ｐ
Ｈ６，５〜９の含量を特徴とる、。
硝酸塩測定の実施のために、単に再構成された試薬を硝
酸塩富有の試料に添加し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化全還元
された補酵素の減少又は酸化された補酵素の増加の測定
によシ測定る、。窒累複素塊緩衝液としては、イミ、ダ
ゾール緩衝液、ぎラゾール緩衝液又はピリジン緩ｍｍが
有利であシ、この場合イミダゾール緩衝液が特に有利で
ある。
酸塩富有の試料に添加し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化全還元
された補酵素の減少又は酸化された補酵素の増加の測定
によシ測定る、。窒累複素塊緩衝液としては、イミ、ダ
ゾール緩衝液、ぎラゾール緩衝液又はピリジン緩ｍｍが
有利であシ、この場合イミダゾール緩衝液が特に有利で
ある。
有利なＰＨｆｌ！Ｌは７．０〜７．８であり、かつ再構
成浴性試桑中の有利な緩衝液製置は２０〜５０ミリモル
／ｌである。
成浴性試桑中の有利な緩衝液製置は２０〜５０ミリモル
／ｌである。
本発明による試薬はその他の成分として殊にスーパーオ
キシドジスムターゼ（ＳＯＤ ） を有利に１０〜１０
００単位／溶解試薬継の童で含有る、。丈に殊に崩墓緩
爾准のために前記した若干の又は全てのｔｉ加物をそこ
に記載した甘で含有る、。
キシドジスムターゼ（ＳＯＤ ） を有利に１０〜１０
００単位／溶解試薬継の童で含有る、。丈に殊に崩墓緩
爾准のために前記した若干の又は全てのｔｉ加物をそこ
に記載した甘で含有る、。
実施例
本発明を次の実施例につき詳説る、二
側 １
Ａ）崩壊
アスペルギルスｓｐ、 ＤＳＭ １７２９の濾別した生
＠貨（Ｂｊ、ｏｍａｓｓ ） ９ ｋｇ ｋ、ＥＤＴＡ
５ ｍＭ 、 ＦＡ−Ｄ５μＭ１ メルカプトエタノ
ール２ｍＭｔ−含有る、０、０５ Ｍ ）リス／酒石酸
緩衝准（ｐＨ７．５ ）よシなる氷冷緩衝液５０を中に
入れる。懸濁液を均質化し、高圧分散（６００バール）
に依り崩壊る、。崩壊生物量に、グリセリン１０％、Ｒ
ｖｌＳＦ１０μ＆／液体を及びベンズアミシン１５μｇ
／液体ｔに添加し、−値ｔ−１Ｍトリスー塩基で７．５
に調整る、。
＠貨（Ｂｊ、ｏｍａｓｓ ） ９ ｋｇ ｋ、ＥＤＴＡ
５ ｍＭ 、 ＦＡ−Ｄ５μＭ１ メルカプトエタノ
ール２ｍＭｔ−含有る、０、０５ Ｍ ）リス／酒石酸
緩衝准（ｐＨ７．５ ）よシなる氷冷緩衝液５０を中に
入れる。懸濁液を均質化し、高圧分散（６００バール）
に依り崩壊る、。崩壊生物量に、グリセリン１０％、Ｒ
ｖｌＳＦ１０μ＆／液体を及びベンズアミシン１５μｇ
／液体ｔに添加し、−値ｔ−１Ｍトリスー塩基で７．５
に調整る、。
容ｆｔニア０ｔ
ＳＵ活性： ７５ ＫＵ
ＳＡ約０．１２０／〜
Ｂ）ボリミンーｐ−分離
Ａ工程からの液体に、撹拌下で予備試験（１％のボリミ
ンＰ−醗＆ｐ８７．０そのっど４％、６係、８係、１０
％を用いて〕後に、活性の８５係が上澄液中に残留る、
ような量のボリミンＰを加える。１５分間の攪拌後に沈
殿を捨て、濾液に液体１を当りＰＭＳＦ ７ ｍ９及び
ベンズアミジン１５ｒｎ９’を加、ｔル。
ンＰ−醗＆ｐ８７．０そのっど４％、６係、８係、１０
％を用いて〕後に、活性の８５係が上澄液中に残留る、
ような量のボリミンＰを加える。１５分間の攪拌後に沈
殿を捨て、濾液に液体１を当りＰＭＳＦ ７ ｍ９及び
ベンズアミジン１５ｒｎ９’を加、ｔル。
容ｉｔニア０ｔ
ＳＵ活性： ７０ ＫＵ
Ｃ） ＤＥＡＥ−セファデックス−パッチＢ工程の濾
液に予備試験（２％、３％、４％）後に、活性の１０％
以上が上澄液中に残留る、ような量のＤＥＡＥ−セファ
デックスを混入攪拌る、。父換体ｔ−ａ別し、ｇＤ’ｒ
Ａ ５ ｍＭ ％ＦＡＤ ５７４Ｍ及びメルカプトエタ
ノール２ｍＭ＋含有ｆるトリス／酒石酸−緩衝液（ｐＨ
７．５）３ｔで洗浄る、。俗離は洗浄緩衝液にＮａＣＬ
Ｑ、５ Ｍの添加によシ行なう（合計３Ｘ３ｔで）。
液に予備試験（２％、３％、４％）後に、活性の１０％
以上が上澄液中に残留る、ような量のＤＥＡＥ−セファ
デックスを混入攪拌る、。父換体ｔ−ａ別し、ｇＤ’ｒ
Ａ ５ ｍＭ ％ＦＡＤ ５７４Ｍ及びメルカプトエタ
ノール２ｍＭ＋含有ｆるトリス／酒石酸−緩衝液（ｐＨ
７．５）３ｔで洗浄る、。俗離は洗浄緩衝液にＮａＣＬ
Ｑ、５ Ｍの添加によシ行なう（合計３Ｘ３ｔで）。
溶離物を一緒にし、１を当りＰＭＳＦ ７１１９及びベ
ンズアミジン１５１ｎ９’？加えかつ冷却放置る、。
ンズアミジン１５１ｎ９’？加えかつ冷却放置る、。
容量：約９１ ８Ｕ活性： ３５ ＫＵＤ） ｆｔＬ
酸アンモニウム−沈殿 り工程の溶離物に予備試験後（２，０Ｍ、 ２．２Ｍ、
２．４Ｍ）に固体の硫酸アンモニウム全１活性の５％以
下が上澄液に残留る、まで加える。
酸アンモニウム−沈殿 り工程の溶離物に予備試験後（２，０Ｍ、 ２．２Ｍ、
２．４Ｍ）に固体の硫酸アンモニウム全１活性の５％以
下が上澄液に残留る、まで加える。
沈殿を遠心分離し、澄明（ｂｌａｎ’ｋ ）な上澄液を
捨てる。
捨てる。
Ｅ）フェニルセファロース−クロマトグラフィＤ工程の
Ａｓ−沈殿に、ＥＤＴＡ ５ ｍＭ 、 ＦＡＤ ５Ｍ
Ｍ、メルカプトエタノール２ｍＭ、グリセリン１０％ｖ
／ｖ及び硫酸アンモニウムＩＭｔ−含有る、トリス／酒
石酸緩衝液（０，０５Ｍ ） （ｐ８７．５）１ｔ′に
入れ、１を当、り ＰＭＳＦ ７Ｉｎｇ及びベンズアミ
ジン１５Ｍ９ｔ−加え、場合による濁りを遠心分離で除
去る、。
Ａｓ−沈殿に、ＥＤＴＡ ５ ｍＭ 、 ＦＡＤ ５Ｍ
Ｍ、メルカプトエタノール２ｍＭ、グリセリン１０％ｖ
／ｖ及び硫酸アンモニウムＩＭｔ−含有る、トリス／酒
石酸緩衝液（０，０５Ｍ ） （ｐ８７．５）１ｔ′に
入れ、１を当、り ＰＭＳＦ ７Ｉｎｇ及びベンズアミ
ジン１５Ｍ９ｔ−加え、場合による濁りを遠心分離で除
去る、。
容量：１．４ｔ
ＳＵ活性： ４５ ＫＵ
ＳＡ１．７Ｕ／ＩＩＩｇ
酵素浴液上フェニルセファロースーカラム２を上で展開
させる（ ＥＤＴＡ ５ ｍＭ ％ＦＡＤ ＡＭ 、メ
ルカプトエタノール２ｍＭ、グリセリン１０％（ｖ／ｖ
）及び硫酸アンモニウム１冨ｔ−含有し、トリス／酒
石酸緩衝液（ｐ８７．５ ） ０．０５ Ｍで平衡させ
たカラム１０Ｘ２８ｃＩｎ）。洗浄を前記の緩衝液３ｔ
で行なう。
させる（ ＥＤＴＡ ５ ｍＭ ％ＦＡＤ ＡＭ 、メ
ルカプトエタノール２ｍＭ、グリセリン１０％（ｖ／ｖ
）及び硫酸アンモニウム１冨ｔ−含有し、トリス／酒
石酸緩衝液（ｐ８７．５ ） ０．０５ Ｍで平衡させ
たカラム１０Ｘ２８ｃＩｎ）。洗浄を前記の緩衝液３ｔ
で行なう。
次のものよりなる勾配溶液：
Ａ：洗浄緩衝液と同様であるが、硫酸アンモニウム０．
５ Ｍ ｋ含有る、緩衝液２１゜Ｂ：洗浄緩衝液と同様
であるが、＆ｔＬｒＨアンモニウム５ ｍＭ ’に含有
る、緩衝液２１゜で俗離させる。
５ Ｍ ｋ含有る、緩衝液２１゜Ｂ：洗浄緩衝液と同様
であるが、＆ｔＬｒＨアンモニウム５ ｍＭ ’に含有
る、緩衝液２１゜で俗離させる。
５Ｕ／αよりも大きい活性を有る、溶離物を一緒にし、
１を当りＰＭＳＦ ７１Ｋｌ及びベンズアミジン１５■
を混合る、。
１を当りＰＭＳＦ ７１Ｋｌ及びベンズアミジン１５■
を混合る、。
容量： ２．５１
ＳＵ活！：： ３６ ＫＵ
ＳＡ４Ｕ／■
Ｆ）硫酸アンモニウム−濃縮及び透析
Ｅ工程からの浴陥物を固体の硫酸アンモニウムで２．４
Ｍ １で沈殿させ、遠心分離し、澄明な上澄液を捨て
る。沈殿を、ＥＤＴＡ ５ ｍＭ％ＦＡＤ ５ＭＭ１
メルカプトエタノール２ｍＭ及びグリセリン１０％を含
有る、トリス／酒石酸緩衝液（ＰＨ１，５） ０．０５
Ｍ （２５ＯＮ）中に入れ、１を当りＰＭＢＦ ７１
ｎ９及びベンズアミジン１５■を混合る、。
Ｍ １で沈殿させ、遠心分離し、澄明な上澄液を捨て
る。沈殿を、ＥＤＴＡ ５ ｍＭ％ＦＡＤ ５ＭＭ１
メルカプトエタノール２ｍＭ及びグリセリン１０％を含
有る、トリス／酒石酸緩衝液（ＰＨ１，５） ０．０５
Ｍ （２５ＯＮ）中に入れ、１を当りＰＭＢＦ ７１
ｎ９及びベンズアミジン１５■を混合る、。
Ｇ）透析
Ｆ工程からの溶液を、ｇＤＴＡ ５ ｍＭ 、 ＦＡＤ
５ＭＭ１ メルカプトエタノール２ ｍＭ ｋ含有る
、０、０５ Ｍ ＨＥＰＥ８緩衝液ｐＨ７，５（Ｉ
Ｎ ＮａＯＨでＶ＠整る、）５Ｘ５Ｌに対して透析る
、。
５ＭＭ１ メルカプトエタノール２ ｍＭ ｋ含有る
、０、０５ Ｍ ＨＥＰＥ８緩衝液ｐＨ７，５（Ｉ
Ｎ ＮａＯＨでＶ＠整る、）５Ｘ５Ｌに対して透析る
、。
透析物を透析緩＠液で６０Ｕ／ｒｕに希釈し、ＦＡＤ
９５ ＩＭ及びＧ８Ｈ２ｍＭ ｆ加え、酵素ｍａｉＩＩ
Ｌｔ轟クフィコル８り１ｎｇ’に混合る、。ＩＭ）リス
−塩基で一値を７．５に調整し、諸過して細菌を少なく
し、凍結乾燥る、。
９５ ＩＭ及びＧ８Ｈ２ｍＭ ｆ加え、酵素ｍａｉＩＩ
Ｌｔ轟クフィコル８り１ｎｇ’に混合る、。ＩＭ）リス
−塩基で一値を７．５に調整し、諸過して細菌を少なく
し、凍結乾燥る、。
収ｉａ−：ｉ結乾燥物約５０ｇ
５Ｕ活！：２５ＫＵ−出発の３０％
（蛋白’Ｊ［１，９）
活性：０．５Ｕ／凍結乾燥物呼
比活性：１０Ｕ／蛋白質〜
異質活性： ＮＡＤＰＨ−酸化酵素０．７％ＮＡＤＰＨ
−依存性ＡＤＨ０，８係 亜硝酸還元酵素０．２％ 貯＊ニー２０°Ｃ 例 ２ 硝酸塩測定 試験条件： 波長： （Ｈｇ） ３３５ ｎｍ、 （Ｈｇ） ３３
４ ｎｍ。
−依存性ＡＤＨ０，８係 亜硝酸還元酵素０．２％ 貯＊ニー２０°Ｃ 例 ２ 硝酸塩測定 試験条件： 波長： （Ｈｇ） ３３５ ｎｍ、 （Ｈｇ） ３３
４ ｎｍ。
３３９ ｎｍ ；層厚１ ｃｍ ；試験ｆ２．７５ｄ；
濾度：２０〜２５°Ｃ；空気に対して測定。
濾度：２０〜２５°Ｃ；空気に対して測定。
測定：
混合；約６分間室温で放置；Ｅｌの測定試料及びブラン
ク値の吸光度差（Ｅｌ −Ｅ２ ）を計算る、。
ク値の吸光度差（Ｅｌ −Ｅ２ ）を計算る、。
ΔＥ（硝酸塩） ＝ （ＥＩ Ｅ２ ） （Ｅ
ｘ試料 −Ｅ２）ブランク値 計算 硝酸塩について： Ｃ−試料溶液中の硝酸塩のＩ！ｋＷ＜９／１）Ｖ−試験
１ｔ（ｍ）（この場合：２．７５Ｉｕ）ＭＧ−分子ｆ（
この場合−硝酸塩−６２，０００Ｆ１モル） ΔＥ−吸光度、前記参照 を−次における吸光係数： ６ろ４ ” （Ｔ（ｇ）−６−１８１Ｘ ｍｍ０
ｌ−１Ｋ而−１３３９ｒｌｍ ＝ ６−３ １
Ｘ ｍｍｏｌ−１ＸｃＩｒＬ−１３３５ｎｍ （Ｈｇ）
−３，５１Ｘ ｍｍｏｌ−１ＸｃＩｎ−”ｄ−キュベ
ツトの層厚（この場合： １ ａｎ ）Ｖ−試料容！（
この場合： ０．０５Ｎ）〔硝酸塩ｙ／試料＃叡ｔ〕 例 ６ 硝酸塩測定 試験条件： 波長： （Ｈｇ） ３３５ ｎｍ −（Ｈｇ） ３３４
ｎｍ ｓ ３３９ｎｍ；層厚１ ａｎ ；試験量２．
７７財：温度：２０〜２５°Ｃ；空気に対して測定。
ｘ試料 −Ｅ２）ブランク値 計算 硝酸塩について： Ｃ−試料溶液中の硝酸塩のＩ！ｋＷ＜９／１）Ｖ−試験
１ｔ（ｍ）（この場合：２．７５Ｉｕ）ＭＧ−分子ｆ（
この場合−硝酸塩−６２，０００Ｆ１モル） ΔＥ−吸光度、前記参照 を−次における吸光係数： ６ろ４ ” （Ｔ（ｇ）−６−１８１Ｘ ｍｍ０
ｌ−１Ｋ而−１３３９ｒｌｍ ＝ ６−３ １
Ｘ ｍｍｏｌ−１ＸｃＩｒＬ−１３３５ｎｍ （Ｈｇ）
−３，５１Ｘ ｍｍｏｌ−１ＸｃＩｎ−”ｄ−キュベ
ツトの層厚（この場合： １ ａｎ ）Ｖ−試料容！（
この場合： ０．０５Ｎ）〔硝酸塩ｙ／試料＃叡ｔ〕 例 ６ 硝酸塩測定 試験条件： 波長： （Ｈｇ） ３３５ ｎｍ −（Ｈｇ） ３３４
ｎｍ ｓ ３３９ｎｍ；層厚１ ａｎ ；試験量２．
７７財：温度：２０〜２５°Ｃ；空気に対して測定。
測定
混合；約６分間室温で放置；Ｅｌの測定。
混合；約３０〜４０分間室温で放置；Ｅ２測定。
試料及びブランク値の吸光反差（ＥＩＥ２）を計算る、
。
。
７Ｅ（硝酸塩どけＩ Ｅ２）試料−（ＢＩＢ２）ブラン
ク値計算 硝酸塩について： Ｃ−試料＃４液中の硝酸塩の製置（１１／ｌ ）Ｖ−試
験量（Ｍ）（この場合： ２．７７紅）ＭＧ−分子量（
この場合：硝は塩−６２，００、＠１モル） ΔＥ−吸光度差、前記参照 １−次におけるＮＡＤＰＨの吸光係数：３３４ ｎｍ
（Ｈｇ） ＝ ６−１８ １ ｘ ｍｍｏｌ−１Ｘ３−
↓３３９ ｎｍ ＝ ６．３ １Ｘ ｍｍｏｌ−
ＩＸｃｒＩＬ″″１３３５ ｎｍ （Ｈｇ） −３−５
１Ｘ ｍｍｏｌ−”Ｘ３−１ｄ−キュベツトの層厚（こ
の場合： １ ａｎ ）■＝試料容１（この場合： ０
．０５成）２．７７ ｘ ６２．００ ｘ １ｇ
３．４３５〔硝酸塩ｇ／試料溶液ｔ〕
ク値計算 硝酸塩について： Ｃ−試料＃４液中の硝酸塩の製置（１１／ｌ ）Ｖ−試
験量（Ｍ）（この場合： ２．７７紅）ＭＧ−分子量（
この場合：硝は塩−６２，００、＠１モル） ΔＥ−吸光度差、前記参照 １−次におけるＮＡＤＰＨの吸光係数：３３４ ｎｍ
（Ｈｇ） ＝ ６−１８ １ ｘ ｍｍｏｌ−１Ｘ３−
↓３３９ ｎｍ ＝ ６．３ １Ｘ ｍｍｏｌ−
ＩＸｃｒＩＬ″″１３３５ ｎｍ （Ｈｇ） −３−５
１Ｘ ｍｍｏｌ−”Ｘ３−１ｄ−キュベツトの層厚（こ
の場合： １ ａｎ ）■＝試料容１（この場合： ０
．０５成）２．７７ ｘ ６２．００ ｘ １ｇ
３．４３５〔硝酸塩ｇ／試料溶液ｔ〕
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、トリス−酒石酸緩衝液（ｐＨ７〜８．５）中の細砕
した出発物質の懸濁液を製造し、これに可溶性のポリエ
チレンイミンを、硝酸還元酵素活性の１０〜２０％が生
成する沈殿に移行するような量で添加し、この沈殿を分
離し、かつ上澄液を常用の生化学的分別法の後に前記の
崩壊緩衝液中で後処理し、得られる酵素溶液を透析し、
かつ両性イオン緩衝液中で凍結乾燥させることにより得
られ、ドデシル硫酸ナトリウムの存在での電気泳動で約
９００００Ｄの分子量及び３５℃で３週間後に６０％よ
りも多い残余活性を特徴とする安定化されたＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ−依存性で、可溶性の同化型硝酸還元酵素。 ２、ドデシル硫酸ナトリウムの存在での電気泳動で約９
００００Ｄの分子量及び３５℃で３週間後に６０％より
も多い残余活性を有する安定化されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−
依存性で可溶性の同化型硝酸還元酵素を、生物原料から
、細砕、中性〜弱アルカリ性媒体中での崩壊及び錯化剤
及びメルカプタンの存在での分別により製造するために
、トリス−酒石酸緩衝液（ｐＨ７〜８．５）中の細砕し
た出発物質の懸濁液を製造し、これに可溶性のポリエチ
レンイミンを、硝酸還元酵素活性の１０〜２０％が生成
する沈殿に移行するような量で添加し、この沈殿を分離
し、かつ上澄液を常用の生化学的分別法の後に前記の崩
壊緩衝液中で後処理し、得られる酵素溶液を透析し、か
つ両性イオン緩衝液中で凍結乾燥させることを特徴とす
る、安定化されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−依存性で可溶性の同
化型硝酸還元酵素の製法。 ３、緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を添加する、特許請求
の範囲第２項記載の方法。 ４、緩衝液にＦＡＤを添加する、特許請求の範囲第２項
または第３項記載の方法。 ５、緩衝液に糖又は糖アルコールを添加する、特許請求
の範囲第２項記載の方法。 ６、ポリエチレンイミン沈殿の上澄液に弱アルカリ性陰
イオン交換体を、硝酸還元酵素活性がなお溶液中に残留
するだけ添加し、次いで交換体を高めたイオン濃度で溶
離させる、特許請求の範囲第２項から第５項までのいず
れか１項に記載の方法。 ７、酵素溶液を芳香族で置換された網状化アガロースの
クロマトグラフィーにかける、特許請求の範囲第２項か
ら第６項までのいずれか１項に記載の方法。 ８、陰イオン交換体処理又は／及びクロマトグラフィー
の前又は後に、酵素を硫酸アンモニウムで沈殿させ、次
いで再び崩壊緩衝液中に溶かす、特許請求の範囲第２項
から第７項までのいずれか１項に記載の方法。 ９、トリス−酒石酸緩衝液（ｐＨ７〜８．５）中の細砕
した出発物質の懸濁液を製造し、これに可溶性のポリエ
チレンイミンを、硝酸還元酵素活性の１０〜２０％が生
成する沈殿に移行するような量で添加し、この沈殿を分
離し、かつ上澄液を常用の生化学的分別法の後に前記の
崩壊緩衝液中で後処理し、得られる酵素溶液を透析し、
かつ両性イオン緩衝液中で凍結乾燥させることにより得
られた、ドデシル硫酸ナトリウムの存在する電気泳動で
約９００００Ｄの分子量及び３５℃で３週間後に ６０％よりも多い残余活性を有する安定化されたＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ−依存性で、可溶性の同化型硝酸還元酵素、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ、両性イオン緩衝液ｐＨ７〜９、窒素複素
環緩衝液ｐＨ６．５〜９を含有する硝酸塩測定試薬。 １０、両イオン緩衝液はＧＯＯＤ−緩衝液である、特許
請求の範囲第９項記載の試薬。 １１、窒素複素環緩衝液は、イミダゾール緩衝液、ピラ
ゾール緩衝液又はピリジン緩衝液である、特許請求の範
囲第９項又は第１０項記載の試薬。 １２、ｐＨ値は７．０〜７．８であり、かつ再構成され
、溶解された試薬中の緩衝液濃度は２０〜５０ミリモル
である、特許請求の範囲第９項から第１１項までのいず
れか１項に記載の試薬。 １３、スーパーオキシドジスムターゼを含有する、特許
請求の範囲第９項から第１２項までのいずれか１項に記
載の試薬。 １４、プロテアーゼ阻害剤、ＦＡＤ及び糖又は糖アルコ
ールから選択した添加物少なくとも１種を含有する、特
許請求の範囲第９項から第 １３項までのいずれか１項に記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863614838 DE3614838A1 (de) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | Stabilisierte nad(p)h-abhaengige loesliche nitratreduktase verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| DE3614838.5 | 1986-05-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62262992A true JPS62262992A (ja) | 1987-11-16 |
| JPH0475757B2 JPH0475757B2 (ja) | 1992-12-01 |
Family
ID=6299993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62106496A Granted JPS62262992A (ja) | 1986-05-02 | 1987-05-01 | 安定化されたｎａｄ（ｐ）ｈ−依存性で可溶性の同化型硝酸還元酵素、その製法及びこれを含有する硝酸塩測定試薬 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0244771B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62262992A (ja) |
| AT (1) | ATE84068T1 (ja) |
| DE (2) | DE3614838A1 (ja) |
| ES (1) | ES2044862T3 (ja) |
| GR (1) | GR3007473T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04267878A (ja) * | 1991-02-21 | 1992-09-24 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 酵素の安定化方法 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8903593D0 (en) * | 1989-02-16 | 1989-04-05 | Pafra Ltd | Storage of materials |
| USRE38385E1 (en) * | 1989-02-16 | 2004-01-13 | Nektar Therapeutics | Storage of materials |
| DE4004900A1 (de) * | 1990-02-16 | 1991-08-22 | Merck Patent Gmbh | Nitratreduktase aus hefen, ihre herstellung und verwendung |
| DE59005286D1 (de) * | 1990-10-04 | 1994-05-11 | Kallies Import Export Vertrieb | Stabilisiertes Thrombin, seine Herstellung und seine Verwendung als Thrombinzeitreagens. |
| AU659645B2 (en) | 1991-06-26 | 1995-05-25 | Inhale Therapeutic Systems | Storage of materials |
| US6290991B1 (en) | 1994-12-02 | 2001-09-18 | Quandrant Holdings Cambridge Limited | Solid dose delivery vehicle and methods of making same |
| US11515021B2 (en) | 2019-10-03 | 2022-11-29 | Rom Technologies, Inc. | Method and system to analytically optimize telehealth practice-based billing processes and revenue while enabling regulatory compliance |
| US11270795B2 (en) | 2019-10-03 | 2022-03-08 | Rom Technologies, Inc. | Method and system for enabling physician-smart virtual conference rooms for use in a telehealth context |
| US11282599B2 (en) | 2019-10-03 | 2022-03-22 | Rom Technologies, Inc. | System and method for use of telemedicine-enabled rehabilitative hardware and for encouragement of rehabilitative compliance through patient-based virtual shared sessions |
| US11282604B2 (en) | 2019-10-03 | 2022-03-22 | Rom Technologies, Inc. | Method and system for use of telemedicine-enabled rehabilitative equipment for prediction of secondary disease |
| US11139060B2 (en) | 2019-10-03 | 2021-10-05 | Rom Technologies, Inc. | Method and system for creating an immersive enhanced reality-driven exercise experience for a user |
| US11282608B2 (en) | 2019-10-03 | 2022-03-22 | Rom Technologies, Inc. | Method and system for using artificial intelligence and machine learning to provide recommendations to a healthcare provider in or near real-time during a telemedicine session |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60259185A (ja) * | 1980-02-05 | 1985-12-21 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | グリセリンオキシダ−ゼの取得法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1930059C3 (de) * | 1969-06-13 | 1975-11-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilisiertes Nicotinamid-adenindinucleotid oder bzw. und Nicotinamld-adenin-dinucleotidphosphat |
| NL7103489A (ja) * | 1970-03-18 | 1971-09-21 |
-
1986
- 1986-05-02 DE DE19863614838 patent/DE3614838A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-04-30 AT AT87106305T patent/ATE84068T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-04-30 ES ES87106305T patent/ES2044862T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-30 EP EP87106305A patent/EP0244771B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-30 DE DE8787106305T patent/DE3783265D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-05-01 JP JP62106496A patent/JPS62262992A/ja active Granted
-
1993
- 1993-03-26 GR GR920402868T patent/GR3007473T3/el unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60259185A (ja) * | 1980-02-05 | 1985-12-21 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | グリセリンオキシダ−ゼの取得法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04267878A (ja) * | 1991-02-21 | 1992-09-24 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 酵素の安定化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2044862T3 (es) | 1994-01-16 |
| DE3614838A1 (de) | 1987-11-12 |
| JPH0475757B2 (ja) | 1992-12-01 |
| DE3783265D1 (de) | 1993-02-11 |
| GR3007473T3 (ja) | 1993-07-30 |
| ATE84068T1 (de) | 1993-01-15 |
| EP0244771A2 (de) | 1987-11-11 |
| EP0244771B1 (de) | 1992-12-30 |
| EP0244771A3 (en) | 1989-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mahler | [120] DPNH cytochrome c reductase (animal) | |
| Yu et al. | Preparation and properties of cardiac cytochrome c1 | |
| London et al. | Renaturation of Escherichia coli tryptophanase after exposure to 8 M urea: evidence for the existence of nucleation centers | |
| Glassman et al. | Mutants of Drosophila melanogaster deficient in xanthine dehydrogenase | |
| Passon et al. | Soluble cytochrome b5 reductase from human erythrocytes | |
| Vermilion et al. | Highly purified detergent-solubilized NADPH-cytochrome P-450 reductase from phenobarbital-induced rat liver microsomes | |
| Sachar et al. | Photometric method for estimation of elastase activity. | |
| Chao et al. | Purification and some properties of choline acetyltransferase (EC 2.3. 1.6) from bovine brain | |
| Plapp et al. | Activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease A with modified amino groups | |
| Hallenberg et al. | [55] Purification of chloroperoxidase from Caldariomyces fumago | |
| Anson et al. | Some effects of iodine and other reagents on the structure and activity of tobacco mosaic virus | |
| Tomasselli et al. | Mitochondrial GTP‐AMP Phosphotransferase: 1. Purification and Properties | |
| JPH11504225A (ja) | 組織を解離するための酵素組成物 | |
| Tani et al. | Purification and general characteristics of bacterial myrosinase produced by Enterobacter cloacae | |
| Peterson et al. | Bovine liver dihydrofolate reductase. Purification and properties of the enzyme | |
| US5169758A (en) | Stabilized, NAD(P)H-dependent, soluble nitrate reductase, a process for the preparation thereof and a reagent containing it | |
| Ignarro et al. | Guanylate cyclase from bovine lung. Evidence that enzyme activation by phenylhydrazine is mediated by iron-phenyl hemoprotein complexes. | |
| Hultquist | [49] Methemoglobin reduction system of erythrocytes | |
| JPH0475757B2 (ja) | ||
| Friedland et al. | The reversibility of the denaturation of bacterial luciferase | |
| Mahler | [124] Diaphorases | |
| Dailey Jr | Purification and characterization of the membrane-bound ferrochelatase from Spirillum itersonii | |
| Wuntch et al. | Studies on rates of abortive ternary complex formation of lactate dehydrogenase isozymes | |
| Hauge | Mode of action of glucose dehydrogenase from Bacterium anitratum | |
| Nygaard | Yeast lactic dehydrogenase I. Purification and reaction properties |