JPS62262996A - ゲンタマイシン耐性遺伝子およびそのマ−カ−としての使用 - Google Patents

ゲンタマイシン耐性遺伝子およびそのマ−カ−としての使用

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JPS62262996A
JPS62262996A JP62108734A JP10873487A JPS62262996A JP S62262996 A JPS62262996 A JP S62262996A JP 62108734 A JP62108734 A JP 62108734A JP 10873487 A JP10873487 A JP 10873487A JP S62262996 A JPS62262996 A JP S62262996A
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gentamicin
streptomyces
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resistance gene
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ウォルフガング、ウォールレーベン
ギュンター、ムート
アルフレート、ピューラー
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトミセス菌類（Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ
）のクローニングに使用可能な耐性遺伝子は、今日まで
に得られているものは数少なく、さらに、そのいくつか
は、使用に際して特別な制約を受ける。例えば、ハイグ
ロマイシンは毒性が強く、ビオマイシンはもはや市販さ
れていないし、クロラムフェニコールはストレプトミセ
ス菌類の耐性遺伝子が不安定であることが知られている
ために、特別な場合にのみ適用される。このような事情
から、さらに、さらに、新しい耐性マーカーが求められ
ている。
ストレプトミセス菌類は、多くは抗生物質ゲンタマイシ
ンに対してきわめて感受性が強い。したがって、一般に
プレート上での増殖は、わずか０．５μｇ／ｍｌのゲン
タマイシン濃度で阻害される。
本発明は、ふたつのゲンタマイシン耐性遺伝子に関する
もので、より詳細には、ストレプトミセス菌類内で活性
があり、そこで安定に存在し、多くの切断サイトを有し
、かつ挿入による不活化に適しているようなゲンタマイ
シン耐性遺伝子に関するものである。
ストレプトミセス菌類のストレプトミセス・ガネンシス
（Ｓｔｒｅｐｔｏａ＋ｙｃｅｓ　ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ
　）　Ｄ　Ｓ　Ｍ２９３２が２０μｚ　／　ｍｌという
通常より高いゲンタマイシン濃度に耐性であることが見
出された。
この菌株については、欧州特許出願公開０．１５８．２
０１号および０，１５８，８７２号各明細書に記述され
ている。この菌株はプラスミドｐＳＧ５を有している。
さらに、ゲンタマイシン耐性は約７ｋｂの８ｇ１ｍ切断
フラグメントに位置していることも見出された。菌株Ｄ
ＭＳ２９３２由来のＤＮＡの全体消化切断処理を行い、
生じたフラグメントを適当なベクターに連結し、ゲンタ
マイシン耐性について選択することによって、７ｋｂの
フラグメントを取り込んで有している腹合ベクターが分
離される。第１図はこの７ｋｂのフラグメントの制限酵
素切断部位を示したものである。第２図は第１図の詳細
図で、とくにコード領域をより詳細に示したものである
。
また、プラスミド　ｐＧＭ２（欧州特許出願０．１５８
，８７２、第３図）が、この７ｋｂフラグメントをスト
ブトミセス・ガネンシス（Ｓ。
ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）　Ｄ　Ｓ　Ｍ　　２９３２．の
ゲノムから分離するためのベクターとして、とくに適し
ていることも見出された。この目的のために、ベクター
ｐＧＭ２は制限酵素ＢｇｌＩ［による切断で直線状にさ
れ、酵素アルカリフォスファターゼで処理される。一方
、ＤＳＭ　　２９３２からの全ＤＮＡは制限酵素Ｂｇｌ
ｎによって完全に消化切断処理され、生じたフラグメン
トは大きさによって分画されることなく、直線状になっ
たプラスミドｐＧＭ２に連結される。連結されたフラグ
メント混合物を、ゲンタマイシン感受性である適切なス
トレプトミセス菌類に取り込ませ、形質転換させる。形
質転換クローンの選択プレート（ｒｅｇｅｎｅｒａｔ　
ｔｏｎｐｌａｔｅ　）は、充分に培養した後、チオスト
レプトンを加えた軟寒天で覆う。さらに培養を行った後
、ゲンタマイシンを含む寒天にレプリカブレーティング
する。その結果、プラスミドｐＧＭ２由来のチオストレ
プトン耐性とＤＳＭ　　２９３２ゲノム由来のゲンタマ
イシン耐性を合わせもつクローンが分離される。プラス
ミド分離およびプラスミドＤＮＡのゲンタマイシン感受
性菌への再形質転換によって、チオストレプトン耐性−
ゲンタマイシン耐性のコロニーのみが得られる。制限酵
素による解析で、第１図に示すような７ｋｂのフラグメ
ントの存在が明らかになる。
適切なゲンタマイシン感受性の菌株としては、ＡＴＣＣ
１４６７２（米国特許 ３．６７４，８６６号および４，６２１，０６１号）な
どのストレプトミセス・ガネンシス（Ｓ、ｇｈａｎａｃ
ｎｓｉｓ）があり、さらに、他のストレプトミセス菌類
の菌種、例えば、ストレプトミセス・コリコラ−（Ｓ、
　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・リビダ
ンス（Ｓ、　１ｔｖｌｄａｎｓ）、ストレプトミセス・
ブラシヌス（Ｓ、　ｐｒａｓｉｎｕｓ）、ストレプトミ
セス・ベネズエラ（Ｓ、　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）およ
びストレプトミセス・ゲイシレンシス（Ｓ、　ｇｅｙｓ
ｉｒｅｎｓｌｓ）からなる群から選ばれる菌種が用いら
れる。
多数の切断サイトが第１図の制限酵素切断地図に示され
ているが、ＰｓｔｌおよびＥｃｏＲＩがそれぞれ単一で
存在する切断サイトとして含まれる。このことから、ゲ
ンタマイシン耐性遺伝子の更なる画定が可能であること
がわかる。また、切断サイトＢａｍＨＩ、ＥＣ０ＲＩ％
　Ｃ１ａＩ。
５ｓｔＩおよびＳｓ　ｔＩＩは、挿入不活性化に適して
いる（第２図）。
この新マーカー遺伝子は、有用な多数の切断サイトによ
って特徴づけられるのみならず、それがストレプトミセ
ス菌類に固有の遺伝子であるため、これを備えたベクタ
ーは特別に安定であることが予想される。
驚いたことに、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｌ　）プラスミド
ｐＰＨＩＪ　１　　（Ｐ、Ｒ，ヒルシュ、Ｊ、Ｅ、ベリ
ンガー、Ｐｌａｓｍｉｄ、　１２　（１９８４）１３９
−１４１　）もまた、ストレプトミセス菌類で活性を示
しかつ安定しているゲンタマイシン耐性遺伝子を有する
ことが見出された。ＨＬｎｄｎＩおよびＢａｍＨｌで消
化処理すると、耐性遺伝子が位置している２、３ｋｂの
フラグメントが得られる（第３図）。
この耐性遺伝子に属しているプロモーター遺伝子はこの
２．３ｋｂフラグメント上にあり、ダラム陰性細菌のＲ
ＮＡポリメラーゼのみならず、意外にもストレプトミセ
ス菌類のＲＮＡポリメラーゼによっても認識される。し
たがって、この遺伝子はダラム陰性細菌およびストレプ
トミセス菌類の双方で複製されるようなシャトルベクタ
ーを作るのに適している。
ｓｐｈ　ＩおよびＢｇｌｍの切断サイトは、挿入不活性
化を伴うクローニングに用いることができる。
プラスミドｐＰＨＩＪＩからのゲンタマイシン耐性遺伝
子はまた、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａｃｔ
ｅｒｉａ）でも形質発現される。このように、「ストレ
プトミセス菌類で活性である」ということは、この活性
がストレプトミセス菌類に限定されるという意味ではま
ったくない。
これまでに知られている、ストレプトミセス菌類が自然
に持っているプラスミドは、遺伝子操作に応用できるよ
うな耐性マーカーを有していない。
したがって、本発明はストレプトミセス菌類を用いる遺
伝子工学の可能性をより広げるものである。
例　　１ プラスミドｐＧＭ２　（欧州特許出願 ０．１５８．８７２号、３ページ、３節および第３図）
を、ＢｇｌＩＩで直線状にして、酵素アルカリフォスフ
ァターゼ（ウシ腸由来）と反応させる。
ストレプトミセス・ガネンシスＤＳＭ２９３２からの全
ＤＮＡをＢｇｌｎで完全に消化し、ｐＧＭ２消化混合物
とあわせ、それにＴ４ＤＮＡリガーゼを加える。
このリガーゼ処理した混合物をストレプトミセス・リビ
ダンス　ＴＫ２３（英国、ノーリッチ、ジョン・インネ
ス・ファウンデーションより入手可能）（Ｋ、Ｆ、ケイ
ター、Ｄ、Ａ、　ホブウッド、Ｔ、キーザーおよびＣ，
Ｊ、　　）ンブソン：ストレプトミセス菌における遺伝
子クローニング、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　Ｉｎ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ａｎｄ　ｌｉｍｕｎｏｌ、。
９Ｂ、　［１９−９５１９８２）　）に形質転換する。
１８時間後、クローン選択プレートをチオストレプトン
を含む軟寒天で覆う。１週間の後、ゲンタマイシン５μ
ｇ　／　ｍｌを含む寒天平板上にレプリカブレーティン
グする。その結果、チオストレプトンおよびゲンタマイ
シンの双方に耐性のクローンが分離される。　プラスミ
ド分離およびプラスミドＤＮＡのストレプトミセス・リ
ビダンス　ＴＫ　　２３への再形質転換によって、チオ
ストレプトン耐性−ゲンタマイシン耐性のコロニーのみ
が検出された（１９３の取り出し株中１９３株）。制限
酵素解析によって、第１図に示すような７ｋｂのフラグ
メントが挿入されているのが明らかにされる。第４図は
、分離されたプラスミドｐＧＭ９９を示すものである。
このプラスミドは約１５キロベースの大きさの分子で、
チオストレプトンとゲンタマイシン対する耐性を付与す
ることができる。
例２ ｐＰＨＩＪＩ（ヒルシュら、前出）をＢａｍＨＩで全消
化すると、ゲンタマイシン耐性遺伝子を有する３、６ｋ
ｂのフラグメントが得られる。このフラグメントを、Ｂ
ａｍＨＩで予め開裂させておいたｐＵＣ８に連結させて
、プラスミドＲ１８９−２を得る。このプラスミドをＨ
ｉｎ−ｄ■で切断して、２．４ｋｂのフラグメントを得
る。このフラグメントを予めＨｉｎｄＩ［［で開裂して
おいたｐＵｃ１９に連結して、プラスミドｐｓＬＥ８０
　（第５図）を得る。このプラスミドは、Ｅ、ｃｏｌｉ
　　ＪＭ８３に含ませたものとして、寄託番号ＤＳＭ　
　３７１０で、ドイツチェ・ザンムルング舎フユールψ
ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａ＋ｕｌ
ｕｎｇ　ｒｕｅｒ　Ｍ１ｋｒｏｏｒｇａｎｉｓａ＋ｅｎ
）に寄託されている。
本発明のゲンタマイシン耐性遺伝子は再分離して、適切
な酵素で切断してクローニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のゲンタマイシン耐性遺伝子の制限地
図である。 第２図は、第１図の遺伝子の詳細を示す説明図である。 第３図は、本発明のゲンタマイシン耐性遺伝子の制限地
図である。 第４図は、プラスミドｐＧＭ９９の制限地図である。 第５図は、プラスミドｐｓＬＥ８０の制限地図である。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、３

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ＢｇｌIIによる全消化と、当該フラグメントの適切
    なプラスミドへの導入およびゲンタマイシン使用による
    選択によってストレプトミセス・ガネンシス（Ｓｔｒｅ
    ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）ＤＳＭ２３
    ９２から得られる、あるいはプラスミドｐＳＬＥ８０（
    ＤＳＭ３７１０）から得られる、ストレプトミセス菌類
    において活性であるゲンタマイシン耐性遺伝子。 ２、第１図および第２図に示される制限酵素切断サイト
    を有するゲンタマイシン耐性遺伝子。 ３、第３図に示される制限酵素切断サイトを有するゲン
    タマイシン耐性遺伝子。 ４、特許請求の範囲第１項記載の遺伝子をストレプトミ
    セス菌類で複製可能なプラスミドに挿入することを特徴
    とする、ゲンタマイシン耐性をストレプトミセス菌類で
    複製可能なプラスミドに付与する方法。 ５、ゲンタマイシン耐性遺伝子が特許請求の範囲第３項
    記載のものであり、プラスミドがストレプトミセス菌類
    のシャトルベクターである、特許請求の範囲第４項記載
    の方法。 ６、特許請求の範囲第１項記載のゲンタマイシン耐性遺
    伝子を含むベクター。 ７、ストレプトミセス菌類のベクターである、特許請求
    の範囲第６項記載のベクター。 ８、プラスミドｐＳＬＥ８０（ＤＳＭ３７１０）。
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DK (1) DK223787A (ja)
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EP0248207A2 (de) 1987-12-09
ATE85359T1 (de) 1993-02-15
EP0248207A3 (en) 1988-08-31
DK223787A (da) 1987-11-03
DK223787D0 (da) 1987-05-01
US4918015A (en) 1990-04-17
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CA1294900C (en) 1992-01-28
DE3614903A1 (de) 1987-11-05
ES2038971T3 (es) 1993-08-16
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